JP5510914B2 - 細胞透過型新規蛍光色素 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞透過型新規蛍光色素に関する。特に、マルチカラーイメージングに対応した蛍光プロープに関する。
従来技術では、蛍光色素の多くがストークスシフトの小さい化合物であるため、マルチカラーイメージングにおいて併用することが困難であったまた、分子設計を少し変えることでその蛍光挙動を制御できる色素骨格は稀であった。
7−ヒドロキシキノリン骨格はストークスシフトが大きいためマルチカラーイメージングに適している。また7位の水酸基の構造により蛍光特性が変化するため、リン酸分解酵素活性の基質として細胞外で用いた例は報告されている。（特許文献１）
Francisco Caturla et al, New fluorescent probes for testing combinatorial catalysts with phosphodiesterase and esterase activities., Tetrahedron, 2004, Vol. 60, No.8, p.1903-1911
In Kyung Rhee et al, Determining Acetylcholinesterase Inhibitory Activity in Plant Extracts Using a Fluorimetric Flow Assay., Phytochem. Anal., 2003, Vol. 14, No. 3, p.145-149
7−ヒドロキシキノリン骨格そのものは細胞膜を透過しないため、細胞導入型の蛍光プローブに応用することは困難であった。
このような状況下、あらたな骨格の蛍光色素分子を開発し、その合成方法、精製方法も合わせて開発し、細胞導入型プロープの骨格として応用することが求められている。
したがって、本発明は、以下の化合物、その誘導体またはそれらの塩、これらを含む（細胞導入用の）蛍光組成物、これらの化合物等を用いた細胞標識法、これらの化合物等の製造方法を提供する。
［１］下記式（I）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドであり、
Ｒ３は、水素原子、置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、カルボニル、アルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、（Ｃ１−３）アルキル、アリール（Ｃ１−３）アルキル、（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロ（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロアリール（Ｃ１−３）アルキル、アリール及びヘテロアリール（それぞれ置換又は無置換）からなる群より選ばれ、
ｎは、０、１、２、または３であり、
ｍは、０、１、または２である）。
［２］Ｒ１が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
Ｒ２が存在しないか、またはメチルであり、
Ｒ３がメチルエチルホルマートであり、
Ｘ２がメチルであり、
ｎが０であり、
ｍが１である、上記［１］に記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩。
［３］下記式（ＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキル−フェニル、アルキル−カルボニル、もしくはアルキル−アミドである。）。
［４］エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）；
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）；
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium）；
これらの誘導体、またはこれらの塩。
［５］７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium）；
これらの誘導体、またはこれらの塩。
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、蛍光組成物。
［７］下記式（ＩＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物：
（式中、Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など））であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）。
［８］Ｒ１が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
Ｒ２が存在しないか、またはメチルである、上記［７］に記載の細胞内導入用蛍光組成物。
［９］７−アセトキシ−１−メチルキノリニウム（7-acetoxy-1-methylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−１−メチルキノリニウム（7-hydroxy-1-methylquinolinium）；
これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物。
［１０］細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用するための、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはこれらの塩、または上記［６］〜［９］のいずれかに記載の蛍光組成物。
［１１］細胞を標識する方法であって、
細胞と、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはそれらの塩、または上記［６］〜［９］のいずれかに記載の細胞内導入用蛍光組成物とを溶液中で混合し、所定時間インキュベートする工程を含む、方法。
［１２］ｍ−アミノフェノールと３−オキソ酪酸エチルエステルとを、ＢｉＣｌ３の存在下で混合することを含む、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）の合成方法。
［１］下記式（I）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドであり、
Ｒ３は、水素原子、置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、カルボニル、アルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、（Ｃ１−３）アルキル、アリール（Ｃ１−３）アルキル、（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロ（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロアリール（Ｃ１−３）アルキル、アリール及びヘテロアリール（それぞれ置換又は無置換）からなる群より選ばれ、
ｎは、０、１、２、または３であり、
ｍは、０、１、または２である）。
［２］Ｒ１が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
Ｒ２が存在しないか、またはメチルであり、
Ｒ３がメチルエチルホルマートであり、
Ｘ２がメチルであり、
ｎが０であり、
ｍが１である、上記［１］に記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩。
［３］下記式（ＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキル−フェニル、アルキル−カルボニル、もしくはアルキル−アミドである。）。
［４］エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）；
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）；
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium）；
これらの誘導体、またはこれらの塩。
［５］７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium）；
これらの誘導体、またはこれらの塩。
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、蛍光組成物。
［７］下記式（ＩＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物：
（式中、Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（リン酸など））であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）。
［８］Ｒ１が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
Ｒ２が存在しないか、またはメチルである、上記［７］に記載の細胞内導入用蛍光組成物。
［９］７−アセトキシ−１−メチルキノリニウム（7-acetoxy-1-methylquinolinium）；
７−ヒドロキシ−１−メチルキノリニウム（7-hydroxy-1-methylquinolinium）；
これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物。
［１０］細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用するための、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはこれらの塩、または上記［６］〜［９］のいずれかに記載の蛍光組成物。
［１１］細胞を標識する方法であって、
細胞と、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはそれらの塩、または上記［６］〜［９］のいずれかに記載の細胞内導入用蛍光組成物とを溶液中で混合し、所定時間インキュベートする工程を含む、方法。
［１２］ｍ−アミノフェノールと３−オキソ酪酸エチルエステルとを、ＢｉＣｌ３の存在下で混合することを含む、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）の合成方法。
本発明により、７−ヒドロキシキノリン（本明細書中、「HQ」と略す場合がある。）の新規誘導体が提供される。本発明者らは、本発明の一実施形態として7−ヒドロキシキノリンの2，4位およびNを化学修飾した新規誘導体を合成し、この化合物のヒドロキシル基を任意の構造で保護・脱保護して化学構造を変化させることで、自発的に細胞内に導入され、蛍光のON／OFFがコントロール可能な蛍光プローブが設計できることを見出した。このプローブは、スト−クスシフトが非常に大きく、マルチカラーイメージングに対応しており、また蛍光量子収率も大きいという利点を有する。
具体的には、新規誘導体として、例えば、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（本明細書中、「meHQ」と略すことがある。）が提供される。通常7-ヒドロキシキノリン(HQ)骨格そのままでは細胞に導入できないが、この新規誘導体のヒドロキシル基をアセチル化して蛍光を発しないように物性を変化させ、またNメチル化することで膜透過性を向上させることにより、細胞膜を透過し細胞内のみで黄色い蛍光を発する色素７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（本明細書中、「mmeHQ-Ac」と略すことがある。）が得られる。
本発明により、自発的に細胞内に導入され、蛍光のON／OFFがコントロール可能な蛍光プローブが提供される。
本発明により、マルチカラーイメージングに対応した蛍光プローブ開発を、容易な設計・合成により可能となる。
本発明は、一実施形態において、下記式（I）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステルであり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドであり、
Ｒ３は、水素原子、置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、カルボニル、アルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、Ｃ１−３アルキル、アリール（Ｃ１−３）アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、ヘテロ（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロアリール（Ｃ１−３）アルキル、アリール及びヘテロアリール（それぞれ置換又は無置換）からなる群より選ばれ、
ｎは、０、１、２、または３であり、
ｍは、０、１、または２である）を提供する。典型的には、上記化合物は、蛍光色素である。
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステルであり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドであり、
Ｒ３は、水素原子、置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、カルボニル、アルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、Ｃ１−３アルキル、アリール（Ｃ１−３）アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、ヘテロ（Ｃ３−１２）シクロアルキル、ヘテロアリール（Ｃ１−３）アルキル、アリール及びヘテロアリール（それぞれ置換又は無置換）からなる群より選ばれ、
ｎは、０、１、２、または３であり、
ｍは、０、１、または２である）を提供する。典型的には、上記化合物は、蛍光色素である。
Ｒ１で表されるＣ１−６アルキルカルボニル基における「Ｃ１−６アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
Ｒ１で表されるアルキルエステルの「アルキル」としては、例えば、Ｃ１−６アルキルが挙げられ、Ｃ１−６アルキルとしては、例えば、上記のものと同様のものが挙げられる。エステルとしては、リン酸エステルなどが挙げられる。
Ｒ２で表されるＣ１−６アルキルとしては、Ｒ１について上記のＣ１−６アルキルの例と同様のものが挙げられる。
Ｒ２で表されるアルキルフェニル、アルキルカルボニル、およびアルキルアミドのアルキルとしては、例えば、Ｃ１−６アルキルが挙げられ、Ｃ１−６アルキルとしては、例えば、Ｒ１について上記したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ３で表される「置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル」における、「Ｃ１−６アルキル」としては、例えば、Ｒ１について上記したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ３で表される「置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル」における「置換基」としては、例えば、置換基が付加されていてもよいカルボン酸エステル、リン酸エステル、等が含まれる。
Ｒ３で表されるアルキルカルボニル、およびアルキルアミドのアルキルとしては、例えば、Ｃ１−６アルキルが挙げられ、Ｃ１−６アルキルとしては、例えば、Ｒ１について上記したものと同様のものが挙げられる。
上記「置換基が付加されていてもよいカルボン酸エステル」における、付加されていてもよい置換基の例としては、水素原子、Ｃ１−６アルキル（例：メチル、エチル、プロピル等）、フェニル等が含まれる。
Ｘ１またはＸ２で表されるＣ１−３アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等が挙げられる。
好ましい実施形態では、Ｒ１は、水素原子またはメチルカルボニル基であり、Ｒ２は存在しないか、またはメチルであり、Ｒ３はメチルエチルホルマートであり、Ｘ２はメチルであり、ｎが０であり、ｍが１である。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、下記式（ＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（例：アルキルリン酸エステル）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）が提供される。
（式中、
Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（例：アルキルリン酸エステル）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）が提供される。
好ましい実施形態は、
エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート、
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート、
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート、
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート、
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
さらにより好ましい実施形態は、
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム、
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
最も好ましい実施形態は、７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウムである。
本発明のさらに別の実施形態によれば、上記化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、蛍光組成物が提供される。好ましい実施形態では、これらの蛍光組成物は、細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用される。
本発明のさらに別の実施形態によれば、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物：
（式中、Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（例：アルキルリン酸エステルなど）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）が提供される。
（式中、Ｒ１は、水素原子、カルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、またはアルキルエステル（例：アルキルリン酸エステルなど）であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−６アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボニル、もしくはアルキルアミドである。）が提供される。
好ましい実施形態では、Ｒ１は水素原子またはメチルカルボニル基であり、Ｒ２は存在しないか、またはメチルである。
より好ましい実施形態では、７−アセトキシ−１−メチルキノリニウム、７−ヒドロキシ−１−メチルキノリニウム、これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用の蛍光組成物が提供される。これらの細胞内導入用の蛍光組成物は、好ましくは、細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用される。
本発明の別の実施形態によれば、細胞と、上記化合物、その誘導体もしくはそれらの塩、または上記の細胞内導入用の蛍光組成物とを溶液中で混合し、所定時間インキュベートする工程を含む、細胞標識方法が提供される。
さらに別の実施形態によれば、ｍ−アミノフェノールと３−オキソ酪酸エチルエステルとを、ＢｉＣｌ３の存在下で混合することを含む、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）の合成方法が提供される。
本発明の典型的な実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で表される蛍光色素のＲ１を、水素原子から任意の酵素などによる化学反応により脱保護される置換基（例えば、カルボニル基）へ化学修飾することによって細胞透過性にし、細胞内に導入し、細胞のイメージングに使用する。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
図２に示すように、HQおよびmeHQの各種誘導体を合成した。
[参考例１]
[参考例１]
キノリン−７−イルアセタート（quinolin-7-yl acetate）(HQ-Ac)の合成
7-hydroxyquinoline 200 mg (1.38 mmol), ジクロロメタン60 ml, トリエチルアミン0.4 mlを50 mlナスフラスコに入れ、室温で30分撹拌した。反応溶液を氷浴に移した後、acetylchloride 0.2 ml (2.46 mmol)を滴下し、そのまま7.5時間撹拌した。反応終了後、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。油層を水、食塩水で洗い、溶媒を留去した。生成物を酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢エチ＝1：1）にて分離精製し、目的物175 mg (収率68%)を得た。
7-hydroxyquinoline 200 mg (1.38 mmol), ジクロロメタン60 ml, トリエチルアミン0.4 mlを50 mlナスフラスコに入れ、室温で30分撹拌した。反応溶液を氷浴に移した後、acetylchloride 0.2 ml (2.46 mmol)を滴下し、そのまま7.5時間撹拌した。反応終了後、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。油層を水、食塩水で洗い、溶媒を留去した。生成物を酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢エチ＝1：1）にて分離精製し、目的物175 mg (収率68%)を得た。
１H NMR (270 MHz, CDCl3)
8.91 (dd, 4.3, 1.6 Hz, 1H), 8.16-8.13 (m, 1H), 7.83-7.81(m, 2H), 7.40-7.31(m, 2H), 2.38 (s, 3H)
[参考例２]
8.91 (dd, 4.3, 1.6 Hz, 1H), 8.16-8.13 (m, 1H), 7.83-7.81(m, 2H), 7.40-7.31(m, 2H), 2.38 (s, 3H)
[参考例２]
７−アセトキシ−１−メチルキノリニウム（7-acetoxy-1-methylquinolinium）（mHQ-Ac）の合成
7HQ-Ac 73 mg (0.39 mmol)のジクロロメタン溶液15 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨウ化メチル1.5 mlを加え、45℃で24時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応を止めた。沈殿を吸引ろ過、ジクロロメタンで洗い、真空乾燥し、目的物を得た。
7HQ-Ac 73 mg (0.39 mmol)のジクロロメタン溶液15 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨウ化メチル1.5 mlを加え、45℃で24時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応を止めた。沈殿を吸引ろ過、ジクロロメタンで洗い、真空乾燥し、目的物を得た。
１H NMR (270 MHz, CD3OD)
9.38(d, 5.9 Hz, 1H), 9.21(d, 8.1Hz, 1H), 8.48(d, 8.9 Hz, 1H), 8.36(d, 1.6 Hz, 1H), 8.06(dd, 5.9, 8.4 Hz, 1H), 7.89(dd, 8.9, 1.9 Hz, 1H), 4.65(s, 3H), 2.43(s, 3H)
[参考例３]
9.38(d, 5.9 Hz, 1H), 9.21(d, 8.1Hz, 1H), 8.48(d, 8.9 Hz, 1H), 8.36(d, 1.6 Hz, 1H), 8.06(dd, 5.9, 8.4 Hz, 1H), 7.89(dd, 8.9, 1.9 Hz, 1H), 4.65(s, 3H), 2.43(s, 3H)
[参考例３]
７−ヒドロキシ−１−メチルキノリニウム（7-hydroxy-1-methylquinolinium）（mHQ）の合成
7HQ 110 mg (0.76 mmol)とジクロロメタン30 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨウ化メチル8.5 ml(60 mmol)を加え、35℃で43時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応を止め沈殿を吸引ろ過し、粉末を得た。これをカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール= 3:1)にて分離精製し、目的物71 mg (収率33％)を得た。
7HQ 110 mg (0.76 mmol)とジクロロメタン30 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨウ化メチル8.5 ml(60 mmol)を加え、35℃で43時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応を止め沈殿を吸引ろ過し、粉末を得た。これをカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール= 3:1)にて分離精製し、目的物71 mg (収率33％)を得た。
１H NMR (270 MHz, CD3OD)
8.54(d, 6.2 Hz, 1H), 8.47(d, 7.8 Hz, 1H), 7.85(d, 9.2 Hz, 1H), 7.22-7.11(m, 2H), 6.78(s, 1H), 4.17(s, 1H)
8.54(d, 6.2 Hz, 1H), 8.47(d, 7.8 Hz, 1H), 7.85(d, 9.2 Hz, 1H), 7.22-7.11(m, 2H), 6.78(s, 1H), 4.17(s, 1H)
エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）（meHQ）の合成
ｍ−アミノフェノール（５５０ｍｇ，５ｍｍｏｌ）およびＢｉＣｌ３の混合物を、３−オキソ酪酸エチルエステル（７９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）中、７５℃で１時間攪拌した。反応混合物を、クロロホルムで抽出し、水で洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ得た後、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＳｉＯ２，ヘキサン−ＡｃＯＥｔ １：１）、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（meHQ）１９４ｍｇを１１％の収率で得た。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ 7.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.15 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.57 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz,1H), 4.25 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl): δ 170.2, 159.6, 157.7, 148.0, 140.9, 124.2, 120.1, 119.5, 119.0, 108.1, 61.6, 38.5, 28.3, 14.4. MS calcd for C14H15NO3 245.1; (ESI)m/z found 246.4(M+H)+. Anal. Calcd for C14H15NO3 : C, 68.56; H, 6.16; N; 5.71. Found: C, 68.48; H, 6.22; N, 5.55. mp 205.
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート（ethyl 2-(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate）（meHQ-Ac）の合成
トリエチルアミン（０．２７ｍｌ，１．９５ｍｍｏｌ）を、meHQ（２００ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２００ｍｌ）に添加し、２０分間室温で攪拌した。次いで、この混合物に塩化アセチル（０．１１ｍｌ，１．５６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、２時間攪拌した。水を加えて反応を止め、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水およびブラインで洗浄した。溶媒を蒸発させた後、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン−ＡｃＯＥｔ １：１）で精製し、２０７ｍｇのmeHQ-Acを９２％の収率で得た。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ; 7.95(d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.74(d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.21(s, 1H), 4.16(q, J = 7.0Hz, 2H), 3.99(s, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl): δ. 169.7, 168.9, 159.4, 151.0, 148.6, 139.8, 124.4, 123.4, 123.1, 121.0, 120.1, 61.3, 38.4, 25.2, 21.2, 14.1. Anal. Calcd for C16H17NO4 : C, 66.89; H, 5.96; N; 4.88. Found: C, 66.71; H, 6.05; N; 4.76.
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（mmeHQ-Ac）の合成
meHQ-Ac（１００ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）とヨウ化メチル（０．５ｍｌ，８．０３ｍｍｏｌ）との混合物を、密封したチューブ内で７０〜８０℃で１時間加熱した。生成された沈殿をろ過によって回収し、冷ＡｃＯＥｔで十分に洗浄した。粗生成物をエタノール／ジエチルエステルからの再結晶化により精製し、４１ｍｇのmmeHQ-Acを２８％の収率で得た。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ; 8.28(d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.28(s, 1H), 7.99(s, 1H), 7.71(d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.61(s, 3H), 4.31(s, 2H), 4.20(q, J = 7.0Hz, 2H), 3.31(s, 3H), 2.45(s, 3H), 1.28(t, J= 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ. 168.3, 167.9, 160.5, 155.5, 150.9, 140.7, 128.2, 127.1, 125.5, 124.9, 111.9, 62.4, 42.3, 39.1, 25.5, 21.6, 14.3. Anal. Calcd for C17H20NO4+I- : C, 47.57; H, 4.70; N; 3.26. Found: C, 47.43; H, 4.60; N; 3.10
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（mmeHQ）の合成
meHQ（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）とヨウ化メチル（０．５ｍｌ，８．０３ｍｍｏｌ）との混合物を、ジクロロメタン（２ｍｌ）中、密封したチューブ中で６０℃で１９時間加熱した。精製された沈殿をろ過により回収した。粗生成物をジクロロメタンからの再結晶化により精製し、６４ｇのmmeHQを４０％の収率で得た。
meHQ（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）とヨウ化メチル（０．５ｍｌ，８．０３ｍｍｏｌ）との混合物を、ジクロロメタン（２ｍｌ）中、密封したチューブ中で６０℃で１９時間加熱した。精製された沈殿をろ過により回収した。粗生成物をジクロロメタンからの再結晶化により精製し、６４ｇのmmeHQを４０％の収率で得た。
1H NMR (270 MHz, CD3OD): δ; 8.29(d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.70(s, 1H), 7.57(d, J = 2.2Hz, 1H), 7.48(dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.32(s, 3H), 4.19(q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.02(s, 3H), 1.25(t, J= 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ. 170.1, 165.3, 159.6, 152.2, 143.8, 130.1, 124.2, 123.3, 122.0, 102.5, 62.9, 40.0, 30.8, 23.3, 14.5. Anal. Calcd for C15H18NO3+I- : C, 46.53; H, 4.69; N; 3.62. Found: C, 46.22; H, 4.72; N; 3.35
mHQ-Ac、mmeHQ-Ac、およびこれらの加水分解産物の吸収・蛍光特性の測定
測定は全て１％DMSO水溶液中、空気下で行った。測定には下記の機器を用いた。
１）吸収スペクトルの測定には、島津UV-1600型可視紫外分光光度計を用いた。
２）蛍光スペクトルおよび蛍光励起スペクトルの測定には、日立F-4500型蛍光光度計を用いた。
３）蛍光量子収率の測定には、光源に日立F-4500型蛍光光度計を用い、標準サンプルにはアントラセンのエタノール溶液を使用し、アントラセンの蛍光量子収率（Φｆ＝０．２７）と比較する相対法により算出した。
測定は全て１％DMSO水溶液中、空気下で行った。測定には下記の機器を用いた。
１）吸収スペクトルの測定には、島津UV-1600型可視紫外分光光度計を用いた。
２）蛍光スペクトルおよび蛍光励起スペクトルの測定には、日立F-4500型蛍光光度計を用いた。
３）蛍光量子収率の測定には、光源に日立F-4500型蛍光光度計を用い、標準サンプルにはアントラセンのエタノール溶液を使用し、アントラセンの蛍光量子収率（Φｆ＝０．２７）と比較する相対法により算出した。
（結果）
図３ＡおよびＢは、測定したmeHQ-AcおよびmmeHQ-Acの加水分解前後の吸収・蛍光特性を示す。図３Ａに示すように、mHQ-Acが加水分解されてmHQになると、吸収スペクトルのピークが318nmから405nmへシフトするとともに、517nm付近に蛍光ピークが現れた。
さらに図３Ｂに示すように、mmeHQ-Acが加水分解されて、mmeHQになると、吸収スペクトルのピークが324nmから405nmにシフトし、503nm付近に蛍光ピークが現れた。
図３ＡおよびＢは、測定したmeHQ-AcおよびmmeHQ-Acの加水分解前後の吸収・蛍光特性を示す。図３Ａに示すように、mHQ-Acが加水分解されてmHQになると、吸収スペクトルのピークが318nmから405nmへシフトするとともに、517nm付近に蛍光ピークが現れた。
さらに図３Ｂに示すように、mmeHQ-Acが加水分解されて、mmeHQになると、吸収スペクトルのピークが324nmから405nmにシフトし、503nm付近に蛍光ピークが現れた。
細胞内へのmHQ-AcおよびmmeHQ-Acの導入
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmHQ-AcおよびmmeHQ-Ac を、終濃度１０μＭになるように添加した。その後、オリンパスIX70蛍光顕微鏡を用いて、励起フィルター ４６０-４９０ｎｍ、吸収フィルター ５００ｎｍリングパスフィルターの条件下で連続撮影を行った。５０分経過後、ＭＥＭ培地にて細胞を２回洗浄した後ふたたびＭＥＭ培地を加えて、同条件にて蛍光撮影を行った。
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmHQ-AcおよびmmeHQ-Ac を、終濃度１０μＭになるように添加した。その後、オリンパスIX70蛍光顕微鏡を用いて、励起フィルター ４６０-４９０ｎｍ、吸収フィルター ５００ｎｍリングパスフィルターの条件下で連続撮影を行った。５０分経過後、ＭＥＭ培地にて細胞を２回洗浄した後ふたたびＭＥＭ培地を加えて、同条件にて蛍光撮影を行った。
（結果）
図４左に示すように、meHQ-Acを添加後細胞内外にあまり変化が見られず、５０分後に細胞外液を緩衝溶液で洗うと、細胞内が光っていた。
他方、図４右に示すように、mmeHQ-Acを添加すると直後から細胞内が明るく光っている様子が観測された。なお、図４の最下段は倍率を上げて、色素の局在を見た写真である。
meHQ-Acは核膜・小胞体・核小体などに色素が局在したのに対し、mmeHQ-Acは細胞内全体に分布していた。
図４左に示すように、meHQ-Acを添加後細胞内外にあまり変化が見られず、５０分後に細胞外液を緩衝溶液で洗うと、細胞内が光っていた。
他方、図４右に示すように、mmeHQ-Acを添加すると直後から細胞内が明るく光っている様子が観測された。なお、図４の最下段は倍率を上げて、色素の局在を見た写真である。
meHQ-Acは核膜・小胞体・核小体などに色素が局在したのに対し、mmeHQ-Acは細胞内全体に分布していた。
meHQ-AcとmmeHQ-Acを細胞に添加したときのフローサイトメトリー
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmHQ、mHQ-AcおよびmmeHQ-Ac を、終濃度３０μＭになるように添加した。２時間後に細胞をトリプシン処理によって浮遊させ、フローサイトメーターFlicyme（三井造船）によって解析した。
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmHQ、mHQ-AcおよびmmeHQ-Ac を、終濃度３０μＭになるように添加した。２時間後に細胞をトリプシン処理によって浮遊させ、フローサイトメーターFlicyme（三井造船）によって解析した。
（結果）
図５上欄に示すように、mHQ-Acは細胞の60％、mmeHQ-Acは細胞の75％を染色していた。図５下欄に示したように、色素を添加していない細胞やその他の誘導体を添加した細胞においては染色が見られなかった。
図５上欄に示すように、mHQ-Acは細胞の60％、mmeHQ-Acは細胞の75％を染色していた。図５下欄に示したように、色素を添加していない細胞やその他の誘導体を添加した細胞においては染色が見られなかった。
mmeHQ-Acを細胞に添加し、PI染色したときのフローサイトメトリー
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmmeHQ-Ac を、終濃度１０μＭになるように添加した。１２時間後に細胞をトリプシン処理によって浮遊させ、終濃度２０μｇ／ｍＬになるようにＰＩを添加し、フローサイトメーターFACSCalibur（BD）によって解析した。死細胞との比較として、７０％エタノール中にて浮遊細胞を固定した後に、ＰＩを添加した解析も行った。
（手順）
１０％仔牛血清を含むＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２下３７度で培養しているヒト上皮系のＨＥｐ-２細胞に、DMSOに１ｍＭになるように溶解させたmmeHQ-Ac を、終濃度１０μＭになるように添加した。１２時間後に細胞をトリプシン処理によって浮遊させ、終濃度２０μｇ／ｍＬになるようにＰＩを添加し、フローサイトメーターFACSCalibur（BD）によって解析した。死細胞との比較として、７０％エタノール中にて浮遊細胞を固定した後に、ＰＩを添加した解析も行った。
（結果）
図６に示すように、mmeHQ-Ac処理によって死細胞に見られるようなFSC/SSCのパターンに大きな変化は見られないことから、細胞の形状も生細胞と変化していないことが示された。また死細胞では９０％以上の細胞がPIによって染色されるのに対して、mmeHQ-Ac処理した細胞ではほとんどの細胞がPIによって染色されなかったことから、mmeHQ-Acは細胞毒性が低いことが示された。また、同様の実験によりすべてのHQおよびmeHQ誘導体は同条件下で毒性がないことが示された。
図６に示すように、mmeHQ-Ac処理によって死細胞に見られるようなFSC/SSCのパターンに大きな変化は見られないことから、細胞の形状も生細胞と変化していないことが示された。また死細胞では９０％以上の細胞がPIによって染色されるのに対して、mmeHQ-Ac処理した細胞ではほとんどの細胞がPIによって染色されなかったことから、mmeHQ-Acは細胞毒性が低いことが示された。また、同様の実験によりすべてのHQおよびmeHQ誘導体は同条件下で毒性がないことが示された。
（まとめ）
本発明の代表的実施形態としての色素mmeHQ-Acは、特に以下の４つの点で蛍光色素として優れている。
１）吸収、蛍光特性
そのままの構造では吸収帯が紫外光にあり無蛍光性であるのに対し、加水分解された構造(７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（本明細書中、「mmeHQ」と略すことがある。）)では400 nm付近に吸収帯があり黄色い蛍光を発する。また、蛍光量子収率を比較すると、meHQ骨格色素の方が、HQ色素よりも明るい色素であり、プローブにより適している。
２）蛍光のON/OFFスイッチング
mmeHQ-Acの10μM溶液に細胞を接触させると、添加直後から細胞内のみが明るく蛍光を発した。（mHQ-Acの場合、この濃度においては細胞内外の明るさの違いがはっきりしなかった。その他の誘導体では、ほとんど蛍光が観測されなかった。）
色素の細胞内での局在は、mmeHQ-Acでは細胞全体に分布していた。（mHQ-Acでは細胞の一部の組織に局在化がみられた。）
３）細胞膜透過性
mmeHQ-Acの30μM溶液を2時間細胞に添加すると、75%の細胞が染色された。（mHQ-Acでは60％の細胞が染色された。mHQでは30％の細胞が染色された。その他の誘導体は全く染色されなかった。）
４）細胞毒性
mmeHQ-Acの10μM溶液を12時間細胞に添加した場合、その細胞はPI染色されず、また細胞の形状も生細胞と同様であり、この条件では細胞毒性がないことが示された。（その他のすべての誘導体でも同様の条件で細胞毒性がないことが示された。）
本発明の代表的実施形態としての色素mmeHQ-Acは、特に以下の４つの点で蛍光色素として優れている。
１）吸収、蛍光特性
そのままの構造では吸収帯が紫外光にあり無蛍光性であるのに対し、加水分解された構造(７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム（本明細書中、「mmeHQ」と略すことがある。）)では400 nm付近に吸収帯があり黄色い蛍光を発する。また、蛍光量子収率を比較すると、meHQ骨格色素の方が、HQ色素よりも明るい色素であり、プローブにより適している。
２）蛍光のON/OFFスイッチング
mmeHQ-Acの10μM溶液に細胞を接触させると、添加直後から細胞内のみが明るく蛍光を発した。（mHQ-Acの場合、この濃度においては細胞内外の明るさの違いがはっきりしなかった。その他の誘導体では、ほとんど蛍光が観測されなかった。）
色素の細胞内での局在は、mmeHQ-Acでは細胞全体に分布していた。（mHQ-Acでは細胞の一部の組織に局在化がみられた。）
３）細胞膜透過性
mmeHQ-Acの30μM溶液を2時間細胞に添加すると、75%の細胞が染色された。（mHQ-Acでは60％の細胞が染色された。mHQでは30％の細胞が染色された。その他の誘導体は全く染色されなかった。）
４）細胞毒性
mmeHQ-Acの10μM溶液を12時間細胞に添加した場合、その細胞はPI染色されず、また細胞の形状も生細胞と同様であり、この条件では細胞毒性がないことが示された。（その他のすべての誘導体でも同様の条件で細胞毒性がないことが示された。）
405nmレーザー励起に対応した蛍光色素、タンパク質のラベル色素、特定の生理活性物質の活性を検知する蛍光プローブ等として有用である。
本発明のプローブは任意の細胞内酵素活性の検出プローブとしての応用が可能であり、またストークスシフトが大きいためマルチカラーイメージングに有用である。
本発明のプローブは任意の細胞内酵素活性の検出プローブとしての応用が可能であり、またストークスシフトが大きいためマルチカラーイメージングに有用である。
Claims (12)
- 下記式（I）で表される化合物またはそれらの塩：
（式中、
Ｒ１は、水素原子、またはＣ１−３アルキルカルボニル基であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−３アルキルであり、
Ｒ３は、置換基（水素原子またはＣ１−３アルキル）が付加されていてもよいカルボン酸エステルで置換されたＣ１−３アルキルであり、
Ｘ２は、２位の位置にあるＣ１−３アルキルであり、
ｎは、０であり、
ｍは、１である）。 - Ｒ１が水素原子または、メチルカルボニル基もしくはエチルカルボニル基であり、
Ｒ２が存在しないか、またはメチルもしくはエチルであり、
Ｒ３ がメチルエチルホルマートであり、
Ｘ２が２位の位置にあるメチルまたはエチルであり、
ｎが０であり、
ｍが１である、請求項１に記載の化合物またはそれらの塩。 - 下記式（ＩＩ）で表される化合物またはそれらの塩：
Ｒ１は、水素原子、またはＣ１−３アルキルカルボニル基であり、
Ｒ２は、存在しないか、またはＣ１−３アルキルである。）。 - エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート；
エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタート；
７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム；
７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウム；
またはこれらの塩。 - 請求項１〜４のいずれかに記載の化合物またはそれらの塩を含む、蛍光組成物。
- 細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物もしくはそれらの塩、または請求項５に記載の蛍光組成物。
- 細胞を標識する方法であって、
細胞と、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物もしくはそれらの塩、または請求項５に記載の細胞内導入用蛍光組成物とを溶液中で混合し、所定時間インキュベートする工程を含む、方法。 - 請求項１に記載の式（I）で表される化合物、請求項３に記載の式（II）で表される化合物において、Ｒ１が水素原子である化合物を、Ｒ１がＣ１−３アルキルカルボニル基である化合物へ化学修飾することを含む、細胞非透過性の蛍光色素を細胞透過性にする方法であって、Ｃ１−３アルキルカルボニル基が細胞内酵素による化学反応により脱保護されるものである、方法。
- ｍ−アミノフェノールと３−オキソ酪酸エチルエステルとを、ＢｉＣｌ３の存在下で混合することを含む、エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタートの合成方法。
- エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタートと塩化アセチルとを、トリエチルアミンおよびジクロロメタンの存在下で混合することを含む、エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタートの合成方法。
- エチル２−（７−アセトキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタートとヨウ化メチルとを混合することを含む、７−アセトキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウムの合成方法。
- エチル２−（７−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−４−イル）アセタートとヨウ化メチルとを、ジクロロメタンの存在下で混合することを含む、７−ヒドロキシ−４−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，２−ジメチルキノリニウムの合成方法。
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| CN110483394A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-22 | 广东工业大学 | 一种化合物的应用 |
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| JP2010209024A (ja) | 2010-09-24 |
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