JP5422803B2 - 相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム/カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法 - Google Patents
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Description
1)6−ブロモ−N−メチル−2−ナフチルアミン(6−bromo−N−methyl−2−naphthylamine)、プロトンスポンジ(proton−sponge)、及びtert‐ブチルブロモアセタート(tert−butyl bromoacetate)の混合物を還流させて、下記化学式2で表される化合物Bを製造する段階と、
2)前記化合物B、ベンズオキサゾール(benzoxazole)、Pd(II)OAc、PPh3、CuI、及びCsCO3の混合物を撹拌して、下記化学式3で表される化合物Aを製造する段階と、
3)前記化合物A、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1−hydroxybenzotriazole)及び下記化学式4で表される化合物Dを混合し、反応させる段階と、を含む前記化学式1で表される二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
6−ブロモ−N−メチル−2−ナフチルアミン(6−Bromo−N−methyl−2−naphthylamine)及び2−(2'−モルホリノ−2'−オキソエトキシ)−4−ニトロ−N,N−ビス(ヒドロキシカルボニルメチル)アニリン(2−(2'−morpholino−2'−oxoethoxy)−4−nitro−N,N−bis(hydroxycarbonylmethyl)aniline、化合物C)を従来技術によって合成した。他の化合物の合成は、下記に表わした。
6−ブロモ−N−メチル−2−ナフチルアミン(6−bromo−N−methyl−2−naphthylamine、2.0g、8.5mmol)、プロトンスポンジ(proton−sponge、2.0g、9.4mmol)、及びtert‐ブチルブロモアセタート(tert−butyl bromoacetate、2.0g、1.5mL、10.2mmol)の混合物をMeCN内でN2下で12時間還流させた。生成物を酢酸エチルで抽出し、塩水(brine)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮させた後、溶離液(eluent)としてヘキサン/酢酸エチル(5:1)を利用したシリカゲルカラムで精製した。
mp:63℃;
IR(KBr):1,736cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3):δ7.79(d、1H、J=2Hz)、7.57(d、1H、J=9Hz)、7.48(d、1H、J=9Hz)、7.38(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.05(dd、1H、J=9、J=2Hz)、6.82(d、1H、J=2Hz)、4.04(s、2H)、3.14(s、3H)、1.40(s、9H);
13C NMR(100MHz、CDCl3):δ=170.3、147.5、133.8、129.8、129.7、128.4、128.3、128.2、116.7、115.7、106.7、82.2、56.0、40.5、28.7ppm。
化合物B(1.0g、2.9mmol)、ベンズオキサゾール(benzoxazole、0.41g、3.4mmol)、Pd(II)OAc(0.033g、0.15mmol)、PPh3(0.073g、0.29mmol)、CuI(0.11g、0.58mmol)、及びCsCO3(1.1g、3.5mmol)の混合物をDMF内でN2下で140℃で12時間撹拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルで希釈し、塩水(brine)で洗浄し、MgSO4で乾燥させた後、濃縮させた。粗生成物を溶離液(eluent)としてヘキサン/酢酸エチル(3:1)を利用したシリカゲルカラムで精製した。
mp:165℃;
IR(KBr):1,738cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3):δ8.56(d、1H、J=2Hz)、8.14(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.78(d、1H、J=9Hz)、7.73(m、1H)、7.69(d、1H、J=9Hz)、7.54(m、1H)、7.30(m、2H)、7.06(dd、1H、J=9、J=2Hz)、6.85(d、1H、J=2Hz)、4.05(s、2H)、3.15(s、3H)、1.41(s、9H);
13C NMR(100MHz、CDCl3):δ=169.7、164.0、150.9、148.6、142.6、136.8、130.3、128.1、127.0、126.4、124.7、124.5、124.4、120.7、119.9、116.2、110.6、106.4、82.1、55.7、40.2、28.4ppm。
mp:188℃;
IR(KBr):2,900、1,718cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3/CD3OD):δ8.57(d、1H、J=2Hz)、8.12(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.84(d、1H、J=9Hz)、7.75(d、1H、J=9Hz)、7.71(m、1H)、7.60(m、1H)、7.36(m、2H)、7.16(dd、1H、J=9、J=2Hz)、6.94(d、1H、J=2Hz)、4.22(s、2H)、3.22(s、3H);
13C NMR(100MHz、CDCl3/CD3OD):δ=173.1、164.3、150.9、148.8、142.1、137.0、130.6、128.4、127.3、126.4、125.2、124.9、124.6、120.3、119.6、116.4、110.8、106.3、54.6、40.1ppm。
化合物C(0.67g、1.6mmol)及びカーボン上のPd(0.033g、0.31mmol)を酢酸エチル(50mL)内で混合し、水素下で12時間振った。反応混合物をセライト(Celite)で濾過し、溶媒は眞空下で除去した。
IR(KBr):1,740、1,642cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3):δ6.77(d、1H、J=8Hz)、6.26(d、1H、J=2Hz)、6.17(dd、1H、J=8、J=2Hz)、4.65(s、2H)、3.97(s、4H)、3.59(s、6H)、3.58−3.53(m、8H);
13C NMR(100MHz、CDCl3):δ=171.6、166.6、151.6、143.3、130.6、122.6、108.6、103.0、68.4、66.8、54.0、51.6、45.8ppm。
化合物A(0.10g、0.30mmol)、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(1,3−dicyclohexyl carbodiimide、0.060g、0.30mmol)、及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1−hydroxybenzotriazole、0.034g、0.25mmol)の混合物をCH2Cl2内で1時間攪拌した。前記混合物にCH2Cl2内の化合物D(0.10g、0.25mmol)を追加し、N2下で12時間撹拌した。結果として得られた混合物を濾過し、濾過物を眞空下で濃縮させた。粗生成物を溶離液(eluent)としてCHCl3/MeOH(20:1)を利用したカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)によって精製した。
mp:80℃;
IR(KBr):1,743、1,626、1,516cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3):δ8.65(d、1H、J=2Hz)、8.27(s、1H)、8.23(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.88(d、1H、J=9Hz)、7.79(d、1H、J=9Hz)、7.76(m、1H)、7.59(m、1H)、7.38(d、1H、J=2Hz)、7.34(m、2H)、7.16(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.09(d、1H、J=2Hz)、6.87(m、2H)、4.74(s、2H)、4.13(s、4H)、4.10(s、2H)、3.66(s、6H)、3.50−3.61(m、8H)、3.22(s、3H);
13C NMR(100MHz、CDCl3):δ=171.6、168.2、166.2、163.6、150.7、150.1、148.6、142.3、136.2、135.9、133.0、130.6、127.9、127.3、126.9、125.0、124.9、124.7、121.3、120.6、119.8、116.6、113.8、110.7、107.5、107.3、67.5、66.8、60.7、53.8、52.1、45.7、40.4ppm。
mp:162℃;
IR(KBr):2,970、1,626、1,514cm−1;
1H NMR(400MHz、CDCl3/CD3OD):δ8.60(d、1H、J=2Hz)、8.16(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.88(d、1H、J=9Hz)、7.78(d、1H、J=9Hz)、7.73(m、1H)、7.60(m、1H)、7.37(d、1H、J=2Hz)、7.34(m、2H)、7.17(dd、1H、J=9、J=2Hz)、7.04(d、1H、J=2Hz)、6.93(m、2H)、4.76(s、2H)、4.14(s、2H)、4.03(s、4H)、3.51−3.59(m、8H)、3.24(s、3H);
13C NMR(100MHz、CDCl3):δ=172.9、168.2、166.4、163.6、150.7、149.9、149.7、142.4、136.9、135.2、133.7、130.6、128.2、127.4、125.9、125.6、125.3、124.5、120.0、119.8、119.6、117.1、112.8、111.3、106.7、106.2、105.8、67.0、66.7、56.1、54.1、45.6ppm。
Anal.Calcd for C36H35N5O9:C、63.43;H、5.18;N、10.27.Found:C、63.22;H、5.21;N、10.19。
DMSOに染料を溶かしてストック溶液(1.0×10−2M)を製造した。溶液を(6.0×10−3〜6.0×10−5)Mで希釈させ、マイクロシリンジを用いてH2O 3.0mLを含有するキュベット(cuvette)に追加した。あらゆる場合、H2O内のDMSOの濃度は、0.2%に維持させた。染料濃度に対する蛍光強度のグラフは、低い濃度で線形であり、高い濃度では下側に曲がった形態であった(図1)。線形領域の最大濃度を溶解度として測定したところ、水に対するBCa1の溶解度は、約5.0μMであった。これは、細胞を着色するに十分である。
吸収スペクトルは、ヒューレットパッカード(Hewlett−Packard)8453ダイオードアレイ分光光度計から測定し、蛍光スペクトルは、1cm標準石英セルを有したAmico−Bowman series2発光分光計から測定した。蛍光量子収率は、従来に知られた方法を利用し、クマリン307(Φ=0.95 in MeOH)を用いて決定した。
Φ:蛍光光子効率(誤差範囲:±10%)
KTP d:バッファ内の二光子工程によって測定されたCa2+に対する解離定数(dissociation constant)
Ki d:細胞内の二光子工程によって測定されたCa2+に対する解離定数(dissociation constant)
FEF:蛍光向上因子((F−Fmin)/Fmin=FEF)、前記表1のFEF値で括弧内の数は、二光子工程に対するものである。
δΦ:10−50cm4s/光子(GM)で二光子作動断面積(誤差範囲:±15%)
nd:二光子励起蛍光強度があまりにも弱くて正確に断面積が測定されない。
単一光子及び二光子スペクトルの測定のためのLUVsを押出法による多重膜リポソーム(multilamellar vesicles)の水和懸濁(hydratedsuspension)によって製造した。脂肪質(Lipids)をCHCl3/MeOH(95/5vol%)に溶かし、N2流れ及び眞空下で乾燥させた。結果フィルムを懸濁液が均質になるまで60℃で振りながら、MOPS buffer(30mM MOPS、100mM KCl、pH7.2)内で水和させた。混合物を3回凝固−解凍(freeze−thaw)サイクルを行った後、100nm気孔メンブレン(AvantiPolar Lipids)を通過させてLUVsを押出した。リポソームを着色するために、DMSO内にBCa1を追加し、30分間待った。リポソーム内のプローブの比率は、300:1であった。温度は、0.1℃の精度を有するデジタル温度計を用いて測定した。
二光子断面積(δ)は、フェムト秒単位(femto second、fs)蛍光測定法を用いて測定した。30mM MOPSバッファ(2.5mM CaCl2、100mM KCl、pH7.2)にBCa1を5.0×10−6Mの濃度で溶かした後、蛍光強度が誘導された二光子は、740〜940nmでフルオレセイン(fluorescein、8.0×10−5M、pH=11)を用いて測定した。レファレンスとサンプルのTPEFスペクトル強度は、同一の励起波長で決定された。TPA断面は、下記数式1を用いて計算した。
前記数式1で、s及びrは、サンプル及びレファレンス分子を表わし、Sは、CCD検出器から収集された信号強度を表わし。Фは、蛍光量子収率を表わし、fは、実験機器の全体蛍光収集効率を表わし、cは、溶液内の分子密度を表わし、δrは、レファレンス分子のTPA断面積を表わす。
HeLa細胞は、熱非活性化された10%(v/v)のfetal bovine serum(FBS;Gibco)、100units/mLペニシリン(penicillin)及び100mg/mLストレプトマイシン(streptomycin)が補充されたDulbecco’s Modified Eagls’s Medium(DMEM;Gibco)内で培養された。細胞は、37℃でair/CO2の比率が95:5である加湿環境で成長された。イメージング4日前に細胞をトリプシン(trypsin)−EDTA溶液で分離し、50,000cells/mm2の細胞をガラス底ディッシュ(MatTek)に平板培養した。細胞は、37℃で20分間、2μMのANa1で培養され、次いで、常温で0.5μMのBCa1を取りこませた。10分後に、細胞を還元されたカルシウム補正塩溶液(RCBSS;127mM NaCl、3.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、0.8mM MgCl2、5mMグルコース、及び10mM HEPESバッファ)で2回洗浄した後、イメージ化した。
プローブでラベルされたHeLa細胞及び組織の二光子蛍光顕微鏡イメージは、共焦点及び多光子顕微鏡(spectral confocal and multiphoton microscopes、Leica TCS SP2)を用いて測定した。
前述のように、BCa1及びANa1の組合わせからNa+/Ca2+変化をモニタリングすることができる。
2週齢のモルモットの海馬から切片を準備した。振動ブレード切断機(vibrating−blade microtome)を用いて人工脳脊髄液(artificialcerebrospinal fluid、ACSF;138.6mM NaCl、3.5mM KCl、21mM NaHCO3、0.6mM NaH2PO4、9.9mM D−glucose、1mM CaCl2、及び3mM MgCl2)内で冠状切片を400μmの厚さで切断した。切片を37℃で40分間に、95% O2及び5% CO2を噴き出すACSF内で10mMのBCa1及び20mMのANa1で培養させた。次いで、切片をACSFで3回洗浄し、ガラス底ディッシュ(MatTek)に移動させ、これを電子顕微鏡で観察した。
Claims (7)
- 下記化学式1で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブ:
[化学式1]
前記化学式1で、Xは、O、SまたはNHである。 - 前記二光子蛍光プローブは、カルシウムイオンと反応して錯体を形成することを特徴とする請求項1に記載の二光子蛍光プローブ。
- 下記化学式1で表される化合物を含む生体細胞または組織のカルシウムイオン検出用の二光子蛍光プローブ:
[化学式1]
前記化学式1で、Xは、O、SまたはNHである。 - 1)6−ブロモ−N−メチル−2−ナフチルアミン(6−bromo−N−methyl−2−naphthylamine)、プロトンスポンジ(proton−sponge)、及びtert‐ブチルブロモアセタート(tert−butyl bromoacetate)の混合物を還流させて、下記化学式2で表される化合物Bを製造する段階と、
2)前記化合物B、ベンズオキサゾール(benzoxazole)、Pd(II)OAc、PPh3、CuI、及びCsCO3の混合物を撹拌して、下記化学式3で表される化合物Aを製造する段階と、
3)前記化合物A、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1−hydroxybenzotriazole)及び下記化学式4で表される化合物Dを混合し、反応させる段階と、
を含む下記化学式1で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブの製造方法:
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
前記化学式1及び化学式3で、Xは、O、SまたはNHである。 - 下記化学式1で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法:
[化学式1]
前記化学式1で、Xは、O、SまたはNHである。 - 前記イメージングの深さは、100〜200μmであることを特徴とする請求項5に記載の生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法。
- 下記化学式1で表される二光子蛍光プローブ及び下記ANa1で表されるナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でNa+/Ca2+交換を同時にイメージングする方法:
[化学式1]
[ANa1]
前記化学式1で、Xは、O、SまたはNHである。
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