CN103796999A - 荧光素酶的发光基质 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种在萤火虫生物发光系统中维持了荧光素酶的发光活性的被修饰的萤火虫荧光素及萤火虫荧光素类似物。本发明的目的特别在于提供一种萤火虫生物发光系统中的发光波长与现有的发光基质相比向长波长一侧偏移了的新的发光基质。本发明提供苯并噻唑环部分的7位被修饰了的荧光素。此外，本发明提供苯环部分的6位被修饰了的荧光素类似物。进而，本发明提供6-（二烷基氨基）-2-萘基部分的5位被修饰了的荧光素类似物。

Description

荧光素酶的发光基质
技术领域
本发明涉及荧光素类似物。本发明更具体涉及通过使荧光素酶的发光波长向长波长一侧偏移来修饰的荧光素类似物。
背景技术
<关于萤火虫荧光素>
近年来，生物学事件及现象的可视化受到重视，期待用于可视化的材料的扩大化。伴随于此，对于标记技术也要求多样化。特别是用于分子影像学的标记技术伴随着诊断及检查设备的进步获得了极大的发展。例如，正在集中精力研究用于在对癌症、心脏疾病等的个体化医疗等的尖端技术中应用的标记技术。此外，伴随着计测技术的进步，对更高灵敏度及更高性能的设备、标记材料的需求正在迅速提高。
在可视化技术中，萤火虫生物发光系统据说是发光效率非常高，能够最有效率地将能量变换成光的系统。此外，生物发光的分子机制的解释也在不断发展。
已知该萤火虫生物发光是通过作为发光基质的荧光素在发光酶荧光素酶的作用下进行化学反应来放出光。在该反应中，发光基质在发光酶内存在三磷酸腺苷（ATP）及2价的镁离子（Mg2+）的条件下被腺苷酰化（AMP化），衍生成作为活性基质的腺苷酰化物。接着，其被氧化而成为过氧阴离子，变换成作为高能过氧化物的二氧杂环丁酮（dioxetanone）。不稳定的二氧杂环丁酮一边分解一边放出质子和二氧化碳，变成激发单重态。来自该双阴离子激发单重态的发光是黄绿色的，将其作为萤火虫的发光。此外，发光后的生成物被称为氧化荧光素。
如上所述，由于萤火虫生物发光的发光效率非常高，此外生物发光的分子机制的解明不断获得进展，所以许多企业正在销售利用了萤火虫生物发光系统的多种多样的发光材料。可是，由于与萤火虫生物发光相关的发光材料的开发以医学生物化学的领域为中心来推进实用化，所以通常从蛋白质（酶）方面的研究开发很积极，而从低分子化合物（基质）方面的尝试非常少。特别是几乎不存在进行发光基质的骨架变换的结构和活性的相关研究。
进而，尽管通过重组技术能够廉价地提供发光酶，但应用以试剂盒制品等提供的萤火虫生物发光系统的发光标记材料并不廉价。这是因为发光基质是荧光素。现在，作为天然的发光基质的D型荧光素由作为非天然氨基酸的D-半胱氨酸来合成，但D-半胱氨酸是非常昂贵的。
<利用了生物发光系统的长波长发光的需求和状况>
为了观测多种现象，即使在利用了标记的检测系统中，也要求多色发光。因此，优选在检测系统中能够利用的标记材料的波长区域的范围大。例如，在利用多色发光的研究中，作为标记优选准备在450nm左右～650nm以上的波长、特别是680nm以上具有发光的标记材料。此外，在生物体内深处标记的用途中，从长波长光比短波长光具有优越的透光性的观点出发，优选红色发光标记材料。特别是在生物体组织的光计测中使用波长为650～900nm的近红外光。可见光（400～700nm）由于血红蛋白、其它的生物体构成物质的吸收大，此外在比近红外光长的波长中水的吸收变大，所以光不能在生物体内前进。与此相对，由于近红外线的波长区域容易穿透生物体，所以也被称为“生物体之窗”。
如上所述，萤火虫生物发光是荧光素与荧光素酶进行化学反应而产生的。当利用该情况，例如对目标脏器预先进行基因重组来制造发光酶，之后当通过对个体将荧光素静脉注射或腹腔内给药而遍布全身时，表达发光酶的目标脏器发光。此外，如果对目标脏器移植癌，则能够作为癌的可视化来利用，如果目标脏器是其他生物的脏器，则能够作为再生医疗的基础研究来利用。特别是如果是在生物体之窗的区域中发光的长波长材料，则可以预想生物体内穿透性高，容易从生物体外观测。
现在，在作为用于萤火虫生物发光系统的发光基质能够获得的基质中，存在具有数个发光波长的基质。作为这些基质的最短及最长的两端波长，可举出腔肠素系统的蓝色（大约480nm）和萤火虫系统的红色（大约613nm）。此外，最近市售有利用了铁路蠕虫发光酶的更长波长的红色发光材料（大约630nm）。可是，由于长波长光具有优越的透光性，所以不仅是这些发光波长，预计对于发光波长最长的波长的进一步扩展也存在潜在的需求。
在以下示出利用了生物发光系统的红色和蓝色发光的现有制品的例子：
1.Promega株式会社:Chroma-Luc：大约613nm（非专利文献1）
该系统是利用了叩头虫（click beetle）的突变体及天然萤火虫发光基质的系统。
2.东洋纺织株式会社：MultiReporter Assay System-Tripluc：大约630nm（非专利文献2）
该系统是利用了铁路蠕虫红色发光酶及天然萤火虫发光基质的系统。使用绿色发光荧光素酶（SLG，最大发光波长550nm）、橙色发光荧光素酶（SLO，580nm）及红色发光荧光素酶（SLR，630nm）的颜色的荧光素酶基因而使发光色变化。其利用了赋予不同的发光色的发光酶。
3.东京大学：氨基虫荧光素（Aminoluciferin）：大约610nm（专利文献1）
其公开了荧光素衍生物。
4.Promega株式会社:Chroma-Luc：大约480nm（非专利文献3）
该系统是利用了腔肠素及海肾荧光素酶的系统。
5.ATTO株式会社：海萤生物发光大约460nm（非专利文献4）
该系统是利用了腔肠素系统基质及海萤荧光素酶的系统。
此外，本发明人们也在专利文献2中公开了荧光素类似化合物。这些化合物是具有与荧光素同样的骨架的化合物。
进而，本发明人们在专利文献4中公开了具有与荧光素不同的骨架的荧光素类似化合物具有各种各样的发光波长。即使在这些荧光素类似化合物中，也期望将发光波长进一步向长波长侧偏移。
专利文献1：日本特开2007-091695号公报
专利文献2：国际公开公报第2007/116687号
专利文献3：日本特开2006-219381号公报
专利文献4：日本特开2010-215795号公报
非专利文献1：Promega株式会社総合カタログ2008-912.6
非专利文献2：Upload vol.79,2005p1-10,Toyobo Biochemicals forLifescience2006/2007p4-67.
非专利文献3：Promega株式会社総合カタログ2008-912.14
非专利文献4：ATTO株式会社総合カタログ2008-2009247
发明内容
发明要解决的课题
鉴于上述状况，本发明的目的在于提供一种与现有的发光基质相比较，萤火虫生物发光系统中的发光波长进一步向长波长侧偏移的新的发光基质。
用于解决课题的方案
为了实现上述目的，本发明人们制作了具有与荧光素类似的结构的发光基质的类似物群，进行了其发光波长的解析。结果，发现了在荧光素及荧光素类似物的结构中，通过在特定的位置具有修饰，从而发光波长向长波长侧偏移的情况。
本发明提供具有以下的通式I的化合物或其盐：
[化1]
式中，
Z是
[化2]
Figure BDA0000469002370000051
R1是H或C1-4烷基，
R4是OH或NR2R3，式中R2及R3是H或C1-4烷基，
n是0、1、2或3。
此外，本发明提供R1、R2及R3是H，R4是OH的上述化合物或其盐。
进而，本发明提供包含上述记载的化合物的荧光素酶的发光基质。
进而，本发明提供包含上述的化合物的发光检测试剂盒。
发明的效果
通过本发明，提供一种以不损害发光活性的方式修饰的荧光素及荧光素类似物。特别是通过本发明提供一种与现有的发光基质相比较，萤火虫生物发光系统中的发光波长进一步向长波长侧偏移的新的发光基质。
附图说明
图1是表示本发明的被修饰的萤火虫荧光素的发光波长的图。
图2是表示本发明的被修饰的萤火虫荧光素类似物的发光波长的图。
具体实施方式
本发明提供具有发光活性的荧光素类似物。在本说明书中，荧光素类似物指的是通过与荧光素酶或荧光素酶变异体进行反应而产生发光的物质。荧光素酶变异体指的是通过对荧光素酶的基因进行改变等，从而其基质特性及其发光波长变化了的荧光素酶蛋白质。
本发明提供具有以下的通式的化合物或其盐：
[化3]
Figure BDA0000469002370000061
式中，
Z是
[化4]
Figure BDA0000469002370000062
R1是H或C1-4烷基，
R4是OH或NR2R3，式中R2及R3是H或C1-4烷基，
n是0、1、2或3。特别是在上述化合物中，R1、R2及R3可以是H，R4可以是OH。
此外，在上述化合物中，在苯环处以马库什方式标记的化合物表示结合部位是任意的，但在本发明的化合物中，Z可以是以下的化合物：
[化5]
Figure BDA0000469002370000063
式中，R4是OH或NR2R3，式中R2及R3是H或C1-4烷基。
在具体方式中，本发明提供苯并噻唑部分的7位被烯丙基修饰了的萤火虫荧光素类似物。在本说明书中，荧光素具有以下的结构。
[化6]
Figure BDA0000469002370000071
也可以对萤火虫荧光素类似物来进行修饰。在本说明书中，修饰指的是对任意的化合物结合任意的基团。修饰部位可以是与苯并噻唑部分的7位对应的部位。例如，可以是具有以下的通式I的化合物。
[化7]
式中，
R1是H或C1-4烷基，
X及Y分别独立是C、N、S或O。
在本说明书中，“C1-4烷基”这一用语指的是包含1～4个碳原子的饱和直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基。同样地，“C1-C3烷基”这一用语指的是包含1～3碳原子的饱和直链或支链烷基（例如甲基、乙基或异丙基）。
如上所述，本领域技术人员容易想到，R1也可以是C1-4烷基。例如，在本发明人的上述专利文献2中，示出了与本发明的化合物的R1部分对应的部分是AMP的荧光素类似化合物可以成为萤火虫生物发光系统的基质的结果。因此，可以预想作为取代的这样的低级烷基对活性造成影响的可能性低。
在上述通式I中，X及Y分别独立地可以是C、N、S或O。本领域技术人员容易想到，X及Y的杂原子也可以是C、N、S或O。例如，在本发明人的上述专利文献2中记载的各种荧光素类似化合物中，示出了与本发明的化合物对应的部分是各种杂原子的荧光素类似化合物可以成为萤火虫生物发光系统的基质的结果。
在一个方式中，本发明提供在通式I中R1是H、X是N、Y是S的以下化合物：
[化8]
Figure BDA0000469002370000081
具有上述式的化合物通过与萤火虫荧光素酶的反应而以大约605nm的发光波长进行发光。
在另一个具体方式中，本发明提供具有以下的通式II的化合物。
[化9]
Figure BDA0000469002370000082
式中，
R1是H或C1-4烷基，
X及Y分别独立是C、N、S或O，
n是0、1、2或3。
如上所述，本领域技术人员容易想到，在通式II中，R1也可以是C1-4烷基。
如上所述，在上述通式II中，X及Y分别独立可以是C、N、S或O。本领域技术人员容易想到，X及Y的杂原子也可以是C、N、S或O。
如上所述，本领域技术人员容易想到，在通式II中，表示为“n”的烯烃链单元可以变为所希望的长度。
在一个具体方式中，本发明提供在通式II中R1是H、X是N、Y是S且n是1的以下化合物：
[化10]
具有上式的化合物通过与萤火虫荧光素酶的反应而以大约690nm的发光波长进行发光。
在另一个具体方式中，本发明提供具有以下的通式III的化合物。
[化11]
Figure BDA0000469002370000092
式中，
R1是H或C1-4烷基，
X及Y分别独立是C、N、S或O，
n是0、1、2或3。
如上所述，本领域技术人员容易想到，在通式III中，R1也可以是C1-4烷基。
如上所述，在上述通式III中，X及Y分别独立地可以是C、N、S或O。本领域技术人员容易想到，X及Y的杂原子也可以是C、N、S或O。
如上所述，本领域技术人员容易想到，在通式III中，表示为“n”的烯烃链单元可以变为所希望的长度。
此外，在上述通式I、通式II及通式III中，也可以用-NR2R3基取代-OH基。在-NR2R3基中，R2及R3分别独立地可以是H或C1-4烷基。
如上所述，本领域技术人员容易想到，R2及R3也可以是C1-4烷基。例如，在本发明人的上述专利文献4中，示出了与本发明的化合物的-OH部分对应的部分是-N（CH3）2基的荧光素类似化合物可以成为萤火虫生物发光系统的基质的结果。因此，可以预想作为取代的这样的NR2R3基对活性造成影响的可能性低。
在本发明中,在修饰了的荧光素及荧光素类似物中包含它的盐。“盐”在本发明的化合物中，仅设想是该化合物的任一个部分能够形成碱的情况。
在“盐”这一表示中，包含与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸、亚磷酸、亚硝酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、草酸、马来酸、乳酸、酒石酸、富马酸、苯甲酸、扁桃酸、肉桂酸、双羟萘酸、硬脂酸、谷氨酸、天冬氨酸、甲磺酸、乙磺酸、p-甲苯磺酸、水杨酸、琥珀酸、三氟乙酸及对活着的生物是非毒性的其它的无机酸或有机酸的任一种的盐，或者在式I的化合物的性质是酸性的情况下，与碱金属或碱土类金属的碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等那样的无机碱的盐。
本发明的修饰了的荧光素及荧光素类似物例如可以按照以下的实施例中记载的过程进行制造。更详细的过程记载在下述的实施例中，但通式I的化合物例如可以按以下的过程来制造。
[化12]
Figure BDA0000469002370000111
简单来说，对通过市售的2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑的脱甲氧基而获得的2-氰基-6-羟基苯并噻唑的羟基进行烯丙基化，通过克莱森重排将烯丙基导入7位而获得2-氰基-7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑4。接着，通过与D-半胱氨酸在甲醇中在碳酸钾存在下在室温进行反应，用盐酸中和，获得7-烯丙基萤火虫荧光素5。
更具体来说，作为开始物质使用2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑，使其与吡啶盐酸盐反应，获得2-氰基-6-羟基苯并噻唑。接着，使2-氰基-6-羟基苯并噻唑与烯丙基溴反应，获得6-烯丙氧基-苯并噻唑-2-甲腈。
在使获得的6-烯丙氧基-苯并噻唑-2-甲腈在氩气氛下在180℃加热熔解并对反应混合物进行冷却之后，获得7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑-2-甲腈。接着，使7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑-2-甲腈在氩气氛下在180℃加热熔解，获得7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑-2-甲腈。接着，将2-氰基-7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑及D-半胱氨酸盐酸盐一水合物溶解在甲醇:蒸馏水中，在氩气氛下通过加入碳酸钾可以获得7-烯丙基-萤火虫荧光素。
此外，下述通式的化合物：
[化13]
Figure BDA0000469002370000112
例如可以按照以下的过程来制造：
[化14]
Figure BDA0000469002370000121
在冰浴中将硝酸钾加入到浓硫酸中并将其加入到市售的2-氯苯并噻唑中而硝化，通过使生成的2-氯-6-硝基苯并噻唑在盐酸中与锡反应而将硝基还原成氨基，衍生为2-氯-6-氨基苯并噻唑。对其在DMSO溶媒中在氩气氛下加入氰化钾，通过进行一夜的加热回流，制成2-氰基-6-氨基苯并噻唑。在DMF溶媒中使其与烯丙基溴和碳酸钾反应，对氨基进行烯丙基化，通过氮杂克莱森重排而将烯丙基导入到7位。在甲醇中加入碳酸钾和半胱氨酸进行搅拌，用盐酸使其为中性，由此能够获得7-烯丙基-氨基荧光素型化合物。
如果是本领域技术人员，应该能够理解从将上述通式I的化合物的取代基取代为所希望的取代基后的开始物质开始，通过与上述合成过程同样的过程，能够合成对应的化合物。此外，如果是本领域技术人员，应该能够理解在上述合成过程的适当的步骤中，可以将化合物的取代基取代成所希望的取代基。此外，在最后的步骤中，通过将羧酸部分取代成所希望的酯，从而能够获得具有对应的R1的化合物。
此外，详细的过程记载在下述的实施例中，但通式II的化合物例如可以按以下的过程来制造：
[化15]
Figure BDA0000469002370000131
简单地说，通过市售的羟萘甲酸11的二烯丙基化而获得二烯丙基化合物12。通过克莱森重排将烯丙基导入芳香环，通过DIBAL-H将酯部还原成羟基亚甲基而获得14。通过氧化和Wittig反应的增碳而获得化合物15。通过同样地反复进行还原和增碳，从而能够将双键部位增加到所希望的数量。对酯部位进行水解而形成羧基，使其与D-半胱氨酸衍生物进行酰胺基结合，进行环化而获得化合物20。使用酯酶、脂肪酶对酯部位进行水解，能够获得化合物II。
更具体地，将2-萘甲酸溶解于丙酮中，在冰冷条件下使其与碳酸钾及烯丙基溴反应，获得化合物2。在200℃加热化合物2，获得化合物3。接着，将化合物3溶解于四氢呋喃中，在室温使其与叔丁基二甲基氯硅烷及三乙胺反应，进而使其在-78℃与二异丁基氢化铝反应，获得化合物14。
接着，将化合物14溶解于二氯甲烷中，在室温使其与氧化锰反应，进而将生成物溶解于苯中，在室温中使其与（甲氧甲酰基亚甲基）三苯基正膦进行反应，获得化合物15。接着，将化合物15溶解于异丙醇，使其与1M氢氧化钠水溶液反应，获得化合物16。
另一方面，将D-半胱氨酸-S-三苯甲基化合物溶解于甲醇，使其与4N氯化氢的1,4-二氧杂环己烷溶液进行反应，获得化合物18。
接着，将化合物16和化合物18溶解于吡啶中，使其与盐酸1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺及1-羟基苯并三唑进行反应，获得化合物19。接着，将化合物19溶解于二氯甲烷中，在0℃使其与三苯基氧膦及无水三氟甲磺酸进行反应，获得化合物20。
最后，将化合物20溶解于四氢呋喃、乙醇及10m碳酸铵水溶液中，在40℃使其与猪胰脂肪酶反应，获得化合物21。
此外，下述通式的化合物：
[化16]
Figure BDA0000469002370000141
例如可以按照以下的过程来制造。对市售的6-氨基萘基甲醛的氨基进行烯丙基化，通过氮杂克莱森重排而将烯丙基导入到7位。通过Wittig反应的增碳而获得αβ-不饱和酯。通过反复进行酯部的还原和增碳，从而能够将双键部位（n）增加到所希望的数量。对氨基进行二烷基化，将酯部水解而形成羧基，使其与D-半胱氨酸衍生物进行酰胺结合，进行环化而获得酯。使用酯酶、脂肪酶对酯部位进行水解，可以获得7-烯丙基-二甲氨基萘酚型化合物。以同样的步骤，如果不对氨基进行烷基化，则可以获得R1=R2=H的4-氨基型（-NH2）7-烯丙基-氨基萘酚型化合物。进而，即使以4-硝基萘基甲醛为出发物质，将硝基还原成氨基进行同样的反应，也能够获得7-烯丙基-氨基萘酚型化合物。
如果是本领域技术人员，应该能够理解从将上述通式II的化合物的取代基取代为所希望的取代基后的开始物质开始，通过与上述合成过程同样的过程，能够合成对应的化合物。此外，如果是本领域技术人员，应该能够理解在上述合成过程的适当的步骤中，能够将化合物的取代基取代成所希望的取代基。此外，在最后的步骤中，通过将甲酯部分取代成所希望的酯，从而能够获得具有对应的R1的化合物。进而，通过变更作为开始物质使用的化合物的烯烃部分的长度，从而能够获得在通式II中具有所希望的长度n的化合物。
如果是本领域技术人员，应该能够理解从将上述通式II的化合物取代为所希望的骨架及取代基后的开始物质开始，通过与上述合成过程同样的过程，能够合成对应的化合物。此外，如果是本领域技术人员，应该能够理解在上述合成过程的适当的步骤中，能够将化合物的取代基取代成所希望的取代基。此外，在最后的步骤中，通过将甲酯部分取代成所希望的酯，从而能够获得具有对应的R1的化合物。进而，通过变更作为开始物质使用的化合物的烯烃部分的长度，从而能够获得在通式III中具有所希望的长度n的化合物。
例如，对市售的4-羟基苯甲醛的羟基进行烯丙基化，通过氮杂克莱森重排而将烯丙基导入到3位。通过Wittig反应的增碳而获得αβ-不饱和酯。通过反复进行酯部的还原和增碳，从而能够将双键部位增加到所希望的数量。对酯部位进行水解而形成羧基，使其与D-半胱氨酸衍生物进行酰胺结合，进行环化而获得酯。使用酯酶、脂肪酶对酯部位进行水解，能够获得化合物III。如果对起始物质不使用4-羟基苯甲醛而使用4-氨基苯甲醛，则通过同样的步骤能够获得R1=R2=H的4-氨基型（-NH2）的化合物。进而，使用与用于获得上述化合物10的反应同样的反应，可以进行环化。此外，使用与用于获得上述化合物11的反应同样的反应，可以进行化合物的水解。
此外，下述通式的化合物：
[化17]
Figure BDA0000469002370000161
例如可以按照以下的过程来制造。对市售的4-二甲氨基苯甲醛的氨基进行烯丙基化，通过氮杂克莱森重排而将烯丙基导入到3位。通过wittig反应的增碳而获得αβ-不饱和酯。通过反复进行酯部的还原和增碳，从而可以将双键部位（n）增加到所希望的数量。对酯部位进行水解而形成羧基，使其与D-半胱氨酸衍生物进行酰胺结合，进行环化而获得酯。使用酯酶或脂肪酶对酯部位进行水解，可以获得3-烯丙基-二甲氨基二烯型化合物。如果起始物质不使用4-二甲氨基苯甲醛而使用4-氨基苯甲醛，则通过同样的步骤可以获得R1=R2=H的4-氨基型（-NH2）的化合物。进而，即使以4-硝基苯甲醛为起始物质，将硝基还原成氨基进行同样的反应，也能够获得3-烯丙基-二甲氨基二烯型化合物。
此外，按照日本特开2010-180191号公报中记载的过程，可以将荧光素及荧光素类似物在它们的苯并噻唑环部分的7位、苯酚部分的6位及萘酚部分的5位用烯丙基进行修饰。
本发明的化合物通过添加到发光甲虫荧光素酶、ATP及Mg2+存在的系统中，从而通过发光甲虫荧光素酶进行氧化而发光。本发明的化合物可以单独作为发光基质来利用，但也可以根据需要与其它的发光基质组合使用。本发明的化合物可以与ATP及Mg2+一起作为试剂盒来提供。此外，也可以在试剂盒中包含其它的发光基质或调制成适当的pH的溶液。进而，本发明的化合物也可以与ATP及Mg2+一起将本发明的化合物调制成适当的pH后的发光基质组合物作为发光剂试剂盒来提供。
萤火虫生物发光系统由于是水性系统，所以也可以存在亲水性有机化合物。例如，也可以存在四氟乙酸、乙酸及甲酸等。在将本发明的化合物应用于发光系统的情况下，为了获得适宜的发光强度，优选以1μM以上的发光基质的浓度进行使用，例如以5μM以上进行使用。此外，预想发光系统的pH是4～10，优选是6～8，但并不特别限定。根据需要，为了使pH稳定化，可以使用磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸、甘氨酸及HEPES等的缓冲剂。
此外，本发明的化合物在萤火虫发光甲虫荧光素酶发光系统中通过各种各样的氧化酶来发光。荧光素酶可以从北美产萤火虫（Photinus pyralis）及铁路蠕虫（Railroad worm）等的各种生物中分离，使用其任一种。在可以使用的氧化酶中，例如包含：叩头虫荧光素酶、西表岛萤火虫荧光素酶及含黄素的单氧酶。
已知将本发明的化合物作为发光基质的生物发光，当在发光系统中存在辅酶A（CoA）、焦磷酸或Mg离子（Mg2+）时，该发光增强。因此，可以将其作为发光甲虫荧光素酶发光系统的发光增强剂来利用。已知这些化合物的发光增强效果在发光系统中的CoA、焦磷酸或Mg2+的浓度分别为5μM以上的条件下是显著的，随着浓度的增加而增强。
为了在测定/检测中使用萤火虫生物发光系统，重要的是防止酶的失活使发光稳定化以显示平稳的发光行为。例如，对于萤火虫生物发光系统中的发光的稳定化，Mg离子是有效的。当在发光系统中存在Mg离子时，发光行为以上升后的衰减被抑制的方式进行变化。特别是当焦磷酸及Mg离子在发光系统中共存时，发光行为变化大。即，发光稳定化变得极其显著，在相对于发光基质大量过剩的焦磷酸及Mg离子共存的情况下的发光行为急速上升并维持其而形成平稳的状态。在单独是Mg离子的情况下，在发光系统的Mg离子浓度为0.5mM以上的条件下，发光稳定化效果显著，随着Mg离子的浓度的增加而增强。为了实现平稳的发光行为，例如可以存在10μM以上、优选存在100μM以上的浓度的焦磷酸镁。此外，焦磷酸和Mg离子的比率不需要是当量比。焦磷酸镁虽然水溶性低，但通过使用焦磷酸镁，可以分别单独地供给焦磷酸及Mg离子。它们可以以游离形态及盐的形态供给到发光系统。在可以使用的Mg盐中包含硫酸镁及氯化镁等无机酸盐，以及乙酸镁等有机酸盐。在焦磷酸盐中包含与钠及钾等碱金属的盐，以及与镁及钙等碱土类金属的盐、与铁等的盐。它们也可以在水溶液状态下包含在发光系统中。此外，考虑到对酶的影响，优选以发光系统的pH成为2～10的方式来包含。
本发明的化合物也可以作为化学发光的基质来使用。化学发光通过如下方式而生成，即通过对本发明的化合物进行氧化而生成过氧化物，该过氧化物的分解物变成激励状态的发光物质。氧化例如能够通过在DMSO中使用叔丁醇钾使空气氧化来进行。在化学发光的情况下，设想是比萤火虫生物发光系统中的发光波长短的发光。
本发明的化合物可以作为生物学的测定/检测中的发光标记来利用。例如，可以为了标记氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等来使用。用于使本发明的化合物与这些物质结合的方案是本领域技术人员公知的。例如，可以由本领域技术人员使用公知的方法使本发明的化合物与目标物质的羧基及氨基结合。
此外，本发明的化合物可以在利用了通过发光基质的发光而检测发光甲虫荧光素酶活性的测定/检测中利用。例如，可以使本发明的化合物在上述那样的适合与发光甲虫荧光素酶反应的条件下进行反应。接着，检测来自该化合物的发光。例如，通过对导入了荧光素酶基因的细胞或动物供给本发明的化合物，可以测定/检测活体的目标基因或蛋白质的表达。本发明的化合物能够以各种不同的发光波长进行发光。因此，通过使用多个化合物，从而可以同时测定/检测多个目标的发光。
此外，波长由于越是长波长就越有透光性，所以组织穿透性也高。因此，本发明的以烯丙基修饰的荧光素及荧光素类似物与没有以烯丙基修饰的荧光素及荧光素类似物相比较，具有更长波长的发光。特别是通过在荧光素及荧光素类似物中，以烯丙基修饰苯并噻唑环部分的7位、苯酚部分的6位及萘酚部分的5位，从而可以使其发光波长向长波长侧偏移，因此，为了生物体内深部标记，以烯丙基修饰的荧光素及荧光素类似物是有用的。
实施例
在以下的实施例中具体说明本发明，但本发明并不限于这些范围。
1）设备分析及测定装置
pH测定：使用东洋滤纸株式会社制pH试纸UNIV进行测定。此外，作为pH计使用崛场会社制pH/ION METER F-23进行测定。
1H核磁共振谱（1H NMR）：使用日本电子社制Lambda-270型装置（270MHz）来测定。记载成“1H NMR（测定频率，测定溶媒）：δ化学位移值（氢的数量,多重性,自旋耦合常数）”。化学位移值（δ）将四甲基硅烷（δ=0）作为内部标准，以pp标明。多重性以s（单峰）、d（双重峰）、t（三重峰）、q（四重峰）、m（多重峰或复杂重合的信号）来表示，宽幅的信号记为br。自旋耦合常数（J）以Hz记载。
13C核磁共振谱（13C NMR）：使用日本电子会社制Lambda-270型装置（67.8MHz）来测定。记载成“13C NMR（测定频率，测定溶媒）：δ化学位移值（多重性）”。化学位移值（δ）将四甲基硅烷（δ=0）作为内标，以ppm标明。多重性以s（单峰）、d（二重峰）、t（三重峰）、q（四重峰）表示。
质谱（MS）：使用日本电子会社制JMS-600H型质量分析仪，通过电子轰击法（EI、电离能：70eV）来测定。使用日本电子会社制JMS-T100LC型质量分析仪AccuTOF，通过电喷雾离子化法（ESI）来测定。再有，装置的设定是脱溶剂气体250℃，孔口1温度80℃，针电压2000V，环状透镜电压10V，孔口1电压85V，孔口2电压5V。样品液体输送以注入法来进行，流速设为10μ1/分钟。记载为“MS（测定法）m/z质量数（相对强度）”。
比旋光度：使用日本分光会社制DIP-1000型旋光计来进行测定。光源使用钠灯，样品池(cell)使用圆筒形玻璃样品池（Φ10×100mm）。测定值是未校正的，数据是5次测定的平均值。分别针对D型、L型记载为“D或L：[α]温度测定值（浓度，测定溶媒）”。
2）层析
分析用薄层层析（TLC）：使用E.Merck会社制的TLC板，硅胶60F254（Art.5715）厚度0.25mm。TLC上的化合物的检测通过进行UV照射（254nm或356nm）及浸入显色剂之后进行加热而显色来进行。作为显色剂，使用将p-茴香醛（9.3ml）和乙酸（3.8ml）溶解于乙醇（340ml）中，添加浓硫酸（12.5ml）之后的显色剂。
使用制备薄层层析（PTLC）：E.Merck会社制的TLC板，硅胶60F254（Art.5744）厚度0.5mm，或者使用将E.Merck会社制的薄层层析用硅胶60GF254（Art.7730）在20cm×20cm的玻璃板上调整为厚度1.75mm之后的部件。
硅胶柱层析：使用E.Merck会社制的硅胶60F254（Art.7734）来进行。
3）基本操作
反应溶液的冷却通过将反应容器浸入到充满冷却介质的杜瓦瓶中来进行。在室温～4℃，使用冰水作为冷却介质，在4～-90℃中使用液氮-丙酮作为冷却介质。反应后的提取溶液的干燥通过用饱和食盐水洗净后加入无水硫酸钠或无水硫酸镁来进行。针对用树脂来进行反应后的中和的方式，使用Organo株式会社制阳离子交换树脂Amberlite（アンバーライト）IR120B NA或阴离子交换树脂Amberlite(アンバーライト)IRA400OH AG。溶液的减压浓缩是在吸引器的减压下（20～30mmHg）使用旋转蒸发器来进行的。痕量溶媒的除去是使用安装有液氮浴冷却阱的真空泵（大约1mmHg）来进行的。溶媒的混合比全部以体积比来表示。
4）溶媒
蒸馏水用使用ADVANTEC东洋株式会社制GS-200型蒸馏水制造装置进行蒸馏和离子交换处理的蒸馏水。
甲苯、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、2-丁酮是将关东化学株式会社制的有机合成用脱水溶媒或特级溶媒使用分子筛（4A）干燥后进行使用。
NMR测定用溶媒直接使用以下所示的物质。CDCl3：ISOTEC Inc.制99.7ATOM%D、0.03%TMS,CD3OD：ISOTEC Inc.制99.8ATOM%D（～0.7ATOM%13C）、0.05%TMS。
实施例17-烯丙基-萤火虫荧光素的合成
7-烯丙基-萤火虫荧光素的合成按照以下的合成方案来进行合成。
[化18]
Figure BDA0000469002370000211
2-氰基-6-羟基苯并噻唑32的合成
[化19]
Figure BDA0000469002370000212
向2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑31（51.4mg、0.271mmol）中加入吡啶盐酸盐（2.32g），在氩气氛下加热到200℃，使吡啶盐酸盐熔解并搅拌30分钟。对反应混合物进行冷却之后，加入1M盐酸（50ml），用乙酸乙酯（3×50ml）进行提取，用无水硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层硅胶层析{20cm×20cm×1.75mm×1个;己烷-乙酸乙酯（1:1）}进行精制，获得作为浅黄色固体的2-氰基-6-羟基苯并噻唑32（47.2mg、99%）。
1H NMR（270MHz,CD3OD）δ7.17（1H,dd,J=2.7,9.2Hz）,7.41（1H,d,J=2.7Hz）,7.99（1H,d,J=9.2Hz）
6-烯丙氧基-苯并噻唑-2-甲腈33的合成
[化20]
Figure BDA0000469002370000213
将2-氰基-6-羟基苯并噻唑32（336.2mg、1.91mmol）、烯丙基溴（331μl、3.82mmol）溶解在N,N二甲基甲酰胺（1.5ml）中，在氩气氛下加入碳酸钾（404.6mg、1.53mmol），在室温中搅拌1小时。在反应混合物中加入水（20ml），用乙酸乙酯（3×50ml）提取，用无水硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层硅胶柱层析{20cm×20cm×1.75mm×1个;己烷-乙酸乙酯（1:1）}进行精制，获得作为浅黄色固体的6-烯丙氧基-苯并噻唑-2-甲腈33（418.1mg、90%）。
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ8.07（1H,d,J=9.2Hz）,7.36（1H,d,J=2.4Hz）,7.26（1H,dd,J=2.4,9.2Hz）,6.08（1H,m）,5.41（comp.2H,m）
7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑-2-甲腈34的合成
[化21]
Figure BDA0000469002370000221
将6-烯丙氧基-苯并噻唑-2-甲腈33（201.0mg、0.93mmol）在氩气氛下在180℃进行加热熔解，搅拌1小时。在将反应混合物冷却之后，用制备薄层硅胶层析{20cm×20cm×1.75mm×1个;己烷-乙酸乙酯（1:1）}进行精制，获得作为浅黄色固体的7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑-2-甲腈34（100.0mg、50%）。
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ7.98（1H,d,J=8.9Hz）,7.17（1H,d,J=2.7Hz）,5.97（1H,m）,5.74（1H,s）,5.17-5.25（comp.2H）,3.65（1H,dt,J=1.3,6.2Hz）
7-烯丙基-萤火虫荧光素35的合成
[化22]
Figure BDA0000469002370000222
将2-氰基-7-烯丙基-6-羟基苯并噻唑34（50mg、0.23mmol）、D-半胱氨酸盐酸盐一水合物（45mg、0.25mmol）溶解于甲醇︰蒸馏水（2:1.6ml）中，在氩气氛下加入碳酸钾（50mg、0.36mmol），在室温搅拌40分钟。过滤所得的固体，用蒸馏水清洗，获得作为黄色固体的7-烯丙基-萤火虫荧光素35（64mg、84%）。
1H NMR（270MHz,CD3OD）δ7.78（1H,d,J=8.9Hz）,7.10（1H,dd,J=8.9Hz）,5.92（1H,m）,5.42（1H,t,J=8.9Hz）,5.15-5.03（comp.2H）,3.75（2H,d,J=8.1Hz）,3.59（2H,J=6.2Hz）
实施例2以烯丙基修饰萘酚部分的5位的化合物的合成
以下的化合物
[化23]
Figure BDA0000469002370000231
按照以下的合成方案来合成。
[化24]
Figure BDA0000469002370000241
[化25]
Figure BDA0000469002370000242
将2-萘甲酸11（500mg、2.66mmol）溶解于丙酮（10ml）中，在冰冷条件下加入碳酸钾（793mg、5.32mmol）、烯丙基溴（0.7ml、8.0mmol），在室温搅拌1小时。向反应液中加入水（100ml），用乙酸乙酯进行提取，用无水硫酸镁对有机层进行脱水。将对溶媒进行减压蒸馏而获得的粗制物用硅胶柱层析（己烷:乙酸乙酯=5:1）进行精制，获得作为淡黄色固体的化合物12（713mg、100%）。
1H NMR（400MHz,CDCl3）δ4.67（2H,d,J=4.8Hz）,5.33（2H,t,J=10.8Hz）,5.46（2H,m）,6.11（2H,m）,7.16（1H,d,J=2.4Hz）,7.22（1H,dd,J=2.4,8.8Hz）,7.74（1H,d,J=8.8Hz）,7.85（1H,d,J=9.2Hz）,8.04（1H,dd,J=1.6,8.8Hz）,8.55（1H,d，J=1.6Hz）
[化26]
Figure BDA0000469002370000251
在200℃加热化合物12（760mg、2.83mmol），搅拌18小时。用硅胶柱层析（己烷:乙酸乙酯=6:1）对反应混合物进行精制，获得作为淡黄色固体的化合物13（546mg、71%）。
[化27]
Figure BDA0000469002370000252
将化合物13（165mg、0.38mmol）溶解于四氢呋喃（1ml）中,在室温加入叔丁基二甲基氯硅烷（180mg、1.0mmol）、三乙胺（0.14ml、0.99mmol），搅拌1小时。通过薄层层析，在确认了原料消失之后，在-78℃向反应液加入二异丁基氢化铝1.0M、n-己烷溶液、1.0ml），搅拌1小时。在将反应液升温到0℃之后，加入水（10ml），用乙酸乙酯进行提取，用无水硫酸镁对有机层进行脱水。将对溶媒进行减压蒸馏而获得的残渣用硅胶柱层析（己烷:乙酸乙酯=6:1）进行精制，获得黄色油状的图中的化合物14（130mg、100%）。
1H NMR（400MHz,CDCl3）δ0.29（6H,s）,1.08（9H,s）,3.85（2H,d,6.0Hz）,4.77（2H,s）,4.97（1H,d,J=30.0Hz）,5.01（1H,d,J=23.2Hz）,6.02（1H,m）,6.02（1H,m）,7.12（1H,d,J=8.8Hz）,7.44（1H,d,J=8.8Hz）,7.62（1H,d,J=8.8Hz）,7.70（1H,s）,7.90（1H,J=8.8Hz）
[化28]
Figure BDA0000469002370000261
将化合物14（130mg、0.38mmol）溶解于（10ml）二氯甲烷中，在室温加入氧化锰（400mg、4.60mmol），搅拌4小时。通过薄层层析，在确认了原料消失之后，用C盐除去不溶物。对溶媒进行减压蒸馏，获得醛的粗制物。将粗制物溶解于苯（5ml）中,在室温加入（甲氧甲酰基亚甲基）三苯基正膦（1.2g、3.8mmol）搅拌6小时。将对溶媒进行减压蒸馏而获得的残渣用硅胶柱层析（己烷:乙酸乙酯=4:1）进行精制，获得作为淡黄色固体的化合物15（145mg、100%）。
1H NMR（400MHz,CDCl3）δ0.26（6H,s）,1.04（9H,s）,3.80（复合峰5H）,4.94（1H,d,J=38.5Hz）,4.98（1H,d,J=30.5Hz）,5.99（1H,m）,6.02（1H,m）,6.49（1H,d,J=16.0Hz）,7.11（1H,d,J=8.8Hz）,7.64（复合峰2H）,7.84（复合峰3H）
[化29]
Figure BDA0000469002370000262
将化合物15（53mg、0.14mmol）溶解于异丙醇（6ml）中，加入1M氢氧化钠水溶液（3ml、3mmol），在室温搅拌12小时。在对反应液进行冷却之后，使用阳离子交换树脂（アンバーライトIR-120H）进行中和。过滤出树脂，对溶媒进行减压蒸馏，以单一的生成物的方式获得作为淡黄色固体的化合物16（51mg、100%）。
1H NMR（400MHz,CD3OD）δ3.83（2H,d,J=6.1Hz）,4.96（复合峰2H）,6.00（1H,m）,6.56（1H,d,J=16.0Hz）,7.26（1H,d,J=8.8Hz）,7.76（复合峰3H）,8.97（复合峰2H）
[化30]
Figure BDA0000469002370000271
使D-半胱氨酸-S-三苯甲基化合物17（504mg、1.39mmol）溶解于甲醇（100ml）中，加入4N氯化氢的1,4-二氧杂环己烷溶液（5.4ml）。在室温进行17天搅拌之后，使用阴离子交换树脂アンバーライトIRA400进行中和。过滤出树脂，对溶媒进行减压蒸馏而获得的残渣用硅胶柱层析（己烷:乙酸乙酯=1:1）进行精制，获得淡黄色油状的化合物18（455mg、86%）。
1H NMR（400MHz,CDCl3）δ2.47（1H,dd,J=8.1,13Hz）,2.60（1H,dd,J=5.1,13Hz）,3.21（1H,dd,J=5.1,8.1Hz）,3.66（3H,s）,7.18-7.32（9H,复合峰）,7.40-7.54（6H,复合峰）
[化31]
Figure BDA0000469002370000272
将化合物16（50mg、0.13mmol）和化合物18（67mg、0.17mmol）溶解于吡啶（2ml）中，加入盐酸1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺（42ml、0.21mmol）、1-羟基苯并三唑（29mg、0.21mmol），在室温搅拌2小时。对反应溶媒进行减压蒸馏，用乙酸乙酯（50ml）进行稀释，加入水（50ml）。用饱和食盐水（20ml）对有机层进行清洗，进而用乙酸乙酯（50ml）对水层进行清洗，之后与有机层一起用无水硫酸镁进行脱水。对溶媒进行减压蒸馏获得酰胺的粗制物（图中的化合物19）。化合物19不稳定，不进行精制而进行以下的反应。
[化32]
Figure BDA0000469002370000281
将酰胺的粗制物（图中的化合物19）溶解于二氯甲烷（35ml）中，在0℃加入三苯基氧膦（106mg、0.37mmol）、三氟甲磺酸酐（160μl、0.88mmol）。进行了2小时搅拌之后，用氯仿（50ml）稀释反应液，加入水（50ml）。用饱和食盐水（20ml）对有机层进行清洗，进而用乙酸乙酯（50ml）对水层进行清洗，之后与有机层一起用无水硫酸镁进行脱水。将对溶媒进行减压蒸馏而获得的残渣用硅胶柱层析（氯仿:甲醇=9:1）进行精制，获得淡黄色油状的化合物20（36mg、2阶段收率80%）。
1H NMR（400MHz,CD3OD）δ3.62（2H,m）,3.82（复合峰5H）,5.05（复合峰2H）5.23（1H,t,J=19.0Hz）,6.05（1H,m）,7.14（复合峰2H,,J=8.7,16.2Hz）,7.26（1H,d,J=16.2Hz）,7.66（复合峰3H）,7.77（1H,s）,7.86（1H,d,J=9.0Hz）
[化33]
Figure BDA0000469002370000282
将化合物20（25mg、0.026mmol）溶解于四氢呋喃（1ml）、乙醇（5ml）及10mM碳酸铵水溶液（30ml）中，在40℃加入猪胰脂肪酶。进行24小时搅拌之后，用氯仿（50ml）稀释反应液，加入水（50ml）。在用C盐除去不溶物之后，对溶媒进行减压蒸馏。将获得的粗制物溶解于甲醇/水混和溶媒（1:1,2ml）中，利用快速液相层析（MightsilRP-18GP（3μm）、0.05％TFAaq.:MeCN=9:1→1:9（40分钟）、20℃、1ml/分钟、检测440nm（DAD））进行精制，获得图2那样的结果。化合物21在19.60分钟附近洗出。
1H NMR（500MHz,CD3OD）δ3.62-3.70（2H,m）,3.78（2H,d,J=5.75Hz）,4.90-4.95（2H,m）,5.21（1H,t,8.05Hz）,5.95-6.02（1H,m）,7.08（1H,m）,7.13（1H,d,9.15Hz）,7.39（1H,d,16.0Hz）,7.67（1H,s）,7.67（1H,d,16Hz）,7.89-7.90（2H,m）
参考例3：萘酚-单烯型的荧光素类似物的合成
TBS保护体32的合成
[化34]
Figure BDA0000469002370000291
将6-氰基-2-萘酚31（50.2mg、0.297mmol）、叔丁基二甲基氯硅烷（143mg、0.95mmol）、咪唑（160.7mg、2.37mmol）溶解于DMF（0.5mL）中，在室温搅拌1小时。向反应混合物中加入水（40mL），用乙酸乙酯（3×60mL）进行提取。用硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用柱层析｛硅胶36g；己烷-乙酸乙酯（8:1）｝进行精制，获得无色油状的TBS保护体32（69.9mg、83%）。
类似物32
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ0.01（6H,s）,0.74（9H,s）,6.80-7.80（6H,复合峰）。
醛33的合成
[化35]
将TBS保护体32（99.3mg、0.35mmol）、1M二异丁基铝（甲苯溶液）0.5mL在氩气氛下溶解于脱水甲苯（10mL）中，搅拌1小时。对反应混合物进行冰冷，加入丙酮（10mL）、饱和罗谢尔盐溶液（20mL）、水（30mL），用乙酸乙酯（3×50mL）进行提取。向有机层中加入硫酸钠，使其干燥之后进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层层析｛20cm×20cm×0.5mm×1个；己烷-乙酸乙酯（10:1）｝进行精制，获得黄色油状的醛33（74.4mg、74%）。
醛33
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ0.28（6H,s）,1.03（9H,s）,7.00-7.80（6H,复合峰）,10.10（1H,s）。
酯34的合成
[化36]
Figure BDA0000469002370000301
将醛33（63.9mg、0.22mmol）、乙氧甲酰基亚甲基三苯基正膦（121mg、0.349mmol）溶解于甲苯（2mL）中，在室温搅拌5小时。向反应混合物中加入水（50mL），用乙酸乙酯（3×50mL）进行提取。用硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层层析｛20cm×20cm×0.5mm×1个；己烷-乙酸乙酯（25:1）｝进行精制，获得黄色油状的酯34（76.6mg、97%）。
酯34
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ0.25（6H,s）,1.00（9H,s）,1.43（3H,t,J=7.0Hz）,4.23（2H,q,J=7.1Hz）,5.95（1H,d,J=12.5Hz）,6.47（1H,d,J=16.1Hz）,7.01-7.80（7H,复合峰）。
羧酸35的合成
[化37]
将酯34（90.8mg、0.253mmol）溶解于异丙醇（3ml）中，加入1M氢氧化钠水溶液（5mL），搅拌5小时。向反应混合物中加入阳离子交换树脂IR-120BNa进行中和。过滤出树脂，对滤液进行减压浓缩，获得作为浅黄色固体的羧酸35（54.9mg、quant.）。
羧酸35
1H NMR（270MHz,CD3OD）δ6.47（1H,d,J=15.8Hz）,7.00-7.90（7H,复合峰）。
甲酯36的合成
[化38]
Figure BDA0000469002370000311
使D-半胱氨酸-S-三苯甲基化合物（504mg、1.39mmol）溶解于甲醇（100ml）中，加入4N氯化氢的1,4-二氧杂环己烷溶液（5.4ml）。在室温进行17天搅拌之后，使用阴离子交换树脂IRA400OH AG进行中和。过滤出树脂，对获得的溶液进行减压浓缩。将获得的残渣用硅胶柱层析｛硅胶33.6g；己烷-乙酸乙酯（1:1）｝进行精制，获得浅黄色油状的甲酯36（455mg、86%）。
甲酯36
IR（neat）3380,3320,1740,1600cm-1
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ2.47（1H,dd,J=8.1,13Hz）,2.60（1H,dd,J=5.1,13Hz）,3.21（1H,dd,J=5.1,8.1Hz）,3.66（3H,s）,7.18-7.32（9H,复合峰）,7.40-7.54（6H,复合峰）
13C NMR（67.8MHz,CD3OD）δ36.90（t）,52.16（q）,53.78（d）,66.83（s）,126.8（d）×3,127.9（d）×6,129.6（d）×6,144.5（s）×3,174.2（s）。
酰胺37的合成
[化39]
Figure BDA0000469002370000321
在氩气氛下，向甲酯36（145mg、0.381mmol）的N，N-二甲基甲酰胺溶液（1ml）中加入羧酸35（54.9mg、0.254mmol）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（145mg、0.762mmol）、4-二甲氨基吡啶（155mg、1.27mmol），在室温中搅拌4小时。向反应混合物中加入水（50ml），用乙酸乙酯（3×50ml）进行提取，用无水硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层层析｛20cm×20cm×0.5mm×2个；己烷-乙酸乙酯（2:1）｝进行精制，获得浅黄色油状的酰胺37（58.4mg、40%）。
酰胺37
1H NMR（270MHz,CDCl3）δ2.75（2H,dd,J=4.6,7.9Hz）,δ3.75（3H,s）,4.77（1H,dd,2.7,7.9Hz）,6.35（1H,d,J=16.1Hz）,6.90-7.80（22H,复合峰）。
二氢噻唑38的合成
[化40]
Figure BDA0000469002370000322
在氩气氛下向酰胺37（60.3mg、0.109mmol）的二氯甲烷溶液（3ml）中加入三苯基氧膦（91mg、0.327mmol），三氟甲磺酸酐（100μL,0.546mmol），在室温搅拌1小时。向反应混合物中加入水（50ml），用二氯甲烷（3×50ml）进行提取，用无水硫酸钠对有机层进行干燥之后，进行减压浓缩。将获得的残渣用制备薄层层析｛20cm×20cm×0.5mm×2个；己烷-乙酸乙酯（1:2）｝进行精制，获得作为黄色固体的油状的二氢噻唑38（17.4mg、55%）。
二氢噻唑38
1H NMR（270MHz,CD3OD）δ3.63（2H,dd,J=3.1,8.9Hz）,3.81（3H,s）,5.27（1H,t,J=8.9Hz）,7.07-7.13（2H,复合峰）,7.33（1H,d,J=16.1Hz）,7.55-7.83（4H,复合峰）。
类似物39的合成
[化41]
Figure BDA0000469002370000331
将二氢噻唑38（6.3mg、0.0201mmol）溶解于乙醇（2mL）和10mM碳酸氢铵水溶液（8mL）的混和溶媒中，在氩气氛下加入少量的猪肝脂肪酶。在36℃搅拌17小时之后，对反应混合物进行过滤，对其滤液进行减压浓缩，获得作为黄色固体的类似物39（7.6mg、quant.）。
生物发光光谱
在200μL聚苯乙烯管内，混合磷酸钾缓冲液（0.5M、pH8.0、20μl）基质溶液（2.5mM、20μl）、酶溶液（20μl）、以及ATP-Mg溶液（10mM、40μl），进行发光光谱测定。酶溶液的浓度使用17μM的浓度。其中，萤火虫荧光素使用1.7μM的酶，酚型荧光素使用170μM的酶。此外，发光光谱测定的曝光时间设为60秒。其中，萤火虫荧光素以5秒进行。
实验结果
使用上述过程，测定了萤火虫荧光素及萘酚-单烯型荧光素类似物（上述化合物39）以及图1和图2所示的用烯丙基修饰的化合物的发光波长。萤火虫荧光素具有565nm的发光波长。此外，萘酚-单烯型荧光素类似物（上述化合物39）具有660nm的发光波长。图1及图2所示的化合物分别具有605nm及690nm的发光波长。通过以烯丙基修饰萤火虫荧光素的苯并噻唑环部分的7位，从而发光波长向长波长侧偏移了大约30～40nm。此外，通过以烯丙基修饰萘酚-单烯型荧光素类似物的萘酚部分的5位，从而发光波长向长波长侧偏移了大约30～40nm。
因此，可知荧光素及荧光素类似物通过用烯丙基进行修饰，可以使其发光波长向长波长侧偏移。
由此，可以确定用于变更实用的发光波长的指标。通过基于该指标设计荧光素衍生物，可以制造具有更长波长的发光波长的荧光素酶基质。
活体的生物成像
通过对导入了荧光素酶的转基因细胞、组织及生物施用本发明的荧光素类似物，可以使其发光。利用该反应，通过使用具有作为生物体之窗的690nm附近的发光波长的本发明的化合物，从而容易检测出活体的发光。例如，在向移植组织或移植细胞导入了荧光素酶之后，通过对移植动物施用本发明的化合物，从而能够对移植后的生物体内的、特别是现在难以成像的生物体内深处的移植组织的状态在活体状态下非侵害地进行成像。
在导入了荧光素酶的细胞等的活体的成像中，荧光素酶转基因细胞例如能够按照实验医学、Vol.26、No.17（增刊）、2008、110-117页中记载的过程进行制备。
在制备荧光素酶转基因细胞、组织及生物之后，为了移植组织等的成像，施用本发明的荧光素类似物。接着，通过IVIS Imaging System（Xenogen会社）等的装置，可以检测出本发明的化合物的发光。

Claims (4)

1.一种化合物或其盐，具有以下的通式：
[化1]
式中，
Z是
[化2]
Figure FDA0000469002360000012
R1是H或C1-4烷基，
R4是OH或NR2R3，式中R2及R3是H或C1-4烷基，
n是0、1、2或3。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中，R1、R2及R3是H，R4是OH。
3.一种荧光素酶的发光基质，其包含权利要求1或2所述的化合物。
4.一种发光检测试剂盒，其包含权利要求1或2所述的化合物。
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