JP2002080476A - Ｄ−ルシフェリン類縁体並びにルシフェラーゼ活性分析用試薬及びａｔｐ分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 溶液中においても長期に保存可能であるＤ−
ルシフェリン類縁体、並びに溶液状でも長期に保存可能
なルシフェラーゼ活性分析用試薬及びＡＴＰ分析用試薬
を提供する。 【解決手段】 一般式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリ
ン類縁体［具体的には、例えば、（Ｓ）−２−（６−ヒ
ドロキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル）
−２−チアゾリン−４−カルボン酸］。前記ルシフェラ
ーゼ活性分析用試薬及びＡＴＰ分析用試薬は、前記一般
式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体を含有す
る。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規のＤ−ルシフ
ェリン類縁体、並びにルシフェラーゼ活性分析用試薬及
びＡＴＰ分析用試薬に関する。本明細書における「分
析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検
出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定
する「測定」とが含まれる。

【０００２】

【従来の技術】蛍の発光は、発光収率が高く、少ないエ
ネルギーで強い発光を示すことから、従来から種々の分
析に用いる努力がなされてきた。この発光反応が、酵素
であるルシフェラーゼ、基質であるルシフェリン、並び
にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＭｇイオンの存在
により起こることが解明されたことによって、初期に
は、ＡＴＰの高感度測定に用いる検討が精力的になされ
た。この場合には、ＡＴＰが測定対象物質であるため、
発光反応に必要な他の成分、すなわち、ルシフェラー
ゼ、ルシフェリン、及びＭｇイオン等の混合物を試薬化
し、被検サンプルに前記試薬を加えて起こる発光反応
を、光電子倍増管を備えた発光検出器で測定する方法が
採られた。

【０００３】前記ＡＴＰ測定用試薬の原料としては、蛍
をすりつぶして得られる抽出液が用いられていたが、そ
の抽出液は安定性が悪く、従って、同じ量のＡＴＰを測
定しても、試薬調製後の時間経過に伴い、発光反応が弱
くなることが知られていた。この現象を分析した結果、
この不安定性の原因は、酵素であるルシフェラーゼ、及
び基質であるルシフェリンの両者が不安定であるために
起こっていることが解明された。このように、前記ＡＴ
Ｐ測定用試薬は、不安定な酵素と基質との組み合わせで
構成されているため、試薬を凍結乾燥して保存し、測定
直前に溶解するという使用上の制約があり、従って、こ
の測定技術は広く使われるには至らなかった。

【０００４】最近、遺伝子操作の技術が進歩し、蛍ルシ
フェラーゼの遺伝子配列に変異を加え、安定なリコンビ
ナントルシフェラーゼを調製することが可能となってき
た。この技術により試薬の一方の成分である酵素の安定
化が飛躍的に向上したが、基質であるルシフェリンの安
定化については対策のないままであった。

【０００５】試薬のもう一方の成分であるＤ−ルシフェ
リンは、式（II）：

【化２】 で表される化合物であり、北アメリカ産ホタルからマッ
ケルロイ（ＭｃＥｌｒｏｙ）らによって１９５７年に単
離され、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らによって１９６１年
に構造決定が行われた。その生合成は、キノンとＤ−シ
ステインとを出発材料にして行われると考えられ、更
に、Ｌ体は発光しないことが知られている。発光反応に
は、チアゾリン環のカルボキシル基が関与し、ジオキセ
タン構造を経由して発光反応が起こると考えられてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】天然のＤ−ルシフェリ
ンは、発光反応に最適な弱アルカリ性溶液中では安定性
に乏しく、溶液状試薬の長期使用という目的には適さな
い。本発明者は、ルシフェリン類縁体について鋭意研究
を重ね、以前にも、天然のルシフェリン分子が有する２
つのイオウ原子の一方又は両方を酸素原子に置換したベ
ンゾオキサゾール型Ｄ−ルシフェリン類縁体について報
告している。本発明者は、別のルシフェリン類縁体につ
いて更に鋭意研究を重ねたところ、天然のルシフェリン
分子が有するベンゾチアゾール環のイオウ原子を、窒素
原子又は置換された窒素原子に置き換えることにより、
溶液中でも長期に保存可能である新規のルシフェリン類
縁体を新たに見出した。本発明は、こうした知見に基づ
くものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、一般式
（Ｉ）：

【化３】 ［式中、Ｙは、−Ｓ−、−Ｏ−、又は−Ｎ（Ｒ²）−で
あり；Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立に、水素原子、ベン
ジル基、又は炭素原子数１〜４のアルキル基である］で
表されるＤ−ルシフェリン類縁体に関する。また、本発
明は、一般式（Ｉ）で表されるルシフェリン類縁体を含
有することを特徴とする、ルシフェラーゼ活性分析用試
薬及びＡＴＰ分析用試薬にも関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】前記一般式（Ｉ）において、炭素
原子数１〜４のアルキル基には、直鎖状アルキル基及び
分枝状アルキル基の両方が含まれ、例えば、メチル基、
エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、ｓ−ブチル基、又はｔ−ブチル基を挙げることが
できる。前記アルキル基としては、炭素原子数１〜２が
好ましく、メチル基が特に好ましい。

【０００９】本発明においては、前記一般式（Ｉ）にお
いて、Ｒ¹及びＹの組合せが、水素原子及び−Ｓ−、ベ
ンジル基及び−Ｓ−、メチル基及び−Ｓ−、エチル基及
び−Ｓ−、プロピル基及び−Ｓ−、ブチル基及び−Ｓ
−、又はイソプロピル基及び−Ｓ−の各組み合せである
Ｄ−ルシフェリン類縁体が好ましく、メチル基及び−Ｓ
−の組み合わせであるＤ−ルシフェリン類縁体が特に好
ましい。

【００１０】本発明による一般式（Ｉ）で表されるＤ−
ルシフェリン類縁体の調製方法は、特に限定されるもの
ではないが、例えば、一般式（IV）：

【化４】 （式中、Ｒ¹は、前記と同じ意味である）で表される化
合物と、一般式（Ｖ）：

【化５】 ［式中、Ｙは、前記と同じ意味である］で表される化合
物とを、適当な溶媒（例えば、メタノール−水混合溶
媒）中に溶解し、適当なｐＨ調整剤（例えば、炭酸カリ
ウム）の存在下にて、室温で反応させることにより、調
製することができる。

【００１１】本発明の分析用試薬は、ルシフェラーゼの
基質である一般式（Ｉ）で表される本発明のＤ−ルシフ
ェリン類縁体を少なくとも含有する限り、特に限定され
るものではなく、その分析対象物質に応じて、その構成
成分を適宜決定することができる。

【００１２】本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬
は、ルシフェラーゼが関与する発光反応に必要な各種成
分（但し、分析対象であるルシフェラーゼを除く）の全
部又は一部を含有することができ、少なくとも、基質で
ある一般式（Ｉ）で表される本発明のＤ−ルシフェリン
類縁体を含有する。ルシフェラーゼが関与する前記発光
反応には、酵素であるルシフェラーゼと、ルシフェラー
ゼの基質となることができる一般式（Ｉ）で表されるＤ
−ルシフェリン類縁体と、発光反応に必須なアデノシン
三リン酸（ＡＴＰ）及びＭｇイオンとが必要である。従
って、本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬は、一般
式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体を少なくと
も含有し、それ以外に、例えば、ＡＴＰ及び／又はＭｇ
イオンを含有することができる。

【００１３】また、本発明のルシフェラーゼ活性分析用
試薬は、前記の各成分のみからなることもできるし、あ
るいは、適当な緩衝液［例えば、グッド緩衝剤（例え
ば、ＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｃｉｎｅ）］を更に含有する
こともできる。本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬
が、緩衝液を含有する場合には、緩衝液以外の成分と緩
衝液とを別々の状態で保存し、分析に用いる直前に混合
して使用することもできるし、あるいは、緩衝液以外の
成分と緩衝液とを予め混合した状態で保存し、そのま
ま、分析に用いることもできる。本発明のルシフェラー
ゼ活性分析用試薬においては、溶液中でも長期に保存可
能な一般式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体を
含有するので、緩衝液以外の成分と緩衝液とを予め混合
した状態でも長期に保存することが可能である。

【００１４】本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬に
おける各成分の濃度は、これに限定されるものではない
が、一般式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体に
関しては、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃
度であることが好ましく、ＡＴＰに関しては、５ｍｍｏ
ｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好まし
く、Ｍｇイオンに関しては、２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００
ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好ましい。

【００１５】本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬に
おいては、例えば、分析対象であるルシフェラーゼを含
有する（あるいは、含有する可能性のある）被検試料
と、本発明のルシフェラーゼ活性分析用試薬とを混合す
ることにより生じる発光を、適当な分析手段（例えば、
発光検出器）で検出又は測定することにより、被検試料
中のルシフェラーゼ活性を分析することができる。

【００１６】また、本発明のＡＴＰ分析用試薬は、ルシ
フェラーゼが関与する発光反応に必要な各種成分（但
し、分析対象であるＡＴＰを除く）の全部又は一部を含
有することができ、少なくとも、基質である一般式
（Ｉ）で表される本発明のＤ−ルシフェリン類縁体を含
有する。従って、本発明のＡＴＰ分析用試薬は、一般式
（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体を少なくとも
含有し、それ以外に、例えば、ルシフェラーゼ及び／又
はＭｇイオンを含有することができる。

【００１７】本発明のＡＴＰ分析用試薬においては、前
記ルシフェラーゼとして、天然型である蛍ルシフェラー
ゼを用いることもできるし、あるいは、遺伝子組換え技
術により得られる組換え型ルシフェラーゼを用いること
もできる。前記組換え型ルシフェラーゼとしては、例え
ば、平家ボタルの熱安定型変異種の遺伝子を大腸菌にお
いて発現させて得られるルシフェラーゼ（例えば、キッ
コーマン社のルシフェラーゼ）を挙げることができる。

【００１８】また、本発明のＡＴＰ分析用試薬は、前記
の各成分のみからなることもできるし、あるいは、適当
な緩衝液［例えば、グッド緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ
又はＴｒｉｃｉｎｅ）］を更に含有することもできる。
本発明のＡＴＰ分析用試薬が、緩衝液を含有する場合に
は、緩衝液以外の成分と緩衝液とを別々の状態で保存
し、分析に用いる直前に混合して使用することもできる
し、あるいは、緩衝液以外の成分と緩衝液とを予め混合
した状態で保存し、そのまま、分析に用いることもでき
る。本発明のＡＴＰ分析用試薬においては、溶液中でも
長期に保存可能な一般式（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェ
リン類縁体を含有するので、緩衝液以外の成分と緩衝液
とを予め混合した状態でも長期に保存することが可能で
ある。

【００１９】本発明のＡＴＰ分析用試薬における各成分
の濃度は、これに限定されるものではないが、一般式
（Ｉ）で表されるＤ−ルシフェリン類縁体に関しては、
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であるこ
とが好ましく、ルシフェラーゼに関しては、１０^-14ｍ
ｏｌ／Ｌ〜１０^-8ｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好まし
く、Ｍｇイオンに関しては、２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００
ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好ましい。

【００２０】本発明のＡＴＰ分析用試薬においては、例
えば、分析対象であるＡＴＰを含有する（あるいは、含
有する可能性のある）被検試料、あるいは、各種酵素反
応を経て生成されるＡＴＰを含有する（あるいは、含有
する可能性のある）被検試料と、本発明のＡＴＰ分析用
試薬とを混合することにより生じる発光を、適当な分析
手段（例えば、発光検出器）で検出又は測定することに
より、被検試料中のＡＴＰ量を分析することができる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の各調製実施例１〜１０は、図１に示す合成経
路に従って実施した。なお、以下の各調製実施例の各標
題において各化合物の直後に記載した括弧内の数字は、
図１において各化合物の構造式に付与されている式番号
を意味する。また、図１及び後述する図２において、記
号「Ｂｎ」はベンジル基を意味し、以下、同様に、記号
「Ａｃ」はアセチル基を、記号「Ｍｅ」はメチル基を、
記号「ＴＢＤＭＳ」はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
基を、そして、記号「ＮＯＥ」は核オーヴァーハウザー
効果をそれぞれ意味する。

【００２２】

【調製実施例１】《３−クロロ−４−ニトロフェノール
（１）の合成》ベントナイト及び硝酸鉄９水和物から調
製したクレイフェン（３．５ｇ）のジエチルエーテル
（Ｅｔ₂Ｏ）懸濁液（５０ｍＬ）に、ｍ−クロロフェノ
ール（１００ｍｇ，０．７７８ｍｍｏｌ）を加え、室温
で２８時間撹拌した。反応液を塩化メチレンで希釈し、
一晩静置した後に、セライト濾過し、濾液を水及び飽和
食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘ
キサン＝１：５）により精製し、標記化合物（６９．０
ｍｇ，５１％）を淡黄色結晶として得た。得られた標記
化合物の理化学的物性は以下のとおりである。 融点：１２２〜１２４℃（文献値：１２１〜１２２℃） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３３２５，３１０１，１５９
６，１５０８，１４３３，１３５５，１２４５，１０４
１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：６．８３（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９，３Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３Ｈ
ｚ），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：１１４．９，１
１７．７，１２７．９，１２８．６，１３８．６，１６
２．２ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：１７３（Ｍ⁺，１００），
１４３（６３），９９（５１） 元素分析： 計算値（Ｃ₆Ｈ₄ＮＯ₃Ｃｌとして）：Ｃ，４１．５２；
Ｈ，２．３２；Ｎ，８．０７；Ｃｌ，２０．４３ 実測値：Ｃ，４１．５３；Ｈ，２．４４；Ｎ，８．０
３；Ｃｌ，２０．３４

【００２３】

【調製実施例２】《３−ベンジルアミノ−４−ニトロフ
ェノール（２）の合成》前記調製実施例１で調製した３
−クロロ−４−ニトロフェノール（２．８１ｇ，１６．
２ｍｍｏｌ）をベンジルアミン（１３．３ｍＬ，１２１
ｍｍｏｌ）に溶解させ、８０℃で７日間攪拌した。反応
液に５％塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を
水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧留去し
た。残渣を酢酸エチル−ヘキサンより再結晶し、標記化
合物（２．５５ｇ，６４％）を橙色結晶として得た。得
られた標記化合物の理化学的物性は以下のとおりであ
る。融点：１９５〜１９８℃（酢酸エチル−ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３１９５，１６２７，１５７
８，１５２５，１３９５，１３０４，１１７５¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ
＝５Ｈｚ），６．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．
１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．３０−７．
４０（５Ｈ，ｍ），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ），８．６３（１Ｈ，ｂｒｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：４５．８，９
７．６，１０６．３，１２４．９，１２６．８，１２
６．９，１２８．５，１２８．９，１３８．２，１４
７．４，１６４．５ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２４４（Ｍ⁺，４１），９
１（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₃Ｈ₁₂Ｎ₂Ｏ₃として）：Ｃ，６３．９３；
Ｈ，４．９５；Ｎ，１１．４７ 実測値：Ｃ，６３．８２；Ｈ，４．９５；Ｎ，１１．３
６

【００２４】

【調製実施例３】《４−ベンジルアミノ−４−ニトロフ
ェニル酢酸（３）の合成》前記調製実施例２で調製した
３−ベンジルアミノ−４−ニトロフェノール（１．５
ｇ，６．１４ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１０ｍＬ）
に、０℃で無水酢酸［（ＡｃＯ）₂Ｏ］（８６９μＬ，
９．２１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で６．５時間攪拌し
た。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢
酸エチルで抽出し、５％ＨＣｌ水溶液、水、及び飽和食
塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧蒸留し、標記化合
物（１．７３ｇ，９８％）を橙色結晶として得た。得ら
れた標記化合物の理化学的物性は以下のとおりである。 融点：１１５〜１１６℃（酢酸エチル） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３３８２，１７６６，１６２
７，１５７５，１５０２，１２５２，１１９３¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：２．２８（３Ｈ，ｓ），
４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．４４（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ），６．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２
Ｈｚ），７．２９−７．４１（５Ｈ，ｍ），８．２３
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｂｒ
ｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：２１．３，４７．
３，１０６．１，１０９．９，１２７．８，１２８．
６，１２８．９，１３６．６，１４６．３，１５６．
６，１６８．２ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２８６（Ｍ⁺，４２），２
２６（４４），１０５（８７），９１（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₁₄Ｎ₂Ｏ₄として）：Ｃ，６２．９３；
Ｈ，４．９３；Ｎ，９．７９ 実測値：Ｃ，６２．９０；Ｈ，４．９６；Ｎ，９．７２

【００２５】

【調製実施例４】《４−アセチルアミノ−３−ベンジル
アミノフェニル酢酸（５）の合成》ＰｔＯ₂（３０ｍ
ｇ）のエタノール（ＥｔＯＨ）−テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）（１：１）溶液（３ｍＬ）を、室温常圧にて
水素気流下で２時間攪拌した。前記調製実施例３で調製
した４−ベンジルアミノ−４−ニトロフェニル酢酸（４
００ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ−ＴＨＦ
（１：１）溶液（３ｍＬ）を滴下し、室温常圧にて水素
気流下で更に６時間攪拌した。触媒を濾去した後、濾液
を減圧濃縮し、得られた４−アミノ−３−ベンジルアミ
ノフェニル酢酸（図１において式４で表される化合物）
を精製することなく次の反応に用いた。

【００２６】４−アミノ−３−ベンジルアミノフェニル
酢酸を含む残渣をピリジン（５ｍＬ）に溶解し、０℃で
無水酢酸（１１８μＬ，１．２５ｍｍｏｌ）を滴下し、
室温で４時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチル
で抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄した。乾燥後、溶媒
を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）により精製し、
標記化合物（３４０ｍｇ，８２％）を無色針状晶として
得た。得られた標記化合物の理化学的物性は以下のとお
りである。 融点：１７０．５〜１７２℃（酢酸エチル） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３２５６，３０３８，２８５
８，１７５５，１６５３，１６０８，１５２０，１４２
８，１３７１，１３０３，１２２０，１１６４，１０１
４¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：２．０５（３Ｈ，
ｓ），２．１７（３Ｈ，ｓ），４．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），６．
１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．２７（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝８，２Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈ
ｚ），７．１９−７．３７（５Ｈ，ｍ），９．１８（１
Ｈ，ｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：２０．９，２
３．３，４６．１，１０４．０，１０８．２，１２０．
９，１２６．６，１２６．７，１２８．２，１３９．
４，１４３．６，１４９．０，１６８．７，１６８．９ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２９８（Ｍ⁺，９７），２
１３（６０），１９７（６２），９１（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₇Ｈ₁₈Ｎ₂Ｏ₃として）：Ｃ，６８．４４；
Ｈ，６．０８；Ｎ，９．３９ 実測値：Ｃ，６８．４３；Ｈ，６．０９；Ｎ，９．４２

【００２７】

【調製実施例５】《６−アセトキシ−１−ベンジル−２
−メチルベンズイミダゾール（６）の合成》前記調製実
施例４で調製した４−アセチルアミノ−３−ベンジルア
ミノフェニル酢酸（２４８ｍｇ，０．８３１ｍｍｏｌ）
のベンゼン溶液（３０ｍＬ）に、ｐ−トルエンスルホン
酸１水和物（ｐ−ＴｓＯＨ・Ｈ₂Ｏ）（３９．５ｍｇ，
０．２０８ｍｍｏｌ）を加え、ディーン−スターク（Ｄ
ｅａｎ−Ｓｔａｒｋ）蒸留器により５日間加熱還流し
た。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、及び
飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧留去した。残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチ
ル：ヘキサン＝４：１）により精製し、標記化合物（２
２４ｍｇ，９６％）を無色針状晶として得た。得られた
標記化合物の理化学的物性は以下のとおりである。 融点：１３０−１３２℃（エチル酢酸） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３０６８，２９４８，１７５
７，１４５３，１３７１，１２１１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：２．２８（３Ｈ，ｓ），
２．５３（３Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
８，２Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），
７．０１−７．０４（２Ｈ，ｍ），７．２６−７．３３
（３Ｈ，ｍ），７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：１４．０，２１．
１，４７．１，１０２．７，１１６．０，１１９．４，
１２６．１，１２７．９，１２９．０，１３５．４，１
４０．４，１４６．２，１５２．７，１６９．８， ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２８０（Ｍ⁺，４７），２
３８（１００），９１（９７） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₇Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₂として）：Ｃ，７２．８４；
Ｈ，５．７５；Ｎ，９．９９ 実測値：Ｃ，７２．６８；Ｈ，５．８２；Ｎ，９．９８

【００２８】

【調製実施例６】《１−ベンジル−６−ヒドロキシ−２
−メチルベンジルイミダゾール（７）の合成》炭酸ナト
リウム（１．４４ｇ）及び炭酸水素ナトリウム（１．６
２ｇ）の懸濁液（１５ｍＬ）に、前記調製実施例５で調
製した６−アセトキシ−１−ベンジル−２−メチルベン
ズイミダゾール（１５０ｍｇ，０．５３５ｍｍｏｌ）の
メタノール（ＭｅＯＨ）溶液（９ｍＬ）を滴下し、室温
で８０分間攪拌した。メタノールを減圧留去後、飽和シ
ュウ酸水を加え酸性にし、酢酸エチルで抽出した。有機
層を水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧留
去し、標記化合物（１１０ｍｇ，８６％）を無色針状晶
として得た。得られた標記化合物の理化学的物性は以下
のとおりである。 融点：２５６〜２６０℃（メタノール−エチル酢酸） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３０３８，１６２９，１４８
７，１４０７，１２４５，１２０５，１１３８，１１０
６¹ Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ：２．４８（３Ｈ，
ｓ），５．３８（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９，２Ｈｚ），６．７５−７．３７（６Ｈ，ｍ），
８．１４（１Ｈ，ｂｒｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：１３．６，４
６．１，９５．６，１１０．６，１１８．４，１２６．
４，１２７．３，１２８．６，１３５．９，１３７．
０，１５０．０，１５３．０ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２３８（Ｍ⁺，８９），９
１（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₁₄Ｎ₂Ｏとして）：Ｃ，７５．６１；
Ｈ，５．９２；Ｎ，１１．７６ 実測値：Ｃ，７５．４３；Ｈ，６．０２；Ｎ，１１．７
１

【００２９】

【調製実施例７】《１−ベンジル−６−（ｔｅｒｔ−ブ
チルジメチルシリルオキシ）−２−メチルベンジルイミ
ダゾール（８）の合成》前記調製実施例６で調製した１
−ベンジル−６−ヒドロキシ−２−メチルベンジルイミ
ダゾール（１１０ｍｇ，０．４６２ｍｍｏｌ）のジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（３ｍＬ）に、イミダゾ
ール（１０８ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−
ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）（１
９９ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０分間
攪拌した。エーテルで希釈後、水及び飽和食塩水で洗浄
した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：
２）により精製し、標記化合物（１４０ｍｇ，８６％）
を無色針状晶として得た。得られた標記化合物の理化学
的物性は以下のとおりである。 融点：９０〜９２℃（エチル酢酸−ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：２９５３，２８５８，１６２
３，１４７６，１４０１，１２５８，１２００，１１３
３¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．１２（６Ｈ，ｓ），
０．９５（９Ｈ，ｓ），２．５３（３Ｈ，ｓ），５．２
３（２Ｈ，ｓ），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），
６．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．０４−
７．０７（２Ｈ，ｍ），７．２６−７．３３（３Ｈ，
ｍ），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．４，１４．
０，１８．３，２５．７，４７．２，１００．４，１１
５．７，１１９．０，１２６．２，１２７．８，１２
８．８，１３５．６，１３５．７，１３７．０，１５
０．９，１５１．５ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：３５２（Ｍ⁺，１００），
２９５（９３），９１（３２） 元素分析： 計算値（Ｃ₂₁Ｈ₂₈Ｎ₂ＯＳｉとして）：Ｃ，７１．５
４；Ｈ，８．０１；Ｎ，７．９５ 実測値：Ｃ，７１．７９；Ｈ，７．９５；Ｎ，８．０１

【００３０】

【調製実施例８】《１−ベンジル−６−（ｔｅｒｔ−ブ
チルジメチルシリルオキシ）ベンズイミダゾール−２−
カルボニトリル（１０）の合成》常法に従い、ジイソプ
ロピルアミン（１．０３ｍＬ，７．３７ｍｍｏｌ）及び
ｎ−ブチルリチウム−ヘキサン溶液（１．５０Ｍ，４．
９１ｍＬ，７．３７ｍｍｏｌ）から調製したリチウムジ
イソプロピルアミド（ＬＤＡ）のＴＨＦ溶液（１０ｍ
Ｌ）に、窒素気流下−７８℃で、前記調製実施例７で調
製した１−ベンジル−６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリルオキシ）−２−メチルベンジルイミダゾール
（１．０５ｇ，２．９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍ
Ｌ）を滴下し、−７８℃で２５分間撹拌した。更に、亜
硝酸ブチル（ｎ−ＢｕＯＮＯ）（１．７７ｍＬ，１４．
７ｍｍｏｌ）を加え、−７８℃で４５分間撹拌した。飽
和塩化アンモニウム水溶液を加え、室温に戻した後、反
応液を酢酸エチルで抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄し
た。乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られたオキシム体
（図１において式９で表される化合物）を精製すること
なく以下の反応に用いた。

【００３１】前記オキシム体を含む残渣をベンゼン（３
０ｍＬ）に溶解させ、１５分間加熱還流した。塩化チオ
ニル（ＳＯＣｌ₂）（０．２６９ｍＬ，３．６９ｍｍｏ
ｌ）を滴下し、更に１時間加熱還流した。室温に戻し、
水で希釈後、酢酸エチルで抽出し、水及び飽和食塩水で
洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝
１：４）により精製し、標記化合物（５４０ｍｇ，５０
％）を無色結晶として得た。 融点：９３．５〜９５℃（ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：２９５３，２８５８，２２３
５，１６２０，１４９４，１４０２，１２５８，１２０
５，１１０６¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．１４（６Ｈ，ｓ），
０．９５（９Ｈ，ｓ），５．４６（２Ｈ，ｓ），６．６
８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．９２（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．２１−７．４０（５Ｈ，ｍ），
７．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：−４．４，１８．３，
２５．７，４９．２，１００．７，１１１．４，１１
９．５，１２２．２，１２５．７，１２７．１，１２
８．６，１２９．１，１３４．０，１３４．８，１３
７．７，１５５．１ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：３６３（Ｍ⁺，４８），３
０６（１００），９１（７２） 元素分析： 計算値（Ｃ₂₁Ｈ₂₅Ｎ₃ＯＳｉとして）：Ｃ，６９．３
８；Ｈ，６．９３；Ｎ，１１．５６ 実測値：Ｃ，６９．１６；Ｈ，６．９４；Ｎ，１１．４
９

【００３２】

【調製実施例９】《１−ベンジル−６−ヒドロキシベン
ズイミダゾール−２−カルボニトリル（１１）の合成》
前記調製実施例８で調製した１−ベンジル−６−（ｔｅ
ｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンズイミダゾー
ル−２−カルボニトリル（２０．０ｍｇ，５５．０μｍ
ｏｌ）のＴＨＦ溶液（３ｍＬ）に、ＨＦ−ＮａＦ緩衝液
（ｐＨ５）（０．２３ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹
拌した。酢酸エチルで希釈後、氷冷下、飽和炭酸水素ナ
トリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩
水で洗浄した。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサ
ン＝１：３）により精製し、標記化合物（１０．０ｍ
ｇ，７３％）を淡黄色結晶として得た。得られた標記化
合物の理化学的物性は以下のとおりである。 融点：２５２〜２５３．５℃（メタノール−酢酸エチ
ル） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３０４０，２２３４，１６２
４，１４９５，１４５９，１４０８，１３３６，１２２
６¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₆ＯＤ）δ：５．５５（２Ｈ，ｓ），
６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．２５−７．４１（５Ｈ，
ｍ），７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ：４９．３，９６．５，
１１２．２，１１６．９，１２２．３，１２６．１，１
２８．１，１２９．４，１３０．０，１３６．３，１３
６．６，１３７．１，１５８．７ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２４９（Ｍ⁺，５３），９
１（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₃Ｈ₁₁Ｎ₃Ｏとして）：Ｃ，７２．２８；
Ｈ，４．４５；Ｎ，１６．８６ 実測値：Ｃ，７１．９９；Ｈ，４．６２；Ｎ，１６．８
５

【００３３】

【調製実施例１０】《（Ｓ）−２−（１−ベンジル−６
−ヒドロキシベンズイミダゾール−２−イル）−２−チ
アゾリン−４−カルボン酸（１２）の合成》窒素気流下
で、前記調製実施例９で調製した１−ベンジル−６−ヒ
ドロキシベンズイミダゾール−２−カルボニトリル（１
０．０ｍｇ，４０．１μｍｏｌ）及びＤ−システイン塩
酸塩１水和物（３５．３ｍｇ，０．２０１ｍｍｏｌ）の
メタノール（０．７ｍＬ）−水（０．３５ｍＬ）混合溶
液中に、炭酸カリウム（１６．６ｍｇ，０．１２０ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。１ｍｏｌ／Ｌ
塩酸によりｐＨ３に調製し、メタノールを減圧留去した
後に、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗
浄し、乾燥後、溶媒を減圧留去し、本発明のＤ−ルシフ
ェリン類縁体である標記化合物（１４．０ｍｇ，９９
％）を淡黄色結晶として得た。得られた標記化合物の理
化学的物性は以下のとおりである。 融点：１３２〜１３５℃ ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：２９３４，１７１７，１６０
３，１４９２，１４５６，１３９５，１２３２，１１４
５，１０４４¹ Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ：３．６１−３．７３
（２Ｈ，ｍ），５．５５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），
６．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．８７−６．９
０（２Ｈ，ｍ），７．２１−７．３３（５Ｈ，ｍ），
７．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）８．６８（１Ｈ，ｂ
ｒｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：３３．２，４
７．４，７９．２，９５．８，１１３．９，１２０．
９，１２７．１，１２７．３，１２８．４，１３５．
５，１３６．９，１３７．１，１４１．８，１５５．
６，１６２．２，１７１．４

【００３４】以下の各調製実施例１１〜１７は、図２に
示す合成経路に従って実施した。なお、以下の各調製実
施例の各標題において各化合物の直後に記載した括弧内
の数字は、図２において各化合物の構造式に付与されて
いる式番号を意味する。

【００３５】

【調製実施例１１】《６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリルオキシ）−２−メチルベンズイミダゾール（１
４）の合成》窒素気流下、−７８℃で、液体アンモニア
（約８０ｍＬ）にナトリウム（３２８ｍｇ，１４．３ｍ
ｍｏｌ）を加え、室温で５分間攪拌した。−７８℃下、
６−アセトキシ−１−ベンジル−２−メチルベンズイミ
ダゾール（８００ｍｇ，２．８５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨ
Ｆ溶液（１３ｍＬ）を加え、１分間攪拌した。塩化アン
モニウムを加え、アンモニアを自然蒸発させた後、残渣
を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。乾燥
後、溶媒を減圧留去し、得られた６−ヒドロキシ−２−
メチルベンズイミダゾール（図２において式１３で表さ
れる化合物）を精製することなく次の反応に用いた。

【００３６】６−ヒドロキシ−２−メチルベンズイミダ
ゾールを含む残渣をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、イミダ
ゾール（９７１ｍｇ，１４．３ｍｍｏｌ）及びＴＢＤＭ
ＳＣｌ（１．２９ｇ，８．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温
で１２時間攪拌した。反応液をエーテルで希釈後、水を
加え、エーテルで抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄し
た。乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製し、標
記化合物（６７９ｍｇ，９１％）を無色針状晶として得
た。得られた標記化合物の理化学的物性は以下のとおり
である。 融点：１４８．５〜１５０．５℃（酢酸エチル） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：２９３０，２８５７，１７２
８，１６２８，１４５８，１４０８，１２５４，１１６
７¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．１８（６Ｈ，ｓ），
２．６１（３Ｈ，ｓ），６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９，２Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），
７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），１０．２４（１
Ｈ，ｂｒｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．３，１５．
０，１８．３，２５．８，１０４．５，１１４．８，１
１５．８，１３４．０，１３８．５，１５１．０，１５
１．３ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２６２（Ｍ⁺，４２），２
０５（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₄Ｈ₂₂Ｎ₂ＯＳｉとして）：Ｃ，６４．０
８；Ｈ，８．４５；Ｎ，１０．６７ 実測値：Ｃ，６４．０８；Ｈ，８．４０；Ｎ，１０．６
６

【００３７】

【調製実施例１２】《６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリルオキシ）−１，２−ジメチルベンズイミダゾール
（１５ａ）及び５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
オキシ）−１，２−ジメチルベンズイミダゾール（１５
ｂ）の合成》窒素気流下、水素化ナトリウム（油脂中６
０％，６８．６ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）をヘキサンで
洗浄後、無水ＴＨＦ（１ｍＬ）で縣濁し、前記調製実施
例１１で調製した６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリ
ルオキシ）−２−メチルベンズイミダゾール（３００ｍ
ｇ，１．１４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（１．５ｍ
Ｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。更に、ヨウ化メ
チル（ＭｅＩ）（７８．３μＬ，１．２６ｍｍｏｌ）を
加え、室温で２時間攪拌した。反応液に氷水を加えた
後、エーテルで抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄した。
乾燥後、溶媒を減圧留去し、標記化合物２種の混合物
（２７９ｍｇ，８８％）を無色針状晶として得た。な
お、標記化合物２種の各々は、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（クロロホルム：アセトン＝１０：１）に
より分離した。得られた各標記化合物の理化学的物性は
以下のとおりである。

【００３８】《６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
オキシ）−１，２−ジメチルベンズイミダゾール（１５
ａ）》 融点：１４１．５〜１４５℃（酢酸エチル−ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３４６６，２９３４，２８５
９，１６２６，１４７６，１４００，１２５４，１２０
９，１０９３¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．２０（６Ｈ，ｓ），
１．０１（９Ｈ，ｓ），２．５６（３Ｈ，ｓ），６．７
０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．７５（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．３，１３．
９，１８．３，２５．８，１９．９，９９．８，１１
５．２，１１８．９，１３６．２，１３７．２，１５
０．９，１５１．３ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２７６（Ｍ⁺，７８），２
１９（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₂₄Ｎ₂ＯＳｉとして）：Ｃ，６５．１
７；Ｈ，８．７５；Ｎ，１０．１３ 実測値：Ｃ，６５．２５；Ｈ，８．６７；Ｎ，１０．１
０

【００３９】《５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
オキシ）−１，２−ジメチルベンズイミダゾール（１５
ｂ）》 融点：１３０〜１３１℃（酢酸エチル−ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３４２８，２９３２，２８５
８，１６２２，１５８７，１５１４，１４８１，１３９
７，１２５７，１１６２¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．１９（６Ｈ，ｓ），
０．９９（９Ｈ，ｓ），２．５６（３Ｈ，ｓ），３．６
８（３Ｈ，ｓ），６．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈ
ｚ），７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．１４
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．４，１３．
９，１８．３，２５．８，２９．９，１０８．６，１０
９．１，１１５．７，１３０．９，１４３．０，１５
１．０，１５２．０ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２７６（Ｍ⁺，４１），２
１９（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₂₄Ｎ₂ＯＳｉとして）：Ｃ，６５．１
７；Ｈ，８．７５；Ｎ，１０．１３ 実測値：Ｃ，６５．２５；Ｈ，８．６７；Ｎ，１０．１
０

【００４０】

【調製実施例１３】《６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリルオキシ）−１−メチルベンズイミダゾール−２−
カルボニトリル（１７ａ）及び５−（ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリルオキシ）−１−メチルベンズイミダゾー
ル−２−カルボニトリル（１７ｂ）の合成》常法に従
い、ジイソプロピルアミン（２５１μＬ，１．７９ｍｍ
ｏｌ）及びｎ−ブチルリチウム−ヘキサン溶液（１．５
０Ｍ，１．１９ｍＬ，１．７９ｍｍｏｌ）から調製した
ＬＤＡのＴＨＦ溶液（２．４ｍＬ）に、窒素気流下、−
７８℃で、前記調製実施例１２で調製した６−（ｔｅｒ
ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１，２−ジメチル
ベンズイミダゾール及び５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチ
ルシリルオキシ）−１，２−ジメチルベンズイミダゾー
ルの混合物（１９８ｍｇ，０．７１６ｍｍｏｌ）のＴＨ
Ｆ溶液（１．２ｍＬ）を滴下し、−７８℃で３０分間攪
拌した。更に、亜硝酸ブチル（４２９μＬ，３．５８ｍ
ｍｏｌ）を加え、−７８℃で４５分間攪拌した。飽和塩
化アンモニウム水溶液を加え、室温に戻した後、反応液
を酢酸エチルで抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄した。
乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られたオキシム体（図２
において式１６で表される化合物）を精製することなく
以下の反応に用いた。

【００４１】前記オキシム体を含む残渣をベンゼン（２
ｍＬ）に溶かし、１５分間加熱還流した。塩化チオニル
（６５．３μＬ，０．８９５ｍｍｏｌ）を滴下し、更に
１時間加熱還流した。室温に戻した後、水を加え、酢酸
エチルで抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄した。乾燥
後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン＝１：１０）によ
り精製し、標記化合物１７ａ（４９．９ｍｇ，２４％）
を無色結晶として、標記化合物１７ｂ（４６．８ｍｇ，
２３％）を淡黄色針状晶として得た。得られた両標記化
合物の理化学的物性は以下のとおりである。

【００４２】《６−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
オキシ）−１−メチルベンズイミダゾール−２−カルボ
ニトリル（１７ａ）》 融点：１０９．５〜１１１℃（酢酸エチル−ヘキサン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３４４３，２９３０，２８５
８，２２３９，１６２４，１４９７，１４６７，１３９
７，１２６８¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．２４（６Ｈ，ｓ），
１．０２（９Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），６．７
９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．３，１８．
３，２５．７，３１．２，９９．８，１１１．２，１１
９．３，１２２．０，１２５．９，１３５．６１３７．
４，１５５．１ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２８７（Ｍ⁺，２９），２
３０（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₂₁Ｎ₃ＯＳｉとして）：Ｃ，６２．６
８；Ｈ，７．３６；Ｎ，１４．６２ 実測値：Ｃ，６２．６６；Ｈ，７．３３；Ｎ，１４．６
６

【００４３】《５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
オキシ）−１−メチルベンズイミダゾール−２−カルボ
ニトリル（１７ｂ）》 融点：１７０．５〜１７３．５℃（酢酸エチル−ヘキサ
ン） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３４６７，２９３１，２８５
９，２２３７，１６２２，１４８６，１２６６，１１６
９¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．２２（６Ｈ，ｓ），
１．００（９Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），７．０
６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δｃ：−４．４，１８．
３，２５．７，３１．５，１１０．２，１１０．３，１
１１．０，１２１．５，１２６．７，１２９．９，１４
３．１，１５３．２ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２８７（Ｍ⁺，７３），２
３０（１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₁₅Ｈ₂₁Ｎ₃ＯＳｉとして）：Ｃ，６２．６
８；Ｈ，７．３６；Ｎ，１４．６２ 実測値：Ｃ，６２．６１；Ｈ，７．３４；Ｎ，１４．５
８

【００４４】

【調製実施例１４】《６−ヒドロキシ−１−メチルベン
ズイミダゾール−２−カルボニトリル（１８）の合成》
前記調製実施例１３で調製した６−（ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリルオキシ）−１−メチルベンズイミダゾー
ル−２−カルボニトリル（８．０ｍｇ，２７．８μｍｏ
ｌ）のＴＨＦ溶液（０．５ｍＬ）に、ｐＨ５のフッ化水
素−フッ化ナトリウム緩衝液（５０μＬ）を加え、室温
で４．５時間攪拌した。生じた沈殿を濾取し、標記化合
物（４．０ｍｇ，８３％）を無色結晶として得た。得ら
れた標記化合物の理化学的物性は以下のとおりである。 沸点：２５７℃ ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３０３７，２２３８，１６２
６，１４６９，１４００，１２４０，１１２２¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ：３．８８（３Ｈ，
ｓ），６．９０−６．９３（２Ｈ，ｍ），７．５９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），９．９５（１Ｈ，ｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δｃ：３１．２，９
５．１，１１１．９，１１５．２，１２１．２，１２
４．８，１３５．５，１３５．９，１５６．７ ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：１７３（Ｍ⁺，１００） 元素分析： 計算値（Ｃ₉Ｈ₇Ｎ₃Ｏとして）：Ｃ，６２．４２；Ｈ，
４．０７；Ｎ，２４．２７ 実測値：Ｃ，６２．２０；Ｈ，４．２７；Ｎ，２３．８
８

【００４５】

【調製実施例１５】《（Ｓ）−２−（６−ヒドロキシ−
１−メチルベンズイミダゾール−２−イル）−２−チア
ゾリン−４−カルボン酸（１９）の合成》窒素気流下
で、前記調製実施例１４で調製した６−ヒドロキシ−１
−メチルベンズイミダゾール−２−カルボニトリル（２
０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）及びＤ−システイン
塩酸塩１水和物（１０１ｍｇ，０．５７５ｍｍｏｌ）の
メタノール（２ｍＬ）−水（１ｍＬ）混合溶液中に、炭
酸カリウム（４８．０ｍｇ，０．３４７ｍｍｏｌ）を加
え、室温で２．５時間撹拌した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸によ
りｐＨ３に調製し、メタノールを減圧留去後、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、
溶媒を減圧留去し、本発明のＤ−ルシフェリン類縁体で
ある標記化合物（３０．３ｍｇ，９５％）を淡黄色結晶
として得た。得られた標記化合物の理化学的物性は以下
のとおりである。 融点：１７７〜１７９℃（分解） ［α］_D ²²−６．１°（ｃ１．００，ＤＭＦ） ＩＲν（ＫＢｒ）ｃｍ^-1：３３３３，１７００，１５９
４，１３８４，１２２８¹Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）
δ：３．５９−３．７２（２Ｈ，ｍ），４．１３（３
Ｈ，ｓ），５．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，８．６
Ｈｚ），６．８８−６．９３（２Ｈ，ｍ），７．５４
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，０．８Ｈｚ），８．６４
（１Ｈ，ｂｒ ｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δｃ：３１．９，３
３．３，７９．２，９５．１，１１３．７，１２０．
７，１３５．３，１３７．９，１４２．１，１５５．
６，１６２．１，１７１．５ 元素分析： 計算値（Ｃ₁₂Ｈ₁₁Ｎ₃Ｏ₃Ｓ・１／３メタノールとし
て）：Ｃ，５１．４４；Ｈ，４．３２；Ｎ，１４．５９ 実測値：Ｃ，５１．５５；Ｈ，４．２７；Ｎ，１４．４
４

【００４６】

【安定性試験例１】《ルシフェリン類縁体の安定性試
験》前記調製実施例１５で調製した本発明のＤ−ルシフ
ェリン類縁体である（Ｓ）−２−（６−ヒドロキシ−１
−メチルベンズイミダゾール−２−イル）−２−チアゾ
リン−４−カルボン酸を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｃｉ
ｎｅ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）で１．４ｍｍｏｌ
／Ｌの濃度に調整し、試験溶液として４℃の冷蔵庫に保
存し、以下の安定性試験に用いた。保存した当日、保存
から３日後、７日後、及び１５日後に、冷蔵庫から前記
試験溶液を取り出し、反応時には、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ
−ＡＴＰ及び６００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＳＯ₄を含む１
ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
８．５）と試験溶液とを等量混合し、その混合液５０μ
Ｌを発光測定用白色９６穴プレートに分注して試験を行
った。測定は発光測定装置ルミノスＣＴ−９０００Ｄで
行い、酵素希釈緩衝液［１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ，１
ｍｍｏｌ／Ｌ−２−メルカプトエタノール，１％牛血清
アルブミン，及び５％グリセロールを含む５０ｍｍｏｌ
／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）］で調製したル
シフェラーゼ溶液５０μＬを加えた後の１０秒間の発光
量を測定した。対照試験として、本発明のＤ−ルシフェ
リン類縁体である（Ｓ）−２−（６−ヒドロキシ−１−
メチルベンズイミダゾール−２−イル）−２−チアゾリ
ン−４−カルボン酸の代わりに、Ｄ−ルシフェリン（す
なわち、天然型ルシフェリン）を用いること以外は、前
記操作を繰り返した。

【００４７】結果を表１に示す。表１に示す測定値の単
位は、「カウント／１０秒」である。表１に示すよう
に、Ｄ−ルシフェリンを用いた対照試験では、３日後に
６３％に、１５日後に２０％に、それぞれ反応性が低下
したのに対し、本発明のＤ−ルシフェリン類縁体を用い
ると、３日後に１０１％、１５日後に９３％の反応性を
それぞれ示し、安定性に優れていることが明らかとなっ
た。

【００４８】《表１》 初日 ３日後 ７日後 １５日後 天然型ルシフェリン １７１７１ １０８３３ ７７６６ ３４４２本発明化合物 ４７６４ ４８１２ ４９８４ ４４３９

【００４９】

【発明の効果】本発明のＤ−ルシフェリン類縁体は、溶
液中においても長期に保存可能である。従って、本発明
のＤ−ルシフェリン誘導類縁体を用いることにより、溶
液状でも長期に保存可能なルシフェラーゼ活性分析用試
薬及びＡＴＰ分析用試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤ−ルシフェリン類縁体の合成経路を
示す説明図である。

【図２】本発明の別のＤ−ルシフェリン類縁体の合成経
路を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C063 AA01 BB01 CC26 CC52 CC62 DD25 DD26 EE01

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、Ｙは、−Ｓ−、−Ｏ−、又は−Ｎ（Ｒ²）−で
   あり；Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立に、水素原子、ベン
   ジル基、又は炭素原子数１〜４のアルキル基である］で
   表されるＤ−ルシフェリン類縁体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤ−ルシフェリン類縁
   体を含有することを特徴とする、ルシフェラーゼ活性分
   析用試薬。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のＤ−ルシフェリン類縁
   体を含有することを特徴とする、ＡＴＰ分析用試薬。