WO2007013201A1 - 亜鉛蛍光プローブ - Google Patents

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WO2007013201A1
WO2007013201A1 PCT/JP2006/304749 JP2006304749W WO2007013201A1 WO 2007013201 A1 WO2007013201 A1 WO 2007013201A1 JP 2006304749 W JP2006304749 W JP 2006304749W WO 2007013201 A1 WO2007013201 A1 WO 2007013201A1
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substituent
general formula
compound
represented
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PCT/JP2006/304749
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masayasu Taki
Yukio Yamamoto
Original Assignee
Kyoto University
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
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    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/42—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a novel zinc fluorescent probe for measuring zinc ions in living cells and living tissues with high sensitivity under physiological conditions.
  • Zinc is an essential trace metal element that is the second most abundant after iron in the human body.
  • free zinc ions Zn 2+
  • Zn 2+ free zinc ions
  • DNA-binding proteins such as transcription factors are said to have Zn 2+ -binding motifs such as zinc fingers and LIM motifs and bind to DNA via them.
  • Zn 2+ deficiency affects the transcription of DNA and other factors, suggesting that it may be involved in carcinogenesis.
  • Patent Document 1 proposes a compound having a polyamine as a substituent. Although this compound can measure zinc in a living organism with high sensitivity, the fluorescence intensity detected due to the difference in the thickness of the introduced cell is affected, and the Zn 2+ ion concentration can be accurately and quantitatively determined from the fluorescence intensity. There was a problem that it was difficult to analyze.
  • Patent Document 2 proposes a ratiometric fluorescence probe. This is an analytical method that uses the shift of the excitation wavelength when the probe binds to the zinc ion. This method allows accurate quantitative analysis because it takes the ratio of the two excitation wavelengths. However, since light of two excitation wavelengths is used, a large-scale and complicated apparatus must be used for the light source and the detection system (fluorescence microscope, flow cytometry, etc.), and there is a problem that the versatility is poor.
  • Non-patent Document 1 a zinc probe that can observe a change in fluorescence wavelength due to the concentration of zinc ions using a single excitation wavelength.
  • this compound has a problem that it is not sufficiently water-soluble and sensitive to zinc ions.
  • the excitation wavelength is in the ultraviolet region, there is a problem that it is not preferable for cells.
  • Patent Document 1 JP 2000-239272 A
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 02/102795
  • Non-Patent Document 1 J. Am. Chem. Soc. Communications, 2004, 126, p712-713
  • the present invention relates to a zinc fluorescent probe that is excellent in water solubility and capable of observing a change in the concentration of zinc ions in the Itoda vesicle with high sensitivity using a single wavelength of excitation light, a method for producing the same, It is another object of the present invention to provide a zinc ion measurement method using the zinc fluorescent probe.
  • the present invention can improve or solve the above problems when a compound represented by the following general formula (I) is used as a zinc probe. I found out. As a result of further research based on this knowledge, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following compounds, zinc fluorescent probes, methods for producing the same, methods for measuring zinc ions using the zinc fluorescent probes, and the like.
  • Ar is an optionally substituted aryl group
  • X is a group represented by —O— or —S—
  • n is 2 or 3
  • R 1 and R 2 are the same or different.
  • Z is a single bond or a formula:
  • A represents a benzene ring which may have a substituent
  • Y represents a group represented by _ ⁇ 1 or 1 S-.
  • Ar is an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, a mono- or di (hydroxyalkyl) amino group, a carboxyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • Item 2. The compound or a salt thereof according to Item 1, which is an aryl group substituted with at least one group selected from the group consisting of: a carboxyalkyl group, an alkoxycarbonylalkyl group, a carboxyalkoxy group, and an alkoxycarbonylalkoxy group.
  • Item 3. In the general formula (I), Ar is a group consisting of a phenyl group, a tolyl group, a naphthyl group, a carboxyalkoxy group-substituted phenyl group, and a 5- (dimethylamino) 1 naphthyl group.
  • Item 3. The compound according to Item 2 or a salt thereof, which is one group selected from the group consisting of:
  • Item 4 The compound according to any one of Items 1 to 3, wherein, in the general formula (I), X and Y are groups represented by -O1, n is 2, and A is a benzene ring. Or a salt thereof.
  • R 1 and R 2 are the same or different and are selected from a nitrogen-containing heteroaryl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, and an alkoxy group.
  • Terms 1 to 4 which are an alkyl group substituted with at least one group selected from the group consisting of
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • the benzene rings, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, may have a substituent, an aryl group or a heteroaryl that may have a substituent Group.
  • Ar is an optionally substituted aryl group
  • X is a group represented by O or S
  • n is 2 or 3
  • R 1 and R 2 are the same or different and have a substituent.
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different, and a group represented by _ ⁇ _ or _S-, n is 2 or 3, and A has a substituent.
  • Benzene ring, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, an alkyl group, a substituent, an aryl group or a heteroaryl group that may have a substituent. Show.
  • R 3 represents an alkyl group, and Ar, X, Y, n, A, R 1 and R 2 are the same as defined above.
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • the benzene rings, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, may have a substituent, an aryl group or a heteroaryl that may have a substituent Group
  • R 3 represents an alkyl group.
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • the benzene rings, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, may have a substituent, an aryl group or a heteroaryl that may have a substituent Group R 3 represents an alkyl group.
  • R 3 represents an alkyl group, and Ar, X, Y, ⁇ , and ⁇ are the same as described above.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents an alkyl group which may have a substituent).
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • Benzene ring, R 3 represents an alkyl group.
  • A represents an optionally substituted benzene ring, m represents 1 or 2)
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • the benzene rings, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, may have a substituent, an aryl group or a heteroaryl that may have a substituent Group R 3 represents an alkyl group.
  • a process comprising reacting a compound represented by the formula: and a trialkyl phosphite
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X and Y are the same or different and are represented by O— or —S
  • n is 2 or 3
  • A has a substituent.
  • the benzene rings, R 1 and R 2 may be the same or different and may have a substituent, may have a substituent, an aryl group or a heteroaryl that may have a substituent Group
  • R 3 represents an alkyl group.
  • A represents a substituent or a benzene ring
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • X is a group represented by O or S
  • n is 2 or 3
  • R 1 and R 2 are the same or different and have a substituent.
  • R 3 represents an alkyl group
  • Ar, X, n, R 1 and R 2 are as defined above.
  • the ester compound represented by this is hydrolyzed, The manufacturing method characterized by the above-mentioned.
  • Item 18 A reagent for measuring zinc ion comprising the compound or salt thereof according to any one of the above claims:! To 7.
  • Item 19 A zinc complex comprising the compound according to any one of claims 7 to 7 and a zinc ion.
  • Item 20. A method for measuring zinc ions, comprising:
  • Measuring method including
  • Item 21 The zinc complex formed in (a) above and the compound or salt thereof according to any one of claims 1 to 7, wherein in the step (b), light having a single excitation wavelength is irradiated. 21. The measuring method according to claim 20, wherein each of the fluorescent intensities is measured.
  • Item 22 The measurement method according to Item 20, wherein the excitation wavelength is 340 to 400 nm.
  • step (b) the peak wavelength of the fluorescence spectrum of the compound or salt thereof according to any one of claims 1 to 7 and the fluorescence spectrum of the zinc complex formed in the above (a).
  • Item 24 A method for measuring intracellular zinc ions, comprising:
  • Measuring method including
  • a zinc fluorescent probe is a compound that exhibits a fluorescence response when complexed with zinc, and is used for imaging free zinc ions in a living body.
  • the zinc fluorescent probe of the present invention has the general formula (I): [0071] [Chemical 18]
  • Ar is an optionally substituted aryl group
  • X is a group represented by O or S
  • n is 2 or 3
  • R 1 and R 2 are the same or different and have a substituent. May have an alkyl group, a substituent, an aryl group or a substituent, a heteroaryl group
  • Z is a single bond or a formula:
  • A represents a benzene ring which may have a substituent
  • Y represents a group represented by —O— or —S—.
  • Examples of the aryl group of the aryl group that may have a substituent represented by Ar include monocyclic or bicyclic rings such as a phenyl group, (o-, m-, or p) tolyl group, and naphthyl group.
  • Reel group Of these, a phenyl group or a p-tolyl group is preferable.
  • Examples of the substituent on the aryl group include an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or di-quinolamino group, a mono- or di (hydroxyalkyl) amino group, a carboxyl group, Examples include an alkoxycarbonyl group, a carboxyalkyl group, an alkoxycarbonylalkyl group, a carboxyalkoxy group, an alkoxycarbonylalkoxy group, etc., and 1 to 3 (preferably 1) groups selected from these groups are present on the aryl group. Replace with May be.
  • alkyl group examples include C 1, such as ethyl group, propyl group, and butyl group.
  • Examples include 1-6 alkyl groups.
  • the alkoxy group includes, for example, C 1, such as a methoxy group, an ethoxy group, and a propoxy group.
  • Examples of the mono- or dianoleno-amino group include mono- or di-C alkylamino groups such as a metheno-leamino group, an ethino-reamino group, a propino-leamino group, a dimethylamino group, a jetino-reamino group, and a dipropylamino group.
  • Examples of the mono- or di (hydroxyalkyl) amino group include 2-hydroxyethylamino group, hydroxypropylamino group, di (2-hydroxyethyl) amino group, and di (hydroxypropyl) amino group. And mono or di (hydroxy C alkyl) amino groups such as groups.
  • alkoxycarbonyl group examples include C alkoxycarbonyl groups such as a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group.
  • Examples of the carboxyalkyl group include carboxy C alkyl groups such as a carboxymethyl group and a carboxyethyl group.
  • alkoxycarbonylalkyl group examples include C alkoxycarbonyl C alkyl groups such as ethoxycarbonylmethyl group and methoxycarbonylmethyl group.
  • Examples of the carboxyalkoxy group include a carboxy C alkyl group such as a carboxymethoxy group and a carboxyethoxy group.
  • alkoxycarbonylalkoxy group examples include c alkoxycarbonyl C alkoxy groups such as methoxycarbonylmethoxy group and ethoxycarbonylmethoxy group.
  • Ar is preferably a phenyl group, a tolyl group, a naphthyl group, a carboxymethoxy group-substituted phenyl group, a 5- (dimethylamino) -1-naphthyl group (dansyl group), or the like.
  • X is preferably a group represented by O-.
  • N is preferably 2.
  • ⁇ has a substituent
  • substituents include an alkyl group, an alkoxy group, a halogen atom and the like.
  • A is preferably a benzene ring.
  • Y is represented by 1 O— is preferable.
  • the alkyl group of an alkyl group which may have a substituent represented by R 1 or R 2 For example, it is preferable C alkyl group such as methyl group, Echiru group, a propyl group.
  • Examples of the substituent on the alkyl group include a nitrogen-containing heteroaryl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, and an alkoxy group (for example, C
  • nitrogen-containing heteroaryl group examples include a nitrogen-containing 6-membered heteroaryl group such as a pyridyl group (particularly 2_pyridyl group), a pyradyl group, a pyrimidinyl group, and a pyridazinyl group.
  • the mono or dianoleno amino group examples include mono or di C alkylamino groups such as a methylamino group and a dimethylamino group.
  • One or two (preferably one) of these may be substituted on the alkyl group.
  • the alkyl group optionally having a substituent represented by R 1 or R 2 is preferably a 2_pyridinoremethinole group, a 2_pyridylethyl group, a hydroxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, a carboxymethyl group. , 2-carboxyethyl group, dimethylamino group and the like.
  • the Ariru group optionally Ariru group which may have a substituent represented by R 1 or R 2, phenylene group, include monocyclic or Ariru group ring C, such as naphthyl.
  • Examples of the substituent on the aryl group include a nitrogen-containing heteroaryl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, and an alkoxy group (for example, a C-alkyl group).
  • nitrogen-containing heteroaryl group examples include nitrogen-containing 6-membered heteroaryl groups such as pyridyl group (particularly 2-pyridyl group), birazinyl group, pyrimidinyl group, pyridazinyl group and the like.
  • mono- or dialkylamino groups examples include: Examples thereof include mono- or di-C alkylamino groups such as a methylamino group and a dimethylamino group.
  • One or two (preferably one) of these may be substituted on the aryl group.
  • the heteroaryl group having a substituent represented by R 1 or R 2 may be, for example, at least one selected from the group consisting of N, ⁇ and S.
  • An example is a C heteroaryl group containing a terror atom.
  • Specific heteroaryl groups include
  • Examples thereof include a pyridinole group, a pyradyl group, a pyrimidinyl group, a pyridazinyl group, an imidazolyl group, a pyrazolyl group, an oxazolyl group, an isoxazolyl group, a chenyl group, and a furyl group.
  • Examples of the substituent on the heteroaryl group include a nitrogen-containing heteroaryl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a mono- or dialkylamino group, an alkoxy group (for example, a C alkoxy group), and the like.
  • Examples of the nitrogen-containing heteroaryl group include pyri
  • Examples thereof include nitrogen-containing 6-membered heteroaryl groups such as dinole group (especially 2_pyridyl group), pyrajur group, pyrimidinyl group and pyridazinyl group.
  • Examples of the mono- or dialkylamino group include mono- or di-C alkylamino groups such as a methylamino group and a dimethylamino group.
  • One or two (preferably one) of these may be substituted on the heteroaryl group.
  • Examples of the salt of the compound represented by the general formula (I) include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt.
  • the compound represented by the general formula (I) is suitably used as a fluorescent probe for measuring zinc ions.
  • the compound has the following characteristics.
  • Ratiometric means a method of observing changes in the intensity ratio at two different wavelengths. Here, we observe the change in the peak intensity ratio of each fluorescence wavelength for a free zinc fluorescent probe and its zinc complex.
  • the excitation light wavelength is longer than the ultraviolet region (around 340 to 370 nm), the effect on the cells can be reduced as much as possible.
  • a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof contained in the zinc fluorescent probe of the present invention (The production method of the compounds represented by the general formulas (II) and (III) or a salt thereof will be described.
  • the compound represented by the general formula (II) can be produced, for example, as follows.
  • R 3 is an alkyl group, m represents 1 or 2, and Ar, X, Y, n, A, R 1 and R 2 are the same as above.
  • Examples of the alkyl group represented by R 3 include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. C alkyl group of. In particular, a methyl group and an ethyl group are preferable.
  • the compound represented by the general formula (1) is converted to a base (for example, potassium carbonate) according to the description of J. Am. Chem. Soc. Communications, 2002, 124 (5), p776-778.
  • a dibromo compound represented by the general formula (2) is reacted in the presence to obtain a compound represented by the general formula (3).
  • the compound represented by the general formula (3) is converted into a compound represented by the general formula (3) in the presence of an acid catalyst (for example, paratoluenesulfonic acid (pTsOH), pyridinium paratoluenesulfonate (PPTS), etc.). ) Is reacted to form an acetal (4), which is then combined with an aldehyde compound represented by the general formula (5) in the presence of a base (for example, sodium hydride, sodium hydroxide, potassium carbonate, etc.). The compound is reacted to obtain the compound represented by the general formula (6).
  • an acid catalyst for example, paratoluenesulfonic acid (pTsOH), pyridinium paratoluenesulfonate (PPTS), etc.
  • PPTS pyridinium paratoluenesulfonate
  • a base for example, sodium hydride, sodium hydroxide, potassium carbonate, etc.
  • the compound represented by the general formula (6) is obtained by reducing the formyl group with a reducing agent such as NaBH.
  • a formyl compound represented by 0) is obtained.
  • Oxidation with an oxidizing agent such as 2 gives an aldehyde compound represented by the general formula (14). This is reacted with a secondary amine represented by the general formula (15) (reductive amination reaction) in the presence of a reducing agent (for example, sodium triacetoxyborohydride) to give a general formula (16) To obtain a compound represented by
  • the carboxylic acid ester of the compound represented by the general formula (16) is hydrolyzed with an alkali metal hydroxide such as LiOH, whereby the present invention represented by the general formula (II) is obtained.
  • an alkali metal hydroxide such as LiOH
  • the present invention represented by the general formula (II) is obtained.
  • Compound Get When Ar, R and / or IT contains a carboxylic acid ester, the carboxylic acid ester is usually hydrolyzed to a carboxylic acid in this hydrolysis step.
  • the compound represented by the general formula (II) can also be produced, for example, as follows.
  • a compound represented by the general formula (17) is reacted with a compound represented by the general formula (18) in the presence of a base (for example, potassium carbonate, etc.) to give a general formula (
  • the formyl compound represented by 19) is obtained.
  • the indole compound represented by the general formula (16) is obtained by reductive ring closure using kill phosphite.
  • the compound represented by the general formula (III) can be produced, for example, as follows.
  • a compound represented by the general formula (17) is reacted with a compound represented by the general formula (24) in the presence of a base (for example, potassium carbonate, etc.) to give a compound represented by the general formula (25). A compound is obtained.
  • a base for example, potassium carbonate, etc.
  • the sulfonic acid amide represented by the general formula (27) is oxidized with an oxidizing agent such as MnO, and the general formula ( The aldehyde compound represented by 28) is obtained. This compound is reacted with a Witig reagent represented by the general formula (11) to obtain an olefin compound represented by the general formula (29), which is converted to P (OEt)
  • the indole compound represented by the general formula (30) is treated with an acid (for example, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, etc.) to remove the Boc group to obtain the compound represented by the general formula (31).
  • an acid for example, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, etc.
  • the compound represented by the general formula (31) is reacted with the compound represented by the general formula (32) and (33) in the presence of an activator such as a base (for example, potassium carbonate).
  • an activator such as a base (for example, potassium carbonate).
  • W 1 of the compound represented by the general formula (32) and W 2 of the compound represented by the general formula (33) may be the same or different.
  • Examples of the leaving group represented by W 1 and W 2 include halogen atoms such as chlorine atom, bromine atom and iodine atom, TfO_, Ms 0_ and TsO_.
  • a predetermined aldehyde compound is used, and in the presence of a reducing agent (for example, sodium triacetoxyborohydride).
  • a reducing agent for example, sodium triacetoxyborohydride.
  • a compound represented by the general formula (34) can also be produced by subjecting the compound represented by the general formula (31) to a reductive amination reaction.
  • the compounds represented by the general formulas (II) and (III) can be converted into a salt, if necessary.
  • acceptable salts include alkali metal salts such as lithium salts, sodium salts, and potassium salts. In some cases, it can be obtained as a solvate such as water or alcohol.
  • the compounds of the present invention represented by the above general formula (I) or salts thereof are useful as zinc fluorescent probes and reagents for measuring zinc ions. is there.
  • the peak wavelength of the absorption spectrum is small. Therefore, the wavelength of the excitation light to be irradiated may be single, and the excitation device and the detection device can be simplified.
  • the absorption wavelength The peak varies depending on the chemical structure of compound (I) or a salt thereof, but is usually about 340 to 400 nm, preferably about 340 to 370 nm, and the wavelength of the excitation light can be appropriately selected from this range.
  • the peak of the fluorescence spectrum causes a remarkable wavelength shift.
  • the wavelength shift of this fluorescence spectrum peak is usually about 20 nm or more, further about 25 to 50 nm, particularly about 25 to 45 nm.
  • the compound of the present invention as a zinc fluorescent probe, irradiation with excitation light having an appropriate single wavelength, and measuring the fluorescence intensity ratio between the compound (I) and the zinc complex at that time.
  • the zinc ion in the sample can be measured by the ratio method.
  • the compound (I) or a salt thereof of the present invention is characterized by being able to specifically capture zinc ions and forming a complex very rapidly.
  • compound (I) or a salt thereof does not affect the sample even if other metal ions (for example, sodium ion, calcium ion, potassium ion or magnesium ion) coexist in addition to zinc ion.
  • other metal ions for example, sodium ion, calcium ion, potassium ion or magnesium ion
  • the compound (I) or a salt thereof of the present invention is extremely useful as a zinc fluorescent probe for measuring zinc ions in living cells and living tissues under physiological conditions.
  • the term “measurement” is interpreted in the broadest sense including quantitative and qualitative.
  • the method for measuring zinc ions of the present invention comprises (a) a step of reacting a compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof with a zinc ion to form a zinc complex, and (b) the above (a And a step of measuring the fluorescence intensity of the zinc complex formed in (1).
  • an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, ethanol, acetone, ethanol or the like.
  • Compound (I) or a salt thereof is dissolved in a mixed medium of a water-compatible organic solvent such as tylene glycol, dimethyl sulfoxide, and dimethylformamide and water.
  • This solution is added to an appropriate buffer containing cells and tissues, irradiated with a single wavelength of excitation light, and compound (
  • each fluorescence intensity ratio of I) and its zinc complex is just to measure each fluorescence intensity ratio of I) and its zinc complex.
  • a hydrophilic group of compound (I) such as a carboxyl group into a predetermined ester group.
  • the ester is not particularly limited as long as it can be hydrolyzed with esterase after entering the cell.
  • the concentration of the compound (I) is, for example, about 0.05 to 100 ⁇ , preferably about 0.1 to 10 ⁇ . If that's the case, The concentration of zinc ions can be measured, for example, from about 0.05 ⁇ to 200 ⁇ , and preferably from about 0.1 ⁇ to 100 ⁇ .
  • the compound (lie) has an absorption wavelength of 342 nm and a fluorescence wavelength of 427 nm, and can be used as a zinc fluorescent probe at a concentration of about 0.1 to 10 ⁇ .
  • concentration of zinc ions in the detectable live cells or tissues may be about 0.1 ⁇ to 100 ⁇ ⁇ .
  • the compound (lie) captures zinc ions to form a complex, and the peak of the fluorescence spectrum is shifted by about 30 to 50 nm for a long wavelength.
  • this compound (lie) when used as a zinc probe, for example, excitation light with an excitation wavelength of 342 nm is used, and the fluorescence intensity of the compound (lie) and the zinc complex at the excitation wavelength is obtained to calculate the ratio. do it. From this fluorescence intensity ratio, the concentration of zinc ions present in cells and tissues can be determined.
  • Zinc ion measurement using the zinc fluorescent probe of the present invention can be carried out using a fluorescence microscope conventionally used for measuring the ratio of calcium ions. Since the method of the present invention is two-wavelength photometry, it is advantageous in that it can be used even in an apparatus that cannot be used because of the excitation power of single light.
  • the zinc fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with an appropriate additive.
  • an appropriate additive for example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, and pH adjusters.
  • the compound of the present invention is used as a ratiometric type fluorescent probe for zinc measurement. Very useful.
  • the compound of the present invention has almost no wavelength shift in the peak of the excitation spectrum even when a complex with zinc ion is formed, and when a complex with zinc ion is formed, the peak of the fluorescence spectrum shifts long wavelength. To do. Therefore, it is possible to detect the zinc ion concentration in the cell with high sensitivity by irradiating excitation light having a single wavelength. Also, since good excitation light source of a single wavelength, there Meritsu solved s being able device also simplifies the excitation system and the detection system.
  • the excitation light wavelength of the compound of the present invention is longer than that in the ultraviolet region (about 340 to 370 nm), the influence on cells is small.
  • the force is also characterized by good sensitivity and selectivity for zinc ions.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of complex formation between a compound (lie) and zinc ions.
  • FIG. 2 shows an absorption spectrum when compound (lie) and zinc are added.
  • FIG. 3 shows the fluorescence spectrum when compound (lie) and zinc are added.
  • FIG. 4 is a graph showing the metal ion selectivity of compound (lie).
  • Example 1 (4) Same as Example 1 (1) to (8), except that ethyl (4-chlorosulfurphenoxy) acetate is reacted instead of p-tonoleenesulfurol chloride. In this manner, compound (16d) was obtained.
  • Compound (29) is obtained by subjecting compound (28) to a Wittig reaction in the same manner as in Example 1 (5).
  • Compound (30) is obtained by reacting compound (29) in the same manner as in Example 1 (6).
  • Example 1 The fluorescence characteristics of the compound (lie) obtained in Example 1 were examined. Compound (lie) was measured for 1 OOmM HEPES buffer (P H7. 2, 5 ⁇ M EDTA containing) to be dissolved at a 10 mu Micromax absorption and fluorescence spectra.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the equilibrium state between the compound (lie) and zinc ion after the addition of zinc ion.
  • Fig. 2 shows the change in the absorption spectrum
  • Fig. 3 shows the change in the fluorescence spectrum. Note that the excitation wavelength in Fig. 3 uses 342 ⁇ m, which is the intersection of the two absorption spectra in Fig. 2.
  • the fluorescence intensity (I) was measured, and the fluorescence intensity ratio (I / 1) was calculated.
  • the fluorescence intensity (I) at a fluorescence wavelength of 485 nm is measured, and the fluorescence intensity ratio (I
  • Compound (lie) shows a high ratio and ratio change (fluorescence intensity ratio) when zinc ions are added, and a ratio change is observed when other ions present in the living body are added. None or fluorescence quenching was observed. This indicates that the compound (lie) exhibits high selectivity and selectivity for zinc ions.

Abstract

　本発明は、水溶性に優れ、かつ、単一の励起波長を用いてレシオメトリックに細胞内亜鉛イオンの濃度の変化を高感度に観測可能な亜鉛蛍光プローブ、その製造方法、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供する。亜鉛蛍光プローブとして、一般式（Ｉ）： ［化１］ （式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは－Ｏ－又は－Ｓ－で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｚは単結合又は式： ［化２］ で表される基を示し、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｙは－Ｏ－又は－Ｓ－で示される基を示す。） で表される化合物又はその塩を提供する。

Description

明 細 書
亜鉛蛍光プローブ
技術分野
[0001] 本発明は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で高感度に測定するた めの新規な亜鉛蛍光プローブに関する。
背景技術
[0002] 亜鉛は、ヒトの体内において、鉄に次いで存在量の多い必須微量金属元素である 。し力し、細胞内でフリーの亜鉛イオン（Zn2+)として存在するのは通常 nmol/1レベル 以下であり、細胞内のほとんどの Zn2+は主にタンパクと強固な結合を作っていると考え られる。その機能は重要であり、タンパクの構造の維持、酵素活性の制御などが挙げ られる。
[0003] また、転写因子等の DNA結合タンパクは zinc fingerや LIM motif等の Zn2+結合性の モチーフを有し、それを介して DNAに結合していると言われている。 Zn2+の欠乏は DN Aの転写などに影響を与え、発癌に関与している可能性も示唆されている。
[0004] 近年では、主に細胞死との関係に着目し、 label Zn2+の局在や動態を関連付ける研 究もさかんに行われている。例えば、外因性による Zn2+による脳細胞の選択的細胞死 や、細胞死と相関の深い酵素の活性制御、酸化ストレスによる酵素活性中心への影 響など種々の研究が行われ亜鉛の生体内での働きに関する知見が集積しつつある 。し力、しながら、その動態や局在について未解明の部分も多い。
[0005] 上記のような研究において汎用されているの力 S、組織内の亜鉛イオンを測定するた めに亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴なつて蛍光を発す る化合物、すなわち「亜鉛蛍光プローブ」である。
[0006] これまでにも亜鉛プローブは種々提案されており、例えば、特許文献 1には、ポリア ミン類を置換基とする化合物が提案されている。この化合物は、生体内の亜鉛を高感 度に測定できるものの、導入される細胞の厚さの相違等により検出される蛍光強度が 影響され、蛍光強度から Zn2+イオン濃度を精度よく定量的解析を行うことが困難であ るという問題があった。 [0007] このような問題点を解決するために、特許文献 2では、レシオメトリックな蛍光プロ一 ブが提案された。これは、プローブが亜鉛イオンに結合する際の励起波長のシフトを 利用する解析手法である。この手法だと、 2つの励起波長の比 (ratio)をとるため正確 な定量的解析を行うことができる。しかし、 2つ励起波長の光を使用するため、光源や 検出系（蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー等）に大掛かりで複雑な機器を使用せざる を得ず、汎用性に乏しいという問題があった。
[0008] この様な問題に鑑み、本発明者等は単一の励起波長を用いて、亜鉛イオンの濃度 による蛍光波長の変化を観測できる亜鉛プローブを開発した (非特許文献 1)。しかし 、この化合物は、水溶性及び亜鉛イオンに対する感度が十分でないという問題があ つた。さらに、励起波長が紫外領域であるため、細胞にとっては好ましくないという問 題があった。
特許文献 1：特開 2000-239272号公報
特許文献 2：国際公開第 02/102795号パンフレット
非特許文献 1 : J. Am. Chem. Soc. Communications, 2004, 126, p712- 713
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、水溶性に優れ、かつ、単一波長の励起光を用いてレシオメトリックに糸田 胞内亜鉛イオンの濃度の変化を高感度に観測可能な亜鉛蛍光プローブ、その製造 方法、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明は、上記の課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、後述する一般式 (I)で表 される化合物を亜鉛プローブとして用いた場合に、上記の課題を改善或いは解決で きることを見出した。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねた結果本発明を完成す るに至った。
[0011] 即ち、本発明は、以下の化合物、亜鉛蛍光プローブ、その製造方法、該亜鉛蛍光 プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法等を提供する。
[0012] 項 1. 一般式 (I) : [0013] [化 1]
Figure imgf000005_0001
[0014] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは— O—又は— S—で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基、 Zは単結合 又は式：
[0015] [化 2]
Figure imgf000005_0002
[0016] で表される基を示し、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 Yは _〇一又は一 S— で示される基を示す。 )
で表される化合物又はその塩。
[0017] 項 2. —般式（I)において、 Arがアルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、モ ノ又はジアルキルアミノ基、モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基、カルボキシル基 、アルコキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル 基、カルボキシアルコキシ基及びアルコキシカルボニルアルコキシ基からなる群より 選ばれる少なくとも 1個の基で置換されたァリール基である項 1に記載の化合物又は その塩。
[0018] 項 3. —般式（I)において、 Arがフエニル基、トルィル基、ナフチル基、カルボキシ アルコキシ基置換フエニル基及び 5—（ジメチルァミノ） 1 ナフチル基からなる群よ り選ばれる 1個の基である項 2に記載の化合物又はその塩。
[0019] 項 4. 一般式（I)において、 X及び Yがー〇一で示される基であり、 nが 2であり、 A がベンゼン環である項 1〜3のいずれかに記載の化合物又はその塩。
[0020] 項 5. —般式 (I)において、 R1及び R2が同一又は異なって、含窒素へテロアリー ル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基及びアルコキ シ基からなる群より選ばれる少なくとも 1個の基で置換されたアルキル基である項 1〜
4のレ、ずれかに記載の化合物又はその塩。
[0021] 項 6. —般式（II) :
[0022] [化 3]
Figure imgf000006_0001
[0023] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
[0024] 項 7. —般式（III) :
[0025] [化 4]
Figure imgf000007_0001
[0026] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基を示す。） で表される化合物又はその塩。
[0027] 項 8. —般式（II) :
[0028] [化 5]
Figure imgf000007_0002
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって _〇_ 又は _S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（16)： [0030]
Figure imgf000008_0001
[0031] (式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 Y、 n、 A、 R1及び R2は前記に同じ。 ) で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
[0032] 項 9. 一般式（16) :
[0033] [化 7]
Figure imgf000008_0002
[0034] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステル化合物。
[0035] 項 10. —般式（16) : [0036] [化 8]
Figure imgf000009_0001
[0037] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステルイ匕合物の製造方法であって、一般式（14)：
[0038] [化 9]
Figure imgf000009_0002
[0039] (式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 Y、 η及び Αは前記に同じ。 )
で表されるアルデヒド化合物と、一般式（15)：
HN (R1) (R2) (15)
(式中、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基を示す。） で表されるァミン化合物を反応させることを特徴とする製造方法。
項 11. 一般式（14) : [0041] [化 10]
Figure imgf000010_0001
[0042] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R3は アルキル基を示す。 )
で表されるアルデヒド化合物。
[0043] 項 12. —般式（6) :
[0044] [化 11]
Figure imgf000010_0002
[0045] (式中、 X及び Yは同一又は異なって O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、
Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 mは 1又は 2を示す）
で表される化合物。
[0046] 項 13· —般式（16) : [0047] [化 12]
Figure imgf000011_0001
[0048] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステルイ匕合物の製造方法であって、一般式（23)：
[0049] [化 13]
Figure imgf000011_0002
(式中、 Ar、 X、 Y、 η、 Α、
Figure imgf000011_0003
R2及び R3は前記に同じ。 )
で表される化合物と、トリアルキルホスファイトを反応させることを特徴とする製造方法
[0051] 項 14. 一般式（23) [0052] [化 14]
Figure imgf000012_0001
[0053] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表される化合物。
[0054] 項 15· —般式（19) :
[0055] [化 15]
Figure imgf000012_0002
[0056] (式中、 X及び Yは同一又は異なって _〇_又は _ S _で示される基、 nは 2又は 3、
Aは置換基を有してもょレ、ベンゼン環を示す）
で表される化合物。
[0057] 項 16. —般式（III) : [0058] [化 16]
Figure imgf000013_0001
[0059] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基を示す。） で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（34)：
[0060] [化 17]
Figure imgf000013_0002
[0061] (式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 n、 R1及び R2は前記に同じ。 )
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
[0062] 項 17. 上記請求項：!〜 7のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光 プローブ。
[0063] 項 18. 上記請求項：!〜 7のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛ィォ ン測定用試薬。
[0064] 項 19. 上記請求項：!〜 7のいずれかに記載の化合物及び亜鉛イオンを含む亜鉛 錯体。 [0065] 項 20. 亜鉛イオンの測定方法であって、
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて 亜鉛錯体を生成する工程、及び
(b)上記 (a)で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
[0066] 項 21. 前記工程 (b)において、単一の励起波長の光を照射し、請求項 1〜7のい ずれかに記載の化合物又はその塩と上記（a)で生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍 光強度を測定する請求項 20に記載の測定方法。
[0067] 項 22. 前記励起波長が 340〜400nmである請求項 20に記載の測定方法。
[0068] 項 23. 前記工程 (b)において、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はそ の塩の蛍光スペクトルのピーク波長と、上記（a)で生成した亜鉛錯体の蛍光スぺタト ルのピーク波長との差が 20nm以上である請求項 20、 21又は 22に記載の測定方法
[0069] 項 24. 細胞内の亜鉛イオンの測定方法であって、
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を細胞内に取り込む工程、 及び
(b)上記（a)で細胞内に取り込んだ化合物又はその塩と細胞内の亜鉛イオンとから 生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
以下、本発明を詳述する。
I.亜 t プローブ
亜鉛蛍光プローブとは亜鉛と錯体形成することにより蛍光応答を示す化合物であり 、生体内のフリーの亜鉛イオンをイメージングするのに利用される。
[0070] 本発明の亜鉛蛍光プローブは、一般式 (I)： [0071] [化 18]
Figure imgf000015_0001
[0072] (式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基、 Zは単結合 又は式：
[0073] [化 19]
Figure imgf000015_0002
[0074] で表される基を示し、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 Yは—〇—又は— S— で示される基を示す。 )
で表される化合物又はその塩を含有する。
[0075] Arで示される置換基を有してもよいァリール基のァリール基としては、例えば、フエ ニル基、（o—、 m—又は p ）トルィル基、ナフチル基等の単環又は 2環の C のァ
6- 10 リール基が挙げられる。このうち、フエニル基又は p?トルィル基が好適である。
[0076] 該ァリール基上の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、ァ ミノ基、モノ又はジァルキノレアミノ基、モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基、カルボ キシル基、アルコキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボ二ノレ アルキル基、カルボキシアルコキシ基、アルコキシカルボニルアルコキシ基等が例示 され、これらのうちから選ばれる 1〜3個（好ましくは 1個）の基がァリール基上に置換 されていてもよい。
[0077] 上記のアルキル基としては、例えば、ェチル基、プロピル基、ブチル基等の C の
1 -6 アルキル基が挙げられる。
[0078] アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の C のァ
1 -6 ルコキシ基が挙げられる。
[0079] モノ又はジァノレキノレアミノ基としては、例えば、メチノレアミノ基、ェチノレアミノ基、プロ ピノレアミノ基、ジメチルァミノ基、ジェチノレアミノ基、ジプロピルアミノ基等のモノ又はジ C アルキルアミノ基が挙げられる。
1 -6
[0080] モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、 2—ヒドロキシェチルアミ ノ基、ヒドロキシプロピルアミノ基、ジ（2—ヒドロキシェチル）アミノ基、ジ（ヒドロキシプ 口ピル）アミノ基等のモノ又はジ（ヒドロキシ C アルキル）ァミノ基が挙げられる。
1 -6
[0081] アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボ二 ル基等の C アルコキシカルボニル基が挙げられる。
1 -6
[0082] カルボキシアルキル基としては、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシェチル基 等のカルボキシ C アルキル基が挙げられる。
1 -6
[0083] アルコキシカルボニルアルキル基としては、例えば、エトキシカルボニルメチル基、 メトキシカルボニルメチル基等の C アルコキシカルボニル C アルキル基が挙げ
1 -6 1 -6
られる。
[0084] カルボキシアルコキシ基としては、例えば、カルボキシメトキシ基、カルボキシェトキ シ基等のカルボキシ C アルキル基が挙げられる。
1 -6
[0085] アルコキシカルボニルアルコキシ基としては、例えば、メトキシカルボニルメトキシ基 、エトキシカルボニルメトキシ基等の c アルコキシカルボニル C アルコキシ基が
1 -6 1 -6
挙げられる。
[0086] このうち、 Arとして、フエニル基、トルィル基、ナフチル基、カルボキシメトキシ基置 換フエニル基、 5 - (ジメチルァミノ）— 1 _ナフチル基 (ダンシル基)等が好適である。
[0087] Xは一 O—で示される基が好ましぐ nは 2が好ましい。
[0088] Zが式： [0089] [化 20]
Figure imgf000017_0001
[0090] (式中、 A及び Yは前記に同じ。）
で表される基の場合、 Αが置換基を有する場合、その置換基としては、例えば、アル キル基、アルコキシ基、ハロゲン原子等が挙げられる。 Aとして好ましくはベンゼン環 である。また、 Yが一 O—で示される基が好ましい。
[0091] R1又は R2で示される置換基を有してもよいアルキル基のアルキル基としては、例え ば、メチル基、ェチル基、プロピル基等の C のアルキル基が好適である。
1 - 3
[0092] 該アルキル基上の置換基としては、例えば、含窒素へテロアリール基、カルボキシ ル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、 C ァ
1 -3 ルコキシ基）等が例示される。含窒素へテロアリール基としては、例えば、ピリジル基（ 特に、 2 _ピリジル基）、ピラジュル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含窒素六 員環へテロァリール基が挙げられる。モノ又はジァノレキノレアミノ基としては、例えば、 メチルァミノ基、ジメチルァミノ基等のモノ又はジ C アルキルアミノ基が挙げられる。
1 -6
これらの 1又は 2個（好ましくは 1個）がアルキル基上に置換されていてもよい。
[0093] R1又は R2で示される置換基を有してもよいアルキル基として好ましくは、 2_ピリジ ノレメチノレ基、 2 _ピリジルェチル基、ヒドロキシメチル基、 2—ヒドロキシェチル基、カル ボキシメチル基、 2—カルボキシェチル基、ジメチルァミノ基などが挙げられる。
[0094] R1又は R2で示される置換基を有してもよいァリール基のァリール基としては、フエ二 ル基、ナフチル基等の単環又は 2環の C のァリール基が挙げられる。
6- 10
[0095] 該ァリール基上の置換基としては、例えば、含窒素へテロアリール基、カルボキシ ル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、 C ァ
1 -3 ルコキシ基）等が例示される。含窒素へテロアリール基としては、例えば、ピリジル基（ 特に、 2—ピリジル基）、ビラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含窒素六 員環へテロァリール基が挙げられる。モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、 メチルァミノ基、ジメチルァミノ基等のモノ又はジ C アルキルアミノ基が挙げられる。
1 -6
これらの 1又は 2個（好ましくは 1個）がァリール基上に置換されていてもよい。
[0096] R1又は R2で示される置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基のへテロアリール基と しては、例えば、 N、〇及び Sからなる群より選ばれる少なくとも 1種のへテロ原子を含 む C のへテロァリール基が挙げられる。具体的なヘテロァリール基としては、例え
6- 10
ば、ピリジノレ基、ピラジュル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾ リル基、ォキサゾリル基、イソキサゾリル基、チェニル基、フリル基等が挙げられる。
[0097] 該ヘテロァリール基上の置換基としては、例えば、含窒素へテロアリール基、カル ボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、 C アルコキシ基）等が例示される。含窒素へテロアリール基としては、例えば、ピリ
1 - 3
ジノレ基（特に、 2 _ピリジル基）、ピラジュル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含 窒素六員環へテロァリール基が挙げられる。モノ又はジアルキルアミノ基としては、例 えば、メチルァミノ基、ジメチルァミノ基等のモノ又はジ C アルキルアミノ基が挙げら
1 -6
れる。これらの 1又は 2個（好ましくは 1個）がへテロァリール基上に置換されていても よい。
[0098] 一般式 (I)で表される化合物の塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の アルカリ金属塩が例示される。
[0099] 一般式 (I)で表される化合物又はその塩のうち、典型的には、一般式 (II)：
[0100] [化 21]
Figure imgf000018_0001
[0101] (式中、 Ar、 X、 Y、 n、 A、 R1及び R2は前記に同じ。 ) で表される化合物又はその塩、或いは、一般式 (III)：
[0102] [化 22]
Figure imgf000019_0001
[0103] (式中、 Ar、 X、 Y、 n、 R1及び R2は前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[0104] 一般式 (II)で表される化合物又はその塩のうち、亜鉛蛍光プローブとして好適な具 体例として、一般式 (Ila) :
[0105] [化 23]
Figure imgf000019_0002
[0106] (式中、 Ar、 X、 Y、 n、 R1及び R2は前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[0107] さらに好適な具体例として、一般式 (lib)：
[0108] [化 24]
Figure imgf000020_0001
[0109] (式中、 Ar、 X、 Y及び nは前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩、或いは、一般式 (lie)：
[0110] [化 25]
Figure imgf000020_0002
[0111] (式中、 Ar、 X、 Y及び nは前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[0112] 一般式 (III)で表される化合物又はその塩のうち、亜鉛蛍光プローブとして好適な 具体例として、一般式 (Ilia) :
[0113] [化 26]
Figure imgf000021_0001
[0114] (式中、 Ar、 X、 n、 R1及び R2は前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[0115] さらに好適な具体例として、一般式 (Illb)：
[0116] [化 27]
Figure imgf000021_0002
[0117] (式中、 Ar、 X及び nは前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩、或いは、一般式 (IIIc)
[0118] [化 28]
Figure imgf000022_0001
[0119] (式中、 Ar、 X、 Y及び nは前記に同じ。 )
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[0120] 一般式 (I)で表される化合物は、亜鉛イオン測定のための蛍光プローブとして好適 に用いられる。該化合物は、次のような特徴を有している。
(1)レシオメトリックタイプの蛍光プローブであるため、細胞数、励起光、基質濃度等 に起因する測定値の変動が小さぐ亜鉛イオンの濃度をより正確に定量解析できる。 なお、レシオメトリックとは、異なる 2波長における強度の比の変化を観測する手法を 意味する。ここでは、フリーの亜鉛蛍光プローブとその亜鉛錯体についてそれぞれの 蛍光波長のピーク強度比の変化を観測する。
(2)単一の励起光波長を使用し、蛍光波長（可視光領域)の変化が観察されるため、 励起系、検出系とも装置が簡素化できる。さらに、励起光波長が単一であるので共焦 点レーザー顕微鏡の利用も容易である。
(3)励起光波長が紫外領域より長波長（340〜370nm付近）であるため、細胞への影 響を極力低減化できる。
(4)亜鉛イオンに対する感度および選択性が良好である。つまり、 ηΜ〜 μ Μオーダ 一の亜鉛イオンを捕捉可能である。
(5)水溶性に優れており、細胞や組織を含む適切な水性媒体中でも十分な溶解性 を有している。
II.亜^)蛍光プローブの製造
本発明の亜鉛蛍光プローブに含まれる一般式 (I)で表される化合物又はその塩（ 一般式 (II)及び (III)で表される化合物又はその塩）の製法にっレ、て説明する。
[0121] 製法 A
一般式 (II)で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することができる。
[0122] [化 29]
Figure imgf000024_0001
(式中、 R3はアルキル基、 mは 1又は 2を示し、 Ar、 X、 Y、 n、 A、 R1及び R2は前記に 同じ。）
上記 R3で示されるアルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基等 の c アルキル基が挙げられる。特に、メチル基、ェチル基が好適である。
1 -3
[0124] 一般式（1)で表される化合物を、 J. Am. Chem. Soc. Communications, 2002, 124(5) ， p776-778の記載に準じて、塩基 (例えば、炭酸カリウム等）の存在下一般式（2)で 表されるジブロモ化合物を反応させて、一般式（3)で表される化合物を得る。
[0125] 一般式（3)で表される化合物を、酸触媒（例えば、パラトルエンスルホン酸 (pTs〇H )、ピリジニゥムパラトルエンスルホネート（PPTS)等）の存在下、一般式（3)で表され るジオールを反応させてァセタール (4)とし、これに塩基 (例えば、水素化ナトリウム、 水酸化ナトリウム、炭酸カリウム等）の存在下一般式 (5)で表されるアルデヒドィ匕合物 を反応させて、一般式 (6)で表される化合物を得る。
[0126] 一般式（6)で表される化合物を、 NaBH等の還元剤によりホルミル基を還元して水
4
酸基とし、これを無水酢酸 (Ac〇）と反応させてァセチル基で保護して、一般式（7)
2
で表される化合物を得る。
[0127] 一般式（7)で表される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒 (Pt〇、 Pd—炭素等
2
)の存在下、ニトロ基をァミノ基に還元して、一般式（8)で表される化合物を得る。
[0128] 一般式 (8)で表される化合物を、塩基 (例えば、ピリジン等）の存在下、一般式（9) で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、スルホン酸アミドとし、これをパラトルェ ンスルホン酸等の酸で処理することにより、ァセタールの保護基を除去して一般式（1
0)で表されるホルミル化合物を得る。
[0129] 一般式（10)で表されるホルミル化合物を、一般式（11)で表される Wittig試薬と反 応させて一般式（12)で表されるォレフィンィ匕合物を得る。これを、 P (OEt) を用いて
3 還元的に閉環させて一般式（13)で表されるインドール化合物を得る。
[0130] 一般式（13)で表されるインドール化合物のァセチル基を Et〇Naで除去し、 MnO
2 等の酸化剤で酸化して、一般式（14)で表されるアルデヒド化合物を得る。これに、還 元剤（例えば、トリァセトキシ水素化ほう素ナトリウム等）の存在下、一般式（15)で表さ れる 2級ァミンを反応（還元的ァミノ化反応）させて、一般式（16)で表される化合物を 得る。
[0131] 一般式（16)で表される化合物のカルボン酸エステルを、 Li〇H等のアルカリ金属 水酸化物を用いて加水分解することにより、一般式 (II)で表される本発明の化合物 を得る。なお、 Ar、 R及び/又は ITにカルボン酸エステルを含む場合には、該カル ボン酸エステルは、通常、本加水分解工程においてカルボン酸に加水分解される。
[0132] 製法 B
或いは、一般式 (II)で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することもで きる。
[0133] [化 30]
Figure imgf000026_0001
[0134] (式中、 Ar、 X、 Y、 η、 Α、
Figure imgf000026_0002
R2及び R3は前記に同じ。 )
一般式（17)で表される化合物を、 Journal of Medicinal Chemical Society, 2003, 46
， pp. 691-701の記載に従い合成する。一般式（17)で表される化合物を、塩基 (例え ば、炭酸カリウム等）の存在下一般式（18)で表される化合物と反応させて、一般式（
19)で表されるホルミル化合物を得る。
[0135] 一般式（19)で表されるホルミル化合物に、還元剤（例えば、トリァセトキシ水素ィ匕ほ う素ナトリウム等）の存在下、一般式（15)で表される 2級ァミンを反応（還元的ァミノ化 反応）させて、一般式（20)で表される化合物を得る。 [0136] 一般式（20)で表される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒 (Pt〇、 Pd—炭素
2 等）の存在下、ニトロ基をァミノ基に還元して、これに塩基（例えば、ピリジン等）の存 在下、一般式（9)で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、一般式（21)で表さ れるスルホン酸アミドとする。
[0137] 一般式（21)で表されるスルホン酸アミドを、 MnO等の酸化剤で酸化して、一般式
2
(22)で表される化合物を得る。これに、一般式（11)で表される Wittig試薬を反応さ せて一般式（23)で表されるォレフィン化合物を得る。これを、 P (OEt) 等のトリアル
3
キルホスファイトを用いて還元的に閉環させて一般式（16)で表されるインドール化合 物を得る。
[0138] 一般式（16)で表されるインドール化合物のエステルを、製法 Aと同様にして加水分 解して、一般式 (II)で表される本発明の化合物を得る。
[0139] 製法。
一般式 (III)で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することができる。
[0140] [化 31]
Figure imgf000028_0001
[0141] (式中、 W1及び W2は脱離基を示し、 Ar、 X、 n、
Figure imgf000028_0002
R2及び R3は前記に同じ。
[0142] 一般式（17)で表される化合物を、塩基 (例えば、炭酸カリウム等）の存在下、一般 式（24)で表される化合物と反応させて、一般式（25)で示される化合物を得る。
[0143] —般式（25)で示される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒 (Pt〇、 Pd—炭素
2
等）の存在下、ニトロ基をァミノ基に還元して、一般式（26)で表される化合物を得る。
[0144] 一般式（26)で表される化合物を、塩基 (例えば、ピリジン等）の存在下、一般式（9) で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、一般式（27)で表されるスルホン酸アミ ドを得る。
[0145] 一般式（27)で表されるスルホン酸アミドを Mn〇等の酸化剤で酸化して、一般式 ( 28)で表されるアルデヒド化合物を得る。この化合物を、一般式（11)で表される Witti g試薬と反応させて一般式（29)で表されるォレフィン化合物とし、これを、 P (OEt) を
3 用いて還元的に閉環させて一般式（30)で表されるインドールイ匕合物を得る。
[0146] 一般式（30)で表されるインドール化合物を、酸 (例えば、塩酸、トリフルォロ酢酸等 )で処理して Boc基を除去して、一般式（31)で表される化合物を得る。
[0147] 一般式（31)で表される化合物に、塩基 (例えば、炭酸カリウム等）等の活性化剤の 存在下、一般式（32)及び（33)で表される化合物を反応させて、一般式 (34)で表さ れる化合物を得る。なお、一般式（32)で表される化合物の W1と、一般式（33)で表さ れる化合物の W2は同一でも異なっていても良い。上記 W1及び W2で示される脱離基 としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、 TfO_、 Ms 0_、 TsO_、が例示される。
[0148] さらに、一般式（32)及び（33)で表される化合物に代えて、所定のアルデヒド化合 物を用いて、還元剤（例えば、トリァセトキシ水素化ほう素ナトリウム等）の存在下、一 般式（31)で表される化合物と還元的ァミノ化反応に付することにより、一般式（34) で表される化合物を製造することもできる。
[0149] 一般式（34)で表されるインドール化合物のエステルを、製法 Aと同様にして加水分 解して、一般式 (III)で表される本発明の化合物を得る。
[0150] なお、一般式 (II)及び (III)で表される化合物は、必要に応じ塩に変換することもで きる。許容される塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアル力 リ金属塩が挙げられる。また、場合によっては、水、アルコール等の溶媒和物として得 ることちでさる。
HI.亜 带光プローブを用いた亜鉛イオンの洵 I定方法
上記一般式 (I)で表される本発明の化合物又はその塩 (一般式 (II)及び (III)で表 される化合物又はその塩）は、亜鉛蛍光プローブ、亜鉛イオン測定用試薬として有用 である。
[0151] 化合物（I)又はその塩は、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成しても、吸収スぺ タトルのピーク波長のシフトが少なレ、。そのため、照射する励起光の波長が単一でよ レ、ことになり、励起装置及び検出装置の簡素化を図ることができる。吸収光波長のピ ークは、化合物（I)又はその塩の化学構造により変化するが、通常 340〜400nm程度 、好ましくは 340〜370nm程度であり、励起光の波長もこの範囲から適宜選択すること ができる。
[0152] また、化合物（I)又はその塩は、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、その 蛍光スペクトルのピークが顕著な波長シフトを生じる。この蛍光スペクトルピークの波 長シフトは、通常は約 20nm以上、さらに 25〜50nm程度、特に 25〜45nm程度となる。
[0153] つまり、本発明の化合物を亜鉛蛍光プローブとして用い、適当な単一波長の励起 光を照射し、その時の化合物 (I)とその亜鉛錯体との蛍光強度比を測定することによ り、試料中の亜鉛イオンをレシオ法によつて測定することが可能になる。
[0154] なお、レシオ法については、 Mason W. T.の著書（Mason W. T. in Fluoresce nt and Luminescent Probes for Biological Activity, Second aition, ait ed by Mason W. T. ， Academic Press)などに詳細に記載されており、これに準 じて測定できる。
[0155] また、本発明の化合物（I)又はその塩は、亜鉛イオンを特異的に捕捉することがで き、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。例えば、化合物（I)又は その塩は、試料中に、亜鉛イオン以外に他の金属イオン (例えば、ナトリウムイオン、 カルシウムイオン、カリウムイオン又はマグネシウムイオンなど）が共存していても、そ の影響をほとんど受けずに亜鉛イオンに対して特異的に錯体を形成する。
[0156] 以上の特徴から、本発明の化合物（I)又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛ィ オンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブとして極めて有用である。な お、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含 めて最も広義に解釈される。
[0157] 本発明の亜鉛蛍光プローブを用いた試料中の亜鉛イオンの測定方法について、そ の具体例を以下に示す。本発明の亜鉛イオンの測定方法は、（a)上記一般式 (I)で 表される化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて亜鉛錯体を生成する工程、及 び、（b)上記 (a)で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程、を含むことを特徴 とする。
[0158] 具体的には、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、ェ チレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水親和性有機 溶媒と水との混合媒体などに、化合物（I)又はその塩を溶解する。この溶液を、細胞 や組織を含む適切な緩衝液中に添加して、単一波長の励起光を照射して、化合物（
I)とその亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度比を測定すればよい。なお、細胞膜の透過 性を考慮して脂溶性を高めるため、化合物（I)の親水性基、例えば、カルボキシル基 を所定のエステル基に変換しても良レ、。該エステルは、細胞内に入った後エステラー ゼで加水分解され得るものであれば特に限定はない。
[0159] 本発明の化合物 (I)を亜鉛蛍光プローブとして用いて亜鉛濃度を測定する場合、 化合物（I)の濃度は、例えば、 0.05〜100 μ Μ程度、好適には 0.1〜10 μ Μ程度であ ればよレ、。また、亜鉛イオンの濃度は、例えば、 0.05ηΜ〜200 μ Μ程度、好適には 0. 1ηΜ〜100 μ Μ程度まで測定可能である。
[0160] 具体例として、上記化合物（lie)は、吸収波長は 342nm、蛍光波長は 427nmであ り、 0.1〜10 μ Μ程度の濃度で亜鉛蛍光プローブとして用いることができる。検出可能 な生細胞又は生組織中の亜鉛イオンの濃度は、 0.1ηΜ〜100 μ Μ程度であればよい 。化合物（lie)は、亜鉛イオンを捕捉し錯体を形成して、蛍光スペクトルのピークが 30 〜50nm程度長波長シフトする。従って、この化合物（lie)を亜鉛プローブとして用い る場合には、例えば、励起波長 342nmの励起光を用い、該励起波長における化合 物（lie)及びその亜鉛錯体の蛍光強度を求めて比を算出すればよい。この蛍光強度 比から、細胞や組織中に存在する亜鉛イオンの濃度を求めることができる。
[0161] 本発明の亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定は、従来カルシウムイオン のレシオ測定に用いられてレ、る蛍光顕微鏡を用いて実施することができる。本発明 の方法は二波長測光であるため、単一光の励起光し力、使用できない装置においても 使用できる点で有利である。
[0162] なお、本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態 で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、 pH調節剤などの添加物と組み合わ せること力 Sできる。
発明の効果
[0163] 本発明の化合物は、亜鉛測定のためのレシオメトリックタイプの蛍光プローブとして 極めて有用である。
[0164] 特に、本発明の化合物は、亜鉛イオンとの錯体を形成しても励起スペクトルのピー クにほとんど波長シフトが生じず、亜鉛イオンとの錯体を形成すると蛍光スペクトルの ピークが長波長シフトする。そのため、単一の波長を有する励起光を照射して、レシ オメトリックに細胞内の亜鉛イオン濃度を高感度で検出することができる。また、単一 の波長の励起光源でよいため、励起系及び検出系の装置も簡略化できるというメリツ トカ sある。
また本発明の化合物は、励起光波長が紫外領域よりも長波長（340〜370nm程度） であるために、細胞への影響は小さい。し力も、亜鉛イオンに対する感度及び選択性 が良好であるという特徴を有している。
図面の簡単な説明
[0165] [図 1]化合物 (lie)と亜鉛イオンとの錯形成模式図を示す。
[図 2]化合物 (lie)および亜鉛添カ卩したときの吸収スペクトルを示す。
[図 3]化合物 (lie)および亜鉛添カ卩したときの蛍光スペクトルを示す。
[図 4]化合物 (lie)の金属イオン選択性を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0166] 本発明を、実施例を用いて更に詳述するが、これに限定されるものではない。
Figure imgf000032_0001
(1) 3-(2-(2-ホルミルフエノキシ )-1-エトキシ) -4-ニトロべンズアルデヒド ジォキソラン (6)
Journal of the American Chemical Society, 2002, 124, pp. 776-778に記載の方法 に従って、 3-(2-ブロモエトキシ) -4-ニトロべンズアルデヒド ジォキソランを合成した。 該化合物 4.8 g (15.1 mmol)とサリチルアルデヒド 1.9 g (15.1 mmol)を 50 mlのジメチノレ ホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム 2.76 g (20.0 mmol)を加え 100 °Cで 3時 間撹拌した。反応液を氷水 300 mlに撹拌しながら加え、析出した固体を濾取し、標記 化合物 (6) 4.3 gを得た（収率 80%)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz):
3 δ 4.03—4.15 (4Η, m)， 4.50—4.59 (4H, m)， 5.84 (1H， s)
， 7.04-7.10 (2H, m)， 7.19 (1H， dd, J = 8.4, 1.4 Hz), 7.32 (1H, d， J = 1.4 Hz), 7.53 ( 1H， m), 7.82-7.85 (2H， m).
(2) 3-(2-(2-ァセトキシメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4-ニトロべンズアルデヒド ジォ キソラン (7)
化合物 (6) 3.6 g (10.0 mmol)を 100 mlのメタノールに懸濁させた溶液に、テトラヒドロ ホウ酸ナトリウム NaBH 0.38 g (10.0 mmol)を 0 °Cで少しずつ加え、室温でー晚撹拌し た。メタノールを減圧下留去後、残留物を水で洗浄し、エタノール Z水にて再結晶し てアルコール体 3.6 gを得た（収率定量的）。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 4.03—4.14 (4Η, m)， 4.41-4.46 (2H, m), 4.51—4.55 (2
H， m), 4.64 (2H， s)， 5.84 (1H， s), 6.93 (1H, d， J = 8.1 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.17 (1H， dd， J = 8.1, 1.4 Hz), 7.25-7.31 (3H, m), 7.84 (1H, d, J = 8.1 Hz).
上記化合物 2.9 g (8.0 mmol)を 30 mlのピリジンに溶かした溶液に、無水酢酸 1.02 g (10.0 mmol)を 0 °Cで加え、室温でー晚撹拌した。反応液にエタノール 10 mlを加え、 ビジリン/エタノールを減圧下留去した。残留物を酢酸ェチル 50 mlに溶かし、飽和 食塩水で 3回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下で留去し、 標記化合物 (7) 2.90 gを得た（収率 90%)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 2.06 (3H， s), 4.05-4.11 (4Η, m), 4.39-4.43 (2H, m)
， 4.48-4.55 (2H， m)， 5.15 (2H， s), 5.85 (1H, s), 6.94-7.01 (2H， m), 7.17 (1H， dd， J = 8.4, 1.4 Hz), 7.28-7.34 (3H, m)， 7.83 (1H， d, J = 8.1 Hz).
(3) 3-(2-(2-ァセトキシメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4-ァミノべンズアルデヒド ジォ キソラン (8)
化合物 (7) 2.0 g (5.0 mmol)を 40 mlのテトラヒドロフランに溶力した溶液に、二酸化白 金 114 mg (0.5 mmol)を加え、 2気圧の水素ガス下室温でー晚撹拌した。二酸化白金 をセライトで濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、標記化合物 (8) 1.9 gを得た。 （収率定 量的)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 2.05 (3H， s), 3.99-4.02 (2Η, m), 4.11-4.14 (2H, m)
， 4.38 (4H, s), 5.18 (2H, s), 5.70 (1H, s)， 6.69 (1H， d, J = 8.0 Hz), 6.93 (1H， dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 6.95 (1H， d, J = 8.0 Hz), 6.97—7.00 (2H, m)， 7.31 (1H， td， J = 7.5, 1. 5 Hz), 7.34 (1H， dd, J = 7.5, 1.5 Hz). (4) 3-(2-(2-ァセトキシメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4-(p-トルエンスルホニルァミノ） ベンズアルデヒド（10)
化合物 (8) 1.9 g (5.0 mmol)を 20 mlのピリジンに溶かした溶液に、 p-トルエンスルホ 二ノレクロリド 1.14 g (6.0 mmol)を 0 °Cで加え、室温でー晚撹拌した。反応液を氷水 300 mlに撹拌しながら加え、室温で 30分間撹拌を続けた。析出した固体を濾取し、スル ホンアミド体 2.4 gを得た (収率定量的）。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 2.07 (3H， s), 2.31 (3Η, s)， 3.97-4.14 (4H, m)， 4.22
(4H, s), 5.17 (2H, s)， 5.69 (1H， s)， 6.90 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H， d, J = 1.6 Hz )， 7.00-7.05 (2H, m), 7.12 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (1H， s), 7.32-7.38 (2H, m), 7.5 4 (1H, d， J = 7.8 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.1 Hz).
上記化合物 2.4 g (5.0 mmol)を 70 mlのアセトンに溶かした溶液に、トルエンスルホン 酸一水和物 87 mg (0.5 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。反応液に飽和食塩水 10 mlを加え、アセトンを減圧下で留去後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を 飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し 、シリカゲルカラムにより精製して化合物 (10) 2.3 gを得た (収率 97 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 2.06 (3H， s), 2.34 (3Η, s)， 4.31-4.40 (4H, m)， 5.15
(2H， s), 6.92 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.04 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.17 (2H， d, J = 8.1 Hz), 7.31-7.42 (4H， m), 7.64—7.71 (4H， m).
(5) 3-ニトロ-4-[2-[3-(2-(2-ァセトキシメチルフェノキシ)-1-ェトキシ)-4-( -トルェン スルホニルァミノ) -フヱニル] -トランス-ビュル]安息香酸 ェチルエステル（12) 化合物 (10) 0.43 g (1.0 mmol)を 6 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、 (4- エトキシカルボニル -2-ニトロベンジル）トリフエニルフォスフォニゥムブロミド (11) 0.83 g (1.5 mmol),炭酸カリウム 0.69 g (5.0 mmol)を加え、 90 °Cでー晚撹拌した。反応液 を水 100 mlに加え、酢酸ェチルで抽出した。酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄後、 硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精 製して化合物 (12) 0.49 gを得た（収率 73 %)。
'H-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.42 (3H， t， J = 7.0 Hz), 2.05 (3H, s)， 2.32 (3H， s),
4.27 (4H, s)， 4.43 (2H, q, J = 7.0 Hz), 5.17 (2H, s)， 6.92 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.02 ( 1H， d, J = 1.5 Hz), 7.04 (1H， d, J = 8.0 Hz), 7.08-7.11 (2H， m), 7.15 (2H, d, J = 8. 5 Hz), 7.34-7.38 (3H, m)， 7.46 (1H， d, J = 14.0 Hz), 7.56 (1H， d, J = 8.5 Hz), 7.64 (2H， d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H， d, J = 8.0 Hz), 8.21 (1H， dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 8.57 (1 H, d, J = 1.5 Hz).
(6) 2-[3_(2_(2-ァセトキシメチルフヱノキシ エトキシ )_4_(p-トルエンスルホニルァ ミノ) -フヱニル] -1H-インドール _6_カルボン酸 ェチルエステル（13)
化合物 (12) 0.32 g (0.48 mmol)を 3 mlの亜リン酸トリェチルに溶かし、 125 °Cで 4時 間撹拌した。亜リン酸トリェチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化 合物 (13) 0.23 gを得た（収率 74 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.42 (3H， t， J = 7.3 Hz), 2.03 (3H, s)， 2.30 (3H， s),
4.22-4.28 (4H, m), 4.40 (2H, q, J = 7.3 Hz), 5.17 (2H, s)， 6.76 (1H， d, J = 1.4 Hz), 6.90 (1H, d， J = 8.6 Hz), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.14 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.22 (1 H, dd, J = 1.8 Hz), 7.30 (1H， dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.32—7.38 (2H, m), 7.59 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.61 (1H， d, J = 8.4 Hz), 7.65 (2H， d, J = 8.4 Hz), 7.80 (1H， dd, J = 8.4 ， 1.1 Hz), 8.15 (1H, s)， 9.19 (1H， brs).
(7) 2-[3-(2-(2-ホルミルフエノキシ )-1-エトキシ) -4-(p-トルエンスルホニルァミノ) -フ ェニル] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチルエステル (14)
化合物 (13) 0.18 g (0.29 mmol)を 20 mlのエタノールに溶かした溶液に、ナトリウム エトキシド 0.39 g (5.7 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。反応液に酢酸 0.34 g (5.7 mmol)を加え、エタノールを減圧下留去した。残留物に飽和食塩水 25 mlを加え、酢 酸ェチルで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下留去し、 シリカゲルカラムにより精製してアルコール体 0.12 gを得た（収率 69 %)。
'H-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.41 (3H， t， J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s)， 4.21 (2H, t, J
= 3.5 Hz), 4.30 (2H, t, J = 3.5 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.67 (2H, s), 6.74 (1H ， d, J = 1.0 Hz), 6.89 (1H， d， J = 8.0 Hz), 7.01 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.25 (1H, s), 7.29-7.34 (3H， m), 7.47 (1H, s)， 7.58 (1H， d, J = 8.3 Hz), 7.5 9 (1H, d， J = 8.3 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.74 (1H， dd, J = 8.3， 1.0 Hz), 8.13 (1H， s), 9.63 (1H, s). 上記化合物 0.12 g (0.2 mmol)を 15 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化マ ンガン 0.17 g (2.0 mmol)をカ卩え、室温でー晚撹拌した。不溶物をセライトで濾去後、 濾液を減圧下留去し、化合物 (14)を得た。
'H-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.34 (3H， t， J = 7.0 Hz), 2.28 (3H, s)， 4.31 (2H, q,
3
J = 7.0 Hz), 4.37-4.43 (4H, m)， 6.99 (1H， s), 7.13 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.21 (1H， d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.39—7.44 (2H, m)， 7.53 (1H， s)， 7.58-7.63 (4 H， m), 7.72-7.73 (2H, m)， 8.03 (1H， s)， 9.55 (1H， brs), 10.31 (1H， s)， 11.83 (1H, s).
(8) 2-[3_(2_(2-ビス (2-ピリジルメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ )_4_(p -トル エンスルホニルァミノ) -フエ二ノレ] -1H -インドール _6_カルボン酸 ェチルエステル (16b )
化合物 (14) 53 mg (0.09 mmol)を 10 mlの 1，2_ジクロロェタンに懸濁させた溶液に、 ジ - (2-ピコリル）ァミン 36 mg (0.18 mmol)を加えた後、ナトリウムトリァセトキシボロヒド リド 38 mg (0.18 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。反応液に水 20 mlを加え、クロ口 ホルムで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロ口ホルムを減圧下留去し、シ リカゲルカラムにより精製して化合物 (16b) 52 mgを得た（収率 75 %)。
'H-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.37 (3H， t, J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s)， 3.60 (2H， s),
3
3.75 (4H, s)， 3.97-3.99 (2H， m)， 4.11—4.14 (2H， m)， 4.36 (2H， q, J = 7.0 Hz), 4.37-
4.43 (4H, m), 6.71 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.76 (1H, dd, J = 2.0， 1.0 Hz), 6.95 (1H， td， J = 7.5， 1.0 Hz), 7.04-7.07 (4H, m), 7.19 (1H， td， J = 7.5， 1.5 Hz), 7.25 (1H， d, J = 2.0 Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.5， 2.0 Hz), 7.41 (1H， dd, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.47 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.52 (1H， td, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.55 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.59 (1H， d, J
= 8.5 Hz), 7.61 (1H, d， J = 8.0 Hz), 7.78 (1H, dd, J = 5.5, 1.5 Hz), 8.04 (1H， d, J =
1.5 Hz), 8.46 (2H, ddd, J = 5.0, 2.0, 1.0 Hz), 10.39 (1H, s).
(9) 2-[3_(2_(2-ビス (2-ピリジルメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ )_4_(p -トル エンスルホニルァミノ) -フヱニル] -1H -インドール _6_カルボン酸（lib)
化合物 (16b) 12 mg (15 mmol)を 10 mlのメタノールに溶かした溶液に、水酸化リチ ゥム一水和物 42 mg (1.0 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。メタノールを減圧留去 し、希塩酸により中和した後、不溶物を濾取しィ匕合物 (lib) 7.3 mgを得た (収率 81%)。 [0168] 実施例 2 (製法 A)
(1) 2-[3-(2-(2-ビス (エトキシカルボ二ルメチノレ)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4 -(p-トルエンスルホニルァミノ) -フエ二ノレ] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチルエス テル（16c)
上記実施例 1 (8)において、ジ _ (2-ピコリル）ァミンの代わりにジェチルイミノジァセ テートを用いること以外、上記実施例（8)と同様にして、化合物 (16c)を得た (収率 68
%)。
'H-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.17 (3H， t, J = 7.0 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2
.30 (3H, s)， 3.53 (4H, s), 3.93 (2H, s), 4.07 (4H, q, J = 7.0 Hz), 4.14-4.16 (2H， m), 4.25-4.27 (2H， m), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 6.77 (1H, s)， 6.84 (1H， d, J = 8.0 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.13 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.24-7.28 (2H, m)， 7.31 (1H， dd, J = 8.0， 1.5 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.48 (1H， brs), 7.58 (1H， d， J = 8.0 Hz), 7.59 (1H， d, J = 8.0 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.89 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 H z)， 8.14 (1H， s)， 9.59 (1H， s).
(2) 2-[3-(2-(2-ビス (カルボキシメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4-(p-トル エンスルホニルァミノ) -フエ二ノレ] -1H-インドール- 6-カルボン酸（lie)
化合物 (16c) 40 mg (52 mmol)を 10 mlのメタノールに溶かした溶液に、水酸化リチウ ム一水和物 42 mg (1.0 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。メタノールを減圧留去し 、 1 mlの 3N塩酸をカ卩え、不溶物を濾取した。これを 1 mlの蒸留水に懸濁させ、希塩 酸を PH8になるまで加えた。 G— 25セフアデックスを用いたカラムクロマトグラフィー により精製して化合物 (lie) 4.1 mgを得た（収率 10 %)。
[0169] 13 法 A)
(1) 2-[3- (2- (2-ビス (エトキシカルボ二ルメチノレ)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4 -(4- (エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルァミノ) -フエニル] -1H-インドー ル -6-カルボン酸 ェチルエステル（16d)
上記実施例 1 (4)において、 p -トノレエンスルホユルク口リドの代わりにェチル（4-クロ ロスルフォユルフェノキシ）アセテートを反応させること以外、実施例 1 (1)〜（8)と同 様にして反応させることにより、化合物 (16d)を得た。 Ή-NMR (CDC1 , 500 MHz): δ 1.27 (3H， t, J = 7.0 Hz), 1.42 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3
3
.61 (2H, s)， 3.75 (4H, s), 4.19-4.24 (6H, m), 4.40 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.56 (2H, s), 6.77 (1H, s)， 6.80 (1H， d, J = 8.5 Hz), 6.91 (1H， d, J = 7.5 Hz), 7.02-7.07 (3H， m), 7.20-7.22 (2H， m), 7.32-7.38 (3H， m), 7.47 (2H, d， J = 7.5 Hz), 7.51 (2H, td, J = 7. 5， 2.0 Hz), 7.58-7.61 (2H, m), 7.67 (2H, d， J = 8.5 Hz), 7.80 (1H, d， J = 8.0 Hz), 8. 16 (1H, s), 8.46 (2H， dd， J = 5.0, 2.0 Hz), 9.79 (1H, s).
(2) 2-[3_(2_(2-ビス (カルボキシメチル)アミノメチルフヱノキシ )-1-エトキシ) -4-(4- (力 ルボキシメトキシ)ベンゼンスルホニルァミノ) -フエニル] -1H-インドール _6_カルボン酸 (lid)
化合物 (16d) 12 mg (15 μ mol)を 10 mlのメタノールに溶力、した溶液に、水酸化リチ ゥム一水和物 42 mg (1.0 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。メタノールを減圧留去 し、希塩酸により中和した後、不溶物を濾取しィ匕合物 (lid) 7.3 mgを得た (収率 81%)。
実施例 4 (製法
(1) 3-(2-(2-ホルミルフエノキシ )-1-エトキシ) -4-ニトロべンジルアルコール（19) Journal of Medicinal Chemical Society, 2003， 46, pp. 691-701に記載の方法に従つ て、 2-nitoro-5_hidroxymethy卜 phenol(17)を合成した。該化合物 (17) 3.4 g (20.0 mm ol)と 2- (2-ブロモエトキシ）ベンズアルデヒド 4.6 g (20.0 mmol)を 100 mlのジメチルホル ムアミドに溶力した溶液に、炭酸カリウム 6.9 g (50.0 mmol)をカ卩ぇ 100 °Cで 5時間撹拌 した。反応液を氷水 300 mlに撹拌しながら加え、析出した固体を濾取し、標記化合物 (19) 4.7 gを得た（収率 74%)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 4.03—4.15 (4Η, m)， 4.50—4.59 (4H, m)， 5.84 (1H， s)
3
， 7.04-7.10 (2H, m)， 7.19 (1H， dd, J = 8.4, 1.4 Hz), 7.32 (1H, d， J = 1.4 Hz), 7.53 ( 1H， m), 7.82-7.85 (2H, m).
(2) 3-(2-(2_ビス (エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) _4_二 トロべンジルアルコール（20)
化合物 (19) 2.78 g (8.76 mmol)を 50 mlの 1，2_ジクロロェタンに溶かした溶液に、ジ ェチルイミノジアセテート 6.24 g (33.0 mmol)を加えた後、ナトリウムトリァセトキシボロ ヒドリド 2.12 g (10.0 mol)と酢酸 0.60 g (10 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。反応 液に水 100 mlを加え、クロ口ホルムで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロ 口ホルムを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物 (20) 3.07 gを得た（ 収率 71 %)。
'H-NMR (CDCl , 270 MHz): δ 4.03—4.14 (4H, m)， 4.41-4.46 (2H, m), 4.51—4.55 (2
3
H， m), 4.64 (2H， s)， 5.84 (1H， s), 6.93 (1H, d， J = 8.1 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.17 (1H， dd， J = 8.1, 1.4 Hz), 7.25-7.31 (3H, m), 7.84 (1H, d, J = 8.1 Hz).
(3) 3-(2-(2_ビス (エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ )_4_(p -トルエンスルホニルァミノ)ベンジルアルコール（21)
化合物 (20) 0.71 g (1.45 mmol)を 20 mlのテトラヒドロフランに溶かした溶液に、 5 %パ ラジウム Z炭素 70 mgを加え、 2気圧の水素ガス下室温で一晩撹拌した。触媒をセラ イトで濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、還元体のアミノ化合物 0.67 gを得た。 （収率 定量的）
'H-NMR (CDCl , 270 MHz): δ 1.22 (6H， t, J = 7.2 Hz), 3.55 (4H, s)， 3.95 (2H， s),
3
4.10 (4H, q, J = 7.2 Hz), 4.32-4.39 (4H, m), 4.56 (2H, s)， 6.67 (1H， d, J = 7.8 Hz), 6.79 (1H, dd， J = 7.8, 1.9 Hz), 6.89-6.92 (3H, m)， 6.96 (1H， td, J = 7.3, 1.9 Hz), 7. 23 (1H, td, J = 7.3, 1.6 Hz), 7.43 (1H, dd， J = 7.3， 1.6 Hz).
上記化合物 0.67 g (1.45 mmol)を 10 mlのクロ口ホルムに溶かした溶液に、 150 mlの ピリジンを加え、この溶液にトルエンスルホニルクロリド 0.28 g (1.50 mmol)の 2 mlクロ口 ホルム溶液を 0 °Cで加え、室温でー晚撹拌した。反応液に水 100 mlを加え、クロロホ ルムで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロ口ホルムを減圧下留去し、シリ 力ゲルカラムにより精製して化合物 (21) 3.07 gを得た (収率 71 %)。
'H-NMR (CDCl , 270 MHz): δ 1.21 (6H， t， J = 7.0 Hz), 2.31 (3H, s)， 3.56 (4H, s),
3
3.89 (2H, s)， 4.05-4.23 (8H， m)， 4.61 (2H, s), 6.85 (2H, m), 6.92 (1H， d, J = 1.9 Hz )， 7.00 (1H， td, J = 7.6, 1.1 Hz), 7.10 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.23—7.30 (2H, m)， 7.43 ( 1H， dd, J = 7.6, 1.9 Hz), 7.49 (1H, d， J = 8.4 Hz), 7.60 (2H, d， J = 7.6 Hz).
(4) 3-(2-(2_ビス (エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ )_4_(p -トルエンスルホニルァミノ)ベンズアルデヒド（21)
化合物 (21) 0.60 g (0.98 mmol)を 15 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化 マンガン 0.34 g (4.0 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。不溶物をセライトで濾去後
、濾液を減圧下留去し、化合物 (21) 0.54 gを得た（収率 89 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.21 (6H， t, J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s)， 3.49 (4H, s),
3
3.87 (2H, s)， 4.00 (4H， q, J = 7.0 Hz), 4.19—4.30 (4H， m)， 6.79 (1H， d, J = 7.8 Hz), 6.91 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.19 (1H， t， J = 7.8 Hz), 7.28-7.3 5 (3H, m), 7.59 (1H， d, J = 7.8 Hz), 7.64 (2H, d, J = 8.2 Hz).
(5) 3-ニトロ-4-[2_[3_(2_(2_ビス(ェトキシカルボニルメチル)ァミノメチルフヱノキシ)_1 -エトキシ) -4-(p-トルエンスルホニルァミノ) -フヱニル] -トランス-ビュル]安息香酸 ェ チノレエステノレ（23)
化合物 (21) 0.54 g (0.87 mmol)を 5 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、 （4 -エトキシカルボニル -2-ニトロベンジル）トリフエニルフォスフォニゥムブロミド 0.72 g (1 .3 mmol),炭酸カリウム 0.60 g (4.4 mmol)を加え、 90 °Cでー晚撹拌した。反応液を水 50 mlにカロえ、酢酸ェチルで抽出した。酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸 マグネシウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製し て化合物 (23) 0.17 gを得た (収率 24 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.20 (6H， t, J = 7.3 Hz), 1.42 (3H, t, J = 7.3 Hz), 2
3
.34 (3H, s)， 3.57 (4H, s), 3.96 (2H, s), 4.08 (4H, q, J = 7.3 Hz), 4.20-4.29 (4H， m), 4.43 (2H, q, J = 7.3 Hz), 6.88 (1H, d, J = xx Hz), 6.94-7.16 (5H， m)， 7.28-7.34 (2H ， m), 7.43-7.49 (2H， m), 7.55-7.67 (4H, m), 7.80 (1H， d, J = 8.6 Hz), 8.21 (1H, dd， J = 8.1, 1.6 Hz), 8.56 (1H, d, J = 1.6 Hz).
(6) 2-[3-(2-(2-ビス (エトキシカルボ二ルメチノレ)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4 -(p-トルエンスルホニルァミノ)-フエ二ノレ] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチルエス テル (16c)
化合物 (23) 0.17 g (0.21 mmol)を 2 mlの亜リン酸トリェチルに溶かし、 125 °Cで 4時 間撹拌した。亜リン酸トリェチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化 合物 (16c) 40 mgを得た（収率 25 %)。
(7) 2-[3_(2_(2-ビス (カルボキシメチル)アミノメチルフエノキシ) -1-エトキシ) -4-(p-トル エンスルホニルァミノ) -フヱニル] -1H -インドール _6_カルボン酸（lie) 化合物 (16c)を実施例 1 (9)と同様に処理して、化合物 (lie)を得た。
Figure imgf000041_0001
(1) (2-(5-ヒドロキシメチル -2-ニトロフエノキシ)ェチル）力ルバミック酸- tert-ブチルェ ステル（25)
化合物 (17) 2.57 g (15.2 mmol)と（2-ブロモェチル）力ルバミック酸- tert-ブチルエス テル 3.40 g (15.2 mmol)を 50 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸力リウ ム 3.15 g (22.8 mmol)を加え 100 °Cで 22時間撹拌した。反応液に水 150 mlを加え、酢 酸ェチルで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸ェチルを減圧下留去し、 シリカゲルカラムにより精製して化合物 (25) 0.85 gを得た（収率 18 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.44 (9H， s), 3.55-3.61 (2Η, m), 4.18 (2H, t, J = 5.
1 Hz), 4.77 (2H, d, J = 5.7 Hz), 5.18 (1H， bs), 6.99 (1H, d， J = 8.4 Hz), 7.13 (1H, s )， 7.88 (1H， d, J = 8.4 Hz).
(2) (2-(5-ヒドロキシメチル -2-(4- (エトキシカルボニルメトキシ）フエニルスルホニルァ ミノ)ェチル)力ルバミック酸- tert-ブチルエステル（27)
化合物 (25) 0.85 g (2.73 mmol)を 30 mlのエタノールに溶かした溶液に、 5 %パラジゥ ム/炭素 70 mgをカ卩え、 2気圧の水素ガス下室温で一晩撹拌した。触媒をセライトで 濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、還元体のアミノ化合物 (26) 0.77 gを得た。 （収率 85 %)
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.45 (9H， s), 3.54—3.61 (2Η, m), 4.07 (2H, t, J = 5.
1 Hz), 4.55 (2H， s), 4.98 (1H, bs), 6.69 (1H， d, J = 7.8 Hz), 6.77-6.81 (2H， m). 上記化合物 (26) 0.65 g (2.31 mmol)を 20 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、 2 ml のピリジンを加え、この溶液にェチル（4-クロロスルフォユルフェノキシ）アセテート 0.6 4 g (2.31 mmol)の 2 mlクロ口ホルム溶液を 0 °Cで加え、室温でー晚撹拌した。反応液 に水 50 mlをカ卩え、酢酸ェチルで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸ェ チルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物 (27) 1.13 gを得た（収率 94 %)。
'H-NMR (CDC1 , 270 MHz): δ 1.28 (3H， t， J = 7.0 Hz), 1.43 (9H, s)， 3.25—3.29 (2
H， m), 3.65-3.69 (2H, m)， 4.24 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.57 (2H， s)， 4.63 (2H, s), 5.44 (1H， bs), 6.70 (1H, s)， 6.80-6.85 (3H， m)， 7.44 (1H， d, J = 8.4 Hz), 7.60 (1H， bs)， 7 .65 (2H, d, J = 8.6 Hz).
(3) (2-(5-ホルミル- 2-(4- (エトキシカルボニルメトキシ）フエニルスルホニルァミノ)ェ チノレ)力ルバミック酸- tert-ブチルエステル（28)
化合物 (27) 1.13 g (2.16 mmol)を 30 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化 マンガン 1.88 g (21.6 mmol)を加え、室温でー晚撹拌した。不溶物をセライトで濾去後 、濾液を減圧下留去し、化合物 (28)を得た。
(4) 3-ニトロ- 4-[2- [3- (2- (tert-ブトキシカルボニルァミノ)- 1-エトキシ) -4- (4- (エトキシ カルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルァミノ)-フエニル] -トランス-ビュル]安息香酸 ェチルエステル（29)
化合物 (28)を、実施例 1 (5)と同様に Wittig反応することにより、化合物 (29)を得る。
(5) 2-[3_(2_(tert-ブトキシカルボニルァミノ)- 1_エトキシ )_4_(4- (エトキシカルボニル メトキシ)ベンゼンスルホニルァミノ) -フエ二ノレ] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチル エステノレ （30)
化合物 (29)を、実施例 1 (6)と同様に反応することにより、化合物 (30)を得る。
(6) 2-[3-(2-ァミノ- 1-エトキシ) -4-(4- (エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホ二 ルァミノ) -フエ二ノレ] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチルエステル（31)
トリフルォロ酢酸/ジクロロメタン 1 : 1混合溶媒に、化合物 (30)を 0度で加え、 30分 撹拌する。溶媒を減圧下で留去し、化合物 (31)を得る。
(7) 2-[3-(2-ビス (2-ピリジルメチル)ァミノ- 1-エトキシ) -4-(4- (エトキシカルボ二ルメト キシ)ベンゼンスルホニルァミノ) -フエニル] -1H-インドール- 6-カルボン酸 ェチルェ ステル（34)
化合物 (31)の 1，2-ジクロロェタン溶液に、 2-ピリジンカルボキシアルデヒドを加えた 後、ナトリウムトリァセトキシボロヒドリドをカ卩え、室温で一晩撹拌する。反応液に水 20 mlを加え、クロ口ホルムで 3回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥する。クロ口ホルムを 減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物 (34)を得る。
(8) 2-[3_(2_ビス (2-ピリジルメチル)ァミノ- 1-エトキシ) _4_(4_ (カルボキシメトキシベン ゼン)スルホニルァミノ)-フエニル] -1H-インドール- 6-カルボン酸 （nib) 化合物 (34)を実施例 1 (9)と同様に処理して、化合物 (Illb)を得る。
試験例 1 (化合物 (lie)の蛍光特性）
上記実施例 1で得られた化合物 (lie)の蛍光特性を調べた。化合物 (lie)を 1 OOmM HEPES緩衝液（PH7. 2、 5 μ M EDTA含有）に 10 μ Μとなるように溶解して吸収 及び蛍光スペクトルを測定した。
ぐ測定条件〉
日本分光株式会社 分光蛍光光度計 FP-750DS
スリット： Ex、 Em 2. 5nm
スキャン速度： 240nm/min
測定温度： 25°C
亜鉛イオン（20 μ Μ ZnCl )の添加前及び亜鉛イオン添加後の化合物 (lie)の蛍光
2
特性を、下記表 1に示す。
[表 1]
Z n 2 +添加前 Z n 2 +添加後
吸収波長ピ- -ク 3 3 7 3 4 5 蛍光波長ピ -ク n m) 4 2 6 4 6 3
[0173] 化合物 (lie)は、亜鉛イオンと配位することによっての吸収波長ピークは 8nmの波長 側にシフトし、蛍光波長のピークは 37nm長波長側にシフトした。これは、亜鉛イオン との相互作用により、化合物 (lie)のスルホンアミド基の pKaの値が小さくなつたため、 中性条件においても脱プロトン化して、共役系が広がったためであると考えられる。
[0174] 亜鉛イオンの添カ卩後における化合物 (lie)と亜鉛イオンの平衡状態の模式図を、図 1 に示す。また、それぞれの吸収スペクトルの変化を図 2に、蛍光スペクトルの変化を図 3に示す。なお、図 3の励起波長は、図 2の 2つの吸収スペクトルの交点である 342η mを用レヽに。
[0175] これによれば、化合物 (lie)とその亜鉛錯体では、吸収波長のシフトが小さぐ蛍光波 長のピークが大きくなることが分かった。従って、化合物 (lie)を亜鉛蛍光プローブとし て用いた場合、単一波長の励起光を用いることができ、かつ、化合物 (lie)とその亜鉛 錯体の蛍光波長ピークが大きく異なり蛍光強度比を正確に検出することができるため 、試料 (細胞）中の亜鉛濃度を正確に測定することができる。
試験例 2 (化合物 (lie)の亜鉛イオン撰択性）
10 μ Μの化合物 (lie)を含む lOOmM HEPES緩衝液（pH7. 2、 5 μ M EDTA含 有）に、マンガン二価イオン、鉄三価イオン又は亜鉛イオンをそれぞれ濃度が 50 μ Μになるまで添カ卩し、励起波長を 350nmに固定して、化合物 (lie)の蛍光波長 410η mにおける蛍光強度（I )及び化合物 (lie)の金属錯体の蛍光波長 485nmにおける
410
蛍光強度 (I )を測定し、その蛍光強度比 (I /1 )を算出した。
485 485 410
[0176] 同様に、 ΙΟ μ Μの化合物 (lie)を含む lOOmM HEPES緩衝液（pH7. 2、 5 μ M E DTA含有）に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン又はマグネシウム イオンをそれぞれ濃度が 5mMになるまで添カ卩し、励起波長 350nmに固定して、化 合物 (lie)の蛍光波長 410nmにおける蛍光強度（I )及び化合物 (lie)の金属錯体の
410
蛍光波長 485nmにおける蛍光強度（I )を測定し、その蛍光強度比（I
485 485 /\ )を
410 算出した。
[0177] その結果を、図 4 (Zn2+なし）に示す。
[0178] 化合物 (lie)は、亜鉛イオンを添加した場合に高レ、レシオ変化（蛍光強度比）を示す 、生体内に多く存在する他のイオンを加えた場合にはレシオの変化がみられない か、又は蛍光の消光が観察された。このこと力ら、化合物 (lie)が亜鉛イオンに対して 高レ、選択性を示すことが分かった。
[0179] 次に、上記で調製した各溶液に、 50 μ Μとなるように亜鉛イオンを添加し、同様の 測定条件でスペクトルを測定した。その結果を、図 4 (Ζη2+あり）に示す。これによれば 、各溶液に亜鉛イオンを添加することにより、上記の亜鉛イオンのみを添加した場合 と同等の亜鉛錯体の蛍光強度比が得られた。このことから、化合物 (lie)を用いると、 他の金属イオンの影響を受けることなく亜鉛イオンのレシオ測定ができることがわかつ た。

Claims

請求の範囲
一般式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000045_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは— O—又は— S—で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基、 Zは単結合 又は式：
[化 2]
Figure imgf000045_0002
で表される基を示し、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 Yは _〇—又は— S— で示される基を示す。 )
で表される化合物又はその塩。
一般式 (I)において、 Arがアルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、モノ又は ジアルキルアミノ基
Figure imgf000045_0003
カルボキシル基、アル コキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、力 ルボキシアルコキシ基及びアルコキシカルボニルアルコキシ基力 なる群より選ばれ る少なくとも 1個の基で置換されたァリール基である請求項 1に記載の化合物又はそ の塩。 [3] 一般式（I)におレ、て、 Arがフエニル基、トルィル基、ナフチル基、カルボキシアルコ キシ基置換フエニル基及び 5—（ジメチルァミノ） 1 ナフチル基からなる群より選ば れる 1個の基である請求項 2に記載の化合物又はその塩。
[4] 一般式（I)におレ、て、 X及び Yが _ O _で示される基であり、 nが 2であり、 Aがベン ゼン環である請求項 1〜3のいずれかに記載の化合物又はその塩。
[5] 一般式 (I)において、 R1及び R2が同一又は異なって、含窒素へテロアリール基、力 ルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から なる群より選ばれる少なくとも 1個の基で置換されたアルキル基である請求項 1〜4の レ、ずれかに記載の化合物又はその塩。
[6] 一般式 (II) :
[化 3]
Figure imgf000046_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって _〇_ 又は _S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
[7] 一般式 (III) : [化 4]
Figure imgf000047_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは—O—又は—S—で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもよ!/、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基を示す。） で表される化合物又はその塩。
一般式 (II) :
[化 5]
Figure imgf000047_0002
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって _〇_ 又は— S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもょレ、アルキル基、置換基を有してもょレヽ ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（16)： [化 6]
Figure imgf000048_0001
(式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 Y、 n、 A、 R1及び R2は前記に同じ。 ) で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
一般式 (16) :
[化 7]
Figure imgf000048_0002
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって _〇_ 又は _S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステル化合物。
一般式 (16) : 化
¾
Figure imgf000049_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステルイ匕合物の製造方法であって、一般式（14)：
[化 9]
Figure imgf000049_0002
(式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 Y、 η及び Αは前記に同じ。 )
で表されるアルデヒド化合物と、一般式（15)：
HN (R1) (R2) (15)
(式中、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基を示す。 ) で表されるァミン化合物を反応させることを特徴とする製造方法。
一般式（14) : [化 10]
Figure imgf000050_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R3は アルキル基を示す。 )
で表されるアルデヒド化合物。
一般式 (6) :
[化 11]
Figure imgf000050_0002
(式中、 X及び Yは同一又は異なって O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 mは 1又は 2を示す）
で表される化合物。
[13] 一般式（16) : [化 12]
Figure imgf000051_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって O— 又は—S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表されるエステルイ匕合物の製造方法であって、一般式（23)：
[化 13]
Figure imgf000051_0002
(式中、 Ar、 X、 Y、 η、 Α、 R1, R2及び R3は前記に同じ。 )
で表される化合物と、トリアルキルホスファイトを反応させることを特徴とする製造方法
[14] 一般式（23) [化 14]
Figure imgf000052_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 X及び Yは同一又は異なって _〇_ 又は _S—で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもよいベンゼン環、 R1及 び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよい ァリール基又は置換基を有してもよいへテロアリール基、 R3はアルキル基を示す。） で表される化合物。
一般式 (19) :
[化 15]
Figure imgf000052_0002
(式中、 X及び Yは同一又は異なって _〇_又は _ S _で示される基、 nは 2又は 3、 Aは置換基を有してもょレ、ベンゼン環を示す）
で表される化合物。
一般式 (III) : [化 16]
Figure imgf000053_0001
(式中、 Arは置換基を有してもよいァリール基、 Xは O 又は S で示される基、 nは 2又は 3、 R1及び R2は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換 基を有してもょレ、ァリール基又は置換基を有してもょレ、ヘテロァリール基を示す。） で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（34)：
[化 17]
Figure imgf000053_0002
(式中、 R3はアルキル基を示し、 Ar、 X、 n、 R1及び R2は前記に同じ。 )
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
[17] 上記請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プロ一 ブ。
[18] 上記請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛イオン測定用 試薬。
[19] 上記請求項:!〜 7のいずれかに記載の化合物及び亜鉛イオンを含む亜鉛錯体。 [20] 亜 イオンの測定方法であって、
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて 亜鉛錯体を生成する工程、及び
(b)上記 (a)で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
[21] 前記工程 (b)において、単一の励起波長の光を照射し、請求項 1〜7のいずれかに 記載の化合物又はその塩と上記（a)で生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を 測定する請求項 20に記載の測定方法。
[22] 前記励起波長が 340〜400nmである請求項 20に記載の測定方法。
[23] 前記工程 (b)において、請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩の蛍 光スペクトルのピーク波長と、上記（a)で生成した亜鉛錯体の蛍光スペクトルのピーク 波長との差が 20nm以上である請求項 20、 21又は 22に記載の測定方法。
[24] 細胞内の亜鉛イオンの測定方法であって、
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載の化合物又はその塩を細胞内に取り込む工程、 及び
(b)上記（a)で細胞内に取り込んだ化合物又はその塩と細胞内の亜鉛イオンとから 生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
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