CN108424402B

CN108424402B - γ-谷氨酰转肽酶生物探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN108424402B
Application number: CN201710082069.7A
Authority: CN
Inventors: 杨国强; 李双; 胡睿; 杨晨临; 张欣; 王双青
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-02-15
Also published as: CN108424402A

Abstract

本发明涉及一种通式(IA)、(IB)所示的用于γ‑谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针的结构及其制备方法和应用。本发明通过对萤光素类物质的化学修饰，连接具有GGT反应特异性的γ‑谷氨酰基团，合成了一类可用于γ‑谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针。该类探针对细胞及血液中的GGT具有非常高的灵敏度和选择性。本发明的γ‑谷氨酰转肽酶生物发光探针具有操作简便、高效专一性、快速、灵敏等优点，易于推广和应用。

Description

γ-谷氨酰转肽酶生物探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明公开了一类用于γ-谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针的结构及其制备方法和应用。

背景技术

γ-谷氨酰转肽酶(GGT)广泛存在于生物体内，是谷胱甘肽(GSH)代谢的关键酶之一。GGT具有转肽、自转肽、水解3种催化作用，通过专一性地催化γ-谷氨酰基的转移，参与谷胱甘肽的循环和氨基酸的跨膜转运。GGT作为一种细胞膜表面结合酶在一系列重要的生理过程中都扮演着重要的角色。据报道，体内GGT含量的异常通常与一些重大的生理疾病如肿瘤、糖尿病及肝脏或胆囊病变相关。因此，对细胞和血清中GGT的水平的快速检测在生命科学及医学临床研究中具有重要意义。

目前检测GGT的方法有很多种，如比色法，荧光法，高效液相色谱法等。但是，这些分析方法当中，比色法检测精度较低，高效液相色谱的使用需要耗费大量的有机溶剂，对环境污染大，检测费用高，且难以实现微量检测；荧光法由于存在对激发光源的依赖性从而产生如光漂白和自发荧光等不可忽视的缺点，也限制了其进一步的应用。设计制备更加简便、快速、高效灵敏得GGT定量检测方法仍是目前研究的一个热点。

生物发光是一种存在于生物体内的特殊类型的化学发光，它不依赖于有机体对外界光能的吸收，而是体内萤光素类物质在酶的催化作用下高效的将化学能转变为光能的过程。生物发光成像技术由于其具有非侵袭性、低背景、高灵敏度、可视化以及能够实现实时动态观测等优点而得到广泛关注，逐渐发展，成为一种重要的活体成像手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一类可用于γ-谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针，该类探针对细胞及血液中的GGT的检测具有非常高的灵敏度和选择性。

本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。

本发明的又一目的在于提供上述化合物在γ-谷氨酰转肽酶检测中的应用。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一类可用于γ-谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针，其结构为如下通式(IA)或通式(IB)所示：

其中，X可独立的任选为O、NR；Y可独立的任选为S、NR；R为H、C_1-3烷基；Z可独立的任选为S、Se；R₁-R₄可相同可不同，独立的任选为H、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3酰基、C_1-3酰氨基、C_1-3酯基、F、Cl、Br、I、芳基、N-杂环基、O-杂环基。

所述的烷基可为直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基等。

优选的，R₁-R₄可独立的任选为H，CH₃-、CH₃O-。

优选的，所述X独立的任选为O、NH。

优选的，所述Y、Z独立的任选为S。

进一步优选的，所述通式(IA)、(IB)化合物可为如下具体化合物：

本发明还提供了一种制备上述通式(IA)化合物的方法，包括如下步骤：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(a)将化合物(IIIA)与D-半胱氨酸盐酸盐反应，得到化合物(IIA)；

(b)将步骤(a)中得到的化合物(IIA)在酸性条件下进行反应，得到化合物(IA)。

根据本发明，步骤(a)中，所述反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶剂。所述反应优选在催化剂中进行，所述催化剂例如为碳酸钾。化合物(IIIA)与D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比优选为1:1.2。优选的，将化合物(IIIA)溶解于溶剂中(例如为甲醇和二氯甲烷的混合溶剂)，加入用甲醇和去离子水的混合溶液溶解的D-半胱氨酸盐酸盐和碳酸钾溶液，反应得到化合物(IIA)。

根据本发明，在步骤(b)中，反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为二氯甲烷。所述酸性条件例如可以使用三氟乙酸。

根据本发明，上述反应得到的通式(IA)化合物可以通过重结晶方法进行分离提纯。例如使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂对粗产物进行重结晶，过滤后可得到纯净的通式(IA)化合物。

根据本发明，所述通式(IIIA)化合物可以由如下方法制备，包括：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(c)将化合物(IV)和对甲苯磺酰氯进行反应，得到化合物(A)；

(d)将步骤(c)中得到的化合物(A)和化合物(B)进行反应，得到化合物(IIIA)。

根据本发明，步骤(c)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂例如可为二氯甲烷。反应温度优选为-10℃到20℃(例如0℃)。所述反应优选在催化剂下进行，所述催化剂可为三乙胺。化合物(IV)、三乙胺及对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1.2:2。

根据本发明，步骤(d)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为乙腈。所述反应优选在催化剂下进行，所述催化剂可为碳酸钾、碘化钠。反应温度优选为60-100℃(例如85℃)。化合物(A)与化合物(B)的摩尔比为1：1.2。

本发明还提供了一种制备上述通式(IB)化合物的方法，包括如下步骤：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(a’)将化合物(IV)与化合物(E)进行反应，得到化合物(IIB)；

(b’)将步骤(a’)中得到的化合物(IIB)在酸性条件下进行反应，得到化合物(IB)。

根据本发明，步骤(a’)中，反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为二氯甲烷溶剂。所述反应优选在催化剂中进行，所述催化剂例如可以为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲基吡啶(DMAP)。化合物(IV)与化合物(E)的摩尔比优选为2:1。优选的，将化合物(IIB)溶解于溶剂中(例如为二氯甲烷溶剂)，加入用二氯甲烷溶解的化合物(E)溶液，反应温度为常温，反应时间为12h，得到化合物(IIB)。

根据本发明，在步骤(b’)中，反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为二氯甲烷。所述酸性条件例如可以使用三氟乙酸。

根据本发明，上述反应得到的通式(IB)化合物可以通过重结晶方法进行分离提纯。例如使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂对粗产物进行重结晶，过滤后可得到纯净的通式(IB)化合物。

根据本发明，上述方法中的通式(IV)化合物可以通过如下方法制备，包括：将化合物(C)和化合物(D)进行反应，得到化合物(IV)；

其中，R₁-R₄如上面所定义。

根据本发明，在上述方法中，反应在溶剂环境下进行，所述溶剂优选为二氯甲烷溶剂。所述反应优选在催化剂下进行，所述催化剂例如可以为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。反应温度优选为-10℃到20℃(例如0℃)。化合物(C)和化学物(D)的摩尔比优选为1.2:1。

本发明所述的通式(IA)、(IB)化合物合成步骤少，反应时间短，提纯方便，工艺简单。

本发明通过对萤光素类物质进行化学修饰，引入具有GGT反应特异性的γ-谷氨酰基团，得到了一类可用于γ-谷氨酰转肽酶检测的生物发光探针。在萤光素/氨基萤光素类物质中，当其6’位为羟基/氨基以及4位为羧酸时，其可以在萤光素酶、ATP和Mg²⁺的存在下发生生物放光。本发明化合物以这些可以发光的萤光素/氨基萤光素类物质为母体，将能够识别γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的基团，通过可发生自发断裂的连接基团链接到萤光素/氨基萤光素的6’位羟基/氨基上或4位的羧酸上。因而本发明化合物作为底物并不能被荧光素酶识别，不具有发光能力。当本发明化合物遇到GGT后，化合物中的识别基团与GGT发生反应，继而连接基团自发断裂，从而释放出萤光素/氨基萤光素类物质，在ATP、Mg²⁺和萤光素酶的作用下发生生物发光(具体实例参见图1)。该探针对γ-谷氨酰转肽酶有很好的选择性和灵敏度，可用作GGT的生物发光探针。

本发明进一步提供了上述通式(IA)、(IB)化合物的用途，其用作γ-谷氨酰转肽酶(GGT)生物发光探针。

根据本发明，所述通式(IA)、(IB)化合物对于GGT的检测可以在多种缓冲溶液中进行，如HEPES缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液等。其发光强度随着GGT浓度增加而变强。

本发明所述通式(IA)、(IB)化合物，对GGT的选择具有专一性，其他阴阳离子、氨基酸及生物体内酶对于本发明所述化合物的发光能力几乎无影响。

本发明所述的通式(IA)、(IB)化合物可用于体外GGT检测及生物样品分析中。

本发明所述的通式(IA)、(IB)化合物可用于细胞内GGT成像。所述化合物可以用于区分部分癌细胞和正常体细胞中GGT含量的变化。

本发明所述的通式(IA)、(IB)化合物可用于小鼠体内GGT成像。

本发明还提供了上述通式(IA)、(IB)化合物的用途，其在制备用于检测γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的试剂中的应用。

附图说明

图1为实施例4制备的Glu-Luc对GGT进行检测的反应机理图；

图2为实施例4制备的Glu-Luc在HEPES缓冲溶液中，随GGT浓度变化而变化的生物发光强度图；

图3为实施例4制备的Glu-Luc对不同类型细胞内γ-谷氨酰转肽酶检测成像的生物发光图。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进行详细说明。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制。任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。

实施例1

制备化合物(1)

在氩气保护下，将N-BOC-L-谷氨酸-1-叔丁酯(3.3mmol，1.01g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.3mmol，632.6mg)溶解于6ml二氯甲烷中，于0℃下缓慢滴加溶解于4mL二氯甲烷中的4-氨基苄醇(3.0mmol，369mg)溶液，室温搅拌1.5h。反应完成后，有机相旋干，粗产物用展开剂乙酸乙酯/石油醚/甲醇过硅胶色谱柱，得到白色固体(945mg，78％)。ESI(C₂₁H₃₂N₂O₆):[M+23]⁺＝431.4。¹H-NMR(400MHz,CD₄O),δ:7.54(d,J＝8.4,2H),7.31(d,J＝8.4,2H),4.57(s,2H),4.05-4.01(m,1H),2.46(t,J＝7.6,2H),2.23-2.15(m,1H),2.03-1.94(m,1H),1.49(s,9H),1.45(s,9H).

实施例2

制备化合物(2)

在氩气保护下，将化合物1(1.16mmol,500mg)和三乙胺(1.27mmol，0.3ml)溶解于10ml二氯甲烷中，于0℃下缓慢滴加溶解于10ml二氯甲烷中的对甲苯磺酰氯(2.52mmol，480mg)，继续搅拌2.5h。反应完成后，有机相旋干，粗产物用展开剂乙酸乙酯/石油醚过硅胶色谱柱，得到白色固体中间产物(690mg，46％)。在氩气保护下，将中间产物(1.2mmol，660mg)，2-氰基-6-羟基苯并噻唑(1.4mmol，246.7mg),碳酸钾(7.1mmol，981.3mg),碘化钠(0.4mmol，59.9mg)溶解于12mL乙腈中，于85℃反应5h。反应完成后，反应液过滤，用二氯甲烷萃取有机相，有机相旋干，粗产物用展开剂乙酸乙酯/石油醚过硅胶色谱柱，得到淡黄色固体化合物2(568mg，92％)。ESI(C₂₉H₃₄N₄O₆S):[M+23]⁺＝589.3。¹H-NMR(300MHz,CD₄O)，δ：8.09(d,J＝9.1Hz,1H),7.72(t,J＝3.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(d,J＝8.6Hz,2H),7.37–7.32(m,1H),5.18(s,2H),4.10–3.93(m,1H),2.49(t,J＝7.3Hz,2H),2.27–2.07(m,1H),2.07–1.86(m,1H),1.46(d,J＝16.9Hz,18H).

实施例3

制备化合物(3)

在氩气保护下，将化合物2(0.42mmol，240mg)溶解于5ml甲醇和二氯甲烷的混合溶剂(v/v＝1:1)中，加入用5ml甲醇和去离子水的混合溶剂(v/v＝1:1)溶解的D-半胱氨酸盐酸盐(0.45mmol，55mg)和碳酸钾(0.45mmol，62mg)溶液。常温下反应20min。反应结束后，将有机溶剂旋干，加入等体积水，用1M的盐酸溶液调整pH至2-3左右。得到的粗产物黄色固体。粗产物用甲醇重结晶后得到微黄色产物(100mg，53.9％)。ESI(C₃₂H₃₈N₄O₈S₂):[M-1]^—＝669.8。¹H-NMR(300MHz,DMSO)，δ：9.96(s,1H),8.04(d,J＝9.0Hz,1H),7.84(s,1H),7.60(d,J＝8.3Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.30–7.19(m,1H),7.13(d,J＝7.4Hz,1H),5.39(t,J＝9.0Hz,1H),5.12(s,2H),4.00–3.54(m,4H),1.97(s,1H),1.79(s,1H),1.41–1.36(m,18H).

实施例4

制备化合物(4)：Glu-Luc

在氩气保护下，将化合物3(0.1mmol，67.8mg)溶解于2ml二氯甲烷中，于0℃下缓慢滴加三氟乙酸(1ml)，继续搅拌反应12h。反应结束后，有机物旋干，粗产物用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂重结晶得到淡黄色固体(49mg，37％)。MALDI-TOF(C₂₃H₂₂N₄O₆S₂):[M+39]⁺＝553.06。¹H-NMR(300MHz,DMSO)，δ：10.30(d,J＝39.7Hz,1H),8.05(d,J＝9.0Hz,1H),7.83(d,J＝2.3Hz,1H),7.63(d,J＝8.3Hz,2H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),7.40(d,J＝8.3Hz,2H),7.29–7.16(m,2H),5.40(t,J＝9.0Hz,1H),5.13(s,2H),4.42(s,1H),1.99(s,4H).

实施例5

将实施例4中得到的Glu-Luc针对不同浓度GGT进行检测：用30mmol HEPES缓冲溶液(含有10mM的MgSO₄)分别将Glu-Luc配制成浓度为60uM的溶液，将GGT配制成浓度为3U/L、6U/L、12U/L、18U/L、24U/L、30U/L、45U/L、60U/L的溶液。然后将50uL Glu-Luc溶液和50uL上述不同浓度的GGT溶液分别加入到黑色96孔板的各个孔中，将板子放在37℃恒温摇床中，孵育80min，然后在各个孔中加入50uL含有2mMATP的萤光素酶溶液(60ug/ml)。将该96-孔板用活体成像仪测试生物发光强度。最后测得不同GGT浓度(0、1U/L、2U/L、4U/L、6U/L、8U/L、10U/L、15U/L、20U/L)下Glu-Luc的生物发光光谱(见附图2)，由图2中可以看出，随着GGT浓度增加，溶液生物发光强度增强。

实施例6

将实施例4中得到的Glu-Luc用于不同类型的细胞成像：本实验分为三组，一组为GGT酶过量表达的癌细胞，作为实验组直接加入不同浓度的探针溶液(Glu-Luc)；第二组作为对照组在加入探针溶液之前先加入一定浓度的GGT酶抑制剂，在37℃培养箱中培养30min后除去培养基，再加入不同浓度的探针溶液(Glu-Luc)；第三组作为对照组用GGT少量表达的正常体细胞类型，同样加入不同浓度的探针溶液(Glu-Luc)。三组细胞与探针溶液孵化20min后，用活体成像仪测试生物发光强度(见附图3)。由图3中可以明显看出GGT酶抑制剂对细胞内的GGT表达有很强的抑制作用，并且癌细胞与正常体细胞中GGT的含量有很明显的差异。

实施例7

将实施例4中得到的Glu-Luc用于血清中GGT的检测：本实验中将血样分为两组，一组血样用商用的GGT活性检测试剂盒(荧光法)进行检测，另一组血样用上述实施例5中方法进行检测。通过将两组实验检测结果进行对比，检测得到的GGT含量相一致。因此，实施例4中合成的Glu-Luc也可以用于生物样品中GGT的检测。

Claims

1.通式(IA)或通式(IB)所示的化合物：

其中，X可独立的任选为O、NR；R为H、C_1-3烷基；Y为S；Z为S；R₁-R₄可相同可不同，独立的任选为H、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3酰基、F、Cl、Br、I。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，R₁-R₄可独立的任选为H、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基；所述X为O、NH。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述通式(IA)化合物为如下具体化合物：

4.权利要求1-3任一项所述化合物的制备方法，其中所述通式(IA)化合物的制备方法包括如下步骤：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(a)将化合物(IIIA)与D-半胱氨酸盐酸盐反应，得到化合物(IIA)；

5.如权利要求4所述的制备方法，其中，步骤(a)中，所述反应在溶剂中、催化剂下进行。

6.如权利要求5所述的制备方法，其中，所述溶剂为甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶剂，所述催化剂为碳酸钾。

7.如权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤(b)中，反应在溶剂环境下进行。

8.如权利要求7所述的制备方法，其中，所述溶剂为二氯甲烷。

9.如权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤(b)中，所述酸性条件为使用三氟乙酸。

10.如权利要求4所述的制备方法，其中，所述通式(IIIA)化合物可以由如下方法制备，包括：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(c)将化合物(IV)和对甲苯磺酰氯进行反应，得到化合物(A)；

11.如权利要求10所述的制备方法，其中，步骤(c)中，所述反应在溶剂中、催化剂下进行。

12.如权利要求11所述的制备方法，其中，所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为三乙胺。

13.如权利要求10所述的制备方法，其中，步骤(d)中，所述反应在溶剂中、催化剂下进行。

14.如权利要求13所述的制备方法，其中，所述溶剂为乙腈，所述催化剂为碳酸钾、碘化钠。

15.权利要求1-3任一项所述的化合物的制备方法，其中通式(IB)化合物的制备方法包括如下步骤：

其中，R₁-R₄、X、Y、Z如上面所定义；

(a’)将化合物(IV)与化合物(E)进行反应，得到化合物(IIB)；

16.如权利要求15所述的制备方法，其中，步骤(a’)中，反应在溶剂中、催化剂下进行。

17.如权利要求16所述的制备方法，其中，所述溶剂为二氯甲烷溶剂，所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲基吡啶(DMAP)。

18.如权利要求15所述的制备方法，其中，在步骤(b’)中，反应在溶剂环境下进行。

19.如权利要求18所述的制备方法，其中，所述溶剂为二氯甲烷。

20.如权利要求15所述的制备方法，其中，在步骤(b’)中，所述酸性条件为使用三氟乙酸。

21.权利要求10、15所述的制备方法，其中，所述通式(IV)化合物通过如下方法制备，包括：将化合物(C)和化合物(D)进行反应，得到化合物(IV)；

其中，R₁-R₄如上面所定义。

22.如权利要求21所述的制备方法，其中，反应在溶剂中、催化剂下进行。

23.如权利要求22所述的制备方法，其中，所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

24.权利要求1-3任一项所述的化合物的用途，其用作γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的生物发光探针。

25.如权利要求24所述的用途，其中，所述化合物对于GGT的检测在缓冲溶液中进行。

26.如权利要求25所述的用途，其中，所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液。

27.如权利要求24所述的用途，其中，所述化合物用于体外GGT检测及生物样品分析中。

28.如权利要求24所述的用途，其中，所述化合物用于区分部分癌细胞和正常体细胞中GGT含量的变化。

29.如权利要求24所述的用途，其中，所述化合物可用于小鼠体内GGT成像。

30.一种检测γ-谷氨酰转肽酶的生物发光探针，包括权利要求1-3任一项所述的化合物。