JP2000239272A - 亜鉛蛍光プローブ - Google Patents
亜鉛蛍光プローブInfo
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- C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
- C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
- C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
- C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下
で高感度に測定するための亜鉛蛍光プローブを提供す
る。 【解決手段】 式（Ｉ）又は（II）：〔Ｒ1〜Ｒ6、Ｒ11
〜Ｒ16は水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基
等を示し；Ｒ7、Ｒ8、Ｒ17、Ｒ18は水素原子、ハロゲン
原子、又は低級アルキル基を示し；Ｒ21〜Ｒ24は水素原
子又は低級アルキル基を示し；Ｙは式（III）〜（Ｖ）
［Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4は−Ｎ（Ｒ51）−等を示し、
Ｒ51は水素原子又は低級アルキル基等を示し、ｍ〜ｒは
２又は３を示す］で表される基等を示す〕で表される化
合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を含む亜鉛蛍
光プローブ。 【化１】
で高感度に測定するための亜鉛蛍光プローブを提供す
る。 【解決手段】 式（Ｉ）又は（II）：〔Ｒ1〜Ｒ6、Ｒ11
〜Ｒ16は水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基
等を示し；Ｒ7、Ｒ8、Ｒ17、Ｒ18は水素原子、ハロゲン
原子、又は低級アルキル基を示し；Ｒ21〜Ｒ24は水素原
子又は低級アルキル基を示し；Ｙは式（III）〜（Ｖ）
［Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4は−Ｎ（Ｒ51）−等を示し、
Ｒ51は水素原子又は低級アルキル基等を示し、ｍ〜ｒは
２又は３を示す］で表される基等を示す〕で表される化
合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を含む亜鉛蛍
光プローブ。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、亜鉛イオンを特異
的に捕捉して蛍光を発する亜鉛蛍光プローブに関するも
のである。
的に捕捉して蛍光を発する亜鉛蛍光プローブに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】亜鉛はヒトの体内において鉄に次いで含
量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛
イオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や
機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在
するフリーの亜鉛イオン（通常はμＭレベル以下であ
る）の生理的役割についても、種々の報告がある。特
に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛イオンが
深く関わっていると考えられており、アルツハイマー病
の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。
量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛
イオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や
機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在
するフリーの亜鉛イオン（通常はμＭレベル以下であ
る）の生理的役割についても、種々の報告がある。特
に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛イオンが
深く関わっていると考えられており、アルツハイマー病
の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。
【０００３】従来、組織内の亜鉛イオンを測定するため
に、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体
形成に伴って蛍光を発する化合物（亜鉛蛍光プローブ）
が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、
ＴＳＱ (Reyes, J.G., et al.,Biol. Res., 27, 49, 19
94）、Zinquin ethyl ester (Tsuda, M. et al., Neuro
sci., 17, 6678, 1997)、Dansylaminoethylcyclen (Koi
ke, T. et al., J. Am.Chem. Soc., 118, 12686, 199
6)、Newport Green (Molecular Probe社のカタログであ
る"Handbook of Fluorescent Probes and Research Che
micals" 6th Edition by Richard P. Haugland pp.531-
540)などが実用化されている。
に、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体
形成に伴って蛍光を発する化合物（亜鉛蛍光プローブ）
が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、
ＴＳＱ (Reyes, J.G., et al.,Biol. Res., 27, 49, 19
94）、Zinquin ethyl ester (Tsuda, M. et al., Neuro
sci., 17, 6678, 1997)、Dansylaminoethylcyclen (Koi
ke, T. et al., J. Am.Chem. Soc., 118, 12686, 199
6)、Newport Green (Molecular Probe社のカタログであ
る"Handbook of Fluorescent Probes and Research Che
micals" 6th Edition by Richard P. Haugland pp.531-
540)などが実用化されている。
【０００４】
【化４】
【０００５】しかしながら、ＴＳＱ、Zinquin、又はDan
sylaminoethylcyclenを用いた測定では、短波長領域の
励起光を用いる必要があるために（それぞれ、励起波長
が367nm、368nm、及び323nmである。）、これらの亜鉛
蛍光ブローブを生体系の測定に用いた場合には、短波長
による励起が細胞傷害を引き起こす可能性があり（細胞
工学, 17, pp.584-595, 1998）、また、測定の際に細胞
系自身が有する自家蛍光（NADHやフラビン類が発する蛍
光）による影響を受けやすいという問題がある。さら
に、Dansylaminoethylcyclenは測定時に試薬が存在する
環境の違い、すなわち溶媒の種類、あるいは細胞外、細
胞内もしくは細胞膜などにおける水溶性、脂溶性などの
環境の違いにより蛍光強度が大きく変化するという欠点
を有しており（蛋白質・核酸・酵素、増刊号, 42, pp.1
71-176, 1997）、ＴＳＱは脂溶性が高いために細胞全体
に均一に分布させることが困難であるという問題も有し
ている。Newport Greenは長波長の励起光で測定を行な
えるものの、亜鉛イオンとのアフィニティーが低く、実
用的な測定感度を有していないという問題がある。従っ
て、細胞障害を引き起こすことなく、高感度に亜鉛イオ
ンを測定できる亜鉛蛍光プローブの開発が求められてい
る。
sylaminoethylcyclenを用いた測定では、短波長領域の
励起光を用いる必要があるために（それぞれ、励起波長
が367nm、368nm、及び323nmである。）、これらの亜鉛
蛍光ブローブを生体系の測定に用いた場合には、短波長
による励起が細胞傷害を引き起こす可能性があり（細胞
工学, 17, pp.584-595, 1998）、また、測定の際に細胞
系自身が有する自家蛍光（NADHやフラビン類が発する蛍
光）による影響を受けやすいという問題がある。さら
に、Dansylaminoethylcyclenは測定時に試薬が存在する
環境の違い、すなわち溶媒の種類、あるいは細胞外、細
胞内もしくは細胞膜などにおける水溶性、脂溶性などの
環境の違いにより蛍光強度が大きく変化するという欠点
を有しており（蛋白質・核酸・酵素、増刊号, 42, pp.1
71-176, 1997）、ＴＳＱは脂溶性が高いために細胞全体
に均一に分布させることが困難であるという問題も有し
ている。Newport Greenは長波長の励起光で測定を行な
えるものの、亜鉛イオンとのアフィニティーが低く、実
用的な測定感度を有していないという問題がある。従っ
て、細胞障害を引き起こすことなく、高感度に亜鉛イオ
ンを測定できる亜鉛蛍光プローブの開発が求められてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、高感
度な亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物又はその
塩を提供することにある。より具体的には、亜鉛イオン
を特異的に捕捉することができ、捕捉後の錯体の蛍光強
度に優れ、長波長の励起光で蛍光測定を行なうことがで
きる亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物を提供す
ることが本発明の課題である。また、本発明の別な課題
は、上記の特徴を有する化合物を含む亜鉛蛍光プロー
ブ、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定
方法を提供することにある。
度な亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物又はその
塩を提供することにある。より具体的には、亜鉛イオン
を特異的に捕捉することができ、捕捉後の錯体の蛍光強
度に優れ、長波長の励起光で蛍光測定を行なうことがで
きる亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物を提供す
ることが本発明の課題である。また、本発明の別な課題
は、上記の特徴を有する化合物を含む亜鉛蛍光プロー
ブ、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定
方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式
（Ｉ）又は（II）で表される化合物が亜鉛イオンに対し
て高い特異性を有しており、亜鉛イオンを捕捉して、長
波長領域の励起光で強い蛍光を発する錯体を形成するこ
とを見出した。また、この化合物を亜鉛蛍光プローブと
して用いると、細胞障害を引き起こすことなく、また、
溶媒の種類や組織内外などの試薬が存在する環境の違い
による蛍光強度の変化が小さく、生体内の亜鉛イオンを
極めて正確かつ高感度に測定できることを見出した。本
発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式
（Ｉ）又は（II）で表される化合物が亜鉛イオンに対し
て高い特異性を有しており、亜鉛イオンを捕捉して、長
波長領域の励起光で強い蛍光を発する錯体を形成するこ
とを見出した。また、この化合物を亜鉛蛍光プローブと
して用いると、細胞障害を引き起こすことなく、また、
溶媒の種類や組織内外などの試薬が存在する環境の違い
による蛍光強度の変化が小さく、生体内の亜鉛イオンを
極めて正確かつ高感度に測定できることを見出した。本
発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００８】すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）
又は（II）：
又は（II）：
【化５】 〔式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6はそ
れぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又は
低級アルキル基を示し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水
素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示し；式
（II）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16は
それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又
は低級アルキル基を示し；Ｒ17及びＲ18はそれぞれ独立
に水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示
し；Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24はそれぞれ独立に水素
原子又は低級アルキル基を示し；式（Ｉ）及び式（II）
中、Ｙは下記の式（III）ないし（Ｖ）：
れぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又は
低級アルキル基を示し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水
素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示し；式
（II）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16は
それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又
は低級アルキル基を示し；Ｒ17及びＲ18はそれぞれ独立
に水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示
し；Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24はそれぞれ独立に水素
原子又は低級アルキル基を示し；式（Ｉ）及び式（II）
中、Ｙは下記の式（III）ないし（Ｖ）：
【化６】 [式中、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4はそれぞれ独立に−Ｎ
（Ｒ51）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を示すが、Ｚ1、Ｚ2、
Ｚ3、及びＺ4のうちの少なくとも１つは−Ｎ（Ｒ 51）−
を示し、Ｒ51は水素原子、低級アルキル基、１若しくは
２個以上のアミノ基で置換された低級アルキル基（該ア
ミノ基は低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、
又はアリールスルホニル基で置換されていてもよい）、
又は１若しくは２個以上の水酸基で置換された低級アル
キル基を示し；ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、及びｒはそれぞれ独立
に２又は３の整数を示す]で表される基を示すか、又は
式（VI）：−Ｎ（Ｒ31）（Ｒ32） [式中、Ｒ31及びＲ32はそれぞれ独立に下記の式（VII）
ないし（X）：
（Ｒ51）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を示すが、Ｚ1、Ｚ2、
Ｚ3、及びＺ4のうちの少なくとも１つは−Ｎ（Ｒ 51）−
を示し、Ｒ51は水素原子、低級アルキル基、１若しくは
２個以上のアミノ基で置換された低級アルキル基（該ア
ミノ基は低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、
又はアリールスルホニル基で置換されていてもよい）、
又は１若しくは２個以上の水酸基で置換された低級アル
キル基を示し；ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、及びｒはそれぞれ独立
に２又は３の整数を示す]で表される基を示すか、又は
式（VI）：−Ｎ（Ｒ31）（Ｒ32） [式中、Ｒ31及びＲ32はそれぞれ独立に下記の式（VII）
ないし（X）：
【化７】 ［式中、Ｒ41、Ｒ42、Ｒ43、Ｒ44、及びＲ45はそれぞれ
独立に水素原子、低級アルキル基、１若しくは２個以上
のアミノ基で置換された低級アルキル基（該アミノ基は
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、又はアリ
ールスルホニル基で置換されていてもよい）、又は１若
しくは２個以上の水酸基で置換された低級アルキル基を
示し；ｓ、ｔ、ｕ、及びｖはそれぞれ独立に２又は３の
整数を示す］で表される基及び水素原子からなる群から
選ばれる置換基を示すが、Ｒ31及びＲ32が同時に水素原
子を示すことはない]で表される基を示す〕で表される
化合物又はその塩を提供するものである。
独立に水素原子、低級アルキル基、１若しくは２個以上
のアミノ基で置換された低級アルキル基（該アミノ基は
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、又はアリ
ールスルホニル基で置換されていてもよい）、又は１若
しくは２個以上の水酸基で置換された低級アルキル基を
示し；ｓ、ｔ、ｕ、及びｖはそれぞれ独立に２又は３の
整数を示す］で表される基及び水素原子からなる群から
選ばれる置換基を示すが、Ｒ31及びＲ32が同時に水素原
子を示すことはない]で表される基を示す〕で表される
化合物又はその塩を提供するものである。
【０００９】上記発明の好ましい態様によれば、 (a)Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が水素原子であり、Ｒ2及び
Ｒ5がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であ
り、Ｒ7及びＲ8が水素原子であり、Ｙが上記式（IV）
〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3はそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−（Ｒ51は低級アルキル基を示す）であり、ｍ、
ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基である式
（Ｉ）で表される化合物又はその塩； (b) Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が水素原子であり、Ｒ2及
びＲ5がともに水素原子であるか、又はともにハロゲン
原子であり、Ｒ7及びＲ8が水素原子であり、Ｙが上記式
（IV）（式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）
−あり、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑが２である）で表される基
である上記化合物又はその塩； (c)Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ
12及びＲ15がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子
であり、Ｒ17及びＲ18が水素原子であり、Ｒ21、Ｒ22、
Ｒ23、及びＲ24が水素原子であり、Ｙが上記式（IV）
〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3がそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−（Ｒ51は低級アルキル基を示す）であり、ｍ、
ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基である式（I
I）で表される化合物又はその塩；及び (d) Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ
12及びＲ15がともに水素原子であるか、又はともにハロ
ゲン原子であり、Ｙが上記式（IV）（式中、Ｚ1、Ｚ2、
及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）−であり、ｍ、ｎ、ｐ、及
びｑが２である）で表される基である上記化合物又はそ
の塩が提供される。
Ｒ5がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であ
り、Ｒ7及びＲ8が水素原子であり、Ｙが上記式（IV）
〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3はそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−（Ｒ51は低級アルキル基を示す）であり、ｍ、
ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基である式
（Ｉ）で表される化合物又はその塩； (b) Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が水素原子であり、Ｒ2及
びＲ5がともに水素原子であるか、又はともにハロゲン
原子であり、Ｒ7及びＲ8が水素原子であり、Ｙが上記式
（IV）（式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）
−あり、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑが２である）で表される基
である上記化合物又はその塩； (c)Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ
12及びＲ15がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子
であり、Ｒ17及びＲ18が水素原子であり、Ｒ21、Ｒ22、
Ｒ23、及びＲ24が水素原子であり、Ｙが上記式（IV）
〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3がそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−（Ｒ51は低級アルキル基を示す）であり、ｍ、
ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基である式（I
I）で表される化合物又はその塩；及び (d) Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ
12及びＲ15がともに水素原子であるか、又はともにハロ
ゲン原子であり、Ｙが上記式（IV）（式中、Ｚ1、Ｚ2、
及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）−であり、ｍ、ｎ、ｐ、及
びｑが２である）で表される基である上記化合物又はそ
の塩が提供される。
【００１０】別の観点からは、本発明により、上記式
（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はそれらの
塩を含む亜鉛蛍光プローブ；及び上記式（Ｉ）若しくは
式（II）で表される化合物又はそれらの塩と亜鉛イオン
とから形成される亜鉛錯体が提供される。この亜鉛蛍光
プローブは、組織や細胞内の亜鉛イオンを測定するため
に用いることができる。さらに別の観点からは、本発明
により、亜鉛イオンの測定方法であって、上記式（Ｉ）
若しくは式（II）で表される化合物又はそれらの塩を亜
鉛蛍光プローブとして用いる方法；亜鉛イオンの測定方
法であって、下記の工程：(a)上記式（Ｉ）若しくは式
（II）で表される化合物又はそれらの塩と亜鉛イオンと
を反応させる工程，及び(b)上記工程で生成した亜鉛錯
体の蛍光強度を測定する工程を含む方法；並びに、上記
式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はそれら
の塩の亜鉛蛍光プローブとしての使用が提供される。
（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はそれらの
塩を含む亜鉛蛍光プローブ；及び上記式（Ｉ）若しくは
式（II）で表される化合物又はそれらの塩と亜鉛イオン
とから形成される亜鉛錯体が提供される。この亜鉛蛍光
プローブは、組織や細胞内の亜鉛イオンを測定するため
に用いることができる。さらに別の観点からは、本発明
により、亜鉛イオンの測定方法であって、上記式（Ｉ）
若しくは式（II）で表される化合物又はそれらの塩を亜
鉛蛍光プローブとして用いる方法；亜鉛イオンの測定方
法であって、下記の工程：(a)上記式（Ｉ）若しくは式
（II）で表される化合物又はそれらの塩と亜鉛イオンと
を反応させる工程，及び(b)上記工程で生成した亜鉛錯
体の蛍光強度を測定する工程を含む方法；並びに、上記
式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はそれら
の塩の亜鉛蛍光プローブとしての使用が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】本明細書において「低級アルキル
基」という場合には、例えば、炭素数１〜６個、好まし
くは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれら
の組み合わせからなるアルキル基を意味している。より
具体的には、低級アルキル基として、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル
基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペ
ンチル基、ｎ−ヘキシル基などを用いることができる。
また、本明細書においてハロゲン原子という場合には、
フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のい
ずれであってもよい。
基」という場合には、例えば、炭素数１〜６個、好まし
くは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれら
の組み合わせからなるアルキル基を意味している。より
具体的には、低級アルキル基として、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル
基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペ
ンチル基、ｎ−ヘキシル基などを用いることができる。
また、本明細書においてハロゲン原子という場合には、
フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のい
ずれであってもよい。
【００１２】式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ
4、及びＲ6が水素原子であり、Ｒ7及びＲ8が水素原子で
あり、Ｒ2及びＲ5がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲ
ン原子であることが好ましいが、Ｒ2及びＲ5がともに水
素原子であるか、又はＲ2及びＲ5がともにハロゲン原子
であることがより好ましい。
4、及びＲ6が水素原子であり、Ｒ7及びＲ8が水素原子で
あり、Ｒ2及びＲ5がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲ
ン原子であることが好ましいが、Ｒ2及びＲ5がともに水
素原子であるか、又はＲ2及びＲ5がともにハロゲン原子
であることがより好ましい。
【００１３】式（II）の化合物において、Ｒ11、Ｒ13、
Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ 17及びＲ18が水素
原子であり、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24が水素原子で
あり、Ｒ12及びＲ15がそれぞれ独立に水素原子又はハロ
ゲン原子であることが好ましいが、Ｒ12及びＲ15がとも
に水素原子であるか、又はＲ12及びＲ15がともにハロゲ
ン原子であることがより好ましい。
Ｒ14、及びＲ16が水素原子であり、Ｒ 17及びＲ18が水素
原子であり、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24が水素原子で
あり、Ｒ12及びＲ15がそれぞれ独立に水素原子又はハロ
ゲン原子であることが好ましいが、Ｒ12及びＲ15がとも
に水素原子であるか、又はＲ12及びＲ15がともにハロゲ
ン原子であることがより好ましい。
【００１４】Ｙが示す基としては、上記の式（III）な
いし（Ｖ）のいずれかの式で表される環状のクラウン残
基のほか、式（VI）で表される基を用いることができ
る。Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4はそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を示すが、Ｒ51は水素原
子、低級アルキル基、１若しくは２個以上のアミノ基で
置換された低級アルキル基（該アミノ基は低級アルキル
基、低級アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニ
ル基で置換されていてもよい）、又は１若しくは２個以
上の水酸基で置換された低級アルキル基を示す。Ｚ1、
Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4のうちの少なくとも１つは−Ｎ（Ｒ
51）−を示す。Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4のうちの２以上
が−Ｎ（Ｒ51）−である場合には、Ｒ51は同一でも異な
っていてもよい。これらのうち、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及び
Ｚ4が独立に−Ｎ（Ｒ51）−（Ｒ51がアルキル基であ
る）である場合が好ましい。Ｒ５１は低級アルキル基で
あることが好ましく、該アルキル基は同一でも異なって
いてもよく、メチル基であることがさらに好ましい。
いし（Ｖ）のいずれかの式で表される環状のクラウン残
基のほか、式（VI）で表される基を用いることができ
る。Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4はそれぞれ独立に−Ｎ（Ｒ
51）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を示すが、Ｒ51は水素原
子、低級アルキル基、１若しくは２個以上のアミノ基で
置換された低級アルキル基（該アミノ基は低級アルキル
基、低級アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニ
ル基で置換されていてもよい）、又は１若しくは２個以
上の水酸基で置換された低級アルキル基を示す。Ｚ1、
Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4のうちの少なくとも１つは−Ｎ（Ｒ
51）−を示す。Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4のうちの２以上
が−Ｎ（Ｒ51）−である場合には、Ｒ51は同一でも異な
っていてもよい。これらのうち、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及び
Ｚ4が独立に−Ｎ（Ｒ51）−（Ｒ51がアルキル基であ
る）である場合が好ましい。Ｒ５１は低級アルキル基で
あることが好ましく、該アルキル基は同一でも異なって
いてもよく、メチル基であることがさらに好ましい。
【００１５】Ｒ51が示すアミノ基で置換された低級アル
キル基は、上記に説明した低級アルキル基の任意の位置
に１個又は２個以上のアミノ基を有していてもよいが、
アルキル基の末端に１個のアミノ基を有しているほうが
好ましい。該アミノ基は、１個の低級アルキル基、又は
同一若しくは異なる２個のアルキル基で置換されていて
もよい。また、低級アルキルスルホニル基又はアリール
スルホニル基で置換されていてもよい。アリールスルホ
ニル基としては、置換又は無置換のベンゼンスルホニル
基、置換又は無置換のナフタレンスルホニル基などを挙
げることができる。アリール基上の置換基の個数、種
類、及び置換位置は特に限定されないが、置換基として
は、例えば、低級アルキル基、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6
のアルコキシル基、水酸基などを挙げることができる。
窒素原子上に存在することがある水酸基で置換された低
級アルキル基は、炭素数が２個以上の低級アルキル基の
任意の位置に１個又は２個以上の水酸基を有していても
よいが、アルキル基の末端に１個の水酸基を有している
ことが好ましい。
キル基は、上記に説明した低級アルキル基の任意の位置
に１個又は２個以上のアミノ基を有していてもよいが、
アルキル基の末端に１個のアミノ基を有しているほうが
好ましい。該アミノ基は、１個の低級アルキル基、又は
同一若しくは異なる２個のアルキル基で置換されていて
もよい。また、低級アルキルスルホニル基又はアリール
スルホニル基で置換されていてもよい。アリールスルホ
ニル基としては、置換又は無置換のベンゼンスルホニル
基、置換又は無置換のナフタレンスルホニル基などを挙
げることができる。アリール基上の置換基の個数、種
類、及び置換位置は特に限定されないが、置換基として
は、例えば、低級アルキル基、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6
のアルコキシル基、水酸基などを挙げることができる。
窒素原子上に存在することがある水酸基で置換された低
級アルキル基は、炭素数が２個以上の低級アルキル基の
任意の位置に１個又は２個以上の水酸基を有していても
よいが、アルキル基の末端に１個の水酸基を有している
ことが好ましい。
【００１６】Ｒ41、Ｒ42、Ｒ43、Ｒ44、及びＲ45が示す
アミノ基で置換された低級アルキル基、又は水酸基で置
換された低級アルキル基は上記に説明したものを用いる
ことができる。Ｙとしては、上記の式(IV)で表される基
であることが好ましく、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ
（ＣＨ3）−であることがさらに好ましい。
アミノ基で置換された低級アルキル基、又は水酸基で置
換された低級アルキル基は上記に説明したものを用いる
ことができる。Ｙとしては、上記の式(IV)で表される基
であることが好ましく、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ
（ＣＨ3）−であることがさらに好ましい。
【００１７】式（Ｉ）又は式（II）で表される本発明の
化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することが
できる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、
硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トル
エンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩
などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩と
しては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マ
グネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリ
エチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることが
できる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩
を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水
和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これら
の物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することが
できる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、
硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トル
エンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩
などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩と
しては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マ
グネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリ
エチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることが
できる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩
を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水
和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これら
の物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００１８】式（Ｉ）又は式（II）で表される本発明の
化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不
斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉
炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づく
ジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性
体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の
範囲に包含される。また、互変異性体が存在する場合が
あるが、互変異性体がいずれも本発明の範囲に包含され
ることはいうまでもない。
化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不
斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉
炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づく
ジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性
体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の
範囲に包含される。また、互変異性体が存在する場合が
あるが、互変異性体がいずれも本発明の範囲に包含され
ることはいうまでもない。
【００１９】本発明の化合物の代表的化合物の製造方法
を、下記のスキームに示す。また、本明細書の実施例に
は、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具
体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明
を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適
宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加
えることによって、式（Ｉ）又は式（II）で表される本
発明の化合物をいずれも製造することができる。なお、
下記のスキーム中に記載された化合物２及び３はOrg. S
ynth., 58, 86, 1979に記載されており、化合物11、1
2、及び13はJ. Chem. Soc. (Lond.), 3982, 1955に記載
されている。また、化合物16、17、及び18はProc. Indi
an Acad. Sci. Sect. A, 57, 280, 1963に記載されてお
り、化合物14及び19はJ. Biol. Chem., 264, 8171, 198
9に記載されており、化合物22はBer.Dtsch. Chem. Ge
s., 46. 1931-1943, 1913に記載されている。
を、下記のスキームに示す。また、本明細書の実施例に
は、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具
体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明
を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適
宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加
えることによって、式（Ｉ）又は式（II）で表される本
発明の化合物をいずれも製造することができる。なお、
下記のスキーム中に記載された化合物２及び３はOrg. S
ynth., 58, 86, 1979に記載されており、化合物11、1
2、及び13はJ. Chem. Soc. (Lond.), 3982, 1955に記載
されている。また、化合物16、17、及び18はProc. Indi
an Acad. Sci. Sect. A, 57, 280, 1963に記載されてお
り、化合物14及び19はJ. Biol. Chem., 264, 8171, 198
9に記載されており、化合物22はBer.Dtsch. Chem. Ge
s., 46. 1931-1943, 1913に記載されている。
【００２０】
【化８】
【００２１】
【化９】
【００２２】
【化１０】
【００２３】
【化１１】
【００２４】式（Ｉ）又は式（II）で表される本発明の
化合物又はそれらの塩は、亜鉛蛍光プローブとして有用
である。本発明の化合物は、それ自体は強い蛍光を発す
る性質を有していないが、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯
体を形成すると、強い蛍光を発するようになる。本発明
の化合物は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、
生体組織や細胞に障害を生じない長波長領域の励起光に
よって強い蛍光を発するので、生細胞や生組織中の亜鉛
イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブ
として極めて有用である。なお、本明細書において用い
られる「測定」という用語については、定量及び定性を
含めて最も広義に解釈すべきものである。
化合物又はそれらの塩は、亜鉛蛍光プローブとして有用
である。本発明の化合物は、それ自体は強い蛍光を発す
る性質を有していないが、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯
体を形成すると、強い蛍光を発するようになる。本発明
の化合物は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、
生体組織や細胞に障害を生じない長波長領域の励起光に
よって強い蛍光を発するので、生細胞や生組織中の亜鉛
イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブ
として極めて有用である。なお、本明細書において用い
られる「測定」という用語については、定量及び定性を
含めて最も広義に解釈すべきものである。
【００２５】本発明の亜鉛蛍光プローブの使用方法は特
に限定されず、従来公知の亜鉛プローブと同様に用いる
ことが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの
水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコ
ール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドな
どの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに式
（Ｉ）及び式（II）で表される化合物並びにそれらの塩
からなる群から選ばれる一の物質を溶解し、細胞や組織
を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペ
クトルを測定すればよい。例えば、上記スキーム中の化
合物20及び21は、それぞれ励起波長が495nm及び505nm、
蛍光波長が515nm及び525nmであり、１〜10μＭ程度の濃
度で用いた場合に10μＭ以下の濃度の亜鉛イオンを測定
することが可能である。なお、本発明の亜鉛蛍光プロー
ブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いて
もよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤などの
添加物と組み合わせることができる。
に限定されず、従来公知の亜鉛プローブと同様に用いる
ことが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの
水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコ
ール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドな
どの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに式
（Ｉ）及び式（II）で表される化合物並びにそれらの塩
からなる群から選ばれる一の物質を溶解し、細胞や組織
を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペ
クトルを測定すればよい。例えば、上記スキーム中の化
合物20及び21は、それぞれ励起波長が495nm及び505nm、
蛍光波長が515nm及び525nmであり、１〜10μＭ程度の濃
度で用いた場合に10μＭ以下の濃度の亜鉛イオンを測定
することが可能である。なお、本発明の亜鉛蛍光プロー
ブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いて
もよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤などの
添加物と組み合わせることができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。実施例中の化合物番号は、上記のスキーム
中の化合物番号に対応している。 例１：本発明の化合物の製造 N-フェニルジエタノールアミン(4) 15.3 g (84.4 mmol)
を100 mlのピリジンに溶解した溶液に、70 mlのピリジ
ンに溶解したp-トルエンスルホニルクロリド 33.9g (17
8 mmol)を、氷冷下で30分間かけて滴下した。滴下後、
氷冷下で２時間撹拌し、その後、反応液に200 mlの水を
加え、終夜撹拌した。析出した固体を濾取して塩化メチ
レンに溶解し、この溶液を水、飽和食塩水で洗浄後、硫
酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物
(5) 37.5 gを得た。淡黄色固体。収率90.8%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ2.42 (s, 6H), 3.56 (t, 4
H, J=6.0Hz), 4.10 (t,4H, J=6.0Hz), 6.49 (d, 2H, J=
8.1Hz), 6.74 (t, 1H, J=7.3Hz), 7.15 (m, 2H), 7.27
(d, 4H, J=8.2Hz), 7.70 (d, 4H, J=8.2Hz)MS(FAB): 49
0(M++1) m.p.:89℃ (ジエチルエーテル)
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。実施例中の化合物番号は、上記のスキーム
中の化合物番号に対応している。 例１：本発明の化合物の製造 N-フェニルジエタノールアミン(4) 15.3 g (84.4 mmol)
を100 mlのピリジンに溶解した溶液に、70 mlのピリジ
ンに溶解したp-トルエンスルホニルクロリド 33.9g (17
8 mmol)を、氷冷下で30分間かけて滴下した。滴下後、
氷冷下で２時間撹拌し、その後、反応液に200 mlの水を
加え、終夜撹拌した。析出した固体を濾取して塩化メチ
レンに溶解し、この溶液を水、飽和食塩水で洗浄後、硫
酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物
(5) 37.5 gを得た。淡黄色固体。収率90.8%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3) :δ2.42 (s, 6H), 3.56 (t, 4
H, J=6.0Hz), 4.10 (t,4H, J=6.0Hz), 6.49 (d, 2H, J=
8.1Hz), 6.74 (t, 1H, J=7.3Hz), 7.15 (m, 2H), 7.27
(d, 4H, J=8.2Hz), 7.70 (d, 4H, J=8.2Hz)MS(FAB): 49
0(M++1) m.p.:89℃ (ジエチルエーテル)
【００２７】化合物(3) 41.3 g (67.8 mmol)を 300 ml
の無水ジメチルホルムアミドに溶解した溶液を、アルゴ
ン下で100℃まで加熱し、120 mlの無水ジメチルホルム
アミドに溶解した化合物(5) 36.5 g (74.6 mmol)を1.5
時間かけて滴下した。滴下後、100℃で１時間撹拌し、
反応液を室温まで冷却した後、500 mlの水を加え、氷冷
下に４時間撹拌した。析出した固体を濾取して塩化メチ
レンに溶解し、この溶液を、水、飽和食塩水で洗浄後、
硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、粗化合
物(6)を得た。シリカゲルカラムにより精製し、化合物
(6) 29.9gを得た。白色固体。収率 62.1%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.44 (s, 9H), 3.22 (m, 4
H), 3.31 (m, 4H), 3.39(t,4H,J=5.0Hz), 3.75 (t, 4H,
J=5.0Hz), 6.79-6.74 (m, 3H), 7.23 (m, 1H),7.32
(d, 2H, J=8.4Hz), 7.33 (d, 4H, J=8.1Hz), 7.68 (d,
4H, J=8.1Hz), 7.69 (d, 2H, J=8.4Hz) MS(FAB): 711(M++1) Anal. Calcd for C35H42N4O6S3 : C, 59.13; H, 5.95;
N, 7.88. Found : C, 58.57; H, 5.84; N, 7.88. m.p.178℃ (メタノール)
の無水ジメチルホルムアミドに溶解した溶液を、アルゴ
ン下で100℃まで加熱し、120 mlの無水ジメチルホルム
アミドに溶解した化合物(5) 36.5 g (74.6 mmol)を1.5
時間かけて滴下した。滴下後、100℃で１時間撹拌し、
反応液を室温まで冷却した後、500 mlの水を加え、氷冷
下に４時間撹拌した。析出した固体を濾取して塩化メチ
レンに溶解し、この溶液を、水、飽和食塩水で洗浄後、
硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、粗化合
物(6)を得た。シリカゲルカラムにより精製し、化合物
(6) 29.9gを得た。白色固体。収率 62.1%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.44 (s, 9H), 3.22 (m, 4
H), 3.31 (m, 4H), 3.39(t,4H,J=5.0Hz), 3.75 (t, 4H,
J=5.0Hz), 6.79-6.74 (m, 3H), 7.23 (m, 1H),7.32
(d, 2H, J=8.4Hz), 7.33 (d, 4H, J=8.1Hz), 7.68 (d,
4H, J=8.1Hz), 7.69 (d, 2H, J=8.4Hz) MS(FAB): 711(M++1) Anal. Calcd for C35H42N4O6S3 : C, 59.13; H, 5.95;
N, 7.88. Found : C, 58.57; H, 5.84; N, 7.88. m.p.178℃ (メタノール)
【００２８】細かく砕いた化合物(6) 28.3 g (39.8 mmo
l)を無水n-ブタノール900 mlに加え、続いてナトリウム
40 g (1.74 mol)を加え、ナトリウム片が消えるまで還
流した。室温まで冷却後、更に 40 g (1.74 mol)のナト
リウムを加え、再びナトリウム片が消えるまで還流し
た。室温まで冷却後、氷冷下１リットルの水を少しずつ
加えた。n-ブタノール層を、0.5N水酸化ナトリウムで洗
浄した後に、2N塩酸で抽出した。2N塩酸層をジエチルエ
ーテルで洗浄した後に、水酸化ナトリウムを加えてアル
カリ性にして、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和
食塩水で洗浄した後、炭酸カリウムで乾燥した。溶媒を
減圧留去し、化合物(7) 6.60gを得た。褐色オイル。収
率66.8%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.63 (t, 4H, J=4.8Hz),
2.77-2.84 (m, 8H), 3.38(t, 4H, J=5.0Hz), 6.82 (t,
1H, J=7.3Hz), 6.98 (d, 2H, J=8.1Hz), 7.23 (m, 2H) MS(FAB): 249(M++1)
l)を無水n-ブタノール900 mlに加え、続いてナトリウム
40 g (1.74 mol)を加え、ナトリウム片が消えるまで還
流した。室温まで冷却後、更に 40 g (1.74 mol)のナト
リウムを加え、再びナトリウム片が消えるまで還流し
た。室温まで冷却後、氷冷下１リットルの水を少しずつ
加えた。n-ブタノール層を、0.5N水酸化ナトリウムで洗
浄した後に、2N塩酸で抽出した。2N塩酸層をジエチルエ
ーテルで洗浄した後に、水酸化ナトリウムを加えてアル
カリ性にして、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和
食塩水で洗浄した後、炭酸カリウムで乾燥した。溶媒を
減圧留去し、化合物(7) 6.60gを得た。褐色オイル。収
率66.8%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.63 (t, 4H, J=4.8Hz),
2.77-2.84 (m, 8H), 3.38(t, 4H, J=5.0Hz), 6.82 (t,
1H, J=7.3Hz), 6.98 (d, 2H, J=8.1Hz), 7.23 (m, 2H) MS(FAB): 249(M++1)
【００２９】化合物(7) 5.00 g (20.2 mmol)をメタノー
ル 300 mlに溶かし、37% ホルムアルデヒド溶液 50 ml
を加え、続いてシアノ水素化ほう素ナトリウム 13.4 g
(213 mmol)を少しずつ加えた。室温で２時間撹拌した
後、酢酸を加えて溶液のpHを中性にして、さらに室温で
３時間撹拌した。メタノールを減圧留去して、残渣を2N
水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、塩化メチレンで抽出
した。塩化メチレン層を0.5N水酸化ナトリウムで洗浄し
た後、2N塩酸で抽出した。2N塩酸層に水酸化ナトリウム
を加えてアルカリ性にし、塩化メチレンで抽出した。塩
化メチレン層を飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾
燥した。塩化メチレンを減圧下留去し、粗化合物(8)を
得た。アルミナカラムにより精製し、化合物(8) 1.53g
を得た。褐色オイル。収率26.1%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.25 (s, 3H), 2.31 (s, 6
H), 2.53 (m, 8H), 2.80(t, 4H, J=5.9Hz), 3.51 (t, 4
H, J=5.9Hz), 6.63 (m, 3H), 7.19 (dd, 2H, J=7.2, 8.
8Hz) MS(EI): 290(M+)
ル 300 mlに溶かし、37% ホルムアルデヒド溶液 50 ml
を加え、続いてシアノ水素化ほう素ナトリウム 13.4 g
(213 mmol)を少しずつ加えた。室温で２時間撹拌した
後、酢酸を加えて溶液のpHを中性にして、さらに室温で
３時間撹拌した。メタノールを減圧留去して、残渣を2N
水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、塩化メチレンで抽出
した。塩化メチレン層を0.5N水酸化ナトリウムで洗浄し
た後、2N塩酸で抽出した。2N塩酸層に水酸化ナトリウム
を加えてアルカリ性にし、塩化メチレンで抽出した。塩
化メチレン層を飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾
燥した。塩化メチレンを減圧下留去し、粗化合物(8)を
得た。アルミナカラムにより精製し、化合物(8) 1.53g
を得た。褐色オイル。収率26.1%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 2.25 (s, 3H), 2.31 (s, 6
H), 2.53 (m, 8H), 2.80(t, 4H, J=5.9Hz), 3.51 (t, 4
H, J=5.9Hz), 6.63 (m, 3H), 7.19 (dd, 2H, J=7.2, 8.
8Hz) MS(EI): 290(M+)
【００３０】化合物(8) 501 mg (1.73 mmol)をジオキサ
ン 20 mlと水 10 mlに溶解した溶液に、5N水酸化カリウ
ム水溶液を0.38 ml加えた。氷冷下、臭素 105 ml (2.04
mmol)をジオキサン 8 ml に溶解した溶液を２時間かけ
て滴下し、滴下後、反応液を氷冷下で１時間撹拌した。
溶媒を減圧留去し、残渣を塩化メチレンに懸濁した。塩
化メチレン層を0.5N水酸化ナトリウムで洗浄した後、2N
塩酸で抽出した。2N塩酸層をジエチルエーテルで洗浄し
た後、水酸化ナトリウムを加えてアルカリ性にし、塩化
メチレンで抽出した。塩化メチレン層を飽和食塩水で洗
浄した後、炭酸カリウムで乾燥した。塩化メチレンを減
圧留去し、化合物(9) 572mgを得た。褐色オイル。収率8
9.6%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ2.17-2.23 (m, 8H), 2.43
(s, 3H), 2.44 (s, 6H),2.69 (t, 4H, J=6.0Hz), 3.39
(t, 4H, J=6.0Hz), 6.44 (d, 2H, J=9.2Hz), 7.17 (d,
2H, J=9.2Hz) MS(EI+): 368, 370 (1:1)(M+)
ン 20 mlと水 10 mlに溶解した溶液に、5N水酸化カリウ
ム水溶液を0.38 ml加えた。氷冷下、臭素 105 ml (2.04
mmol)をジオキサン 8 ml に溶解した溶液を２時間かけ
て滴下し、滴下後、反応液を氷冷下で１時間撹拌した。
溶媒を減圧留去し、残渣を塩化メチレンに懸濁した。塩
化メチレン層を0.5N水酸化ナトリウムで洗浄した後、2N
塩酸で抽出した。2N塩酸層をジエチルエーテルで洗浄し
た後、水酸化ナトリウムを加えてアルカリ性にし、塩化
メチレンで抽出した。塩化メチレン層を飽和食塩水で洗
浄した後、炭酸カリウムで乾燥した。塩化メチレンを減
圧留去し、化合物(9) 572mgを得た。褐色オイル。収率8
9.6%。1 H-NMR (300MHz, CDCl3):δ2.17-2.23 (m, 8H), 2.43
(s, 3H), 2.44 (s, 6H),2.69 (t, 4H, J=6.0Hz), 3.39
(t, 4H, J=6.0Hz), 6.44 (d, 2H, J=9.2Hz), 7.17 (d,
2H, J=9.2Hz) MS(EI+): 368, 370 (1:1)(M+)
【００３１】化合物(9) 299 mg (0.81 mmol)を無水2-メ
チルテトラヒドロフラン 20 mlに加え、アルゴン下液体
窒素-イソペンタン浴中で-150℃まで冷やし、1.64N ter
t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液2.85 ml を加えた。TL
Cで原料の消失を確認した後、化合物(14) 719 mg (1.58
mmol) を25 mlのテトラヒドロフランに溶解した溶液を
少しずつ加えた。-150℃で１時間撹拌した後、反応液を
室温まで戻した。反応液に水20 mlとテトラヒドロフラ
ン10 mlの混合液を加えた後に、溶媒を減圧留去した。
残渣に2N塩酸 10 mlを加え、遮光して室温で１時間撹拌
した。塩酸溶液をジエチルエーテルで洗浄した後、水酸
化ナトリウムを加えてアルカリ性にし、再び水層をジエ
チルエーテルで洗浄した。2N塩酸、2N水酸化ナトリウム
を用いてpHを7〜8に調節し、析出してきた固体を濾取し
て粗化合物(20)を得た。オクタデシルカラムにより精製
し、化合物(20) 90.7 mgを得た。茶色固体。収率22.4
%。1 H-NMR (300MHz, DMSO-d6+D2O):δ 2.16 (s, 3H), 2.61
(m, 10H), 2.85 (m, 4H), 2.99 (m, 4H), 3.72 (m, 4
H), 6.28 (d, 2H, J=2.0Hz), 6.37 (dd, 2H, J=2.0,9.3
Hz), 6.87 (d, 2H, J=8.8Hz), 7.04 (d, 2H, J=9.3Hz),
7.27 (d, 2H, J=8.6Hz) MS(FAB): 501(M++1) m.p.:189℃
チルテトラヒドロフラン 20 mlに加え、アルゴン下液体
窒素-イソペンタン浴中で-150℃まで冷やし、1.64N ter
t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液2.85 ml を加えた。TL
Cで原料の消失を確認した後、化合物(14) 719 mg (1.58
mmol) を25 mlのテトラヒドロフランに溶解した溶液を
少しずつ加えた。-150℃で１時間撹拌した後、反応液を
室温まで戻した。反応液に水20 mlとテトラヒドロフラ
ン10 mlの混合液を加えた後に、溶媒を減圧留去した。
残渣に2N塩酸 10 mlを加え、遮光して室温で１時間撹拌
した。塩酸溶液をジエチルエーテルで洗浄した後、水酸
化ナトリウムを加えてアルカリ性にし、再び水層をジエ
チルエーテルで洗浄した。2N塩酸、2N水酸化ナトリウム
を用いてpHを7〜8に調節し、析出してきた固体を濾取し
て粗化合物(20)を得た。オクタデシルカラムにより精製
し、化合物(20) 90.7 mgを得た。茶色固体。収率22.4
%。1 H-NMR (300MHz, DMSO-d6+D2O):δ 2.16 (s, 3H), 2.61
(m, 10H), 2.85 (m, 4H), 2.99 (m, 4H), 3.72 (m, 4
H), 6.28 (d, 2H, J=2.0Hz), 6.37 (dd, 2H, J=2.0,9.3
Hz), 6.87 (d, 2H, J=8.8Hz), 7.04 (d, 2H, J=9.3Hz),
7.27 (d, 2H, J=8.6Hz) MS(FAB): 501(M++1) m.p.:189℃
【００３２】化合物(9) 300 mg (0.81 mmol)を無水2-メ
チルテトラヒドロフラン 30 mlに加え、アルゴン下液体
窒素-イソペンタン浴中で-150℃まで冷やし、1.54N t-
ブチルリチウムn-ペンタン溶液 2.50 mlを加えた。TLC
で原料の消失を確認した後、化合物(19) 500 mg (0.95
mmol) を10 mlのテトラヒドロフランに溶解した溶液を
少しずつ加えた。-150℃で１時間撹拌後、反応液を室温
まで戻した。反応液に水20 mlとテトラヒドロフラン 10
mlの混合液を加えた後に、溶媒を減圧留去した。残査
に2N塩酸 10 mlを加え、遮光して室温下１時間撹拌し
た。塩酸溶液をジエチルエーテルで洗浄した後、水酸化
ナトリウムを加えてアルカリ性にし、塩化メチレン-メ
タノール（5:1）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗
浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、粗
化合物(21)を得た。オクタデシルカラムにより精製し、
化合物(21)を得た。褐色固体。収率1.2%。1 H-NMR (300MHz, CD3OD):δ 2.26 (s, 3H), 2.66-2.69
(m, 4H), 2.68 (s, 6H),2.89-2.93 (m, 4H), 3.09 (m,
4H), 3.79 (m, 4H), 6.54 (s, 2H), 6.96 (d, 2H, J=8.
8Hz), 7.29 (s, 2H), 7.31 (d, 2H, J=8.8Hz) MS(FAB) 569, 571, 573 (M++1) m.p.:230℃
チルテトラヒドロフラン 30 mlに加え、アルゴン下液体
窒素-イソペンタン浴中で-150℃まで冷やし、1.54N t-
ブチルリチウムn-ペンタン溶液 2.50 mlを加えた。TLC
で原料の消失を確認した後、化合物(19) 500 mg (0.95
mmol) を10 mlのテトラヒドロフランに溶解した溶液を
少しずつ加えた。-150℃で１時間撹拌後、反応液を室温
まで戻した。反応液に水20 mlとテトラヒドロフラン 10
mlの混合液を加えた後に、溶媒を減圧留去した。残査
に2N塩酸 10 mlを加え、遮光して室温下１時間撹拌し
た。塩酸溶液をジエチルエーテルで洗浄した後、水酸化
ナトリウムを加えてアルカリ性にし、塩化メチレン-メ
タノール（5:1）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗
浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、粗
化合物(21)を得た。オクタデシルカラムにより精製し、
化合物(21)を得た。褐色固体。収率1.2%。1 H-NMR (300MHz, CD3OD):δ 2.26 (s, 3H), 2.66-2.69
(m, 4H), 2.68 (s, 6H),2.89-2.93 (m, 4H), 3.09 (m,
4H), 3.79 (m, 4H), 6.54 (s, 2H), 6.96 (d, 2H, J=8.
8Hz), 7.29 (s, 2H), 7.31 (d, 2H, J=8.8Hz) MS(FAB) 569, 571, 573 (M++1) m.p.:230℃
【００３３】例２：亜鉛イオンに対する選択性 上記例１で得た化合物20及び化合物21を用いて、亜鉛イ
オンに対する選択性を評価した。種々の金属イオン（5
μM又は5 mM）を含む100 mM HEPES (pH 7.5)中に5μMの
化合物20又は21を加え、蛍光強度を測定した。化合物20
については励起波長 495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化
合物21については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmと
して蛍光スペクトルを測定した。結果を図１及び図２に
示す。図中、縦軸の蛍光強度は、金属イオンを加えてい
ないときの蛍光強度を１として、各金属イオンを加えた
ときの蛍光強度を数値で示したものである。これらの結
果から、本発明の化合物が亜鉛イオンに対して極めて高
い選択性を有しており、生体内に多量に存在するナトリ
ウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどの
存在下では、全く蛍光強度が増加しないことが明らかで
ある。
オンに対する選択性を評価した。種々の金属イオン（5
μM又は5 mM）を含む100 mM HEPES (pH 7.5)中に5μMの
化合物20又は21を加え、蛍光強度を測定した。化合物20
については励起波長 495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化
合物21については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmと
して蛍光スペクトルを測定した。結果を図１及び図２に
示す。図中、縦軸の蛍光強度は、金属イオンを加えてい
ないときの蛍光強度を１として、各金属イオンを加えた
ときの蛍光強度を数値で示したものである。これらの結
果から、本発明の化合物が亜鉛イオンに対して極めて高
い選択性を有しており、生体内に多量に存在するナトリ
ウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどの
存在下では、全く蛍光強度が増加しないことが明らかで
ある。
【００３４】例３：亜鉛蛍光プローブの検出感度 亜鉛蛍光プローブとして使われているNewport Green (H
andbook of FluorescentProbes and Research Chemical
s, 6th Edition by Richard P. Haugland, pp.531-540)
と本発明の亜鉛蛍光プローブの測定感度を比較した。種
々の濃度の亜鉛イオン（10μMまで）を含む100 mM HEPE
S (pH 7.5)中に5μMの化合物20、化合物21、又はNewpor
t Greenを加え、蛍光強度を測定した。化合物20につい
ては励起波長 495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化合物21
については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmとし、Ne
wport Greenについては励起波長 505 nm、蛍光波長 530
nmとして蛍光スペクトルを測定した。結果を図３に示
す。図中、縦軸の蛍光強度は、金属イオンを加えていな
いときの蛍光強度を１として、各金属イオンを加えたと
きの蛍光強度を数値で示したものである。この結果から
明らかなように、本発明の化合物は、従来亜鉛蛍光プロ
ーブとして用いられているNewport Greenに比べて、は
るかに高い検出感度を有している。
andbook of FluorescentProbes and Research Chemical
s, 6th Edition by Richard P. Haugland, pp.531-540)
と本発明の亜鉛蛍光プローブの測定感度を比較した。種
々の濃度の亜鉛イオン（10μMまで）を含む100 mM HEPE
S (pH 7.5)中に5μMの化合物20、化合物21、又はNewpor
t Greenを加え、蛍光強度を測定した。化合物20につい
ては励起波長 495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化合物21
については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmとし、Ne
wport Greenについては励起波長 505 nm、蛍光波長 530
nmとして蛍光スペクトルを測定した。結果を図３に示
す。図中、縦軸の蛍光強度は、金属イオンを加えていな
いときの蛍光強度を１として、各金属イオンを加えたと
きの蛍光強度を数値で示したものである。この結果から
明らかなように、本発明の化合物は、従来亜鉛蛍光プロ
ーブとして用いられているNewport Greenに比べて、は
るかに高い検出感度を有している。
【００３５】例４：亜鉛蛍光プローブの蛍光強度 化合物20及び21について、亜鉛イオン濃度と蛍光強度と
の相関関係を調べた。種々の濃度の亜鉛イオン（10μM
まで）を含む100 mM CAPS (pH 10.0)中に5μMの化合物2
0又は化合物21を加え、蛍光強度を測定した。化合物20
については励起波長495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化
合物21については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmと
して蛍光スペクトルを測定した。結果を図４及び５に示
す。両化合物とも亜鉛イオンの濃度に依存して蛍光強度
が上昇し、化合物に対して１当量以上の亜鉛イオンの存
在下では、蛍光強度が一定になることが認められた。こ
の結果は、本発明の化合物が亜鉛と１：１の錯体を形成
していることを示している。
の相関関係を調べた。種々の濃度の亜鉛イオン（10μM
まで）を含む100 mM CAPS (pH 10.0)中に5μMの化合物2
0又は化合物21を加え、蛍光強度を測定した。化合物20
については励起波長495 nm、蛍光波長 515 nmとし、化
合物21については励起波長 505 nm、蛍光波長 525 nmと
して蛍光スペクトルを測定した。結果を図４及び５に示
す。両化合物とも亜鉛イオンの濃度に依存して蛍光強度
が上昇し、化合物に対して１当量以上の亜鉛イオンの存
在下では、蛍光強度が一定になることが認められた。こ
の結果は、本発明の化合物が亜鉛と１：１の錯体を形成
していることを示している。
【図１】 本発明の亜鉛蛍光プローブ（化合物20）が亜
鉛イオンに対して優れた選択性を有していることを示し
た図である。
鉛イオンに対して優れた選択性を有していることを示し
た図である。
【図２】 本発明の亜鉛蛍光プローブ（化合物21）が亜
鉛イオンに対して優れた選択性を有していることを示し
た図である。
鉛イオンに対して優れた選択性を有していることを示し
た図である。
【図３】 本発明の亜鉛蛍光プローブ（化合物20及び2
1）の蛍光強度を従来公知の亜鉛蛍光プローブ（Newport
Green）と比較した結果を示す図である。
1）の蛍光強度を従来公知の亜鉛蛍光プローブ（Newport
Green）と比較した結果を示す図である。
【図４】 本発明の亜鉛蛍光プローブ（化合物20）の蛍
光強度と亜鉛イオン濃度との関係を示した図である。
光強度と亜鉛イオン濃度との関係を示した図である。
【図５】 本発明の亜鉛蛍光プローブ（化合物21）の蛍
光強度と亜鉛イオン濃度との関係を示した図である。
光強度と亜鉛イオン濃度との関係を示した図である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BC11 CA10 CB10 DA06 DA08 FA06 FA11 2G045 AA24 AA25 BB25 BB60 CB01 DB12 FA11 FB07 FB12 GC15 2G054 AA08 AB07 CA10 EA03 EA06 GA04 GB04 GB05 4C063 AA01 BB06 CC59 CC67 CC79 DD47 DD79 EE10 4H048 AA01 AA03 AB92 VA67 VB10
Claims (8)
- 【請求項1】 下記の一般式（Ｉ）又は（II）： 【化１】 〔式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6はそ
れぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又は
低級アルキル基を示し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水
素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示し；式
（II）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16は
それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、又
は低級アルキル基を示し；Ｒ17及びＲ18はそれぞれ独立
に水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基を示
し；Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24はそれぞれ独立に水素
原子又は低級アルキル基を示し；式（Ｉ）及び式（II）
中、Ｙは下記の式（III）ないし（Ｖ）： 【化２】 ［式中、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、及びＺ4はそれぞれ独立に−Ｎ
（Ｒ51）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を示すが、Ｚ1、Ｚ2、
Ｚ3、及びＺ4のうちの少なくとも１つは−Ｎ（Ｒ 51）−
を示し、Ｒ51は水素原子、低級アルキル基、１若しくは
２個以上のアミノ基で置換された低級アルキル基（該ア
ミノ基は低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、
又はアリールスルホニル基で置換されていてもよい）、
又は１若しくは２個以上の水酸基で置換された低級アル
キル基を示し；ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、及びｒはそれぞれ独立
に２又は３の整数を示す］で表される基を示すか、又は
式（VI）：−Ｎ（Ｒ31）（Ｒ32） [式中、Ｒ31及びＲ32はそれぞれ独立に下記の式（VII）
ないし（X）： 【化３】 ［式中、Ｒ41、Ｒ42、Ｒ43、Ｒ44、及びＲ45はそれぞれ
独立に水素原子、低級アルキル基、１若しくは２個以上
のアミノ基で置換された低級アルキル基（該アミノ基は
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基、又はアリ
ールスルホニル基で置換されていてもよい）、又は１若
しくは２個以上の水酸基で置換された低級アルキル基を
示し；ｓ、ｔ、ｕ、及びｖはそれぞれ独立に２又は３の
整数を示す］で表される基及び水素原子からなる群から
選ばれる置換基を示すが、Ｒ31及びＲ32が同時に水素原
子を示すことはない]で表される基を示す〕で表される
化合物又はその塩。 - 【請求項２】 Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が水素原子であ
り、Ｒ2及びＲ5がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン
原子であり、Ｒ7及びＲ8が水素原子であり、Ｙが上記式
（IV）〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3がそれぞれ独立に−
Ｎ（Ｒ51）−（Ｒ5 1は低級アルキル基を示す）であり、
ｍ、ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基である請
求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。 - 【請求項３】 Ｒ2及びＲ5がともに水素原子であるか、
又はともにハロゲン原子であり、Ｙが上記式（IV）（式
中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）−である）
である請求項２に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項４】 Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ16が水素原子
であり、Ｒ12及びＲ15がそれぞれ独立に水素原子又はハ
ロゲン原子であり、Ｒ17及びＲ18が水素原子であり、Ｒ
21、Ｒ22、Ｒ23、及びＲ24が水素原子であり、Ｙが上記
式（IV）〔式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3がそれぞれ独立に
−Ｎ（Ｒ51）−（Ｒ51は低級アルキル基を示す）であ
り、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑが２である〕で表される基であ
る請求項１に記載の式（II）で表される化合物又はその
塩。 - 【請求項５】 Ｒ12及びＲ15がともに水素原子である
か、又はともにハロゲン原子であり、Ｙが上記式（IV）
（式中、Ｚ1、Ｚ2、及びＺ3が共に−Ｎ（ＣＨ3）−であ
る）である請求項４に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれか１項に記載
の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ。 - 【請求項７】 請求項１ないし５のいずれか１項に記載
の化合物又はその塩と亜鉛イオンとにより形成された亜
鉛錯体。 - 【請求項８】 亜鉛イオンの測定方法であって、下記の
工程： (a)請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物又
はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程；及び (b)上記工程(a)で生成した請求項７に記載の亜鉛錯体の
蛍光強度を測定する工程を含む方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4032599A JP4402191B2 (ja) | 1999-02-18 | 1999-02-18 | 亜鉛蛍光プローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4032599A JP4402191B2 (ja) | 1999-02-18 | 1999-02-18 | 亜鉛蛍光プローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000239272A true JP2000239272A (ja) | 2000-09-05 |
| JP4402191B2 JP4402191B2 (ja) | 2010-01-20 |
Family
ID=12577467
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4032599A Expired - Fee Related JP4402191B2 (ja) | 1999-02-18 | 1999-02-18 | 亜鉛蛍光プローブ |
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|---|---|
| JP (1) | JP4402191B2 (ja) |
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| US6903226B2 (en) | 2000-02-28 | 2005-06-07 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Fluorescent probe for the quantitation of zinc |
| WO2005080331A1 (ja) * | 2004-02-23 | 2005-09-01 | Tetsuo Nagano | 蛍光プローブ |
| JP2005325074A (ja) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Tokyo Univ Of Science | 化合物、化合物の製造方法及びアポトーシス細胞の検出方法 |
| WO2005121109A3 (en) * | 2004-06-10 | 2006-03-09 | Univ Hull | Novel antiviral macrocycle derivatives and metal complexes, incorporating bridged macrocycles |
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