CN1911917A - 一种制备荧光素的化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备荧光素的化合物及其制备方法，该化合物是利用苯并噻唑的酰基氟衍生物与半胱氨酸在有机溶剂中，以碱为催化剂，发生成环反应，一步生成如上所示的通式I，通式I中，R为氢，或烷基，或酰基，M为铵离子、钠离子、钾离子或钙离子；以通式I的化合物为母核结构制备的荧光素用于蔬菜、食品安全检测方面。该化合物的制备方法为：(1).制备中间体二酸1；(2).与苯胺衍生物的缩合；(3).噻唑3的制备；(4).酰基氟的制备；(5).酰基氟代物与半胱氨酸的成环反应；(6).制做荧光素的化合物的制备。本发明解决了现有合成荧光素的方法用腈类衍生物与半胱氨酸成环，比较复杂需分离纯化，固相合成实际很难达到，且难以进一步纯化。

Description

说明书 一种制备荧光素的化合物及其制备方法

一、技术领域：本发明属于生物检测试剂的合成和应用领域。

二、背景技术：包括细菌在内的所有细胞都含有数量处于动态平衡的能量物质ATP，在有氧条件下，荧光素酶能利用ATP的能量，让特定的化学物质(荧光素)发光，其产生的光强度与细菌(或细胞)数量成正相关关系(J.Am.Chem.S℃.1980，102，3199-3208)。利用这一基本原理，只要能提供对ATP高度敏感的荧光素酶和与之对应的荧光素底物，就可能实现对细菌总数的间接检测。而这一技术也无疑可用于食品检测、卫生预警和生物安全方面。(Biotechnol.Lett.1993，15，1111-1116 and Science，1986，234，856-859)。

围绕如何简便高效地合成荧光素，国际上已开展了一些有益的尝试工作。早在1961年，White等人就利用苯并噻唑的腈类衍生物与半胱氨酸成环来制备荧光素(J.Am.Chem.S℃.1961，83，2402-2403)，后来陆续开发的新方法基本上都是在此基础上改进的((J.Am.Chem.S℃.1963，85，337-343；J.Org.Chem.1965，30，2344-2348)。进入90年代，日本科学家利用固相合成技术，在PEG固相载体上合成了荧光素，减轻了分离纯化的压力(Bull.Chem.S℃.Jpn.，1992，65，392-395)。

三、发明内容：

1、发明目的：本发明提供一种荧光素的制备方法和用途，其目的是解决现有合成荧光素的方法中用腈类衍生物与半胱氨酸成环，过程比较复杂，需分离纯化；固相合成理论上需每一步反应的产率接近100％，实际很难达到，应用中往往若干步化学反应之后，从固相上切下来的产物是一些结构相似的化合物的混合体，难以进一步纯化等问题。

2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种制备荧光素的化合物，其特征在于：该化合物是利用苯并噻唑的酰基氟衍生物与半胱氨酸在有机溶剂中，以碱为催化剂，发生成环反应，一步生成如下所示的通式I：

                              通式I

通式I中，R为氢，或烷基，或酰基，M为铵离子、钠离子、钾离子或钙离子；以通式I的化合物为母核结构制备的荧光素用于蔬菜、食品安全检测方面。

上述的烷基选用甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基中的一种；上述的酰基选用乙酰基，苯甲酰基、叔丁酰基的一种。

所述的有机溶剂选用二氯甲烷、乙腈、1，4-二氧六环中的一种。

所述的碱选用三乙胺、吡啶、碳酸钾中的一种。

一种制备荧光素的化合物的制备方法，其特征在于：

(1).制备中间体二酸1：

在氮气，冰水浴条件下，向硫化钾的氯仿溶液中慢慢滴加三氯乙酸的氯仿溶液，剧烈搅拌，直到加完三氯乙酸，再搅拌40分钟，将用碳酸钾中和至中性的三氯乙酸的水溶液加到上述溶液中，仍在冰水浴中剧烈搅拌，溶液立即变为深红色，5分钟后，过滤掉产生的无机盐，得到化合物1的溶液，质谱检验正确后直接用于下一步反应；

(2).由上述得到的化合物1的溶液与苯胺衍生物的缩合：

在氮气下，将上述得到的化合物1的红色溶液加入到对甲氧基苯胺的乙醇水溶液中，室温下剧烈搅拌24小时，过滤产生的黄色固体，得到化合物2；

(3).噻唑3的制备：

将步骤(2)中得到的化合物2溶在10％的氢氧化钾水溶液中，然后慢慢滴加到铁氰化钾水溶液中，剧烈搅拌1小时，1M盐酸中和后过滤产生的固体产物，得到化合物3；

(4).酰基氟的制备：

将步骤(3)中得到的化合物3溶于二氯甲烷中，加入N，N’-二环己基碳亚胺(DCC，3当量)和氟化氢-吡啶复合物(HF-Pyr)，室温下反应20小时，然后用饱和的食盐水洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，用苯重结晶后得到化合物4；

(5).酰基氟代物与半胱氨酸的成环反应：

将步骤(4)中得到的化合物4和等当量的D-半胱氨酸和三乙胺共溶于1，4-二氧六环中，先在室温反应16小时，后升温至70度，反应6-10小时，冷却后，用1M盐酸中和至PH＝6-7，过滤收集生成的固体，得到黄色固体化合物5；

(6).荧光素的化合物的制备：

将步骤(5)中得到的化合物5溶于二氯甲烷中，0℃下加入市售三溴化硼，搅拌4小时后，减压蒸干，加入盐酸，过滤收集生成的固体，用甲醇重结晶，得到本发明制备荧光素的黄色固体化合物6。

上述步骤(6)中加入的盐酸用氢氧化钾中和至PH＝6-7。

3、优点及效果：通过本发明技术方案的实施，能够很好地解决现有合成荧光素的方法中用腈类衍生物与半胱氨酸成环，比较复杂需分离纯化；固相合成理论上需每一步反应的产率接近100％，实际很难达到，应用中往往若干步化学反应之后，从固相上切下来的产物是一些结构相似的化合物的混合体，难以进一步纯化等方面存在的问题。本发明通过制备苯并噻唑的酰基氟代物，与半胱氨酸一步成环，反应简单，产率高，通过结晶即可达到纯化目的，可用于多种荧光素衍生物的合成。方法简单实用，可用于多种荧光素衍生物的合成，特别是酚羟基被取代的该类荧光素的衍生物。

四、具体实施方式：

实施例1：

本发明是一种制备荧光素的化合物，该化合物是利用苯并噻唑的酰基氟衍生物与半胱氨酸在有机溶剂中，以碱为催化剂，发生成环反应，一步生成如下所示的通式I：

                              通式I

通式I中，R为氢，或烷基，或酰基，M为铵离子、钠离子、钾离子或钙离子；以通式I的化合物为母核结构制备的荧光素用于蔬菜、食品安全检测方面。

上述的溶剂选用二氯甲烷、乙腈、1、4-二氧六环中的一种。

上述的碱选用三乙胺、吡啶、碳酸钾中的一种。

利用本发明制得的化合物制备的荧光素可应用于蔬菜、食品安全检测等方面。本发明化合物的具体制备方法如下：

一般方法：核磁共振(¹H，¹³C NMR)由Bruker ARX 400在CDCl₃或CD₃OD中测得，以四甲基硅为内标；质谱用VG PLATFORM质谱仪，用ESI技术进样；薄层色谱(TLC)由HF₂₅₄硅胶板上用30％(v/v)的硫酸甲醇溶液或紫外(UV)检测器检测；柱色谱采用100～200目的硅胶，用甲醇、乙酸乙酯或石油醚(60～90℃)的混合液作为淋洗液，溶剂在小于60℃时，蔽光、减压蒸馏，以下未特别说明的化合物都是可商购或可参照文献制备的物质；

(1)、中间体二酸1的制备：

在氮气，冰水浴条件下，往硫化钾(3.0g)的氯仿溶液(20毫升)慢慢滴加三氯乙酸的氯仿溶液(1.85g/10ml)，剧烈搅拌，直到加完三氯乙酸，再搅拌30min，然后，三氯乙酸的水溶液(1.6g/10ml，用碳酸钾中和至中性)加到上述溶液中，仍在冰水浴中剧烈搅拌，溶液立即变为深红色，5分钟后，过滤掉产生的无机盐，得到化合物1的溶液，质谱检验正确后直接用于下一步反应；

(2)、与苯胺衍生物的缩合：

在氮气下，将上述得到的化合物1的红色溶液加到对甲氧基苯胺的乙醇水溶液中(1.0g/10ml，乙醇∶水＝1∶1)，室温下剧烈搅拌24小时，过滤产生的黄色固体，得到化合物2(0.5g)，晾干，可直接用于下一步反应，纯化后的化合物2的样品给出下列¹³C核磁数据：δ56.0，114.6，127.5，129.4，156.7，166.0，178.8.8ppm；

(3)噻唑3的制备：

将上述制得的化合物2(0.5g)溶在10％氢氧化钾水溶液(40ml)中，然后慢慢滴加到铁氰化钾水溶液中(9g/20ml)，剧烈搅拌1小时，1M盐酸中和后过滤产生的固体产物，得到化合物3(0.4g)，晾干，直接用于下一步反应，纯化后的化合物3的样品给出下列¹³C核磁数据：δ55.9，105.1，113.2，122.8，136.1，145.8，156.8，158.2，161.3ppm；

(4)、酰基氟的制备：

化合物3(1g)溶于30毫升二氯甲烷中，加入N，N’-二环己基碳亚胺(DCC，3当量)和氟化氢-吡啶复合物(HF-Pyr)，室温下反应20小时，然后用饱和的食盐水洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得到化合物4(0.8g)，可用苯重结晶，纯化后的化合物4的样品给出下列¹³C核磁数据：δ56.0，105.0，113.5，123.1，136.1，145.8，156.0，156.8，190.0ppm；

(5)、酰基氟代物与半胱氨酸的成环反应：

将1克化合物4和等当量的市售D-半胱氨酸和三乙胺共溶于1，4-二氧六环中(30毫升)，先在室温反应16小时，后升温至70度，反应6-10小时，冷却后，用1M盐酸中和至PH＝6-7，过滤收集生成的固体，得到黄色固体化合物5(800毫克)，纯化后的化合物5的样品给出下列¹³C核磁数据：δ34.5，55.9，80.1，105.1，113.2，122.8，136.1，145.8，156.0，163.8，177.5ppm；

(6)、荧光素的制备：

将上述制得的化合物5(500毫克)溶于20毫升二氯甲烷中，0℃下加入市售三溴化硼(2个当量)，搅拌4小时后，减压蒸干，加入1M盐酸(可用1M氢氧化钾中和至PH＝6-7)，过滤收集生成的固体，用甲醇重结晶，得到黄色固体化合物6(380毫克)，纯化后的样品给出下列¹H核磁数据：δ3.54(dd，1H)，3.75(t，1H)，5.14(t，1H)，7.04(dd，1H)，7.34(br s，1H)，7.79(d，1H)。

(7)、本发明的方法具有合成此类衍生物的通用性，专业人士完全可参照本方法制备其它荧光素。如反应(2)中，使用对-苄基苯胺即可制备化合物6中酚羟基苄基化的衍生物；反应(6)中，化合物6在吡啶-醋酸酐中可获得酚羟基乙酰化的荧光素，因此不以本发明实施例的具体实施方式限制本发明。

Claims (6)

1、一种制备荧光素的化合物，其特征在于：该化合物是利用苯并噻唑的酰基氟衍生物与半胱氨酸在有机溶剂中，以碱为催化剂，发生成环反应，一步生成如下所示的通式I：

                            通式I

通式I中，R为氢，或烷基，或酰基，M为铵离子、钠离子、钾离子或钙离子；以通式I的化合物为母核结构制备的荧光素用于蔬菜、食品安全检测方面。

2、根据权利要求1所述的一种制备荧光素的化合物，其特征在于：上述的烷基选用甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基中的一种；上述的酰基选用乙酰基，苯甲酰基、叔丁酰基的一种。

3、根据权利要求1所述的一种制备荧光素的化合物，其特征在于所述的有机溶剂选用二氯甲烷、乙腈、1，4-二氧六环中的一种。

4、根据权利要求1所述的一种制备荧光素的化合物，其特征在于所述的碱选用三乙胺、吡啶、碳酸钾中的一种。

5、一种制备荧光素的化合物的制备方法，其特征在于：

(1).制备中间体二酸1：

在氮气，冰水浴条件下，向硫化钾的氯仿溶液中慢慢滴加三氯乙酸的氯仿溶液，剧烈搅拌，直到加完三氯乙酸，再搅拌40分钟，将用碳酸钾中和至中性的三氯乙酸的水溶液加到上述溶液中，仍在冰水浴中剧烈搅拌，溶液立即变为深红色，5分钟后，过滤掉产生的无机盐，得到化合物1的溶液，质谱检验正确后直接用于下一步反应；

(2).由上述得到的化合物1的溶液与苯胺衍生物的缩合：

在氮气下，将上述得到的化合物1的红色溶液加入到对甲氧基苯胺的乙醇水溶液中，室温下剧烈搅拌24小时，过滤产生的黄色固体，得到化合物2；

(3).噻唑3的制备：

将步骤(2)中得到的化合物2溶在10％的氢氧化钾水溶液中，然后慢慢滴加到铁氰化钾水溶液中，剧烈搅拌1小时，1M盐酸中和后过滤产生的固体产物，得到化合物3；

(4).酰基氟的制备：

将步骤(3)中得到的化合物3溶于二氯甲烷中，加入N，N’-二环己基碳亚胺(DCC，3当量)和氟化氢—吡啶复合物(HF-Pyr)，室温下反应20小时，然后用饱和的食盐水洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，用苯重结晶后得到化合物4；

(5).酰基氟代物与半胱氨酸的成环反应：

将步骤(4)中得到的化合物4和等当量的D-半胱氨酸和三乙胺共溶于1，4-二氧六环中，先在室温反应16小时，后升温至70度，反应6-10小时，冷却后，用1M盐酸中和至PH＝6-7，过滤收集生成的固体，得到黄色固体化合物5；

(6).荧光素的化合物的制备：

将步骤(5)中得到的化合物5溶于二氯甲烷中，0℃下加入市售三溴化硼，搅拌4小时后，减压蒸干，加入盐酸，过滤收集生成的固体，用甲醇重结晶，得到本发明制备荧光素的黄色固体化合物6。

6、根据权利要求1所述的一种制备荧光素的化合物的制备方法，其特征在于：上述步骤(6)中加入的盐酸用氢氧化钾中和至PH＝6-7。