KR20120013627A

KR20120013627A - 서로 다른 형광색의 이광자 형광 프로브를 이용하여 나트륨/칼슘 활성을 동시에 이미지화하는 방법 및 이광자 형광 프로브의 제조방법

Info

Publication number: KR20120013627A
Application number: KR1020100075718A
Authority: KR
Inventors: 김환명
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-02-15
Also published as: KR101233679B1; US8557811B2; JP2012037498A; JP5422803B2; US20120035360A1

Abstract

본 발명은 서로 다른 형광색의 이광자 형광 프로브를 이용하여 나트륨/칼슘활성을 동시에 이미지화하는 방법 및 이광자 형광 프로브의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포막 인근의 칼슘 이온 이광자 형광 프로브는 칼슘 양이온과 반응하여 강한 이광자 형광을 나타내고, 칼슘 이온과 함께 착물을 형성하여 세포막에 선택적이고 쉽게 로딩될 수 있다. 또한, 60분 이상의 시간에 걸쳐 100 ~ 200㎛ 깊이의 생체 세포 및 생체 조직에서 선택적으로 칼슘 이온을 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 조직에서 칼슘 양이온의 분포를 이미징할 수 있다. 또한, 서로 다른 형광색의 두 표지자를 생체 세포 또는 조직에 동시에 염색함으로써 칼슘과 나트륨의 활동성을 서로 다른 채널에서 영상화 시킬 수 있다.

Description

서로 다른 형광색의 이광자 형광 프로브를 이용하여 나트륨/칼슘 활성을 동시에 이미지화하는 방법 및 이광자 형광 프로브의 제조방법{DUAL-COLOR IMAGING METHOD OF SODIUM/CALCIUM ACTIVITIES USING TWO-PHOTON FLUORESCENT PROBES AND PREPARATION METHOD OF TWO-PHOTON FLUORESCENT PROBES}

본 발명은 서로 다른 형광색의 이광자 형광 프로브를 이용하여 나트륨/칼슘활성을 동시에 이미지화하는 방법 및 이광자 형광 프로브의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 높은 감도와 선택성으로 생체 세포막 이온 채널 인근의 칼슘 이온의 활동성을 이미징할 수 있는 이광자 형광 프로브와 이를 다른 형광색의 이광자 나트륨 프로브와 동시에 염색함으로서, 생체 세포 또는 조직에서 일어나는 나트륨/칼슘 양이온의 교환 및 활동성을 두 채널에서 동시 이미징 할 수 있는 방법에 관한 것이다.

세포 내 칼슘 이온 분포의 변화는 생리, 병리적인 현상 연구에서 매우 중요하다. 세포 내 칼슘 이온의 농도는 원형질막과 각 기관의 막에 존재하는 펌프 혹은 채널을 통해 세포 내의 다양한 상황에 맞게 조절된다. 이에 따라 세포막 인근의 칼슘 이온의 농도는 세포 내 평균치보다 훨씬 높게 존재하고, 생리적 활성에 따라 100μmol 이상 증가한다. 이러한 세포막 인근 고농도의 칼슘 이온은 호르몬과 신경전달물질의 엑소시토시스(exocytosis), 신호전달에서 2차 전달자(second messenger) 등의 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 칼슘이온 농도 변화를 조절하는 대표적인 생체 물질은 Na⁺/Ca² ⁺ 이온 교환자(NCX)이다. NCX의 기능은 세포 내에 칼슘 이온 농도가 높아지면 항상성(homeostasis)을 유지하기 위해 칼슘 이온은 세포 밖으로 내보내고, 나트륨은 세포 안으로 들어오게 한다. 이것을 Na⁺/Ca² ⁺ 교환이라고 한다.

이러한 기능을 이해하기 위하여, 수많은 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나 개별적인 이온의 활성을 연구하는데 그치고 있고, 서로 다른 이온을 동시에 영상화시킴으로서 이들의 상호작용을 동시에 영상화시킨 예는 전무하다. 또한, 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(< 500nm)이다. 이러한 요구는 얕은 투과 깊이(< 100㎛), 광표백(photobleaching) 및 세포 자가 형광으로 인하여 조직 이미징에 대한 적용을 제한한다.

이러한 문제에 대한 이상적인 해결은 여기를 위하여 낮은 에너지의 2개의 근적외선 광자를 이용하는 이광자 현미경(TPM)이 된다. 이광자 현미경을 사용하면, 온전한 조직이 70㎛보다 더 큰 조직 조각 내부로 연장될 수 있는 조직 준비 성형물로부터 최소한의 간섭을 만들면서 오랜 기간 동안 이미지로 만들어질 수 있다. 그러나, 생체 조직의 내부 깊이(> 100㎛)에 존재하는 세포막 인근의 칼슘과 세포 내부의 나트륨 이온 분포를 동시에 이미지로 만들 수 있는 서로 다른 형광색의 이광자 프로브는 현재까지 개발되지 않고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 작은 분자량을 가지면서 세포막에 선택적으로 염색되고 세포막 인근의 칼슘 이온에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 이광자 형광 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직에서 세포막 인근의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 이광자 형광 프로브와 서로 다른 이광자 형광색의 나트륨 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직에서 Na⁺/Ca² ⁺ 교환을 동시 영상화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 네 번째 과제는 상기 세포막 인근의 칼슘 이온 이광자 형광 프로브의 제조방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이다.

또한, 본 발명은

1) 6-브로모-N-메틸-2-나프틸아민(6-bromo-N-methyl-2-naphthylamine), 프로톤-스폰지(proton-sponge), 및 터트-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)의 혼합물을 환류시켜서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 B를 제조하는 단계,

2) 상기 화합물 B, 벤즈옥사졸(benzoxazole), Pd(II)OAc, PPh₃, CuI, 및 CsCO₃의 혼합물을 교반하여 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 A를 제조하는 단계, 및

3) 상기 화합물 A, 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 D를 혼합하고, 반응시키는 단계

를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법을 제공한다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 3에서, X는 O, S 또는 NH 이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 및 나트륨 이온 감지용 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직에서 Na⁺/Ca² ⁺ 교환을 동시에 이미징하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세포막 인근의 칼슘 이온 이광자 형광 프로브는 칼슘 양이온과 반응하여 강한 이광자 형광을 나타낸다. 세포막에 선택적이고 쉽게 로딩될 수 있어 세포막 인근의 칼슘 이온과 함께 착물을 형성할 수 있고, 세포 내에서 해리상수(Kdi)가 78 ± 5 μM로 이 인근의 칼슘 이온의 활동성을 감지하기 적합하다. 또한, 60분 이상의 시간에 걸쳐 100 ~ 200㎛ 깊이의 생체 세포 및 생체 조직에서 선택적으로 칼슘 이온을 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 조직에서 칼슘 양이온의 분포를 이미징할 수 있다. 또한, 서로 다른 형광색의 두 표지자를 생체 세포 또는 조직에 동시에 염색함으로써 칼슘과 나트륨의 활동성을 서로 다른 채널에서 영상화 시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구체예로서 BCa1의 단일광자 형광 스펙트럼 및 H₂O 내 BCa1의 농도에 따른 형광 강도를 나타낸 도이다.
도 2은 본 발명의 일구체예로서 1,4-디옥산, EtOH, DMF 및 H₂O 내 BCa1의 표준 흡수 스펙트럼 및 표준 방출 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 HeLa 세포 내 BCa1 및 ANa1의 표준 방출 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일구체예로서 단일광자 형광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일구체예로서 BCa1의 단일광자 흡수곡선, BCa1의 단일광자 및 이광자 형광 적정곡선, 및 BCa1의 단일광자 및 이광자 Hill 곡선을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일구체예로서 다양한 양이온들에 대한 BCa1의 상대적인 형광 강도 및 BCa1의 단일광자 형광 강도에 대한 pH의 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일구체예로서 이광자 형광 작동 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일구체예로서 BCa1의 단일광자 형광 스펙트럼 및 BCa1의 Hill 곡선을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일구체예로서 LUVs 내 BCa1의 표준 방출 스펙트럼 및 HeLa 세포 내 BCa1의 표준 방출 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 10의 (a)는 본 발명의 일구체예로서 BCa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지를 나타낸 도이고, (b)는 그에 따른 분석도표를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일구체예로서 BCa1 라벨된 Hela 세포의 전자사진 및 형광 강도를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일구체예로서 BCa1 라벨된 Hela 세포의 TPM 이미지를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일구체예로서 BCa1 및 ANa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지 및 형광강도를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일구체예로서 BCa1 및 ANa1으로 착색된 쥐 해마 조각의 이미지를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이고, O인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브는 생체 세포 또는 조직에서 칼슘 이온의 검출용으로 적용될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브는 2-(2'-모폴리노-2'-옥소에톡시)-N,N-비스(히드록시카보닐메틸)아닐린(2-(2'-morpholino-2'-oxoethoxy)-N,N-bis(hydroxycarbonylmethyl)aniline, MOBHA)을 칼슘 양이온 수용체로서 포함하고, 6-(벤조[d]옥사졸-2'-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌(6-(benzo[d]oxazol-2'-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene)을 리포터로서 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법의 일구체예는 1) 6-브로모-N-메틸-2-나프틸아민(6-bromo-N-methyl-2-naphthylamine), 프로톤-스폰지(proton-sponge), 및 터트-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)의 혼합물을 환류시켜서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 B를 제조하는 단계, 2) 상기 화합물 B, 벤즈옥사졸(benzoxazole), Pd(II)OAc, PPh₃, CuI, 및 CsCO₃의 혼합물을 교반하여 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 A를 제조하는 단계, 및 3) 상기 화합물 A, 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 D를 혼합하고, 반응시키는 단계를 포함한다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 3에서, X는 O, S 또는 NH 이고, O인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법은 후술하는 실시예에 보다 구체적으로 나타내었다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 생체 세포 또는 조직에서 세포막 인근의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브는 칼슘 양이온과 반응하여 강한 이광자 형광을 나타내고, 칼슘 이온과 함께 착물을 형성하여 세포막에 선택적이고 쉽게 로딩될 수 있다. 또한, 60분 이상의 시간에 걸쳐 100 ~ 200㎛ 깊이의 생체 세포 및 생체 조직에서 선택적으로 칼슘 이온을 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 조직에서 칼슘 양이온의 분포를 이미징할 수 있다.

상기 나트륨 이온 감지용 이광자 형광 프로브는 하기 ANa1으로 표시될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

[ANa1]

상기와 같이, 본 발명에 따르면, 서로 다른 형광색의 두 표지자를 생체 세포 또는 조직에 동시에 염색함으로써 칼슘과 나트륨의 활동성을 서로 다른 채널에서 동시에 영상화 시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 이광자 형광 프로브(BCa1)의 제조

6-브로모-N-메틸-2-나프틸아민(6-Bromo-N-methyl-2-naphthylamine) 및 2-(2'-모폴리노-2'-옥소에톡시)-4-니트로-N,N-비스(히드록시카보닐메틸)아닐린(2-(2'-morpholino-2'-oxoethoxy)-4-nitro-N,N-bis(hydroxycarbonylmethyl)aniline, 화합물 C)을 종래기술에 따라 합성하였다. 다른 화합물의 합성은 하기에 나타내었다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서, (a)는 t-부틸 브로모아세테이트(t-butyl bromoacetate)/프로폰-스폰지(proton-sponge)/MeCN, (b)는 벤족사졸(benzoxazole)/Pd(II)OAc/PPh₃/CuI/CsCO₃/DMF, 및 CF₃CO₂H/CH₂Cl₂, (c)는 DCC/HOBt/CH₂Cl₂ 및 KOH/EtOH/디옥산(dioxane)의 반응조건이다.

1) 2- 브로모 -6-N-( 터트 - 부톡시카르보닐 ) 메틸 -N-메틸아미노나프탈렌(2- Bromo -6-N-(tert-butoxycarbonyl)methyl-N-methylaminonaphthalene, 화합물 B)의 제조

6-브로모-N-메틸-2-나프틸아민(6-bromo-N-methyl-2-naphthylamine, 2.0g, 8.5mmol), 프로톤-스폰지(proton-sponge, 2.0g, 9.4mmol), 및 터트-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate, 2.0g, 1.5mL, 10.2mmol)의 혼합물을 MeCN 내에서 N₂ 하에서 12시간 동안 환류시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수(brine)로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 농축시킨 후, 용리액(eluent)으로서 헥산/에틸 아세테이트(5 : 1)을 이용한 실리카 겔 컬럼으로 정제하였다.

수율: 2.6g(87%);

mp: 63℃;

IR (KBr): 1,736 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.79 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.57 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.38 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.05 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2 Hz), 4.04 (s, 2H), 3.14 (s, 3H), 1.40 (s, 9H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 170.3, 147.5, 133.8, 129.8, 129.7, 128.4, 128.3, 128.2, 116.7, 115.7, 106.7, 82.2, 56.0, 40.5, 28.7 ppm.

Anal. Calcd for C₁₇H₂₀BrNO₂: C, 58.30; H, 5.76; N, 4.00. Found: C, 58.43; H, 5.65; N, 4.06.

2) 화합물 A의 제조

화합물 B(1.0g, 2.9mmol), 벤즈옥사졸(benzoxazole, 0.41g, 3.4mmol), Pd(II)OAc(0.033g, 0.15mmol), PPh₃(0.073g, 0.29mmol), CuI(0.11g, 0.58mmol), 및 CsCO₃(1.1g, 3.5mmol)의 혼합물을 DMF 내에서 N₂ 하에서 140℃로 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 필터하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수(brine)로 세척하며, MgSO₄로 건조시킨 후 농축시켰다. 조생성물을 용리액(eluent)으로서 헥산/에틸 아세테이트(3 : 1)를 이용한 실리카 겔 컬럼으로 정제하였다.

수율: 0.64g(57%);

mp: 165℃;

IR (KBr): 1,738 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.56 (d, 1H, J = 2 Hz), 8.14 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.73 (m, 1H), 7.69 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.54 (m, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.06 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2 Hz), 4.05 (s, 2H), 3.15 (s, 3H), 1.41 (s, 9H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 169.7, 164.0, 150.9, 148.6, 142.6, 136.8, 130.3, 128.1, 127.0, 126.4, 124.7, 124.5, 124.4, 120.7, 119.9, 116.2, 110.6, 106.4, 82.1, 55.7, 40.2, 28.4 ppm.

Anal. Calcd for C₂₄H₂₄N₂O₃: C, 74.21; H, 6.23; N, 7.21. Found: C, 74.33; H, 6.35; N, 7.11.

CH₂Cl₂(10mL) 내 상기 에스테르(0.50g, 1.3mmol) 용액에 CF₃CO₂H(2mL)를 추가하고, 혼합물을 N₂ 하에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하였다. 생성물을 헥산으로 세척하고 필터하였다.

수율: 0.29g(68%);

mp: 188℃;

IR (KBr): 2,900, 1,718 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD): δ 8.57 (d, 1H, J = 2 Hz), 8.12 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.84 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.75 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.71 (m, 1H), 7.60 (m, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 2 Hz), 4.22 (s, 2H), 3.22 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃/CD₃OD): δ = 173.1, 164.3, 150.9, 148.8, 142.1, 137.0, 130.6, 128.4, 127.3, 126.4, 125.2, 124.9, 124.6, 120.3, 119.6, 116.4, 110.8, 106.3, 54.6, 40.1 ppm.

Anal. Calcd for C₂₀H₁₆N₂O₃: C, 72.28; H, 4.85; N, 8.43. Found: C, 72.17; H, 4.91; N, 8.40.

3) 2-(2'- 모폴리노 -2'- 옥소에톡시 )-N,N- 비스 ( 메톡시카보닐메틸 )-1,4- 페닐렌디아민 (2-(2'- morpholino -2'- oxoethoxy )-N,N- bis ( methoxycarbonylmethyl )-1,4-phenylenediamine, 화합물 D)의 제조

화합물 C(0.67g, 1.6mmol) 및 카본 상의 Pd(0.033g, 0.31mmol)를 에틸 아세테이트(50mL) 내에서 혼합하고 수소하에서 12시간 동안 흔들어 주었다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)로 필터하고, 용매는 진공하에서 제거하였다.

수율: 0.58g(92%);

IR (KBr): 1,740, 1,642 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.77 (d, 1H, J = 8 Hz), 6.26 (d, 1H, J = 2 Hz), 6.17 (dd, 1H, J = 8, J = 2 Hz), 4.65 (s, 2H), 3.97 (s, 4H), 3.59 (s, 6H), 3.58-3.53 (m, 8H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 171.6, 166.6, 151.6, 143.3, 130.6, 122.6, 108.6, 103.0, 68.4, 66.8, 54.0, 51.6, 45.8 ppm.

Anal. Calcd for C₁₈H₂₅N₃O₇: C, 54.68; H, 6.37; N, 10.63. Found: C, 54.59; H, 6.50; N, 10.58.

4) 이광자 형광 프로브(BCa1)의 제조

화합물 A(0.10g, 0.30mmol), 1,3-디시클로헥실 카보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide, 0.060g, 0.30mmol), 및 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, 0.034g, 0.25mmol)의 혼합물을 CH₂Cl₂ 내에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 CH₂Cl₂ 내의 화합물 D(0.10g, 0.25mmol)를 추가하고 N₂ 하에서 12시간 동안 교반하였다. 결과 혼합물을 필터하고, 필터물을 진공하에서 농축시켰다. 조생성물을 용리액(eluent)으로서 CHCl₃/MeOH(20 : 1)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔)에 의하여 정제하였다.

수율: 0.12g(66%);

mp: 80℃;

IR (KBr): 1,743, 1,626, 1,516 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.65 (d, 1H, J = 2 Hz), 8.27 (s, 1H), 8.23 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.76 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.38 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.34 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 2 Hz), 6.87 (m, 2H), 4.74 (s, 2H), 4.13 (s, 4H), 4.10 (s, 2H), 3.66 (s, 6H), 3.50-3.61 (m, 8H), 3.22 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 171.6, 168.2, 166.2, 163.6, 150.7, 150.1, 148.6, 142.3, 136.2, 135.9, 133.0, 130.6, 127.9, 127.3, 126.9, 125.0, 124.9, 124.7, 121.3, 120.6, 119.8, 116.6, 113.8, 110.7, 107.5, 107.3, 67.5, 66.8, 60.7, 53.8, 52.1, 45.7, 40.4 ppm.

Anal. Calcd for C₃₈H₃₉N₅O₉: C, 64.31; H, 5.54; N, 9.87. Found: C, 64.71; H, 5.60; N, 9.79.

MeOH/dioxane(1/1 mL) 내의 상기 중간체(0.10g, 0.14mmol) 용액에 KOH(1M, 0.35mL, 0.35mmol)를 일정비율방식으로 추가하고, 반응 혼합물을 15시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 결과 혼합물을 증류수(distilled water, 20mL)에 녹이고, 에테르로 추출한 후, 수용액을 수집하였다. HCl(1M, 0.35mL, 0.35mmol)을 천천히 추가하고, AcOH 두 방울을 추가하였다. 침전물을 수집하고 증류수로 세척하였다.

수율: 57mg(60%);

mp: 162℃;

IR (KBr): 2,970, 1,626, 1,514 cm^-1;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD): δ 8.60 (d, 1H, J = 2 Hz), 8.16 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.73 (m, 1H), 7.60 (m, 1H), 7.37 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.34 (m, 2H), 7.17 (dd, 1H, J = 9, J = 2 Hz), 7.04 (d, 1H, J = 2 Hz), 6.93 (m, 2H), 4.76 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.51-3.59 (m, 8H), 3.24 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 172.9, 168.2, 166.4, 163.6, 150.7, 149.9, 149.7, 142.4, 136.9, 135.2, 133.7, 130.6, 128.2, 127.4, 125.9, 125.6, 125.3, 124.5, 120.0, 119.8, 119.6, 117.1, 112.8, 111.3, 106.7, 106.2, 105.8, 67.0, 66.7, 56.1, 54.1, 45.6 ppm.

Anal. Calcd for C₃₆H₃₅N₅O₉: C, 63.43; H, 5.18; N, 10.27. Found: C, 63.22; H, 5.21; N, 10.19.

< 실험예 >

1) 수용해도( Water solubility ) 특성 결과

DMSO에 염료를 녹여서 스톡 용액(1.0 × 10^-2 M)을 제조하였다. 용액을 (6.0 × 10^-3 ~ 6.0 × 10^-5) M으로 희석시키고, 마이크로 시린지를 이용하여 H₂O 3.0mL를 함유하는 큐벳(cuvette)에 추가하였다. 모든 경우, H₂O 내 DMSO의 농도는 0.2%로 유지시켰다. 염료 농도에 대한 형광 강도의 그래프는 낮은 농도에서 선형이었고, 높은 농도에서는 아래쪽으로 구부러진 형태였다(도 1). 선형 영역의 최대 농도를 용해도로서 측정하였고, 물에 대한 BCa1의 용해도는 약 5.0μM 이었다. 이는 세포를 착색하기에 충분하다.

상기 BCa1의 단일광자 형광 스펙트럼을 하기 도 1의 (a)에 나타내었고, H₂O 내 BCa1의 농도에 따른 형광 강도를 하기 도 1의 (b)에 나타내었다. 여기 상태의 파장은 360nm 이었다.

2) 분광학적 특성 결과

흡수 스펙트럼은 휴렛 팩커드(Hewlett-Packard) 8453 다이오드 어레이 분광광도계로부터 측정하였고, 형광 스펙트럼은 1cm 표준 석영 셀을 가진 Amico-Bowman series 2 발광분광계로부터 측정하였다. 형광 양자 수율은 종래에 알려진 방법을 이용하고 쿠마린 307(Φ = 0.95 in MeOH)을 이용하여 결정하였다.

1,4-디옥산, EtOH, DMF 및 H₂O 내 BCa1의 표준 흡수 스펙트럼을 하기 도 2의 (a)에 나타내었고, 1,4-디옥산, EtOH, DMF 및 H₂O 내 BCa1의 표준 방출 스펙트럼을 하기 도 2의 (b)에 나타내었다.

도 2의 결과와 같이, BCa1의 흡수 및 방출 스펙트럼은 용매 극성의 증가에 따라 점진적인 적색 이동을 나타내었다.

HeLa 세포 내 BCa1 및 ANa1의 표준 방출 스펙트럼을 하기 도 3에 나타내었다. 도 3의 결과와 같이, BCa1의 방출 밴드는 ANa1의 방출 밴드와 구분될 수 있도록 잘 분리되어 있음을 알 수 있다.

자유 Ca² ⁺(0 ~ 2.5mM)의 존재하에서 1μM BCa1(30mM MOPS, 100mM KCl, pH 7.2)의 단일광자 형광 스펙트럼을 하기 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과와 같이 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS) 버퍼 용액(30mM, 100mM KCl, pH 7.2) 내 BCa1에 Ca² ⁺를 추가하였을 때, 형광강도는 금속 이온의 농도의 함수로서 급격하게 증가하였고, 이는 금속 이온과의 복합화에 의한 광-유도 전자 수송(photo-induced electron transfer, PeT) 공정의 봉쇄에 기인한 것이다. 거의 동일한 결과가 이광자 공정에서도 관찰되었다.

ANa1 및 BCa1에 대한 광물리학적 실험결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

λ⁽¹⁾ _max: 단일광자 흡수 및 방출 스펙트럼(nm)

Φ: 형광 광자 효율(오차범위: ±10%)

K^TP _d: 버퍼 내 이광자 공정에 의하여 측정된 Ca² ⁺에 대한 해리상수(dissociation constant)

Kⁱ _d: 세포 내 이광자 공정에 의하여 측정된 Ca² ⁺에 대한 해리상수(dissociation constant)

FEF: 형광 향상 인자((F - F_min)/F_min = FEF), 상기 표 1의 FEF 값에서 괄호 안의 수는 이광자 공정에 대한 것임

λ⁽²⁾ _max: 이광자 여기 스펙트럼(nm)

δΦ: 10^-50 cm⁴ s/광자(GM)에서 이광자 작동 단면적(오차범위: ±15%)

nd: 이광자 여기 형광 강도가 너무 약해서 정확하게 단면적이 측정되지 않음

λ^fl _max: DPPC/CHL((1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine/cholesterol), 부유 혼합물 및 DOPC(1,2-dioleoylsn-glycero-3-phosphocholine)로 구성된 LUVs 내 측정값

또한, 버퍼 및 LUVs 내에서 측정된 K^OP _d 값은 각각 90 ± 2μM 및 81 ± 4μM 이었다.

자유 Ca² ⁺의 존재하에서 1μM BCa1(30mM MOPS, 100mM KCl, pH 7.2)의 복합체에 대한 단일광자 흡수곡선을 하기 도 5의 (a)에 나타내었고, 단일광자 및 이광자 형광 적정곡선을 하기 도 5의 (b)에 나타내었으며, 단일광자 및 이광자 Hill 곡선을 하기 도 5의 (c)에 나타내었다.

단일광자 및 이광자 공정에 대한 BCa1의 해리상수(K^OP _d 및 K^TP _d)는 도 5의 (b)의 형광 적정곡선으로부터 계산되었다.

다양한 양이온들에 대한 1μM BCa1의 상대적인 형광 강도를 하기 도 6의 (a)에 나타내었고, BCa1의 단일광자 형광 강도에 대한 pH의 영향을 하기 도 6의 (b)에 나타내었다. BCa1은 Mg² ⁺, Zn² ⁺ 및 Mn² ⁺에 대하여 약한 반응을 나타내었고, Fe² ⁺, Cu² ⁺ 및 Co² ⁺에 대하여 아무 반응을 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 프로브는 다른 생물학적 관련 양이온으로부터 최소한의 간섭을 받으면서 Ca² ⁺를 선택적으로 검출할 수 있다. 또한, BCa1은 pH에 대하여 영향을 받지 않았다.

과량의 Ca² ⁺를 함유하는 MOPS 버퍼 내 BCa1의 이광자 동작 스펙트럼은 δΦ 값으로서 780nm에서 150GM을 나타내었고, 이러한 값은 Calcium-Green-Ca² ⁺ 및 Fura-2-Ca²⁺ 보다 3 ~ 5배 향상되었음을 알 수 있다(도 7 참조). 따라서, BCa1으로 착색된 셀의 TPM 이미지는 다른 상업용 프로브로 착색된 것보다 밝은 이미지를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

3) 큰 단일막 리포솜( Large unilamellar vesicles , LUVs )의 제조

단일광자 및 이광자 스텍트럼의 측정을 위한 LUVs를 압출방법에 의한 다중막 리포솜(multilamellar vesicles)의 수화 현탁(hydrated suspension)에 의하여 제조하였다. 지방질(Lipids)을 CHCl₃/MeOH(95/5 vol%)에 녹이고, N₂ 흐름 및 진공하에서 건조시켰다. 결과 필름을 현탁액이 균질하게 될 때까지 60℃에서 흔들어주면서 MOPS buffer(30mM MOPS, 100mM KCl, pH 7.2) 내에서 수화시켰다. 혼합물을 3회 응고-해동(freeze-thaw) 사이클을 수행한 후, 100nm 기공 멤브레인(Avanti Polar Lipids)을 통과시켜 LUVs를 압출하였다. 리포솜을 착색하기 위하여, DMSO 내 BCa1을 추가하고 30분 동안 기다렸다. 리포솜 내 프로브의 비율은 300 : 1 이었다. 온도는 0.1℃의 정밀도를 갖는 디질털 온도계를 이용하여 측정하였다.

DOPC/스핑고미엘린(sphingomyelin)/콜레스테롤(cholesterol) (1 : 1 : 1, 부유 혼합물)로 구성된 LUVs 내 자유 Ca² ⁺(0 ~ 2.5mM)과 1μM BCa1의 복합체에 대한 단일광자 형광 스펙트럼을 하기 도 8의 (a)에 나타내었고, Hill 곡선을 하기 도 8의 (b)에 나타내었다.

25 ± 0.5℃에서 DPPC/CHL(검정 곡선), DOPC/스핑고미엘린(sphingomyelin)/CHL(1 : 1 : 1, 부유 혼합물) (청색 곡선), 및 DOPC(분홍 곡선)로 구성된 LUVs 내 자유 Ca2+(2.5mM)을 포함하는 BCa1의 표준 방출 스펙트럼을 하기 도 9의 (a)에 나타내었고, HeLa 세포 내 BCa1의 표준 방출 스펙트럼을 하기 도 9의 (b)에 나타내었다. 부유 혼합물(raft mixture)에 따른 스펙트럼은 436 및 467nm에 집중된 두 개의 가우스 곡선(하늘색 곡선)에 잘 들어맞았다. 또한, 세포로부터의 스펙트럼은 430 및 460nm에 집중된 두 개의 가우스 곡선(녹색 곡선)에 잘 들어맞았다.

4) 이광자 단면적의 측정 결과

이광자 단면적(δ)은 펨토 초단위(femto second, fs) 형광 측정법을 이용하여 측정하였다. 30mM MOPS 버퍼(2.5mM CaCl₂, 100mM KCl, pH 7.2)에 BCa1을 5.0 × 10^-6 M의 농도로 녹인 후, 형광 강도가 유도된 이광자는 740 ~ 940nm에서 플루오레세인(fluorescein, 8.0 × 10^-5 M, pH = 11)을 이용하여 측정하였다. 레퍼런스와 샘플의 TPEF 스펙트럼 강도는 동일한 여기상태 파장에서 결정되었다. TPA 단면은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

δ = δ_r(S_sФ_rf_rc_r)/(S_rФ_sf_sc_s)

상기 수학식 1에서, s 및 r은 샘플 및 레퍼런스 분자를 나타내고, S는 CCD 검출기로부터 수집된 신호 강도를 나타내며, Ф는 형광 양자 수율을 나타내고, f는 실험기기의 전체 형광 수집 효율을 나타내며, c는 용액 내 분자밀도를 나타내고, δ_r는 레퍼런스 분자의 TPA 단면적을 나타낸다.

5) 세포 배양( Cell Culture )

HeLa 세포는 열비활성화된 10%(v/v)의 fetal bovine serum(FBS; Gibco), 100 units/mL 페니실린(penicillin) 및 100 ug/mL 스트렙토마이신(streptomysin)이 보충된 Dulbecco’s Modified Eagls’s Medium(DMEM; Gibco) 내에서 배양되었다. 세포는 37℃에서 air/CO₂ 비율이 95 : 5인 가습환경에서 성장되었다. 이미징 4일 전에 세포를 트립신(trypsin)-EDTA 용액으로 분리하고, 50,000 cells/mm² 의 세포를 유리바닥 디쉬(MatTek)에 평판배양하였다. 세포는 37℃에서 20분 동안 2μM의 ANa1로 배양되었고, 그 후 상온에서 0.5μM의 BCa1로 로드되었다. 10분 후에, 세포를 환원된 칼슘 보정 염 용액(RCBSS; 127mM NaCl, 3.8mM KCl, 1.2mM KH₂PO₄, 0.8mM MgCl₂, 5mM 글루코즈, 및 10mM HEPES 버퍼)으로 2회 세척한 후, 이미지화 하였다.

6) 이광자 형광 현미경 이미지의 측정

프로브로 라벨된 HeLa 세포 및 조직의 이광자 형광 현미경 이미지는 공초점 및 다광자 현미경(spectral confocal and multiphoton microscopes, Leica TCS SP2)를 이용하여 측정하였다.

BCa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지 및 그에 따른 분석도표를 하기 도 10에 나타내었다.

390 ~ 450nm에서 수집된 BCa1(0.5μM) 라벨된 HeLa 세포의 밝은 영역 이미지(a), TPM 이미지(b), 및 시간에 따른 상대적인 TPEF 강도(c)를 하기 도 11에 나타내었다.

또한, 0.5μM의 BCa1 및 2μM의 ANa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지를 하기 도 12에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 12의 (a)는 390 ~ 450nm 에서의 0.5μM의 BCa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지이고, (b)는 500 ~ 560nm 에서의 0.5μM의 BCa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지이며, (c)는 390 ~ 450nm 에서의 2μM의 ANa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지이고, (d)는 500 ~ 560nm 에서의 2μM의 ANa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지이다.

BCa1 및 ANa1으로 라벨된 HeLa 세포의 TPM 이미지 및 형광강도를 하기 도 13에 나타내었다. 보다 구체적으로 도 13의 (a)는 390 ~ 450nm에서 BCa1으로 라벨된 TMP 이미지를 나타낸 것이고, (b)는 500 ~ 560nm에서 ANa1으로 라벨된 TPM 이미지를 나타낸 것이며, (c)는 상기 (a) 및 (b)를 통합한 것이고, (d)는 (c)의 박스 부분을 확대한 것이며, (e)는 (d)의 1 및 2로 표시한 부분의 형광 강도를 나타낸 것이다.

상기와 같이, BCa1 및 ANa1의 조합으로부터 Na⁺/Ca² ⁺ 변화를 모니터링할 수 있다.

7) 쥐의 해마 및 시상하부 조직의 제조 및 착색

2주된 쥐의 해마로부터 조각을 준비하였다. 진동 블레이드 절단기(vibrating-blade microtome)를 이용하여 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF; 138.6mM NaCl, 3.5mM KCl, 21mM NaHCO₃, 0.6mM NaH₂PO₄, 9.9mM D-glucose, 1mM CaCl₂, 및 3mM MgCl₂) 내에서 관상 조각을 400㎛의 두께로 절단하였다. 조각들을 37℃에서 40분 동안 95% O₂ 및 5% CO₂를 내뿜는 ACSF 내에서 10mM의 BCa1 및 20mM의 ANa1으로 배양시켰다. 그 후, 조각들을 ACSF로 3회 세척하고, 유리 바닥 디쉬(MatTek)로 이동시키고, 이를 전자현미경으로 관찰하였다.

BCa1 및 ANa1으로 착색된 쥐 해마 조각의 이미지를 하기 도 14에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 14의 (a) 및 (b)는 10× 배율에 의한 치아이랑(dentate gyrus) 뿐 아니라 CA1-CA3 영역의 밝은 영역 및 TPM 이미지를 나타낸 것으로서, (b)는 390 ~ 450nm(채널 1) 및 500 ~ 560nm(채널 2)에서 수집된 25 TPM 이미지를 나타낸 것이다. 도 14의 (c) 내지 (e)는 CA3 영역의 TPM 이미지를 나타낸 것으로서, (c) 및 (d)는 각각 100× 배율에서 100 ~ 200㎛의 깊이에서 채널 1 및 채널 2에서 수집된 TPM 이미지를 나타낸 것이고, (e)는 이를 병합한 것이다.

상기와 같이 본 발명에 따른 세포막 인근의 칼슘 이온 이광자 형광 프로브는 칼슘 양이온과 반응하여 강한 이광자 형광을 나타내고, 칼슘 이온과 함께 착물을 형성하여 세포막에 선택적이고 쉽게 로딩될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 60분 이상의 시간에 걸쳐 100 ~ 200㎛ 깊이의 생체 세포 및 생체 조직에서 선택적으로 칼슘 이온을 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 조직에서 칼슘 양이온의 분포를 이미징할 수 있다. 또한, 서로 다른 형광색의 두 표지자를 생체 세포 또는 조직에 동시에 염색함으로써 칼슘과 나트륨의 활동성을 서로 다른 채널에서 영상화 시킬 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이다.
제1항에 있어서,
상기 이광자 형광 프로브는 칼슘 이온과 반응하여 착물을 형성하는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이다.
1) 6-브로모-N-메틸-2-나프틸아민(6-bromo-N-methyl-2-naphthylamine), 프로톤-스폰지(proton-sponge), 및 터트-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)의 혼합물을 환류시켜서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 B를 제조하는 단계,
2) 상기 화합물 B, 벤즈옥사졸(benzoxazole), Pd(II)OAc, PPh₃, CuI, 및 CsCO₃의 혼합물을 교반하여 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 A를 제조하는 단계, 및
3) 상기 화합물 A, 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 D를 혼합하고, 반응시키는 단계
를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 1 및 화학식 3에서, X는 O, S 또는 NH 이다.
하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징하는 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이다.
제5항에 있어서,
상기 이미징의 깊이는 100 ~ 200㎛인 것을 특징으로 하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 분포를 선택적으로 이미징하는 방법:
하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 및 나트륨 이온 감지용 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직에서 Na⁺/Ca² ⁺ 교환을 동시에 이미징하는 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X는 O, S 또는 NH 이다.
제7항에 있어서,
상기 나트륨 이온 감지용 이광자 형광 프로브는 하기 ANa1으로 표시되는 것을 특징으로 하는 생체 세포 또는 조직에서 Na⁺/Ca² ⁺ 교환을 동시에 이미징하는 방법:
[ANa1]