JP2009184932A - ルシフェラーゼの発光基質 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、生物学的事象および現象の可視化が重要視され、可視化対象の拡大が望まれてきている。これに伴い、標識技術にも多様化が求められている。特に分子イメージングのための標識技術は、診断および検査機器の進歩と相まって大きく発展している。たとえば、癌や心疾患などに対する個別化医療などの先端技術に応用するための標識技術が精力的に研究されている。また、計測技術の進歩に伴い、より高感度および高性能な機器や標識材料に対する需要が急速に高まっている。
多現象を観測するために、標識を利用した検出系においても、多色発光が求められている。このため、検出系に利用できる標識材料の波長域は、幅広い方が望ましい。また、生体内深部標識における用途では、短波長光よりも長波長光のほうが優れた光透過性を有するという観点から、赤色発光標識材料が望まれている。たとえば、多色発光を利用した研究には、標識として450 nm以下程度〜650 nm以上程度の波長にわたる発光を有する標識材料が準備されることが望ましい。
nm)が、東洋紡から最近市販されている。しかし、これらの発光波長だけでなく、発光波長の最短および最長の両端の波長のさらなる拡張には、潜在的需要が見込まれる。
1.プロメガ社:Chroma-Luc: 約613 nm(非特許文献1)
この系は、ヒカリコメツキ虫(クリックビートル)の突然変異体および天然型ホタル発光基質を利用した系である。
2.東洋紡績(株):MultiReporter Assay System-Tripluc:
約630 nm(非特許文献2)
この系は、鉄道虫赤色発光酵素および天然型ホタル発光基質を利用した系である。緑色発光ルシフェラーゼ(SLG、最大発光波長550nm)、橙色発光ルシフェラーゼ(SLO、580nm)および赤色発光ルシフェラーゼ(SLR、630nm)の色のルシフェラーゼ遺伝子を使用して発光色を変化させている。これは、異なる発光色を与える発光酵素を利用している。
3.東京大学:アミノルシフェリン:約610 nm(特許文献1)
これは、ルシフェリン誘導体を開示している。
4.プロメガ社:Chroma-Luc: 約480 nm(非特許文献3)
この系は、セレンテラジンおよびウミシイタケルシフェラーゼを利用した系である。
5.ATTO社:ウミホタル生物発光 約460 nm(非特許文献4)
セレンテラジン系基質およびウミホタルルシフェラーゼを利用した系である。
R1、R2およびR3は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOであり、
nは、0、1、2または3である。
当業者であれば、R1およびR2を所望の置換基と置き換えた開始物質から開始して、実施例1と同様の手順によって、D-システイン-S-トリチル由来のメチルエステル体との反応により、対応する化合物を合成することができることを理解するであろう。また、最後の工程において、チアゾリン体のメチルエステル部分を所望のエステルに置換することにより、対応するR3を有する化合物を得ることができるであろう。さらに、開始物質と指定使用するエチルエステル体のオレフィン部分の長さを変更することにより、一般式Iにおいて所望の長さのnを有する化合物を得ることができるであろう。
Resonance Energy Transfer)型発光系を構成することができる。BRET型発光系により、種々のタンパク質翻訳後修飾および遺伝子発現のバイオイメージングが可能になる。たとえば、GFPと発光甲虫ルシフェラーゼ融合タンパク質とがタンパク質プロセッシング配列を介している状態で発現される場合、融合タンパク質がプロセッシングを受けなと、GFPの緑色蛍光が検出される。逆に、融合タンパク質がプロセッシングを受けると、発光基質の青色発光が検出される。したがって、発光状態に基づいて、融合タンパク質をプロセッシングする酵素の発現についてのバイオイメージングが可能になる。また、タンパク量の測定およびタンパク質の局在化状態のバイオイメージングも可能になる。さらに、タンパク質の熟成に必要な糖鎖の付加プロセスのバイオイメージに利用することもできる。また、タンパク質/タンパク質間の相互作用等を観測するために利用することができる。
pH測定:東洋濾紙株式会社製pH試験紙UNIVを使用して測定した。また、pHメータとして、堀場社製pH/ION
METER F-23 を使用して測定した。
NMR):日本電子社製Lambda-270型装置(270 MHz)を使用して測定した。“1H NMR(測定周波数,測定溶媒):δケミカルシフト値(水素の数,
多重度, スピン結合定数)”と記載した。ケミカルシフト値(δ)はテトラメチルシラン(δ = 0)を内部基準とし、ppで表記した。多重度は、s(単一線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、m(多重線あるいは複雑に重なったシグナル)で表示し、幅広いシグナルは、brと記した。スピン結合定数(J)は、Hzで記載した。
NMR):日本電子社製Lambda-270型装置(67.8 MHz)を使用して測定した。“13C NMR(測定周波数,測定溶媒):δケミカルシフト値(多重度)”と記載した。ケミカルシフト値(δ)は、テトラメチルシラン(δ=
0)を内部基準とし、ppmで表記した。多重度は、s(単一線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)で表示した。
eV)により測定した。日本電子社製JMS-T100LC型TOF質量分析計AccuTOFを用い、エレクトロンスプレーイオン化法(ESI)により測定した。なお、装置の設定は脱溶媒ガス250
℃、オリフィス1温度80 ℃、ニードル電圧2000 V、リングレンズ電圧10 V、オリフィス1電圧85 V、オリフィス2電圧5 Vとした。サンプル送液はインフュージョン法で行い、流速10
μl/minとした。“MS(測定法)m/z 質量数(相対強度)”と記載した
比旋光度:日本分光社製DIP-1000型旋光計を使用して測定した。光源は、ナトリウムランプ、セルは円筒型ガラスセル(Φ10×100
mm)を使用した。測定値は未補正であり、データは5回測定の平均値である。それぞれD体、L体について“D or L: [α]温度 測定値(濃度, 測定溶媒)”と記載した。
分析用薄層クロマトグラフィー(TLC):E.Merck社製のTLCプレート、シリカゲル60F254(Art.5715)厚さ0.25
mmを使用した。TLC上の化合物の検出はUV照射(254 nmあるいは365 nm)および発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはp-アニスアルデヒド(9.3
ml)と酢酸(3.8 ml)をエタノール(340 ml)に溶解し、濃硫酸(12.5 ml)を添加したものを使用した。
mmを用いるか、あるいはE. Merck社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル60GF254(Art.7730)を20 cm×20
cm のガラスプレート上に、厚さ1.75 mmに調整したものを使用して行った。
反応溶液の冷却は、冷媒を満たしたジュワー瓶に反応容器を浸して行った。室温〜4℃では、氷水、4〜-90℃では、液体窒素−アセトンを冷媒として用いた。反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムまたは無水硫酸マグネシウムを加えることで行った。反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトIR120B
NAまたは陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA400 OH AGを使用した。溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下(20〜30 mmHg)、ロータリーエバポレーターを使用して行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ(約1
mmHg)を使用して行った。溶媒の混合比は全て体積比で表した。
蒸留水は、アドバンテック東洋株式会社製GS-200型蒸留水製造装置を使用して蒸留およびイオン交換処理したものを使用した。
Inc.製 99.7 ATOM%D、0.03% TMS、CD3OD:ISOTEC Inc.製 99.8 ATOM%D(〜0.7
ATOM%13C)、0.05% TMS。
ml)に溶解させ、カルベトキシメチレントリフェニルホスフォラン(621.6 mg, 1.78 mmol)を加え4.5時間加熱還流した。反応混合物を放冷した後、水(50
ml)を加え、酢酸エチル(3×50 ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー {シリカゲル192
g; ヘキサン−酢酸エチル(3:2)}にて精製し、エチルエステル体(144 mg, 99%)を黄色固体として得た。
ml)に溶解させ、1 M水酸化ナトリウム水溶液(4 ml, 4 mmol)を加えた。室温で3日撹拌した後、1 M塩酸を使用して中和した。それに水(50 ml)を加え、酢酸エチル(3×50
ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮するとカルボキシル体(137.1 mg, 58%)が黄色固体として得られた。
実施例1-3:メチルエステル1の合成
ml)に溶解させ、4 N塩化水素 1,4-ジオキサン溶液(4 ml)を加えた。室温で18日間撹拌した後、陰イオン交換樹脂 IRA400 OH AG を用いて中和した。樹脂を濾別し、得られた溶液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル44.0
g;ヘキサン−酢酸エチル(2:3)}にて精製し、メチルエステル1(421 mg, 81%)を薄黄色油状として得た。
メチルエステル1
IR (neat) 3381, 3317, 1739, 1595 cm-1
1H NMR
(270MHz, CD3OD):δ2.46(1 H, dd, J = 7.1, 12.4
Hz), 2.58(1 H, dd, J = 5.8, 12.4 Hz), 3.11(1 H, dd, J = 5.8, 7.1 Hz), 3.65(3 H,
s), 7.19-7.32(9 H, complex), 7.32-7.42(6 H, complex)
13C NMR
(67.8MHz, CD3OD):δ37.37(t), 52.62(q),
54.42(d), 67.86(s), 127.87(d), 128.97(d), 130.64(d), 145.82(s), 174.98(s)。
ml)にアルゴン雰囲気下、カルボキシル体 (81.4 mg, 0.375 mmol)、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(181
mg, 0.944 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(103 mg, 0.845 mmol)を加え、室温で18時間撹拌した。反応混合物に水(100 ml)を加え、ジエチルエーテル(3×100
ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル112 g;ヘキサン−酢酸エチル(3:
2)}にて精製し、アミド体(158 mg, 73%)を黄色油状として得た。
mg, 0.161 mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(17 μl, 0.101 mmol)を加え、室温で80分撹拌した。反応混合物に水(50
ml)を加え、クロロホルム (50 ml)、酢酸エチル(2×50 ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー{20
cm×20 cm×0.5 mm 3枚;ヘキサン−酢酸エチル (1:1)}にて精製し、チアゾリン体(17.6 mg, 74%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.00(6 H, s), 3.54(1 H, dd, J = 8.9,11
Hz), 3.57(1 H, dd, J = 8.9,11 Hz), 5.17(1 H, t, J = 8.9 Hz), 6.54(1 H, d, J =
15 Hz), 6.65-6.80(4 H, complex), 6.94(1 H, dd, J = 8.9,15 Hz) 7.36(2 H, d, J =
8.9 Hz)。
mM炭酸水素アンモニウム水溶液(6 ml)の混合溶媒に溶解させ、アルゴン雰囲気下、少量のブタ肝臓エステラーゼを加えた。36℃で25時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、その濾液を減圧濃縮して、類似体(10.2
mg, quant.)を薄黄色固体として得た。
1H NMR
(270MHz, CD3OD)
δ2.98(6 H, s), 3.54(1 H, d, J = 8.9 Hz),
3.57(1 H, d, J = 8.9 Hz), 5.19(1 H, t, J = 8.9 Hz), 6.47(1 H, d, J = 15 Hz),
6.70-7.06(5 H, complex), 7.38(2 H, d, J = 8.9 Hz)。
0.485 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(5 ml)にアルゴン雰囲気下、p-ジメチルアミノ桂皮酸(92.1 mg, 0.482 mmol)、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(196
mg, 1.02 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(124 mg, 1.02 mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物に水(100 ml)を加え、酢酸エチル(3×100
ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル181 g;ヘキサン−酢酸エチル(1:1)}にて精製し、アミド体(214
mg, 80%)を黄色油状として得た。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ2.99(6 H, s), 3.71(3 H, s), 4.78(1 H, dd, J
= 5.1,7.8 Hz), 6.05(1 H, d, J = 7.8 Hz), 6.15(1 H, d, J = 15 Hz), 6.66(1 H, d, J
= 8.6 Hz), 7.16-7.40(19 H, complex), 7.53(1 H, d, J = 15 Hz)。
mg, 0.446 mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(360 μl, 2.14 mmol)を加え、室温で40分撹拌した。反応混合物に水(50
ml)を加え、クロロホルム(50 ml)、酢酸エチル(2×50 ml)で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー{シリカゲル42
g;ヘキサン−酢酸エチル(1:2)}にて精製し、チアゾリン体(44.2 mg, 71%)を黄色固体として得た。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.00(6 H, s), 3.56(1 H, dd, J = 9.2, 11
Hz), 3.58(1 H, dd, J = 9.2, 11 Hz), 3.83(3 H, s), 5.18(1 H, t, J = 9.2 Hz),
6.67(2 H, d, J = 9.5 Hz), 6.91(1 H, d, J = 16 Hz), 7.07(1 H, d, J = 16 Hz),
7.38(2 H, d, J = 9.5 Hz)。
mM炭酸水素アンモニウム水溶液(8 ml)の混合溶媒に溶解させ、アルゴン雰囲気下、少量のブタ肝臓エステラーゼを加えた。36℃で19時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、その濾液を減圧濃縮して、類似体(15.2
mg, quant.)を橙色固体として得た。
1H NMR
(270MHz, CD3OD)
δ3.02(6 H, s), 3.57(1 H, dd, J = 8.6,11
Hz), 3.72(1 H, dd, J = 8.6,11 Hz), 5.03(1 H, t, J = 8.6 Hz), 6.73(2 H, d, J =
8.9 Hz), 6.87(1 H, d, J = 16 Hz), 7.24(1 H, d, J = 16 Hz), 7.45(2 H, d, J = 8.9
Hz)。
mg, 2.12 mmol)をエタノール (4 ml)に溶解させ、アルゴン雰囲気下、1 M水酸化ナトリウム水溶液(5 ml)を加え、80℃で5時間撹拌した。反応混合物に1
M塩酸(5ml)を加え酸性にした後、減圧濃縮した。得られた固体を濾過し、蒸留水で洗浄して類似体(50.9 mg, quant.)を黄色固体として得た。
1H NMR
(270MHz, CDCl3)
δ3.01(6 H, s), 3.50(1 H, dd, J = 9.2, 11
Hz), 3.61(1 H, dd, J = 9.2, 11 Hz), 5.00(1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.71(2 H, dd, J =
2.4, 7.0 Hz), 7.71(2 H, dd, J = 2.4, 7.0 Hz)
mg、3.43 mmol)に、ピリジニウムクロライド(30.6 g、265 mmol)を加え、アルゴン雰囲気下で20℃に加熱し、塩化ピリジニウムを融解させ30分間撹拌した。反応混合物を放冷した後、1
M塩酸(80 ml)を加え、酢酸エチル(4×60 ml)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル85
g; クロロホルム‐メタノール(10:1)}にて精製し、フェノール体13(448.8 mg、74%)を黄色固体として得た。また原料(213.4 g、1.12
mmol)を回収した。
mp 155-170 ℃ decomp.
IR(film)3178, 2225 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 7.17(1H, dd, J = 2.6, 8.9 Hz), 7.40(1H, d, J = 2.6 Hz),
7.99(1H, d, J = 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 107.00(d), 114.29(s), 119.61(d), 126.58(d), 133.91(s),
139.01(s), 147.29(s), 160.32(s)
MS(EI)m/z 176(M+・, 100), 124(5)。
mg、0.125 mmol)をメタノール:蒸留水(2:1)(3.0 ml)に溶解し、アルゴン雰囲気下、炭酸カリウム(17.0 mg、0.123 mmol)を加え、室温で30分間撹拌した。反応混合物に1
M塩酸0.2 mlを加え、酸性にした後、減圧濃縮した。得られた固体を濾過し、蒸留水で洗浄してホタルルシフェリン(1)(23.5 mg、74%)を黄色固体として得た。
1H NMR(270
MHz, DMSO-d6):δ 3.66(1H, dd, J = 8.2, 11.2 Hz), 3.67(1H, dd, J =
9.9, 11.2 Hz), 5.40(1H, dd, J = 8.2, 9.9 Hz), 7.06(1H, dd, J = 2.6, 8.9 Hz),
7.51(1H, d, J = 2.6 Hz), 7.96(1H, d, J = 8.9 Hz), 10.24(1H, br.s, OH)
13C NMR(67.8
MHz, DMSO-d6):δ 34.5(t), 78.0(d), 106.7(d), 117.0(d), 124.8(d),
137.1(s), 146.1(s), 157.3(s), 159.8(s), 164.3(s), 171.1(s)。
mg、1.93 mmol)、D‐システイン塩酸塩一水和物(1.73 g、9.82 mmol)をアルゴン雰囲気下、脱気したエタノール(5.0 ml)と1 M水酸化ナトリウム水溶液(15.0
ml)の混合溶液に溶解させ、80℃で18時間加熱撹拌した。反応混合物を放冷後、陽イオン交換樹脂を使用して中和した。樹脂を濾別し得られた溶液に水(80 ml)を加え、酢酸エチル(3×130
ml)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、類似体(388.2 mg、90%)を無色固体として得た。
mp 200-204 ℃ decomp.
IR(film)3066, 1652, 1583 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.70(1H, dd, J = 7.9, 11.5 Hz), 3.76(1H, dd, J = 8.9,
11.5 Hz), 5.23(1H, dd, J = 7.9, 8.9 Hz), 6.85(2H, d, J = 8.9 Hz), 7.74(2H, d, J
= 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 35.95(t), 77.97(d), 116.53(d)×2, 124.48(s), 131.80(d)×2,
163.00(s), 173.94(s), 174.63(s)
MS(EI)m/z 223(M+・, 44), 178(100),
137(43), 119(46)
Optical rotation:L:
[α]25 -1.0600°(c = 1.2000, CH3OH)、D: [α]22
+6.6979°(c = 0.7692, CH3OH)。
mg, 2.57 mmol)をメタノール(200 ml)に溶解させ、4 N塩化水素1,4‐ジオキサン溶液(10 ml, 40 mmol)を加えた。室温で2日間撹拌した後、陰イオン交換樹脂IRA400
OH AGを使用して中和した。樹脂を濾別し、得られた溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル85 g; ヘキサン‐酢酸エチル(2:1)→
クロロホルム‐メタノール(10:1)}にて精製し、エステル体15(414.6 mg、43%)を薄黄色油状物として得た。
IR(neat)3381, 3315, 1739, 1595 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.47(1H, dd, J = 7.7, 12.4 Hz), 2.60(1H, dd, J = 4.8,
12.4 Hz), 3.20(1H, br.dd, J = 4.8, 7.7 Hz), 3.65(3H, s), 7.18-7.31(9H, complex),
7.40-7.45(6H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 36.90(t), 52.16(q), 53.78(d), 66.83(s), 126.76(d)×3,
127.94(d)×6, 129.57(d)×6, 144.51(s)×3, 174.18(s)
MS(FAB)m/z 378(M+H+, 10), 243(100)。
mg、1.55 mmol)のジクロロメタン溶液(20 ml)に、無水酢酸(0.5 ml、5.3 mmol)、4‐ジメチルアミノピリジン(572.0 mg、4.68
mmol)を加えた。室温にて4時間撹拌した後、反応混合物に1 M塩酸(40 ml)を加え、ジクロロメタン(1×50 ml)、酢酸エチル(2×50 ml)で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル200
g; ヘキサン‐酢酸エチル(2:1)}にて精製し、アセチル体16(303.4 mg、95%)を無色結晶として得た。
mp 182-183℃
IR(film)3050, 1743, 1680, 1630 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.33(3H, s), 6.41(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.15(2H, d, J =
8.7 Hz), 7.58(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.77(1H, d, J = 16.0 Hz)
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 2.28(3H, s), 6.47(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.14(2H, d, J =
8.6 Hz), 7.58-7.64(3H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 20.95(q), 120.99(d), 123.37(d)×2, 130.20(d)×2, 133.86(s),
144.18(d), 153.60(s), 170.85(s), 171.23(s)
MS(EI)m/z 206(M+・, 14), 164(100),
147(20), 119(12), 92(14)。
mg、0.435 mmol)のN,N‐ジメチルホルムアミド溶液(80 ml)にアルゴン雰囲気下、アセチル体16(109.4 mg、0.531 mmol)、塩酸1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(252.6
mg、1.32 mmol)、4‐ジメチルアミノピリジン(166.4 mg、1.36 mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物に水(100 ml)を加え、ジエチルエーテル(3×180
ml)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー{シリカゲル245 g; ヘキサン‐酢酸エチル(2:1)}にて精製し、アミド体17(111.4
mg、37%)を薄黄色油状物として得た。
IR(neat)3282, 1763, 1743, 1662, 1626 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.32 (3H, s), 2.70(1H, dd, J = 4.8, 12.4 Hz), 2.78(1H,
dd, J = 5.4, 12.4 Hz), 3.74(3H, s), 4.58(1H, ddd, J = 4.8, 5.4, 7.7 Hz), 6.10(1H,
d, J = 7.7 Hz), 6.30(1H, d, J = 15.7 Hz), 7.12(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.18-7.31(9H,
complex), 7.37-7.41(6H, complex), 7.52(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.57(1H, d, J = 15.7
Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.16(q), 33.94(t), 51.20(d), 52.74(q), 67.00(s),
120.04(d), 122.09(d)×2, 126.94(d)×3, 128.04(d)×6, 129.00(d)×2, 129.49(d)×6,
132.38(s), 140.78(d), 144.27(s)×3, 151.77(s), 165.07(s), 169.25(s), 170.93(s)
MS(FAB)m/z 566(M+H+, 1), 243(100)
Optical rotation :L: [α]19
-4.3639°(c = 13.946, CHCl3)、D: [α]19 +2.1802°(c = 5.3462,
CHCl3)。
mg、0.164 mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(50 μl、0.297 mmol)を加え、室温で45分間撹拌した。反応混合物に水(40 ml)を加え、クロロホルム(1×60
ml)、酢酸エチル(2×60 ml)で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー{20 cm×20
cm×0.5 mm×4枚; ヘキサン‐酢酸エチル(1: 1)}にて精製し、チアゾリン体18(19.6 mg、82%)を無色固体として得た。
mp 118-121℃
IR(film)1757, 1724 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.31(3H, s), 3.58(1H, dd, J = 9.3, 11.2 Hz), 3.65(1H,
dd, J = 9.1, 11.2 Hz), 3.85(3H, s), 5.22(1H, dd, J = 9.1, 9.3 Hz), 7.04(1H, d, J
= 16.1 Hz), 7.12(2H, d, J = 8.6 Hz), 7.13(1H, d, J = 16.1 Hz), 7.51(2H, d, J =
8.6 Hz)、13C NMR(67.8 MHz, CDCl3):δ 21.15(q), 34.64(t),
52.89(q), 77.96(d), 122.15(d)×2, 122.42(d), 128.69(d)×2, 132.75(s), 141.094(d),
151.66(s), 169.20(s), 170.01(s), 171.17(s)、MS(EI)m/z 305(M+・, 44),
263(88), 205(100), 177(69), 163(15), 145(87)、Optical rotation:L: [α]22
+9.0924°(c = 2.9308, CHCl3)、D: [α]22 -10.9198°(c =
0.4077, CHCl3)。
mg、quant.)を黄色結晶として得た。
mp 138-140 ℃ decomp.
IR(film)3151, 1626, 1568 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.52(1H, dd, J = 8.9, 10.9 Hz), 3.61(1H, dd, J = 8.9,
10.9 Hz), 5.01(1H, t, J = 8.9 Hz), 6.80(2H, d, J = 8.9 Hz), 6.91(1H, d, J =
16.0 Hz), 7.10(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.42(2H, d, J = 8.9 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 36.54(t), 81.19(d), 116.86(d)×2, 119.72(d), 128.00(s),
130.52(d)×2, 143.65(d), 160.70(s), 171.97(s), 177.53(s)
MS(EI)m/z 248(M+-H, 100), 204(57),
177(59), 163(4), 145(1)
Optical rotation:L: [α]23 +2.2244°(c
= 1.2462, CH3OH)、D: [α]23 -2.3653°(c = 0.4769, CH3OH)。
g、11.0 mmol)のジクロロメタン溶液(200 ml)に、無水酢酸(4.0 ml、42 mmol)、4‐ジメチルアミノピリジン(6.70 g、54.8
mmol)を加えた。室温にて4時間撹拌した後、反応混合物に水(150 ml)を加え、ジクロロメタン(1×100 ml)、酢酸エチル(2×80 ml)で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー{シリカゲル200
g; ヘキサン‐酢酸エチル(2:1)}にて精製し、アセチル体19(1.28 mg、71%)を無色結晶として得た。
mp 140-142℃、IR(film)3037, 1761, 1687, 1631
cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.30(3H,s), 6.44(1H, br.d, J = 15.6 Hz), 7.10-7.35(3H,
complex), 7.71(1H, br.d, J = 15.6 Hz)
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 2.28(3H, s), 6.49(1H, d, J = 16.0 Hz), 7.12(1H, d, J =
7.4 Hz), 7.34-7.46(3H, complex), 7.63(1H, d, J = 16.0 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 20.91(q), 121.03(d), 122.06(d), 124.55(d), 12126.64(d),
130.91(d), 137.45(s), 144.75(s), 152.66(s), 170.47(br.s), 170.99(s)
MS(EI)m/z 206(M+・, 26), 164(100),
147(23), 119(6), 91(10)。
mg、0.645 mmol)、塩酸1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(181.2 mg、0.945 mmol)、4‐ジメチルアミノピリジン(197.2
mg、1.61 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応混合物に水(250 ml)を加え、ジエチルエーテル(4×200 ml)で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー{シリカゲル200
g; ヘキサン‐酢酸エチル(3:2)}、更に分取薄層クロマトグラフィー{20 cm×20 cm×0.5 mm×4枚; クロロホルム‐酢酸エチル(5: 1)}にて精製し、アミド体20(159.3
mg、89%)を薄黄色油状物として得た。
IR(neat)3283, 1764, 1739, 1663, 1624 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.31(3H,s), 2.70(1H, dd, J = 4.8, 12.5 Hz), 2.78(1H,
dd, J = 5.4, 12.5 Hz), 3.72(3H, s), 4.75(1H, ddd, J = 4.8, 5.4, 7.9 Hz), 6.18(1H,
br.d, J = 7.9 Hz), 6.33(1H, d, J = 15.6 Hz), 7.09(1H, dt, J = 2.1, 7.1 Hz),
7.17-7.41(18H, complex), 7.55(1H, d, J = 15.6 Hz)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.15(q), 33.88(t), 51.22(d), 52.72(q), 66.97(s),
120.61(d), 121.03(d), 122.94(d), 125.45(d), 126.92(d)×3, 128.02(d)×6, 129.47(d)×6,
129.82(d), 136.26(s), 140.70(d), 144.25(s)×3, 151.01(s), 164.88(s), 169.31(s),
170.88(s)
MS(FAB)m/z 566(M+H+, 1), 243(100)
Optical rotation:L: [α]23
-3.3299°(c = 12.254, CHCl3)、D: [α]23 +4.1534°(c = 7.9231,
CHCl3)。
mg、2.72 mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(0.70 ml、4.16 mmol)を加え、室温で5分間撹拌した。反応混合物に水(50)を加え、クロロホルム(3×50
ml)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー{20 cm×20 cm×1.75 mm×2枚; ヘキサン‐酢酸エチル(1:
2)}にて精製し、チアゾリン体21(93.6 mg、36%)を無色油状物として得た。
IR(neat)1768, 1743, 1633 cm-1
1H NMR(270
MHz, CDCl3):δ 2.32(3H,s), 3.58(1H, dd, J = 9.2, 11.2 Hz), 3.65(1H,
dd, J = 9.2, 11.2 Hz), 3.82(3H, s), 5.22(1H, t, J = 9.2 Hz), 7.06-7.10(3H,
complex), 7.21(1H, m), 7.34-7.42(2H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CDCl3):δ 21.13(q), 34.65(t), 52.89(q), 77.99(d), 120.62(d),
122.85(d), 123.23(d), 124.91(d), 129.89(d), 136.60(s), 141.07(d), 151.06(s),
169.27(s), 169.84(s), 171.13(s)
MS(EI)m/z 305(M+・, 31), 246(100),
204(86)
Optical rotation:L: [α]26
+6.2401°(c = 0.6923, CHCl3)、D: [α]18 -5.5608°(c = 1.1538,
CHCl3)。
mmol)を、エタノール(4 ml)と10 mM炭酸水素アンモニウム水溶液(16 ml)の混合溶媒に溶解させ、アルゴン雰囲気下、少量のブタ肝臓由来エステラーゼを加えた。35℃で20時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、その濾液を減圧濃縮して、類似体9(34.6
mg、quant.)を黄色結晶として得た。
mp 163-165 ℃ decomp.
IR 3180, 1583, 1628 cm-1
1H NMR(270
MHz, CD3OD):δ 3.54(1H, dd, J = 8.9, 10.9 Hz), 3.63(1H, dd, J = 9.2,
10.9 Hz), 5.05(1H, dd, J = 8.9, 9.2 Hz), 6.79(1H, ddd, J = 1.0, 2.3, 7.9 Hz),
6.99-7.23(5H, complex)
13C NMR(67.8
MHz, CD3OD):δ 36.53(t), 81.23(d), 114.66(d), 118.12(d), 120.44(d),
122.89(d), 131.02(d), 137.82(s), 143.45(d), 159.13(s), 171.45(s), 177.05(s)
MS(EI)m/z 249(M+・, 15), 204(98),
145(100)。
生物発光スペクトルの測定
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent 1100 series HPLC
を使用した。装置の内訳は、デガッサー、クォータナリポンプ、マニュアルインジェクター、カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器、蛍光検出器、ケミステーション(PC用ソフトウェア)である。用いたカラムはダイセル化学工業株式会社製CHIRALCEL
OD-RH(内径 0.46 cm、長さ 15 cm)である。
堀場製作所製F-23型ガラス電極式水素イオン濃度指示計を使用して行った。
ATTO株式会社製Luminescencer-PSN AB-2200を使用して測定した。
ATTO株式会社製微弱発光蛍光スペクトル装置AB-1850を使用して測定した。測定したスペクトルは全て検出器の特性を補正したスペクトルである。
超純水は、MILLIPORE製Milli-RX12αから採水したものを使用した
メタノール、t-ブタノールは、関東化学株式会社製の特級溶媒を使用した。
基質溶液
基質を電子天秤で秤量し希釈した。溶媒として、生物発光の測定の場合はリン酸緩衝液(50
mM, pH 6.0)を、化学発光測定の場合はt-ブタノールを使用した。
ルシフェラーゼを1 μg/μlになるようにTris-HCl緩衝液(50 mM, pH8.0)で希釈し小分けにした。これをストック溶液とし、必要量をその都度希釈して用いた。なお、ストック溶液は-80 ℃の冷凍庫に保存した。
ATP-Mgを超純水で希釈した。
200μLポリスチレンチューブ内で、リン酸カリウム緩衝液(0.5 M, pH 8.0, 20μl)基質溶液(2.5 mM, 20 μl)、酵素溶液(20μl)、次いでATP-Mg溶液(10 mM, 40μl)を混合して発光スペクトル測定を行った。酵素溶液の濃度は、17μ Mのものを使用した。ただし、ホタルルシフェリン(1)は、1.7μM、フェノール型ルシフェリンは、170μ Mの酵素をそれぞれ使用した。また、発光スペクトル測定の露光時間は、60秒とした。ただし、ホタルルシフェリンは、5秒で行った。
上記実験より本発明のホタルルシフェリン類似体II、IIIおよびIVは、445nm、565nmおよび680nmの発光を生じる基質であることが明らかとなった(図1を参照されたい)。一方、アニリン型ではなく、フェノール型のホタルルシフェリン類似体に関しては、類似体9は発光しなかった。また、類似体7および類似体8は、それぞれ415nmと520nmの発光波長に発光活性があった(図2を参照されたい)。
上記式II、IIIおよびIVの化合物は、図1に示したように、それぞれ青色、黄緑色および赤色に対応している。したがって、本発明のホタルルシフェリン類似体を使用することにより、光の3原色であるRGBに対応する発光を得ることができる。また、450nmよりも短波長の青色と650nmよりも長波長の赤色は、既存のホタル生物発光系では達し得なかった発光波長領域である。
Claims (6)
- R1、R2およびR3がそれぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
XがNであり、
YがSであり、並びに、
nが0、1、2または3である、
請求項1に記載の複素環化合物またはその塩。 - R1およびR2がそれぞれメチルであり、
R3がHであり、
XがNであり、
YがSであり、並びに、
nが0、1、2または3である、
請求項1に記載の複素環化合物またはその塩。 - nが0、1または2である、
請求項1に記載の複素環化合物またはその塩。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物をATPおよびMg2+と共に含む、発光検出のためのキット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を発光甲虫ルシフェラーゼと反応させる工程と、該化合物からの発光を検出する工程とことを含む、発光検出方法。
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