CN110590700B - 多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用 - Google Patents

多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用，多元杂环化合物的化学结构如式Ⅰ所示：
Figure DDA0002201227560000011
本公开以该多元杂环化合物作为检测半胱氨酸的生物发光探针，能够实现高选择性、高灵敏度地定性、半定量分析检测半胱氨酸。

Description

多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用
技术领域
本公开涉及多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
半胱氨酸(Cys)是一种含巯基的氨基酸，在许多生物活动过程中起着十分重要的作用，如生物酶中金属辅因子结合剂，蛋白质结构稳定剂，生物体解毒剂等。此外，半胱氨酸本身作为二十种基本氨基酸之一，参与蛋白质的合成以及细胞生长。半胱氨酸的缺陷还与许多人类的流行疾病有关，如半胱氨酸缺乏会导致儿童生长缓慢、脱发、水肿、嗜睡以及皮肤损害、肝损伤、肌肉和脂肪的损失、体重显着下降，骨骼肌也会出现功能异常；如若半胱氨酸含量过高，则会导致神经毒性。因此，快速可靠的对体内半胱氨酸的检测具有十分重要的意义，也越来越引起人们的高度重视。
目前对半胱氨酸的检测的方法有很多，有比色法、HPLC和荧光探针等方法，但是本公开发明人研究发现，这些分析方法中，比色法检测精密度较低；HPLC的使用需要耗费大量的有机溶剂，对环境污染大，检测费用高，且难以实现微量检测；荧光探针法由于存在对激发光源的依赖性从而产生光漂白和自发荧光等不可忽视的缺点，也限制了其进一步的应用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用，以实现高选择性、高灵敏度地定性、半定量分析检测半胱氨酸。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种多元杂环化合物，化学结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002201227540000011
另一方面，一种多元杂环化合物的制备方法，包括以化合物1作为起始原料通过以下反应路线获得式Ⅰ所示化合物：
Figure BDA0002201227540000021
第三方面，一种上述多元杂环化合物在检测半胱氨酸中的应用。
第四方面，一种上述多元杂环化合物在制备检测半胱氨酸的生物发光探针中的应用。
第五方面，一种检测半胱氨酸的生物发光探针，包括上述多元杂环化合物。
第六方面，一种检测半胱氨酸的方法，将上述多元杂环化合物或上述生物发光探针加入至含有半胱氨酸的待测溶液中孵育，孵育后添加含有ATP的萤光素酶溶液，然后检测生物发光强度。
本公开的有益效果为：
本公开提供的多元杂环化合物对检测半胱氨酸具有选择性好、灵敏性高、检测限低及良好生物相容性等优点。经过实验发现，该多元杂环化合物在体外环境中的生物发光强度的与半胱氨酸浓度呈现良好的线性关系，说明该多元杂环化合物可用于半定量检测半胱氨酸，同时也实现了活体水平内源性半胱氨酸的高灵敏检测，响应较快，生物发光信号较稳定等优点。响应性好，其可在0～100μM进行检测，其检测限低至0.005μM。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物检测半胱氨酸的原理图；
图2为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物和实施例2制备的式Ⅰ所示化合物体外检测选择性的表征图；
图3为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物的体外检测响应性表征图，A为图为探针对半胱氨酸响应的时间动力学表征图(在黑色96孔板中加入50μL半胱氨酸和50μL探针溶液于37℃孵育30min，随后加入50μL酶工作液，分别测定50，100，150，200min的生物发光总光子数)，B为荧光光谱图，C为光子数柱状图；
图4为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物检测不同浓度半胱氨酸的通量柱状图，插图为拟合曲线；
图5为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物的在不同时间内的的紫外吸收光谱；
图6为不同浓度抑制剂下生物发光强度与细胞内外源性半胱氨酸浓度的关系柱状图；
图7为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物的外源性半胱氨酸的活体成像结果表征图，A为小鼠注射不同浓度半胱氨酸的生物发光成像表征图，B为小鼠注射不同浓度半胱氨酸30min内产生的总光子数柱状图，C为小鼠注射不同浓度半胱氨酸不同时间点下产生的光子数趋势图；
图8为本公开实施例1制备的式Ⅰ所示化合物的内源性半胱氨酸的活体成像结果表征图，A为图为小鼠注射DEM(300μM)和空白对照组30min内不同时刻的生物发光成像表征图，B为小鼠注射DEM(300μM)和空白对照组30min不同时刻生物发光强度图，C为小鼠注射DEM(300μM)和空白对照组30min内产生的总光子数对照图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现有半胱氨酸光学探针存在选择性差、灵敏度低、条件苛刻等的问题，本公开提出了多元杂环化合物与制备方法及其在检测半胱氨酸中的应用。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种多元杂环化合物，化学结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002201227540000031
本公开的另一种实施方式，提供了一种多元杂环化合物的制备方法，包括以化合物1作为起始原料通过以下反应路线获得式Ⅰ所示化合物：
Figure BDA0002201227540000032
该实施方式的一种或多种实施例中，化合物1与甲基丙烯酸或甲基丙烯酸的羧酸衍生物进行取代反应获得化合物2，化合物2与半胱氨酸进行环化反应获得式Ⅰ所示化合物。
甲基丙烯酸的羧酸衍生物的结构式为
Figure BDA0002201227540000033
其中，R为卤素或烷氧基。
当化合物1与甲基丙烯酸进行反应时，取代反应为酯化反应。
化合物1与甲基丙烯酸的羧酸衍生物进行反应，当甲基丙烯酸的羧酸衍生物为酰卤(即R为卤素)时，取代反应为醇解反应；当甲基丙烯酸的羧酸衍生物为酯(即R为烷氧基)时，取代反应为酯交换反应。
为了提高化合物2的收率，该实施方式的一种或多种实施例中，化合物1与甲基丙烯酰卤进行醇解反应。
甲基丙烯酰卤包括甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酰溴、甲基丙烯酰碘等，为了降低生成成本，该系列实施例中，甲基丙烯酰卤为甲基丙烯酰氯。化合物1与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1～3:2～6。
该系列实施例中，所述醇解反应的条件为碱性条件。所述碱性条件为体系中添加三乙胺、碳酸钾、碳酸铯或碳酸氢钠，当添加三乙胺时，反应效果更好。化合物1与三乙胺的摩尔比为1～3:2～6。
该系列实施例中，醇解反应的溶剂为二氯甲烷、乙腈、醇类有机物。当溶剂为二氯甲烷时，反应效率更快。醇类有机物为含有醇羟基的有机物，例如甲醇、乙醇、丙醇等。
该系列实施例中，环化反应的溶剂为甲醇、二氯甲烷和去离子水中的一种或多种。
该系列实施例中，化合物2与半胱氨酸的摩尔比为1:1.1～1.3。当化合物2与半胱氨酸的摩尔比为1:1.2时，化合物2的转化率更高。
该系列实施例中，环化反应中的半胱氨酸为D-半胱氨酸。
本公开的第三种实施方式，提供了一种上述多元杂环化合物在检测半胱氨酸中的应用。
本公开的第四种实施方式，提供了一种上述多元杂环化合物在制备检测半胱氨酸的生物发光探针中的应用。
本公开的第五种实施方式，提供了一种检测半胱氨酸的生物发光探针，包括上述多元杂环化合物。
本公开的第六种实施方式，提供了一种检测半胱氨酸的方法，将上述多元杂环化合物或上述生物发光探针加入至含有半胱氨酸的待测溶液中孵育，孵育后添加含有ATP的萤光素酶溶液，然后检测生物发光强度。
该实施方式的一种或多种实施例中，孵育温度为体温，孵育时间为20～40min。所述体温指人体温度，一般为36.2～37.2℃。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
如式Ⅰ所示化合物的合成，路线如下：
Figure BDA0002201227540000051
步骤如下：
将化合物1(352mg，2.0mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷(DCM)溶解，冰浴下搅拌，加入三乙胺(832uL，6.0mmol)，S-2(576uL，6.0mmol)用10mL二氯甲烷溶解，滴加至烧瓶，于室温反应5h。通过柱层析得化合物2，产率为94.7％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.30(d,J＝9.0Hz,1H),8.21(d,J＝2.3Hz,1H),7.55(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.26–7.14(m,1H),6.21(dd,J＝15.5,1.7Hz,1H),1.98(dd,J＝6.9,1.7Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.94(s),150.22(s),149.36(s),148.80(s),137.43(s),136.28(s),125.21(s),123.28(s),121.01(s),115.94(s),113.25(s),18.00(s).
将化合物2(122mg，0.5mmol)，用8mL二氯甲烷和甲醇的混合液将其溶解，加入用2mL甲醇和水的混合液(1:1)溶解的D-半胱氨酸盐酸盐(88mg，0.5mmol)和无水碳酸氢钠(42mg，0.5mmol)溶液。用稀盐酸调至出现固体化合物Ⅰ，产率为91.9％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.25(s,1H),8.21(d,J＝8.9Hz,1H),8.07(d,J＝2.3Hz,1H),7.42(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.19(dq,J＝13.8,6.9Hz,1H),6.19(dd,J＝15.5,1.7Hz,1H),5.48(t,J＝9.1Hz,1H),3.78(ddd,J＝19.7,11.3,9.2Hz,2H),1.97(dt,J＝18.0,9.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.02(s),164.38(s),164.10(s),161.00(s),150.38(s),149.24(s),148.49(s),135.99(s),124.63(s),122.08(s),121.16(s),115.82(s),78.15(s),34.82(s),17.98(s).
实施例2
如式Ⅱ所示化合物的合成，路线如下：
Figure BDA0002201227540000052
步骤如下：
将化合物1(88mg，0.5mmol)置于圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷(DCM)溶解，冰浴下搅拌，加入三乙胺(208uL，1.5mmol)，S-1(122uL，1.5mmol)用5mL二氯甲烷溶解，滴加至烧瓶，于室温反应5h。通过柱层析得(V石油醚：V乙酸乙酯＝10：1～30：1)固体化合物3，产率为94.8％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.32(d,J＝9.0Hz,1H),8.25(d,J＝2.3Hz,1H),7.59(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.61(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),6.48(dd,J＝17.3,10.2Hz,1H),6.23(dd,J＝10.2,1.3Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.94(s),150.02(s),149.46(s),137.57(s),136.29(s),134.34(s),127.23(s),125.29(s),123.17(s),115.92(s),113.23(s).
将化合物3(115mg，0.5mmol)，用8mL二氯甲烷和甲醇的混合液将其溶解，加入用2mL甲醇和水的混合液(1:1)溶解的D-半胱氨酸盐酸盐(88mg，0.5mmol)和无水碳酸氢钠(42mg，0.5mmol)溶液。用稀盐酸调至出现固体化合物Ⅱ，产率为87.7％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.20(s,1H),8.22(d,J＝8.9Hz,1H),8.12(d,J＝2.3Hz,1H),7.46(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.60(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),6.47(dd,J＝17.3,10.2Hz,1H),6.21(dd,J＝10.2,1.3Hz,1H),5.46(dd,J＝9.7,8.4Hz,1H),3.85–3.77(m,1H),3.72(dd,J＝11.3,8.4Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.01(s),164.37(s),164.09(s),161.13(s),150.50(s),149.05(s),136.01(s),134.11(s),127.37(s),124.71(s),121.98(s),115.80(s),78.15(s),34.83(s).
利用化合物Ⅰ进行半胱氨酸检测的原理如图1所示，化合物Ⅰ与半胱氨酸亲核加成环合成七元环，其中不含有自降解基团的探针被还原为D-萤光素，这种方式释放的萤光素酶底物在特定条件下发生生物发光，用生物发光的强度对半胱氨酸在体外、细胞和体内的浓度的变化进行实时半定量检测。
对化合物Ⅰ和化合物Ⅱ进行体外检测选择性检测：
将15μM的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ分别与各种阴离子(F-,Cl-,Br-,I-,SO4 2-,SO3 2-,S2O3 2-,S2-,NO3-,NO2-,SCN-,CO3 2-)或氨基酸(Cys,Hcy,GSH,Gly,Ser,Lys,Thr,Glu,Phe,Ile,Arg,Met,Asp,Tyr,Ala)溶液加入到黑色的96孔板中，37℃恒温摇床反应10min，然后加入50μL含有2mM ATP的萤光素酶溶液(20μg/mL)。用活体成像仪测试生物发光强度。结果如图2所示，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ在与半胱氨酸作用的生物发光强度分别是空白组强度的20倍和34倍，是同型半胱氨酸组强度的6.5倍和5.5倍，是谷胱甘肽组强度的3.5倍和17倍。由于化合物Ⅱ的生物发光强度优于化合物Ⅰ，因而本公开选择化合物Ⅰ作为生物发光探针，记为CBP。
化合物Ⅰ进行体外检测响应检测：
将化合物Ⅰ和不同浓度半胱氨酸溶液加入到黑色的96孔板中，37℃恒温摇床孵育10～50min，然后加入含有ATP的萤光素酶溶液，每个浓度做3个复孔，随即用活体成像仪测试生物发光强度。结果如图3～4所示，化合物Ⅰ的生物发光强度在一定范围内随半胱氨酸的浓度增加而增加，并且在0～100μM具有良好的线性，其检测限为0.005μM。上述结果说明化合物Ⅰ具有较好的检测灵敏性，可以对生物样本中微量的半胱氨酸进行半定量检测。
化合物Ⅰ的稳定性检测：
将100μM的化合物Ⅰ在24h内的紫外吸收光谱变化，如图5所示，24h内紫外吸收光谱无变化，证明化合物Ⅰ的稳定性良好。
化合物Ⅰ的细胞毒性检测：
细胞株：ES-2-Fluc cells。
细胞培养条件：黑色96孔板；10％胎牛血清；37℃，95％湿度，24h。
浓度为10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM的化合物Ⅰ分别与细胞共孵育12h。
表征结果为IC50值为1mM，证明化合物Ⅰ的毒性较低，具有良好的生物相容性。
外源性半胱氨酸的细胞成像实验：
细胞株：ES-2-Fluc cells。
孵育条件：黑色96孔板；10％胎牛血清；37℃，95％湿度，24h。
细胞内加入NEM(N-ethylmaleimide，40μM)，清除细胞自身内源性半胱氨酸，排除假阳性结果。
加入外源性半胱氨酸：0、10μM、50μM、250μM、500μM，37℃下孵育15min。
用小动物活体成像仪收集生物发光信号。
生物发光强度与细胞内外源性半胱氨酸浓度的关系，如图6所示，加入抑制剂NEM后生物发光信号弱，而加入外源性半胱氨酸后，生物发光信号增强，即化合物Ⅰ可用于细胞内外源性半胱氨酸的可视化分析和成像。
给小鼠注射外源性半胱氨酸的活体成像实验：
动物：Transgenic FVB-luc+mice。
实验组：先腹腔注射0.2mL半胱氨酸浓度(10、50、100和500μM)，再腹腔注射0.2mL探针(10μM)。
空白对照组：先腹腔注射0.2mL生理盐水，再腹腔注射0.2mL探针(10μM)，体内孵育10min。
阴性对照组：先腹腔注射0.2mL NEM(50μM)，再腹腔注射0.2mL探针(10μM)，体内孵育10min。
成像条件：CCD每个3min拍摄一次，持续30min，曝光时间10s。
结果如图7所示，实验组中老鼠体内的生物发光信号随着外源性注射的半胱氨酸浓度的升高而逐渐增强；空白对照组呈现了微弱的生物发光信号；阴性对照组仅呈现微弱生物发光信号。即化合物Ⅰ可对活体水平外源性的半胱氨酸进行可视化和成像分析。
小鼠内源性半胱氨酸的活体成像实验：
实验组：腹腔注射0.2mL的DEM(300μM)造成小鼠体内产生大量半胱氨酸，随即腹腔注射等体积探针(10μM)。
对照组：腹腔注射0.2mL的生理盐水，随即腹腔注射等体积探针(10μM)。
用试剂盒测量出上述经DEM处理后的小鼠，其体内的半胱氨酸确实上升，即模型成功。
用小动物活体成像仪进行成像，每3min/次，持续30min。
结果如图8所示，对照组仅有微弱生物发光信号，实验组有强烈生物发光信号，即化合物Ⅰ具有动物水平可视化分析内源性半胱氨酸的能力。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种多元杂环化合物，其特征是，化学结构如式Ⅰ所示：
Figure 262489DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种多元杂环化合物的制备方法，其特征是，包括以化合物1作为起始原料通过以下反应路线获得式Ⅰ所示化合物：
Figure 448751DEST_PATH_IMAGE002
；
化合物1与甲基丙烯酸或甲基丙烯酸的羧酸衍生物进行取代反应获得化合物2，化合物2与半胱氨酸进行环化反应获得式Ⅰ所示化合物。
3.如权利要求2所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，化合物1与甲基丙烯酰卤进行醇解反应获得化合物2。
4.如权利要求3所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，甲基丙烯酰卤为甲基丙烯酰氯。
5.如权利要求4所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，化合物1与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1~3:2~6。
6.如权利要求3所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，所述醇解反应的条件为碱性条件。
7.如权利要求6所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，所述碱性条件为体系中添加三乙胺。
8.如权利要求7所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，化合物1与三乙胺的摩尔比为1~3:2~6。
9.如权利要求3所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，醇解反应的溶剂为二氯甲烷、乙腈、醇类有机物。
10.如权利要求9所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，溶剂为二氯甲烷。
11.如权利要求2所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，环化反应的溶剂为甲醇、二氯甲烷和去离子水中的一种或多种；
或，化合物2与半胱氨酸的摩尔比为1:1.1~1.3；
或，环化反应中的半胱氨酸为D-半胱氨酸。
12.如权利要求11所述的多元杂环化合物的制备方法，其特征是，化合物2与半胱氨酸的摩尔比为1:1.2。
13.一种权利要求1所述的多元杂环化合物在制备检测半胱氨酸的生物发光探针中的应用。
14.一种检测半胱氨酸的生物发光探针，其特征是，包括权利要求1所述的多元杂环化合物。
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