WO2021187531A1 - 発光基質化合物 - Google Patents

発光基質化合物 Download PDF

Info

Publication number
WO2021187531A1
WO2021187531A1 PCT/JP2021/010852 JP2021010852W WO2021187531A1 WO 2021187531 A1 WO2021187531 A1 WO 2021187531A1 JP 2021010852 W JP2021010852 W JP 2021010852W WO 2021187531 A1 WO2021187531 A1 WO 2021187531A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
formula
salt
solvate
hydrate
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/010852
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
諒 西原
僚二 栗田
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人産業技術総合研究所 filed Critical 国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority to US17/911,452 priority Critical patent/US20230288338A1/en
Priority to JP2022508414A priority patent/JPWO2021187531A1/ja
Publication of WO2021187531A1 publication Critical patent/WO2021187531A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a compound serving as a luminescent substrate and its use.
  • protein analysis technology has a wide variety of detection methods depending on the application, such as an ultraviolet absorptiometry method utilizing an ultraviolet light absorption characteristic of 280 nm and a BCA method for detecting by reduction of copper.
  • these methods are detrimental to other biomolecules such as nucleic acids and phospholipids.
  • protein analysis by the fluorescence method is relatively sensitive, but the excitation light source at the time of observation induces a high background signal. Therefore, the current protein analysis technique is time inefficient in addition to complicated operations such as sample pretreatment.
  • the fluorescence method is unsuitable for continuous observation of protein dynamics in a living body because its excitation light source may cause protein denaturation and phototoxicity.
  • HSA human serum albumin
  • R 1 is -CH 2 -A (where A is hydrogen, or the following formula: (During the ceremony, R 3 is hydrogen, hydroxyl group, fluorine, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a methoxy group, or a trifluoromethyl group, and m is an integer of 0 to 5. ) Group represented by, or the following formula: It is a group represented by.
  • R 2 is the following formula: (In the formula, R 4 is (i) -O- (CH 2 ) n -R 6 (where R 6 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group or an azide group, and n is an integer of 1 to 5. ), (ii) Alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or (iii) The following formula: It is one of the groups represented by.
  • R 5 is (i) Hydrogen atom, hydroxyl group, methoxy group, methyl group, trifluoromethyl group, dimethylamino group, phenyl group, or azide group, (ii) Alkyl groups with 1 to 5 carbon atoms, (iii) -O- (CH 2 ) p -R 7 (Here, R 7 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group, a dimethylamino group, an azide group, or an alkyl having 1 to 5 carbon atoms.
  • the compound represented by the formula [I] is the following formula [II]: [In formula [II], R 3 is a hydrogen, a hydroxyl group, a fluorine, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a methoxy group, or a trifluoromethyl group. R 4 is (i) -O- (CH 2 ) n -R 6 (where R 6 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group or an azide group, and n is an integer of 1 to 5. ), (ii) Alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or (iii) The following formula: It is a group represented by any one of them. ] The compound according to (1) above, a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof, which is a compound represented by.
  • the compound represented by the formula [I] is the following formula [III]: [In formula [III], R 4 is (i) -O- (CH 2 ) n -R 6 (where R 6 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group or an azide group, and n is an integer of 1 to 5. ), (ii) Alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or (iii) The following formula: It is a group represented by any one of them. ] The compound according to (1) above, a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof, which is a compound represented by.
  • R 3 is a hydrogen, a hydroxyl group, a fluorine, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a methoxy group, or a trifluoromethyl group.
  • R 5 is (i) Hydrogen atom, hydroxyl group, methoxy group, methyl group, trifluoromethyl group, dimethylamino group, phenyl group, or azide group, (ii) Alkyl groups with 1 to 5 carbon atoms, (iii) -O- (CH 2 ) p -R 7 (Here, R 7 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group, a dimethylamino group, an azide group, or an alkyl having 1 to 5 carbon atoms.
  • a luminescent substrate for a protein or peptide which comprises the compound according to any one of (1) to (14) above, a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • the compound according to any one of (1) to (14) above, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof, or the luminescent substrate of (15) above is administered in vivo.
  • a method for analyzing a protein or peptide which comprises adding in vitro to detect the desired protein or peptide.
  • a novel compound or the like as a luminescent molecule (a luminescent substrate that produces light by an enzymatic reaction with a human-derived protein) that serves as a substrate for a human-derived protein. Since the compounds of the present invention have higher luminescence intensity than known luminescent substrate compounds such as coelenterazine derivatives, proteins capable of performing quantitative analysis of desired proteins in solutions having various compositions easily and with high sensitivity. It is extremely useful and practical in the development of analytical technology.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the luminescence intensity with human or bovine serum albumin of each compound of an Example and a comparative example of this invention. It is a figure which shows the luminescence intensity with each human-derived protein or bovine serum albumin of the compound (HuLumino12) of the Example of this invention.
  • a is a schematic diagram. It is a figure which shows the luminescence property (signal to noise ratio, S / N ratio) in human serum albumin (HSA) of each compound of an Example and a comparative example of this invention. It is a figure which shows the luminescence property (luminescence duration) in human serum albumin (HSA) of the compound (HuLumino12) of the Example of this invention.
  • a luminescent molecule contained in a luminescent organism and composed of amino acids is utilized as a chemical probe for converting molecular recognition or enzymatic reaction into spectroscopic information.
  • Bioanalysis utilizing these luminescence reactions enables trace analysis and bioimaging that do not require an excitation light source, and is widely used as a highly sensitive analysis technique in life science. This is due to the fact that luminescent molecules use chemical reactions for excitation energy.
  • Luminescent systems widely used for bioanalysis include marine luminescent species such as firefly luminescent system and luminescent Aequorea coeruleus.
  • the renilla-luciferase (RLuc) luminescence system which is one of the marine luminescent species and uses coelenterazine (CTZ) as the luminescent substrate, is a simple luminescent system that does not require any cofactors other than oxygen molecules (for details, see CTZ. It is a simple luminescence mechanism that emits light with the movement of protons in the chemical structure), and enables highly reproducible analysis not only inside the cell but also outside the cell where ATP does not exist. Therefore, many CTZ derivatives in which the chemical structure of CTZ has been modified have been reported so far, and their optical properties have been investigated in detail (Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 3 and 4 described above).
  • the compound according to the present invention is a compound as a luminescent molecule (a luminescent substrate that produces light by an enzymatic reaction with a human-derived protein) that serves as a substrate for a human-derived protein, and is more than a known luminescent substrate compound as described above. It was found as a compound having high luminescence intensity and excellent usefulness and practicality.
  • Luminescent Substrate Compound The compound according to the present invention (hereinafter, also referred to as the compound of the present invention) is a compound represented by the following formula [I].
  • R 1 is -CH 2 -A.
  • the above A is hydrogen, or the following formula:
  • R 3 is hydrogen, hydroxyl group, fluorine, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a methoxy group, or a trifluoromethyl group, and m is an integer of 0 to 5.
  • R 2 is the following formula: (In the formula, R 4 is (i) -O- (CH 2 ) n -R 6 (where R 6 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group or an azide group, and n is an integer of 1 to 5. ), (ii) Alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or (iii) The following formula: It is one of the groups represented by.
  • R 5 is (i) Hydrogen atom, hydroxyl group, methoxy group, methyl group, trifluoromethyl group, dimethylamino group, phenyl group, or azide group, (ii) Alkyl groups with 1 to 5 carbon atoms, (iii) -O- (CH 2 ) p -R 7 (Here, R 7 is a hydroxyl group, a methoxy group, a methyl group, a trifluoromethyl group, a dimethylamino group, an azide group, or an alkyl having 1 to 5 carbon atoms. It is a group, and p is an integer from 1 to 5.) Or (iv) The following equation: It is one of the groups represented by, and n is an integer from 0 to 5. ) It is a group represented by.
  • the compound represented by the formula [I] is not limited, but is represented by a compound represented by the following formula [II], a compound represented by the following formula [III], and a compound represented by the following formula [IV]. Compounds and the like are preferably mentioned.
  • R 4 is not limited, but the ones described in the following table are preferably mentioned, for example.
  • n and R 3 and R 5 are not limited, but the ones described in the following table are preferably mentioned, for example.
  • a salt of the compound preferably, for example, a pharmacologically acceptable salt
  • Such salts include, but are not limited to, for example, hydrohalogenates (eg, hydrochlorides, hydrobromide, and hydroiodide), inorganic salts (eg, sulfates, nitrates, etc.).
  • Preferable examples include acid salts and glutamates), quaternary amine salts, alkali metal salts (eg, sodium salts and potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts (eg, magnesium salts, calcium salts, etc.) and the like. ..
  • the compound of the present invention includes all isomers that can occur due to the structure of the compound (for example, geometric isomers, optical isomers based on asymmetric carbon, rotational isomers, stereoisomers, homomorphs, etc.). And a mixture of two or more kinds of these isomers is also included, and the description is not limited to the description of the structural formula for convenience.
  • the compound of the present invention may be any of S-form, R-form and RS-form, and is not limited.
  • the compound of the present invention may exist in the form of a hydrate or a solvate depending on the type thereof, and in the present invention, the hydrate and the solvate are also included in the compound of the present invention. It can be used for the same purpose as the compound of.
  • the solvate is not limited, and examples thereof include a solvate with ethanol.
  • the compound of the present invention is, for example, a ketoacetal compound (in the formula, R 3a is a TBS (t-butyldimethylsilyl) protected hydroxyl group or hydrogen) as shown in the following reaction scheme 1.
  • a coelenteramine derivative in the formula, R 4 has the same meaning as above, the same applies hereinafter) can be produced.
  • a coelenteramine derivative used as a starting material which is used for producing a compound in which R 4 in the formula [II] is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, is, for example, It can be produced by the following reaction scheme 3.
  • the compound of the present invention can be used as a luminescent substrate for a desired protein or peptide.
  • the desired protein or peptide include, but are not limited to, those derived from humans.
  • the desired protein or peptide is, for example, but not limited to, for example, a luciferase enzyme (for example, RLuc8 of a luciferase (RLuc) luminescent system (reference: Loening, A. M. et al., Protein Eng. Des). .Sel., 2006, 19, 391-400 .; Loening, A. M. et al., J. Mol. Biol., 2007, 374, 1017-1028 .; Loening, A. M. et al., Protein Eng.
  • a luciferase enzyme for example, RLuc8 of a luciferase (RLuc) luminescent system
  • the compound of the present invention can also be used in a method for analyzing a protein or peptide, which comprises detecting a desired protein or peptide by administering it in vivo or adding it in vitro.
  • a protein or peptide those derived from humans are preferably mentioned, and specifically, the above-mentioned description can be applied.
  • the in vivo administration method / administration conditions and the in vitro addition method / addition conditions are not particularly limited, and should be appropriately selected / set with reference to generally known well-known methods / conditions. Can be done.
  • the protein or peptide may be detected as long as it is a method capable of detecting luminescence derived from the compound of the present invention as a luminescent molecule, and a well-known detection device or detection conditions can be set, and there are no particular restrictions. Not done.
  • the reaction solution was evacuated, a catalytic amount of tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (about 1 tablespoon of microspatula) was added, the reaction solution was evacuated again, and the mixture was stirred at 100 ° C. overnight (12 hours). After allowing to cool to room temperature, the palladium catalyst was removed by filtration through Celite. The obtained residue was extracted with ethyl acetate, washed with distilled water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the reaction solution was evacuated, a catalytic amount of tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (about 1 tablespoon of microspatula) was added, the reaction solution was evacuated again, and the mixture was stirred at 100 ° C. overnight (12 hours). After allowing to cool to room temperature, the palladium catalyst was removed by filtration through Celite. The obtained residue was extracted with ethyl acetate, washed with distilled water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • NCTZ Native CTZ; Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • DeepBlueC TM NanoLight
  • MCLA TM Cayman Chemical
  • BBlue2.3 Non-Patent Document 4: R. Nishihara et al. Represented by the following structural formulas. , Theranostics, 2019, 9, 2646-2661.), Each of which was used as a compound according to Comparative Examples 1 to 4.
  • Comparative Examples 1 to 3 represented by the following structural formulas (see Non-Patent Document 3: T. Hirono et al., Tetrahedron Letters, 1992, 33, 5771-5774.) Are shown in Comparative Example 5 in order. The compounds according to 7 to 7 were used.
  • the reaction solution was evacuated, a catalytic amount of tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (about 1 tablespoon of microspatula) was added, the reaction solution was evacuated again, and the mixture was stirred at 100 ° C. overnight. After allowing to cool to room temperature, the palladium catalyst was removed by filtration through Celite. The obtained residue was extracted with ethyl acetate, washed with distilled water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the reaction solution was evacuated, a catalytic amount of tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (about 1 tablespoon of microspatula) was added, the reaction solution was evacuated again, and the mixture was stirred at 100 ° C. overnight. After allowing to cool to room temperature, the palladium catalyst was removed by filtration through Celite. The obtained residue was extracted with ethyl acetate, washed with distilled water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the reaction solution was evacuated, a catalytic amount of tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (about 1 tablespoon of microspatula) was added, the reaction solution was evacuated again, and the mixture was stirred at 100 ° C. overnight. After allowing to cool to room temperature, the palladium catalyst was removed by filtration through Celite. The obtained residue was extracted with ethyl acetate, washed with distilled water and saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the novel compound of the present invention was recognized by human serum albumin (HSA) and showed significant luminescence.
  • HSA human serum albumin
  • the combination of HuLumino 12 / HSA was found to have 912 times the emission intensity of NCTZ / HSA.
  • the HuLumino 12 / HSA and NCTZ / HSA Michaelis-Menten constants are 4.2 ⁇ M and 25.3 ⁇ M, respectively, and the luminescent molecule of the present invention has a higher affinity for HSA than the conventional molecule.
  • HuLumino32 which has a relatively high fluorescence quantum yield, showed the highest emission intensity in both BSA and HSA.
  • Emission spectrum measurement method When the emission spectrum was measured in the same manner as in the above emission intensity measurement method, it was found that the maximum emission wavelength was 427 nm (FIG. 6). The emission spectrum was measured using a spectroscopic measuring device. The maximum emission wavelength was obtained by standardizing the maximum emission intensity as 1.0.
  • the design of the CTZ derivative obtained in the present invention can also be applied to other bioluminescent systems.
  • the thorny shrimp (Oplophorus gracilirostris) uses CTZ as a luminescent substrate.
  • luciferase NanoLuc (trade name) (Promega) derived from spiny shrimp has been developed (reference: Hall P. M. et al., ACS. Chem. Biol., 2012, 7, 1848-1857.). When combined with the substrate furimazine, it has about 100 times the luminescence intensity of the firefly luciferase luminescence system.
  • the compound of the present invention can be used not only for detecting human-derived proteins, but also as a reagent for detecting structural deterioration and aggregates of antibody proteins by luminescence. It can be used for quality control of antibody drugs and immunochromatographic in vitro diagnostic agents. Further, the binding property between the serum protein and the drug can be rapidly determined by conducting a competitive inhibition test with the compound of the present invention which is a luminescent molecule. Therefore, the compound of the present invention contributes to the acceleration of drug discovery research as one of the pharmacokinetic evaluation methods.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

ヒト由来タンパクの基質となる発光分子として有用な新規化合物等を提供する。本発明に係る化合物は、下記式［Ｉ］で表される化合物、又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物である。

Description

発光基質化合物
　本発明は、発光基質となる化合物、及びその用途に関する。
　従来、タンパク質分析技術は、280 nmの紫外光吸収特性を利用した紫外吸光光度法や銅の還元で検出するBCA法など、用途に応じて多種多様な検出法がある。しかしながら、これらの手法は核酸やリン脂質などの他の生体分子が弊害となる。また蛍光法によるタンパク質分析は、比較的高感度であるが、観察時の励起光源が、高いバックグランドシグナルを誘発する。従って、現状のタンパク質分析技術は、サンプル前処理などの煩雑な操作に加えて、時間的に非効率である。特に蛍光法は、その励起光源がタンパク質変性や光毒性を引き起こす恐れがあり、生体中のタンパク質動態の連続的な観察に不向きである。またタンパク質に特異的反応を示す蛍光・吸光検査試薬の開発は容易ではなく、タンパク質を様々な組成の溶液中で簡便かつ高感度に定量分析する手法は、十分に確立されているとはいえない。
　一方で、ヒト由来タンパクのヒト血清アルブミン(HSA)は、血液の浸透圧の保持やビリルビンなどの内因性リガンド輸送を持つ重要な血清タンパク質として広く認識されている他、Kemp elimination反応（炭素よりプロトンを脱離する化学反応）の触媒酵素としても働き、生体内で多機能性を持つ重要なタンパク質である（例えば、非特許文献１、２）。
特開2018-158896号公報 特開2018-165265号公報
F. Hollfeider et al., J.Am.Chem,Soc., 2000, 122, 1022-1029. D. Rothlisberger et al., Nature, 2008, 453, 190-195. T. Hirano et al., Tetrahedron Letters, 1992, 33, 5771-5774. R. Nishihara et al., Theranostics, 2019, 9, 2646-2661.
　このような状況下において、所望のタンパク質を様々な組成の溶液中で簡便かつ高感度に定量分析等をすることができるタンパク質分析技術の開発、より具体的には、ヒト由来タンパク質との酵素反応で光を産生する新規発光基質化合物の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す化合物等を提供するものである。
（１）下記式［Ｉ］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式［Ｉ］中、
　R1は、-CH2-A（ここで、Aは、水素、又は下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、
　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、mは0～5の整数である。）
で表される基、若しくは
　下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 で表される基である。）
であり、
　R2は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、R4は、
　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
　(iii) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 で表される基のいずれか１種
　である。）
で表される基、又は
　下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、R5は、
　(i) 水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、フェニル基、若しくはアジド基、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、
　(iii) -O-(CH2)p-R7（ここで、R7は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、アジド基、若しくは炭素数１～5のアルキル基であり、pは1～5の整数である。）、若しくは
　(iv) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 で表される基のいずれか１種
　であり、nは0～5の整数である。）
で表される基である。］
で表される化合物、又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（２）前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＩ］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 ［式［ＩＩ］中、
　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、
　R4は、
　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
　(iii) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 のうちのいずれか１種で表される基
である。]
で表される化合物である、上記（１）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（３）前記式［Ｉ］又は式［ＩＩ］中のR3及びR4が、それぞれ下記表に示される基又は原子の組合せである、上記（１）又は（２）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
（４）R3が-Hであり、R4が-O-(CH2)3-OCH3である、上記（３）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（５）R3が-OHであり、R4が-O-(CH2)3-OCH3である、上記（３）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（６）前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＩＩ］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式［ＩＩＩ］中、
　R4は、
　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
　(iii) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 のうちのいずれか１種で表される基
である。]
で表される化合物である、上記（１）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（７）前記式［ＩＩＩ］中のR4が、下記表に示される基である、上記（６）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
（８）R4が-O-(CH2)3-OCH3である、上記（７）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（９）前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＶ］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 ［式［ＩＶ］中、
　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、
　R5は、
　(i) 水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、フェニル基、若しくはアジド基、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、
　(iii) -O-(CH2)p-R7（ここで、R7は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、アジド基、若しくは炭素数１～5のアルキル基であり、pは1～5の整数である。）、若しくは
　(iv) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 で表される基のいずれか１種
　であり、nは0～5の整数である。]
で表される化合物である、上記（１）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（１０）前記式［ＩＶ］中のn、並びにR3及びR5に示される基又は原子が、それぞれ下記表に示される組合せである、上記（９）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
（１１）nが1であり、R3が-Hであり、R5が-OCH3である、上記（１０）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（１２）nが1であり、R3が-Hであり、R5が-CF3である、上記（１０）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（１３）nが1であり、R3が-Hであり、R5が-C6H5である、上記（１０）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（１４）nが1であり、R3が-Hであり、R5が-Hである、上記（１０）に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
（１５）上記（１）～（１４）のいずれか１つに記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、タンパク質又はペプチドの発光基質。
（１６）上記（１）～（１４）のいずれか１つに記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物、又は上記（１５）の発光基質を、in vivoで投与、又はin vitroで添加し、所望のタンパク質又はペプチドを検出することを含む、タンパク質又はペプチドの分析方法。
　本発明によれば、ヒト由来タンパクの基質となる発光分子（ヒト由来タンパク質との酵素反応で光を産生する発光基質）としての新規化合物等を提供することができる。
　本発明の化合物等は、セレンテラジン誘導体などの公知の発光基質化合物よりも、発光強度が高いため、所望のタンパク質を様々な組成の溶液中で簡便かつ高感度に定量分析等をすることができるタンパク質分析技術の開発において、非常に有用性・実用性に優れたものである。
本発明の実施例及び比較例の各化合物の、ヒトまたはウシ血清アルブミンとの発光強度を示す図である。 本発明の実施例の化合物（HuLumino12）の、各ヒト由来タンパク質またはウシ血清アルブミンとの発光強度を示す図である。図中aは、模式図を示す。 本発明の実施例及び比較例の各化合物の、ヒト血清アルブミン(HSA)における発光特性(signal to noise ratio, S/N比)を示す図である。 本発明の実施例の化合物（HuLumino12）の、ヒト血清アルブミン(HSA)における発光特性(発光持続時間)を示す図である。 本発明の実施例の化合物（HuLumino12）のヒト血清アルブミン(HSA)の濃度に依存した発光強度を示す図である。 本発明の実施例の化合物（HuLumino12）のヒト血清アルブミン(HSA)における発光波長（発光スペクトル測定の結果）を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2020-046137号明細書（令和2年（2020年）3月17日付け出願）の全体を包含する。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
 
１．本発明の概要
　発光生物に含まれ、アミノ酸から構成される発光分子は、分子認識あるいは酵素反応を分光情報へと変換する化学プローブとして活用されている。これら発光反応を活用した生体分析は、励起光源の必要でない微量分析やバイオイメージングが可能であり、ライフサイエンスにおいて高感度な分析技術として広く利用されている。これは、発光分子が化学反応を励起エネルギーに用いることに起因する。生体分析に広く用いられている発光系に、ホタル発光系と発光オワンクラゲなど海洋発光生物種がある。特に、海洋発光生物種の一つで、セレンテラジン(CTZ)を発光基質に用いるレニラルシフェラーゼ(RLuc)発光系は酸素分子以外の補因子を一切必要としないシンプルな発光システム（詳しくは、CTZの化学構造中のプロトン移動に伴って発光する単純な発光メカニズム）であり、細胞内だけでなくATPの存在しない細胞外での再現性の高い分析を可能にする。従って、CTZの化学構造を改変したCTZ誘導体はこれまでにも数多く報告されており、その光学特性が詳細に調べられている（前掲の特許文献１、２、及び非特許文献３、４）。
　本発明に係る化合物は、ヒト由来タンパクの基質となる発光分子（ヒト由来タンパク質との酵素反応で光を産生する発光基質）としての化合物であって、上述したような公知の発光基質化合物よりも発光強度が高く、有用性・実用性に優れた化合物として見いだされたものである。
 
２．発光基質化合物
　本発明に係る化合物（以下、本発明の化合物ともいう。）は、下記式［Ｉ］で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　ここで、式［Ｉ］中、R1は、-CH2-Aである。
　上記Aは、水素、又は下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中、
　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、mは0～5の整数である。）
で表される基であるか、若しくは
　下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 で表される基であるが、好ましくは、前者の基である。
　また、式［Ｉ］中、R2は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （式中、R4は、
　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
　(iii) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 で表される基のいずれか１種
　である。）
で表される基であるか、又は、
　下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （式中、R5は、
　(i) 水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、フェニル基、若しくはアジド基、
　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、
　(iii) -O-(CH2)p-R7（ここで、R7は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、アジド基、若しくは炭素数１～5のアルキル基であり、pは1～5の整数である。）、若しくは
　(iv) 下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 で表される基のいずれか１種
　であり、nは0～5の整数である。）
で表される基である。
　前記式［Ｉ］で表される化合物としては、限定はされないが、下記式［ＩＩ］で表される化合物、下記式［ＩＩＩ］で表される化合物、及び下記式［ＩＶ］で表される化合物などが好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　ここで、上記式［ＩＩ］中のR3及びR4や、上記式［ＩＩＩ］中のR4や、上記式［ＩＶ］中のR3及びR5並びにnについては、前記式［Ｉ］中のR3、R4及びR5並びにnの値に関する説明が同様に適用できる。
　上記式［ＩＩ］中、R3及びR4の組合せとしては、限定はされないが、例えば下記表に記載のものが好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　また、上記式［ＩＩ］で表される化合物の具体例としては、以下の各式で表される化合物も、好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　上記式［ＩＩＩ］中、R4としては、限定はされないが、例えば下記表に記載のものが好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　上記式［ＩＶ］中、nの値と、R3及びR5の組合せとしては、限定はされないが、例えば下記表に記載のものが好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　上述した本発明の化合物は、当該化合物とともに、又は当該化合物に代えて、当該化合物の塩（好ましくは、例えば、薬理学的に許容し得る塩など）を用いることもできる。そのような塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）などが好ましく挙げられる。
　また、本発明の化合物は、当該化合物の構造上生じ得るすべての異性体（例えば、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、及び互変異性体等）及びこれら異性体の２種以上の混合物をも包含し、便宜上の構造式の記載等に限定されるものではない。また、本発明の化合物は、S-体、R-体又はRS-体のいずれであってもよく、限定はされない。さらに、本発明の化合物は、その種類により水和物や溶媒和物の形で存在する場合もあり、本発明においては当該水和物及び溶媒和物も本発明の化合物に含むものとし、本発明の化合物と同様の用途に用いることができる。当該溶媒和物としては、限定はされないが、例えば、エタノールとの溶媒和物等が挙げられる。
　本発明の化合物（式［ＩＩ］の化合物）は、例えば、下記の反応スキーム１に示すとおり、ケトアセタール化合物(式中、R3aはTBS(t-ブチルジメチルシリル）保護された水酸基または水素)と、セレンテラミン誘導体（式中、R4は上記と同義、以下同じ）とを縮合することにより、製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　上記反応スキーム１において、出発物質として用いられるセレンテラミン誘導体であって、上記式［ＩＩ］中のR4が-O-(CH2)n-R6である化合物の製造に用いるものは、例えば、下記の反応スキーム２により製造することができる。なお、以下の全ての反応スキームにおいて、「Boronic acid」は、それぞれの反応スキーム中に示されるボロン酸誘導体を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　また、上記反応スキーム１において、出発物質として用いられるセレンテラミン誘導体であって、前記式［ＩＩ］中のR4が炭素数１～５のアルキル基である化合物の製造に用いるものは、例えば、下記の反応スキーム３により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　なお、上記各スキームにおける各工程の具体的な条件は、当業者が適宜設定することができ、下記合成例にも個別に具体的に記載している。
　本発明の化合物は、所望のタンパク質又はペプチドの発光基質として用いることができる。当該所望のタンパク質又はペプチドとしては、限定はされないが、例えばヒト由来のものが挙げられる。当該所望のタンパク質又はペプチドとしては、限定はされないが、例えば、ルシフェラーゼ系酵素（例えば、レニラルシフェラーゼ(RLuc)発光系のRLuc8（参照文献：Loening, A. M. et al., Protein Eng. Des. Sel., 2006, 19, 391-400.；Loening, A. M. et al., J. Mol. Biol., 2007, 374, 1017-1028.；Loening, A. M. et al., Protein Eng. Des. Sel., 2006, 19, 391-400.）、RLuc8.6（参照文献：Loening, A. M. et al., Nat. Methods, 2007, 4, 641-643.）、及びCLuc系(参照文献：Mitani, Y. et al., Protein Expression and Purification, 2017, 133, 102-109.)など）や、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)などを挙げることができる。
　また本発明の化合物は、in vivoで投与し、あるいはin vitroで添加して、所望のタンパク質又はペプチドを検出することを含む、タンパク質又はペプチドの分析方法に用いることもできる。当該タンパク質又はペプチドとしては、ヒト由来のものが好ましく挙げられ、具体的には前述した説明が適用できる。in vivoでの投与方法・投与条件や、in vitroでの添加方法・添加条件は、特に制限されず、一般的に知られている周知の方法・条件も参照しつつ、適宜選択・設定することができる。当該タンパク質又はペプチドの検出についても、発光分子としての本発明の化合物由来の発光を検出できる方法であればよく、周知の検出装置を用いたり検出条件を設定したりすることができ、特に制限はされない。
 
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
合成方法
　各試薬は和光純薬、関東化学、東京化学、またはシグマアルドリッチから購入し精製せずそのまま用いた。発光基質合成の際、シリカカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル (Merck社製1.07734.9025, silica gel 60 (0.063-0.200 mm), カラムクロマトグラフィー用 (70-230 mesh ASTM))を用いた。1H-NMRまた13C-NMRはBruker社のAvanceIII-500を用いて内部標準としてテトラメチルシラン (TMS, 0 ppm)を用いた。また結合定数(J)はHzで示した。略号s, d, t, q, m, 及びbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、及び幅広線を示す。
［実施例１］
２-ベンジル-６(４-(３-メトキシプロポキシ) フェニル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino12)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
＜合成方法＞
（１）窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (300.0 mg, 1.3 mmol, 1 eq.)と、炭酸カリウム (246 mg, 1.7 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1-ブロモ-3-メトキシプロパン (416.2 mg, 2.7 mmol, 2 eq.), ヨウ化カリウム (12 mg, 0.06 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で一晩(19時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=9/1)にて精製し、2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色固体として得た (287.3 mg, 73%)。
（２）窒素雰囲気下、5-ブロモピラジン-2-アミン (54.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)と、上記（１）で得た2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (90.0 mg, 0.6 mmol, 1 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (8 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=7/3→1/1)にて精製し、5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色固体として得た (80 mg, 100%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.89 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.97 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 1.33(m, 12H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ(ppm) = -5.05, 18.54, 24.99, 26.05, 62.07, 69.18, 83.66, 114.02, 136.61, 161.64. 
（３）アルゴン雰囲気下、上記（２）で得た5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン(30.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)と、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (38.0 mg, 0.17 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、２-ベンジル-６(４-(３-メトキシプロポキシ) フェニル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た (22.6 mg, 55%)。
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.88 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.28-7.11 (m, 5H), 7.00 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.09 (s, 2H), 4.06 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.53 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.26 (q, J = 3.2 Hz, 3H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 161.75, 139.52, 129.94, 129.53, 128.74, 127.48, 116.23, 108.44, 70.17, 66.10, 58.91, 34.43, 30.52.
［実施例２］
　６(４-(３-メトキシプロポキシ)フェニル)-２-メチルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino22)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
＜合成方法＞
　アルゴン雰囲気下、5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン(30.0 mg, 0.11 mmol, 1eq.)と、ジアセチル (19.9 mg, 0.23 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、６(４-(３-メトキシプロポキシ)フェニル)-２-メチルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た(22.6 mg, 10%)。
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.88 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.35 (s, 3H), 2.05 (t, J = 12.4 Hz, 2H)..
［実施例３］
　(E)-２-ベンジル-６-(４-(トリフルオロメチル)スチリル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino32)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
＜合成方法＞
（１）窒素雰囲気下、5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.57 mmol, 1 eq.)と、（E）-(４-(トリフルオロメチル)スチリル)ボロン酸 (196 mg, 0.91 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1.6 ml)、トルエン (10 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (4 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/1)にて精製し、（E）-５-(４-(トリフルオロメチル)スチリル)ピラジン-２-アミンを黄色固体として得た (144.4 mg, 95%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.07 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 8.02 (d, J= 1.2 Hz, 2H), 7.60 (q, J = 1.8 Hz, 4H), 7.46 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 16.0 Hz, 1H),4.73 (s, 2H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 153.43, 141.61, 140.78, 140.58, 132.42, 129.66, 129.40, 128.10, 126.88, 125.79, 125.76.
（２）アルゴン雰囲気下、上記（１）で得た(E）-５-(４-(トリフルオロメチル)スチリル)ピラジン-２-アミン(30.0 mg, 0.05 mmol, 1eq.)と、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(30.1 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、(E)-２-ベンジル-６-(４-(トリフルオロメチル)スチリル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た (22.6 mg, 55%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 7.76 (s, 1H), 7.70-7.61 (m, 6H), 7.34-7.29 (m, 3H), 7.21-7.16 (m, 2H), 7.06 (d, J = 16.5 Hz, 1H),4.40 (s, 2H).
［比較例１～４及び比較例５～７］
　下記構造式で示す、NCTZ（Native CTZ；富士フイルム和光純薬社）、DeepBlueCTM（NanoLight社）、MCLATM（Cayman Chemical社）、及びBBlue2.3（非特許文献４：R. Nishihara et al., Theranostics, 2019, 9, 2646-2661. 参照）を、それぞれ順に、比較例１～４に係る化合物とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　また、下記構造式で示す、比較化合物１～３（いずれも、非特許文献３：T. Hirano et al., Tetrahedron Letters, 1992, 33, 5771-5774. 参照）を、それぞれ順に、比較例５～７に係る化合物とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
［実施例４］
(E)-２-ベンジル-６-(４-メトキシスチリル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino30)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
＜合成方法＞
（１）アルゴン雰囲気下、5-ブロモピラジン-2-アミン (500.0 mg, 2.87 mmol, 1 eq.)、（E）-(４-メトキシスチリル)ボロン酸 (818 mg, 4.34 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (4.8 ml)、トルエン (30 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (12 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/1)にて精製し、（E）-５-(４-メトキシスチリル)ピラジン-２-アミンを黄色固体として得た (423.0 mg, 64%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.04 (s, 1H),7.98 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.93 (d, 1H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H),4.61 (s, 2H), 3.82 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 159.53, 152.71, 141.89, 140.61, 131.98, 129.77, 129.34, 128.00, 122.19, 114.17, 55.33.
（２）アルゴン雰囲気下、（E）-４-(２-(５-アミノピラジン2-イル)ビニル)フェノール(30.0 mg, 0.14 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (37.3 mg, 0.16 mmol, 1.2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=10/1)にて精製し、(E)-２-ベンジル-６-(４-メトキシスチリル)イミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た (10.3 mg, 21%)。
1H-NMR (500 MHz, CD3OD,CDCl3): δ(ppm) = 7.70 (s, 1H), 7.65 (s, 1H),7.50-7.17 (m, 7H), 7.07 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.15 (s, 2H), 3.84 (s, 3H).
［実施例５］
(E)-６-（２-([１,１’-ビフェニル]-4-イル)ビニル）-2-ベンジルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino44)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
＜合成方法＞
（１）アルゴン雰囲気下、5-ブロモピラジン-2-アミン (150.0 mg, 0.86 mmol, 1 eq.)、(E)-(２-([１,１’-ビフェニル]-4-イル)ビニル）ボロン酸 (309mg, 1.37 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (4 ml)、トルエン (20 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (8 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/2)にて精製し、（E）-５-(２-([１,１’-ビフェニル]-4-イル)ビニル）ピラジン-２-アミンを黄色固体として得た (114.0 mg, 48%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.08 (s, 1H), 8.02 (s, 1H),7.62-7.33 (m, 11H),7.10 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 152.92, 141.53, 141.03, 140.65, 140.60, 136.03, 132.12, 129.24, 128.81, 127.38, 127.17, 126.93, 124.29.
（２）アルゴン雰囲気下、（E）-５-(２-([１,１’-ビフェニル]-4-イル)ビニル）ピラジン-２-アミン(31.7 mg, 0.11 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (30.6 mg, 0.13 mmol, 1.2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で6時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=10/1)にて精製し、(E)-６-（２-([１,１’-ビフェニル]-4-イル)ビニル）-2-ベンジルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た (6.4 mg, 13%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3, CD3OD): δ(ppm) = 7.73-7.00 (m, 18H), 4.37 (s, 2H).
［実施例６］
(E)-２-ベンジル-６-スチリルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンの合成 (HuLumino45)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
＜合成方法＞
（１）アルゴン雰囲気下、5-ブロモピラジン-2-アミン (150.0 mg, 0.86 mmol, 1 eq.)、（E）-シスチリルボロン酸 (204 mg, 1.37 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (4 ml)、トルエン (20 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (8 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/2)にて精製し、（E）-５-スチリルピラジン-２-アミンを黄色固体として得た (153.6 mg,90%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.06 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.54-7.25 (m, 6H), 7.05 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 4.67 (s, 2H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 153.09, 141.57, 141.08, 137.07, 132.21, 129.82, 128.82, 128.00, 126.84, 124.39.
（２）アルゴン雰囲気下、E）-５-スチリルピラジン-２-アミン(30.0 mg, 0.15 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(40.6 mg, 0.18 mmol, 1.2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=10/1)にて精製し、(E)-２-ベンジル-６-スチリルイミダゾ[１,２-a]ピラジン-３(７H)-ワンを黄色固体として得た (6.0 mg, 12%)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3, CD3OD): δ(ppm) = 7.76-6.92 (m, 14H), 4.44 (s, 2H).
発光活性測定方法、及び発光強度比較の結果
　ヒト血清アルブミン(ヒト血清由来lyophilized powder, Fatty acid free, Globulin free、SigmaAldrich社)、その他のヒトタンパク質種またはウシ血清アルブミン(ウシ血清由来lyophilized powder、SigmaAldrich社)を PB Buffer(10 mM, pH7.4)に溶解し、発光測定にそのまま用いた。発光基質としては、NCTZ、DeepBlueCTM、MCLATM、比較化合物1～3、HuLumino12及びHuLumino22を用いた。発光基質をメタノールに溶解させ、2 mMの溶液とした。これを10 mM PB buffer (pH7.4)で10μMに希釈、これを基質溶液とした。この溶液90μLに対してヒト血清アルブミン（HSA）またはウシ血清アルブミン（BSA）を含む10 mM PB buffer (pH7.4)10μLを加え、発光反応を開始した。発光強度はPromega社製GloMax(R) 20/20にて60秒間測定し、総発光量 (Total Luminescence/min)で示し、比較した(図１)。また天然のセレンテラジンのHSAにおける発光強度を1.0と規格化した発光強度の比較結果を下記表Ａに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　図１及び表Ａより、本発明の新規化合物はヒト血清アルブミン(HSA)に認識され有意な発光を示している。特にHuLumino12/HSAの組み合わせは、NCTZ/HSAの912倍の発光強度であることが分かった。更にHuLumino12/HSAとNCTZ/HSAミカエリス・メンテン定数は、各々4.2μMと25.3μMであり、本発明の発光分子が、従来分子よりHSAと高い親和性を示す。また蛍光量子収率が比較的高いHuLumino32は、BSAとHSA共に最も高い発光強度を示した。
　図２より、本発明の新規化合物HuLumino12は種々のヒトタンパク質種の中でも、ヒト血清アルブミン(HSA)に認識され特異的な発光反応を示している事が判明した。
　図３より、本発明の新規化合物HuLumino12とHSAの発光反応のS/N比は37であり、その発光持続時間は3時間に達する事が図４より分かった。また、図３より、本発明の新規化合物であるHuLumino44とHSAの発光反応のS/N比は150であり、HuLumino12の場合の4倍程度と、優れた光学特性である事が判明した。
　図５より、本発明の新規化合物HuLumino12によるHSAの検出限界は、7.4μg/mLである事が分かった。
発光スペクトル測定方法
　上記の発光強度測定方法と同様に、発光スペクトル測定を行ったところ、最大発光波長は427 nmである事が分かった（図６）。発光スペクトルは分光計測装置を用いて行った。最大発光波長は最大発光強度を1.0として規格化する事で求めた。
　本発明で得られたCTZ誘導体の設計は、他の生物発光系に対しても応用可能である。トゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)は、発光基質にCTZを利用する。近年、トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼNanoLuc（商品名）(Promega社)(参照文献：Hall P. M. et al., ACS. Chem. Biol., 2012, 7, 1848-1857.)が開発されており、基質furimazineと組み合わせることで、ホタルルシフェラーゼ発光系の約100倍もの発光強度を持つ。レポーターアッセイだけでなく、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)機構を利用したタンパク質間相互作用解析を始めとする様々なバイオアッセイ系への応用が実証されている(参照文献：England G. C. et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27, 1175-1187.)
　NanoLuc（商品名）(Promega社)に対する基質合成研究では、CTZの6位及び2位の誘導体が報告されている(参照文献：Hall P. M. et al., ACS. Chem. Biol., 2012, 7, 1848-1857.；Shakhmin A. et al., Chem. Eur. J., 2016, 22, 10369-10375.)が、いずれも2位置換基の酵素活性に対する影響が重点的に調べられている。本発明よりCTZ6,8位置換基改変の酵素活性への影響は大きく、CTZ6,8位を改変した新規基質開発により、NanoLuc（商品名）(Promega社)の更なる発光強度増大が望める。
　本発明の化合物は、ヒト由来タンパク質の検出のほか、抗体タンパク質の構造劣化及び凝集体を発光検出する試薬としても利用できる。これは抗体医薬及びイムノクロマト体外診断薬の品質管理に利用可能である。また血清タンパク質と薬物の結合性は、発光分子である本発明の化合物と競争阻害試験を実施することで、迅速に判定できる。従って、本発明の化合物は、薬物動態評価法の一つとして、創薬研究の加速化に資するものである。

Claims (16)

  1. 　下記式［Ｉ］：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式［Ｉ］中、
    　R1は、-CH2-A（ここで、Aは、水素、又は下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、mは0～5の整数である。）
    で表される基、若しくは
    　下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される基である。）
    であり、
    　R2は、下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、R4は、
    　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
    　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
    　(iii) 下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で表される基のいずれか１種
    　である。）
    で表される基、又は
    　下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、R5は、
    　(i) 水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、フェニル基、若しくはアジド基、
    　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、
    　(iii) -O-(CH2)p-R7（ここで、R7は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、アジド基、若しくは炭素数１～5のアルキル基であり、pは1～5の整数である。）、若しくは
    　(iv) 下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     で表される基のいずれか１種
    　であり、nは0～5の整数である。）
    で表される基である。］
    で表される化合物、又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  2. 　前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＩ］：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式［ＩＩ］中、
    　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、
    　R4は、
    　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
    　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
    　(iii) 下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     のうちのいずれか１種で表される基
    である。]
    で表される化合物である、請求項１に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  3. 　前記式［Ｉ］又は式［ＩＩ］中のR3及びR4が、それぞれ下記表に示される基又は原子の組合せである、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  4. 　R3が-Hであり、R4が-O-(CH2)3-OCH3である、請求項３に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  5. 　R3が-OHであり、R4が-O-(CH2)3-OCH3である、請求項３に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  6. 　前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＩＩ］：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式［ＩＩＩ］中、
    　R4は、
    　(i) -O-(CH2)n-R6（ここで、R6は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基若しくはアジド基であり、nは1～5の整数である。）、
    　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、若しくは
    　(iii) 下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     のうちのいずれか１種で表される基
    である。]
    で表される化合物である、請求項１に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  7. 　前記式［ＩＩＩ］中のR4が、下記表に示される基である、請求項６に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  8. 　R4が-O-(CH2)3-OCH3である、請求項７に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  9. 　前記式［Ｉ］で表される化合物が、下記式［ＩＶ］：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［式［ＩＶ］中、
    　R3は、水素、水酸基、フッ素、炭素数１～5のアルキル基、メトキシ基、又はトリフルオロメチル基であり、
    　R5は、
    　(i) 水素原子、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、フェニル基、若しくはアジド基、
    　(ii) 炭素数１～5のアルキル基、
    　(iii) -O-(CH2)p-R7（ここで、R7は、水酸基、メトキシ基、メチル基、トリフルオロメチル基、ジメチルアミノ基、アジド基、若しくは炭素数１～5のアルキル基であり、pは1～5の整数である。）、若しくは
    　(iv) 下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     で表される基のいずれか１種
    　であり、nは0～5の整数である。]
    で表される化合物である、請求項１に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  10. 　前記式［ＩＶ］中のn、並びにR3及びR5に示される基又は原子が、それぞれ下記表に示される組合せである、請求項９に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  11. 　nが1であり、R3が-Hであり、R5が-OCH3である、請求項１０に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  12. 　nが1であり、R3が-Hであり、R5が-CF3である、請求項１０に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  13. 　nが1であり、R3が-Hであり、R5が-C6H5である、請求項１０に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  14. 　nが1であり、R3が-Hであり、R5が-Hである、請求項１０に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物。
  15. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、タンパク質又はペプチドの発光基質。
  16. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物、又は請求項１５の発光基質を、in vivoで投与、又はin vitroで添加し、所望のタンパク質又はペプチドを検出することを含む、タンパク質又はペプチドの分析方法。
PCT/JP2021/010852 2020-03-17 2021-03-17 発光基質化合物 WO2021187531A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/911,452 US20230288338A1 (en) 2020-03-17 2021-03-17 Luminescent substrate compound
JP2022508414A JPWO2021187531A1 (ja) 2020-03-17 2021-03-17

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020046137 2020-03-17
JP2020-046137 2020-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021187531A1 true WO2021187531A1 (ja) 2021-09-23

Family

ID=77772109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/010852 WO2021187531A1 (ja) 2020-03-17 2021-03-17 発光基質化合物

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230288338A1 (ja)
JP (1) JPWO2021187531A1 (ja)
WO (1) WO2021187531A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018158896A (ja) * 2017-03-22 2018-10-11 学校法人慶應義塾 新規セレンテラジン化合物及びその用途
JP2018165265A (ja) * 2017-03-28 2018-10-25 国立大学法人電気通信大学 新規セレンテラジン誘導体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018158896A (ja) * 2017-03-22 2018-10-11 学校法人慶應義塾 新規セレンテラジン化合物及びその用途
JP2018165265A (ja) * 2017-03-28 2018-10-25 国立大学法人電気通信大学 新規セレンテラジン誘導体

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRANO TAKASHI ET AL: "Chemiluminescence of coelenterazine analogues: Structures of emitting species", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM , NL, vol. 33, no. 39, 1 January 1992 (1992-01-01), Amsterdam , NL , pages 5771 - 5774, XP002444903, ISSN: 0040-4039, DOI: 10.1016/0040-4039(92)89028-B *
KUBOTA, HIDEHIRO: "Development of a convenient and highly sensitive antioxidant capacity assay for food ingredients", TECHNICAL REPORT OF JAPAN FOOD INDUSTRY CENTER, vol. 27, 2001, pages 47 - 56, ISSN: 0388-3388 *
NISHIHARA RYO, NIWA KAZUKI, TOMITA TATSUNOSUKE, KURITA RYOJI: "Coelenterazine Analogue with Human Serum Albumin-Specific Bioluminescence", BIOCONJUG CHEM, vol. 31, no. 12, 16 December 2020 (2020-12-16), pages 2679 - 2684, XP055859050 *
NISHIHARA RYO, PAULMURUGAN RAMASAMY, NAKAJIMA TAKAHIRO, YAMAMOTO EIJI, NATARAJAN ARUTSELVAN, AFJEI RAYHANEH, HIRUTA YUKI, IWASAWA : "Highly bright and stable NIR-BRET with blue-shifted coelenterazine derivatives for deep-tissue imaging of molecular events in vivo", THERANOSTICS, vol. 9, no. 9, 13 April 2019 (2019-04-13), pages 2646 - 2661, XP055859049 *
VASSEL N, COX CD, NASEEM R, MORSE V, EVANS RT, POWER RL, BRANCALE A, WANN KT, CAMPBELL AK: "Enzymatic activity of albumin shown by coelenterazine chemiluminescence", LUMINESCENCE, vol. 27, no. 3, May 2012 (2012-05-01), pages 234 - 241, XP055859048 *
YANG JING, YIN WEI, YIN KEYI, WANG PENG, ZHENG CHAO, ZHU BIYUE, RAN KATHLEEN, ZHANG CAN, SHAO YIHAN, RAN CHONGZHAO: "Smart chemiluminescence probes and dual-amplification of signal for detection of amyloid beta species in Alzheimer's disease model", CHEMRXIV, 17 April 2020 (2020-04-17), pages 1 - 25, XP055859051 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230288338A1 (en) 2023-09-14
JPWO2021187531A1 (ja) 2021-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4958388B2 (ja) 発光性化合物に関する組成物、方法並びにキット
CN108069966B (zh) 用于snap蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用
EP2454261B1 (en) Imidazo[1,2-alpha]pyrazin-3(7h)-one derivatives bearing a new electron-rich structure
JP4899046B2 (ja) 新規ルシフェリン誘導体
US8927727B2 (en) Thiol detection
JP5550035B2 (ja) 波長が制御されたルシフェラーゼの発光基質および製造方法
US10239884B2 (en) Coelenterazine compounds and uses thereof
JP2010215795A5 (ja)
WO2021187531A1 (ja) 発光基質化合物
JP2023516154A (ja) 細胞間および細胞内の近接性に基づく標識化の組成物およびシステム
JP2583327B2 (ja) 分析で使用するジオキセタン
JP2005500281A (ja) ルシフェリンヒドラジド
CN108424402B (zh) γ-谷氨酰转肽酶生物探针及其制备方法和应用
JP2012154693A (ja) カリウム蛍光プローブ
JP2006234772A (ja) タンパク質の検出方法及びそれに用いる蛍光色素
JP2005514405A (ja) カリウムフルオロイオノフォア
JP4272516B2 (ja) 過酸化水素定量用試薬
JP2002080476A (ja) Ｄ−ルシフェリン類縁体並びにルシフェラーゼ活性分析用試薬及びａｔｐ分析用試薬
JP2004101389A (ja) アルミニウムイオン及び／又は第二鉄イオン測定用プローブ
US20230052551A1 (en) Fluorescent probe for detection of enpp activity
US8440417B2 (en) Method for assaying compounds or agents for ability to displace potent ligands of hematopoietic prostaglandin D synthase
JP2008208039A (ja) クマリン誘導体及びその用途
JP2010090268A (ja) ケイ光ソルバトクロミック色素
JP3551984B2 (ja) アクリジン誘導体
JPWO2007111345A1 (ja) 活性酸素測定用試薬

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21771224

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022508414

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21771224

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1