JP5464311B2 - ルシフェラーゼの発光基質 - Google Patents
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Description
近年、生物学的事象および現象の可視化が重要視され、可視化対象の拡大が望まれてきている。これに伴い、標識技術にも多様化が求められている。特に分子イメージングのための標識技術は、診断および検査機器の進歩と相まって大きく発展している。たとえば、癌や心疾患などに対する個別化医療などの先端技術に応用するための標識技術が精力的に研究されている。また、計測技術の進歩に伴い、より高感度および高性能な機器や標識材料に対する需要が急速に高まっている。
多現象を観測するために、標識を利用した検出系においても、多色発光が求められている。このため、検出系に利用できる標識材料の波長域は、幅広い方が望ましい。また、生体内深部標識における用途では、短波長光よりも長波長光のほうが優れた光透過性を有するという観点から、赤色発光標識材料が望まれている。たとえば、多色発光を利用した研究には、標識として450 nm以下程度〜650 nm以上程度の波長にわたる発光を有する標識材料が準備されることが望ましい。
nm)が、東洋紡から最近市販されている。しかし、これらの発光波長だけでなく、発光波長の最短および最長の両端の波長のさらなる拡張には、潜在的需要が見込まれる。
1.プロメガ社:Chroma-Luc: 約613 nm(非特許文献1)
この系は、ヒカリコメツキ虫(クリックビートル)の突然変異体および天然型ホタル発光基質を利用した系である。
2.東洋紡績(株):MultiReporter Assay System-Tripluc:
約630 nm(非特許文献2)
この系は、鉄道虫赤色発光酵素および天然型ホタル発光基質を利用した系である。緑色発光ルシフェラーゼ(SLG、最大発光波長550nm)、橙色発光ルシフェラーゼ(SLO、580nm)および赤色発光ルシフェラーゼ(SLR、630nm)の色のルシフェラーゼ遺伝子を使用して発光色を変化させている。これは、異なる発光色を与える発光酵素を利用している。
3.東京大学:アミノルシフェリン:約610 nm(特許文献1)
これは、ルシフェリン誘導体を開示している。
4.プロメガ社:Chroma-Luc: 約480 nm(非特許文献3)
この系は、セレンテラジンおよびウミシイタケルシフェラーゼを利用した系である。
5.ATTO社:ウミホタル生物発光 約460 nm(非特許文献4)
セレンテラジン系基質およびウミホタルルシフェラーゼを利用した系である。
R1 およびR2 は、それぞれ独立してC1-4アルキルであり、
R 3 はHであり、
XはNであり、
YはSまたはOであり、
nは、0、2または3である。
当業者であれば、R1およびR2を所望の置換基と置き換えた開始物質から開始して、実施例1と同様の手順によって、D-システイン-S-トリチル由来のメチルエステル体との反応により、対応する化合物を合成することができることを理解するであろう。また、最後の工程において、チアゾリン体のメチルエステル部分を所望のエステルに置換することにより、対応するR3を有する化合物を得ることができるであろう。さらに、開始物質と指定使用するエチルエステル体のオレフィン部分の長さを変更することにより、一般式Iにおいて所望の長さのnを有する化合物を得ることができるであろう。
Resonance Energy Transfer)型発光系を構成することができる。BRET型発光系により、種々のタンパク質翻訳後修飾および遺伝子発現のバイオイメージングが可能になる。たとえば、GFPと発光甲虫ルシフェラーゼ融合タンパク質とがタンパク質プロセッシング配列を介している状態で発現される場合、融合タンパク質がプロセッシングを受けなと、GFPの緑色蛍光が検出される。逆に、融合タンパク質がプロセッシングを受けると、発光基質の青色発光が検出される。したがって、発光状態に基づいて、融合タンパク質をプロセッシングする酵素の発現についてのバイオイメージングが可能になる。また、タンパク量の測定およびタンパク質の局在化状態のバイオイメージングも可能になる。さらに、タンパク質の熟成に必要な糖鎖の付加プロセスのバイオイメージに利用することもできる。また、タンパク質/タンパク質間の相互作用等を観測するために利用することができる。
pH測定:東洋濾紙株式会社製pH試験紙UNIVを使用して測定した。また、pHメータとして、堀場社製pH/ION
METER F-23 を使用して測定した。
NMR):日本電子社製Lambda-270型装置(270 MHz)を使用して測定した。“1H NMR(測定周波数,測定溶媒):δケミカルシフト値(水素の数,
多重度, スピン結合定数)”と記載した。ケミカルシフト値(δ)はテトラメチルシラン(δ = 0)を内部基準とし、ppで表記した。多重度は、s(単一線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、m(多重線あるいは複雑に重なったシグナル)で表示し、幅広いシグナルは、brと記した。スピン結合定数(J)は、Hzで記載した。
NMR):日本電子社製Lambda-270型装置(67.8 MHz)を使用して測定した。“13C NMR(測定周波数,測定溶媒):δケミカルシフト値(多重度)”と記載した。ケミカルシフト値(δ)は、テトラメチルシラン(δ=
0)を内部基準とし、ppmで表記した。多重度は、s(単一線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)で表示した。
eV)により測定した。日本電子社製JMS-T100LC型TOF質量分析計AccuTOFを用い、エレクトロンスプレーイオン化法(ESI)により測定した。なお、装置の設定は脱溶媒ガス250
℃、オリフィス1温度80 ℃、ニードル電圧2000 V、リングレンズ電圧10 V、オリフィス1電圧85 V、オリフィス2電圧5 Vとした。サンプル送液はインフュージョン法で行い、流速10
μl/minとした。“MS(測定法)m/z 質量数(相対強度)”と記載した
比旋光度:日本分光社製DIP-1000型旋光計を使用して測定した。光源は、ナトリウムランプ、セルは円筒型ガラスセル(Φ10×100
mm)を使用した。測定値は未補正であり、データは5回測定の平均値である。それぞれD体、L体について“D or L: [α]温度 測定値(濃度, 測定溶媒)”と記載した。
分析用薄層クロマトグラフィー(TLC):E.Merck社製のTLCプレート、シリカゲル60F254(Art.5715)厚さ0.25
mmを使用した。TLC上の化合物の検出はUV照射(254 nmあるいは365 nm)および発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはp-アニスアルデヒド(9.3
ml)と酢酸(3.8 ml)をエタノール(340 ml)に溶解し、濃硫酸(12.5 ml)を添加したものを使用した。
mmを用いるか、あるいはE. Merck社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル60GF254(Art.7730)を20 cm×20
cm のガラスプレート上に、厚さ1.75 mmに調整したものを使用して行った。
反応溶液の冷却は、冷媒を満たしたジュワー瓶に反応容器を浸して行った。室温〜4℃では、氷水、4〜-90℃では、液体窒素−アセトンを冷媒として用いた。反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムまたは無水硫酸マグネシウムを加えることで行った。反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトIR120B
NAまたは陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA400 OH AGを使用した。溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下(20〜30 mmHg)、ロータリーエバポレーターを使用して行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ(約1
mmHg)を使用して行った。溶媒の混合比は全て体積比で表した。
蒸留水は、アドバンテック東洋株式会社製GS-200型蒸留水製造装置を使用して蒸留およびイオン交換処理したものを使用した。
Inc.製 99.7 ATOM%D、0.03% TMS、CD3OD:ISOTEC Inc.製 99.8 ATOM%D(〜0.7
ATOM%13C)、0.05% TMS。
実施例1-3:メチルエステル1の合成
メチルエステル1
IR (neat) 3381, 3317, 1739, 1595 cm-1
1H NMR (270MHz, CD3OD):δ2.46(1 H, dd, J = 7.1, 12.4 Hz), 2.58(1 H, dd, J = 5.8, 12.4 Hz), 3.11(1 H, dd, J = 5.8, 7.1 Hz), 3.65(3 H, s), 7.19-7.32(9 H, complex), 7.32-7.42(6 H, complex)
13C NMR (67.8MHz, CD3OD):δ37.37(t), 52.62(q), 54.42(d), 67.86(s), 127.87(d), 128.97(d), 130.64(d), 145.82(s), 174.98(s)。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.00(6 H, s), 3.54(1 H, dd, J = 8.9,11
Hz), 3.57(1 H, dd, J = 8.9,11 Hz), 5.17(1 H, t, J = 8.9 Hz), 6.54(1 H, d, J =
15 Hz), 6.65-6.80(4 H, complex), 6.94(1 H, dd, J = 8.9,15 Hz) 7.36(2 H, d, J =
8.9 Hz)。
1H NMR
(270MHz, CD3OD)
δ2.98(6 H, s), 3.54(1 H, d, J = 8.9 Hz),
3.57(1 H, d, J = 8.9 Hz), 5.19(1 H, t, J = 8.9 Hz), 6.47(1 H, d, J = 15 Hz),
6.70-7.06(5 H, complex), 7.38(2 H, d, J = 8.9 Hz)。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ2.99(6 H, s), 3.71(3 H, s), 4.78(1 H, dd, J
= 5.1,7.8 Hz), 6.05(1 H, d, J = 7.8 Hz), 6.15(1 H, d, J = 15 Hz), 6.66(1 H, d, J
= 8.6 Hz), 7.16-7.40(19 H, complex), 7.53(1 H, d, J = 15 Hz)。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.00(6 H, s), 3.56(1 H, dd, J = 9.2, 11
Hz), 3.58(1 H, dd, J = 9.2, 11 Hz), 3.83(3 H, s), 5.18(1 H, t, J = 9.2 Hz),
6.67(2 H, d, J = 9.5 Hz), 6.91(1 H, d, J = 16 Hz), 7.07(1 H, d, J = 16 Hz),
7.38(2 H, d, J = 9.5 Hz)。
1H NMR
(270MHz, CD3OD)
δ3.02(6 H, s), 3.57(1 H, dd, J = 8.6,11
Hz), 3.72(1 H, dd, J = 8.6,11 Hz), 5.03(1 H, t, J = 8.6 Hz), 6.73(2 H, d, J =
8.9 Hz), 6.87(1 H, d, J = 16 Hz), 7.24(1 H, d, J = 16 Hz), 7.45(2 H, d, J = 8.9
Hz)。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.01(6 H, s), 3.50(1 H, dd, J = 9.2, 11
Hz), 3.61(1 H, dd, J = 9.2, 11 Hz), 5.00(1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.71(2 H, dd, J =
2.4, 7.0 Hz), 7.71(2 H, dd, J = 2.4, 7.0 Hz)
mp 155-170 ℃ decomp.
IR(film)3178, 2225 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 7.17(1H, dd, J = 2.6, 8.9 Hz), 7.40(1H, d, J = 2.6 Hz),
7.99(1H, d, J = 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 107.00(d), 114.29(s), 119.61(d), 126.58(d), 133.91(s),
139.01(s), 147.29(s), 160.32(s)
MS(EI)m/z 176(M+・, 100), 124(5)。
1H NMR(270
MHz, DMSO-d6):δ 3.66(1H, dd, J = 8.2, 11.2 Hz), 3.67(1H, dd, J =
9.9, 11.2 Hz), 5.40(1H, dd, J = 8.2, 9.9 Hz), 7.06(1H, dd, J = 2.6, 8.9 Hz),
7.51(1H, d, J = 2.6 Hz), 7.96(1H, d, J = 8.9 Hz), 10.24(1H, br.s, OH)
13C NMR(67.8
MHz, DMSO-d6):δ 34.5(t), 78.0(d), 106.7(d), 117.0(d), 124.8(d),
137.1(s), 146.1(s), 157.3(s), 159.8(s), 164.3(s), 171.1(s)。
mp 200-204 ℃ decomp.
IR(film)3066, 1652, 1583 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.70(1H, dd, J = 7.9, 11.5 Hz), 3.76(1H, dd, J = 8.9,
11.5 Hz), 5.23(1H, dd, J = 7.9, 8.9 Hz), 6.85(2H, d, J = 8.9 Hz), 7.74(2H, d, J
= 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 35.95(t), 77.97(d), 116.53(d)×2, 124.48(s), 131.80(d)×2,
163.00(s), 173.94(s), 174.63(s)
MS(EI)m/z 223(M+・, 44), 178(100),
137(43), 119(46)
Optical rotation:L:
[α]25 -1.0600°(c = 1.2000, CH3OH)、D: [α]22
+6.6979°(c = 0.7692, CH3OH)。
IR(neat)3381, 3315, 1739, 1595 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.47(1H, dd, J = 7.7, 12.4 Hz), 2.60(1H, dd, J = 4.8,
12.4 Hz), 3.20(1H, br.dd, J = 4.8, 7.7 Hz), 3.65(3H, s), 7.18-7.31(9H, complex),
7.40-7.45(6H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 36.90(t), 52.16(q), 53.78(d), 66.83(s), 126.76(d)×3,
127.94(d)×6, 129.57(d)×6, 144.51(s)×3, 174.18(s)
MS(FAB)m/z 378(M+H+, 10), 243(100)。
mp 182-183℃
IR(film)3050, 1743, 1680, 1630 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.33(3H, s), 6.41(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.15(2H, d, J =
8.7 Hz), 7.58(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.77(1H, d, J = 16.0 Hz)
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 2.28(3H, s), 6.47(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.14(2H, d, J =
8.6 Hz), 7.58-7.64(3H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 20.95(q), 120.99(d), 123.37(d)×2, 130.20(d)×2, 133.86(s),
144.18(d), 153.60(s), 170.85(s), 171.23(s)
MS(EI)m/z 206(M+・, 14), 164(100),
147(20), 119(12), 92(14)。
IR(neat)3282, 1763, 1743, 1662, 1626 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.32 (3H, s), 2.70(1H, dd, J = 4.8, 12.4 Hz), 2.78(1H,
dd, J = 5.4, 12.4 Hz), 3.74(3H, s), 4.58(1H, ddd, J = 4.8, 5.4, 7.7 Hz), 6.10(1H,
d, J = 7.7 Hz), 6.30(1H, d, J = 15.7 Hz), 7.12(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.18-7.31(9H,
complex), 7.37-7.41(6H, complex), 7.52(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.57(1H, d, J = 15.7
Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.16(q), 33.94(t), 51.20(d), 52.74(q), 67.00(s),
120.04(d), 122.09(d)×2, 126.94(d)×3, 128.04(d)×6, 129.00(d)×2, 129.49(d)×6,
132.38(s), 140.78(d), 144.27(s)×3, 151.77(s), 165.07(s), 169.25(s), 170.93(s)
MS(FAB)m/z 566(M+H+, 1), 243(100)
Optical rotation :L: [α]19
-4.3639°(c = 13.946, CHCl3)、D: [α]19 +2.1802°(c = 5.3462,
CHCl3)。
mp 118-121℃
IR(film)1757, 1724 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.31(3H, s), 3.58(1H, dd, J = 9.3, 11.2 Hz), 3.65(1H,
dd, J = 9.1, 11.2 Hz), 3.85(3H, s), 5.22(1H, dd, J = 9.1, 9.3 Hz), 7.04(1H, d, J
= 16.1 Hz), 7.12(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.13(1H, d, J = 16.1 Hz), 7.51(2H, d, J =
8.6 Hz)、13C NMR(67.8 MHz, CDCl3):δ 21.15(q), 34.64(t),
52.89(q), 77.96(d), 122.15(d)×2, 122.42(d), 128.69(d)×2, 132.75(s), 141.094(d),
151.66(s), 169.20(s), 170.01(s), 171.17(s)、MS(EI)m/z 305(M+・, 44),
263(88), 205(100), 177(69), 163(15), 145(87)、Optical rotation:L: [α]22
+9.0924°(c = 2.9308, CHCl3)、D: [α]22 -10.9198°(c =
0.4077, CHCl3)。
mp 138-140 ℃ decomp.
IR(film)3151, 1626, 1568 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.52(1H, dd, J = 8.9, 10.9 Hz), 3.61(1H, dd, J = 8.9,
10.9 Hz), 5.01(1H, t, J = 8.9 Hz), 6.80(2H, d, J = 8.9 Hz), 6.91(1H, d, J =
16.0 Hz), 7.10(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.42(2H, d, J = 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 36.54(t), 81.19(d), 116.86(d)×2, 119.72(d), 128.00(s),
130.52(d)×2, 143.65(d), 160.70(s), 171.97(s), 177.53(s)
MS(EI)m/z 248(M+-H, 100), 204(57),
177(59), 163(4), 145(1)
Optical rotation:L: [α]23 +2.2244°(c
= 1.2462, CH3OH)、D: [α]23 -2.3653°(c = 0.4769, CH3OH)。
mp 140-142℃、IR(film)3037, 1761, 1687, 1631
cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.30(3H,s), 6.44(1H, br.d, J = 15.6 Hz), 7.10-7.35(3H,
complex), 7.71(1H, br.d, J = 15.6 Hz)
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 2.28(3H, s), 6.49(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.12(1H, d, J =
7.4 Hz), 7.34-7.46(3H, complex), 7.63(1H, d, J = 16.0 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 20.91(q), 121.03(d), 122.06(d), 124.55(d), 12126.64(d),
130.91(d), 137.45(s), 144.75(s), 152.66(s), 170.47(br.s), 170.99(s)
MS(EI)m/z 206(M+・, 26), 164(100),
147(23), 119(6), 91(10)。
IR(neat)3283, 1764, 1739, 1663, 1624 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.31(3H,s), 2.70(1H, dd, J = 4.8, 12.5 Hz), 2.78(1H,
dd, J = 5.4, 12.5 Hz), 3.72(3H, s), 4.75(1H, ddd, J = 4.8, 5.4, 7.9 Hz), 6.18(1H,
br.d, J = 7.9 Hz), 6.33(1H, d, J = 15.6 Hz), 7.09(1H, dt, J = 2.1, 7.1 Hz),
7.17-7.41(18H, complex), 7.55(1H, d, J = 15.6 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.15(q), 33.88(t), 51.22(d), 52.72(q), 66.97(s),
120.61(d), 121.03(d), 122.94(d), 125.45(d), 126.92(d)×3, 128.02(d)×6, 129.47(d)×6,
129.82(d), 136.26(s), 140.70(d), 144.25(s)×3, 151.01(s), 164.88(s), 169.31(s),
170.88(s)
MS(FAB)m/z 566(M+H+, 1), 243(100)
Optical rotation:L: [α]23
-3.3299°(c = 12.254, CHCl3)、D: [α]23 +4.1534°(c = 7.9231,
CHCl3)。
IR(neat)1768, 1743, 1633 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.32(3H,s), 3.58(1H, dd, J = 9.2, 11.2 Hz), 3.65(1H,
dd, J = 9.2, 11.2 Hz), 3.82(3H, s), 5.22(1H, t, J = 9.2 Hz), 7.06-7.10(3H,
complex), 7.21(1H, m), 7.34-7.42(2H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.13(q), 34.65(t), 52.89(q), 77.99(d), 120.62(d),
122.85(d), 123.23(d), 124.91(d), 129.89(d), 136.60(s), 141.07(d), 151.06(s),
169.27(s), 169.84(s), 171.13(s)
MS(EI)m/z 305(M+・, 31), 246(100),
204(86)
Optical rotation:L: [α]26
+6.2401°(c = 0.6923, CHCl3)、D: [α]18 -5.5608°(c = 1.1538,
CHCl3)。
mp 163-165 ℃ decomp.
IR 3180, 1583, 1628 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.54(1H, dd, J = 8.9, 10.9 Hz), 3.63(1H, dd, J = 9.2,
10.9 Hz), 5.05(1H, dd, J = 8.9, 9.2 Hz), 6.79(1H, ddd, J = 1.0, 2.3, 7.9 Hz),
6.99-7.23(5H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 36.53(t), 81.23(d), 114.66(d), 118.12(d), 120.44(d),
122.89(d), 131.02(d), 137.82(s), 143.45(d), 159.13(s), 171.45(s), 177.05(s)
MS(EI)m/z 249(M+・, 15), 204(98),
145(100)。
生物発光スペクトルの測定
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent 1100 series HPLC
を使用した。装置の内訳は、デガッサー、クォータナリポンプ、マニュアルインジェクター、カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器、蛍光検出器、ケミステーション(PC用ソフトウェア)である。用いたカラムはダイセル化学工業株式会社製CHIRALCEL
OD-RH(内径 0.46 cm、長さ 15 cm)である。
堀場製作所製F-23型ガラス電極式水素イオン濃度指示計を使用して行った。
ATTO株式会社製Luminescencer-PSN AB-2200を使用して測定した。
ATTO株式会社製微弱発光蛍光スペクトル装置AB-1850を使用して測定した。測定したスペクトルは全て検出器の特性を補正したスペクトルである。
超純水は、MILLIPORE製Milli-RX12αから採水したものを使用した
メタノール、t-ブタノールは、関東化学株式会社製の特級溶媒を使用した。
基質溶液
基質を電子天秤で秤量し希釈した。溶媒として、生物発光の測定の場合はリン酸緩衝液(50
mM, pH 6.0)を、化学発光測定の場合はt-ブタノールを使用した。
ルシフェラーゼを1 μg/μlになるようにTris-HCl緩衝液(50 mM, pH8.0)で希釈し小分けにした。これをストック溶液とし、必要量をその都度希釈して用いた。なお、ストック溶液は-80 ℃の冷凍庫に保存した。
ATP-Mgを超純水で希釈した。
200μLポリスチレンチューブ内で、リン酸カリウム緩衝液(0.5 M, pH 8.0, 20μl)基質溶液(2.5 mM, 20 μl)、酵素溶液(20μl)、次いでATP-Mg溶液(10 mM, 40μl)を混合して発光スペクトル測定を行った。酵素溶液の濃度は、17μ Mのものを使用した。ただし、ホタルルシフェリン(1)は、1.7μM、フェノール型ルシフェリンは、170μ Mの酵素をそれぞれ使用した。また、発光スペクトル測定の露光時間は、60秒とした。ただし、ホタルルシフェリンは、5秒で行った。
上記実験より本発明のホタルルシフェリン類似体II、参考例2-3のモノエン体発光基質(ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン)および本発明のホタルルシフェリン類似体IVは、445nm、565nmおよび680nmの発光を生じる基質であることが明らかとなった(図1を参照されたい)。一方、アニリン型ではなく、フェノール型のホタルルシフェリン類似体に関しては、類似体9は発光しなかった。また、類似体7および類似体8は、それぞれ415nmと520nmの発光波長に発光活性があった(図2を参照されたい)。
上記式IIの化合物、参考例2-3のモノエン体発光基質(ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン)および上記式IVの化合物は、図1に示したように、それぞれ青色、黄緑色および赤色に対応している。したがって、本発明のホタルルシフェリン類似体を使用することにより、光の3原色であるRGBに対応する発光を得ることができる。また、450nmよりも短波長の青色と650nmよりも長波長の赤色は、既存のホタル生物発光系では達し得なかった発光波長領域である。
Claims (7)
- R1およびR2がそれぞれメチルであり、
R3がHであり、
XがNであり、
YがSであり、並びに、
nが0、2または3である、
請求項1に記載の複素環化合物またはその塩。 - nが0または2である、請求項1に記載の複素環化合物またはその塩。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物をATPおよびMg2+と共に含む、発光検出のためのキット。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物を発光甲虫ルシフェラーゼと反応させる工程と、該化合物からの発光を検出する工程とを含む、発光検出方法。
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