JP4309253B2 - 亜鉛蛍光プローブ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、亜鉛イオンを特異的に捕捉するための蛍光プローブに関するものである。
背景技術
亜鉛はヒトの体内において鉄に次いで含量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛イオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在するフリーの亜鉛イオン（通常はμＭレベル以下である）の生理的役割についても、種々の報告がある。特に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛イオンが深く関わっていると考えられており、アルツハイマー病の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。
従来、組織内の亜鉛イオンを測定するために、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴って蛍光を発する化合物（亜鉛蛍光プローブ）が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、ＴＳＱ（Ｒｅｙｅｓ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，２７，４９，１９９４）、Ｚｉｎｑｕｉｎ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｔｓｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，６６７８，１９９７）、Ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｃｙｃｌｅｎ（Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，１２６８６，１９９６）、Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のカタログである”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｐｐ．５３１−５４０）などが実用化されている。
本発明者らは、ＴＳＱなどの亜鉛蛍光プローブの欠点を克服した高感度な亜鉛蛍光プローブとして、環状アミン又はポリアミンを置換基として有し、亜鉛イオンを捕捉して長波長領域の励起光で強い蛍光を発するプローブを提供しており（特開平２０００−２３９２７２号公報）、亜鉛イオンと瞬時に反応して蛍光性の錯体を形成し、生体内の亜鉛を極めて正確かつ高感度に測定できるプローブも提供している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，１２３９９−１２４００）。
一方、細胞に蛍光プローブを適用するときには、細胞内に導入される蛍光プローブの濃度が細胞の種類によってばらつく場合があり、また細胞膜の厚さの違いによって測定部位でも蛍光強度に差が生じ、膜などの疎水性の高い部分に蛍光プローブが局在してしまう可能性があるなど、測定に影響を与える要因も多い。
これらの要因による測定誤差を減少させ、正確な定量的解析を行える方法としてレシオ（ｒａｔｉｏ）測定法が開発され使用されている（Ｋａｗａｎｉｓｈｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３９（１９），３４３８，２０００）。この方法は、蛍光スペクトル又は励起スペクトルにおいて異なる２波長での蛍光強度を測定してその比を検出する工程を含んでおり、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、１つの波長で観測を行った場合に生じる蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができる。
例えば、カルシウムイオンの測定用の蛍光プローブとしてＦｕｒａ ２（１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ペンタカリウム塩：Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ第２１版／総合カタログ、１３７〜１３８頁、１９９８年４月２０日発行、株式会社同仁化学研究所）が実用化されている。この化合物は、カルシウムイオン結合により励起波長のピークが低波長側にシフトする性質を有しており、３３５ｎｍ付近で励起した場合にはカルシウムイオン濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大するのに対して、３７０〜３８０ｎｍ付近で励起したときにはカルシウムイオン濃度の増加とともに蛍光強度が減少する。従って、この化合物を適当な２波長を用いて励起し、そのときの蛍光強度の比をとることにより、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なくカルシウムイオンを正確に測定できる。
また、前記Ｆｕｒａ ２あるいはその類似構造化合物がカルシウムイオン以外のイオンも捕捉してしまう性質を利用し、亜鉛イオン検出への応用を検討した報告もある（Ｈｙｒｃ Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，２７（２），７５，２０００）。
しかしながら、従来、亜鉛蛍光プローブに関しては、亜鉛イオンと特異的に結合して励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルのピークに十分な波長シフトを生じるプローブが開発されておらず、細胞中の亜鉛イオンを正確に測定するためにレシオ法を利用することができなかった。
発明の開示
本発明の課題は、高感度な亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物又はその塩を提供することにある。より具体的には、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルのピークに波長シフトを生じる化合物を提供することが本発明の課題である。また、本発明の課題は、亜鉛イオンをレシオ測定法により測定するための蛍光プローブとして利用可能な化合物を提供することにある。さらに本発明の別な課題は、上記の特徴を有する化合物を含む亜鉛蛍光プローブ、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物が亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スペクトルのピークに顕著な波長シフトを生じること、及び該化合物を用いてレシオ法により亜鉛イオンを極めて正確に測定できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はヒドロキシ基を示し；Ｒ２は下記の式（Ａ）：
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、又は２−ピリジルメチル基を示し、ｍ及びｎはそれぞれ独立に０又は１を示す）で表される基を示し；Ｙは単結合又は−ＣＯ−を示し；Ｒ３はカルボキシ置換アリール基、カルボキシ置換ヘテロアリール基、ベンゾチアゾール−２−イル基、又は５−オキソ−２−チオキソ−４−イミダゾリジニリデンメチル基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、ｍが０又は１であり、ｎが０である上記の化合物又はその塩；Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、ｍが１である場合にはＸ３が水素原子である上記の化合物又はその塩；Ｙが単結合である上記の化合物又はその塩；Ｒ１がメトキシ基である上記の化合物又はその塩；Ｒ３がカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基である上記の化合物又はその塩；アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基が保護基を有している上記の化合物又はその塩；保護基を有するカルボキシル基がメトキシカルボニル基又はアセトキシメチルオキシカルボニル基である上記の化合物又はその塩が提供される。
特に好ましい態様によれば、
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３がｐ−カルボキシフェニル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−カルボキシオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが０であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−カルボキシオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３がｐ−アセトキシメチルオキシカルボニルフェニル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；及び
ｍが０であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩
が提供される。
別の観点からは、上記の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ；上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとにより形成された亜鉛錯体；及び上記の化合物又はその塩を含む亜鉛イオンの測定用試薬が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
（ａ）上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程；及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法；及び測定をレシオ法により行う上記の方法が提供される。
また、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
（ａ）カルボキシル基が保護された上記の化合物又はその塩を細胞内に取り込ませる工程；
（ｂ）細胞内に取り込まれた該化合物又はその塩の加水分解により生じた化合物又はその塩（ただしそのカルボキシル基は保護基を有しない）と亜鉛イオンとの反応により生じた亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法；及び測定をイメージングにより行う上記の方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜１２個、好ましくは炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数１〜６個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。Ｒ１が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、Ｒ１が示すアルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。特に好ましいのはメトキシ基である。Ｒ２におけるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が示すアルキル基としてはメチル基が好ましい。
Ｒ３が示すカルボキシ置換アリール基におけるアリール基としては、単環性又は縮合環性のアリール基を用いることができ、例えばフェニル基又はナフチル基などが好ましい。特に好ましいのはフェニル基である。Ｒ３が示すカルボキシ置換ヘテロアリール基におけるヘテロアリール基としては、単環性又は縮合環性のヘテロアリール基を用いることができる。ヘテロアリール基に含まれるヘテロ原子の個数及び種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原子、及びイオウ原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個含んでいてもよい。ヘテロアリール基を構成するヘテロアリール化合物として、例えばオキサゾール、イミダゾール、チアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、又はベンゾチアゾールなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。ヘテロアリール基としてはオキサゾリル基が好ましい。
Ｒ３が示すカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基において、アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基の個数は特に限定されないが、好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基は保護基を有していてもよい。カルボキシル基の保護基については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９８１年）などを参照することができる。保護基を有するカルボキシル基の好ましい例としては、エステル類、特にアルコキシカルボニル基を挙げることができる。アルコキシカルボニル基の特に好ましい例としてメトキシカルボニル基を挙げることができる。また、膜透過性を高めたい場合には、カルボキシル基の保護基としてアセトキシメチル基を用い、保護基を有するカルボキシル基をアセトキシメチルオキシカルボニル基とすることが特に好ましい。アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基の位置は特に限定されないが、アリール基としてフェニル基を用いる場合にはパラ位が好ましい。
式（Ａ）で表される基において、ｍが０又は１であり、ｎが０であることが好ましい。この場合、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であることが好ましく、ｍが１である場合にはＸ３が水素原子であることが好ましい。Ｙは単結合又は−ＣＯ−を示すが、Ｙが単結合であることが好ましい。Ｙが単結合を示す場合には、Ｒ３がカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基であることが好ましく、より具体的にはＲ３がカルボキシ置換フェニル基又はカルボキシ置換オキサゾリル基であることが好ましい。
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
本発明の上記一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を、下記のスキームに示す。本明細書の実施例には、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鉛蛍光プローブとして有用である。上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、励起スペクトルのピークに顕著な波長シフトを生じる。この波長シフトは、亜鉛イオン濃度に応じて通常は約２０ｎｍ程度までの範囲で観測でき、他の金属イオン（例えばナトリウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンなど）の影響を受けずに亜鉛イオンに特異的な波長シフトとして観測できる。従って、本発明の化合物を亜鉛蛍光プローブとして用い、適当な異なる２波長を選択して励起し、その時の蛍光強度の比を測定することにより、亜鉛イオンをレシオ法によって測定することが可能になる。異なる２波長は、一方の波長において励起した場合に亜鉛イオン濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大し、かつ他方の波長において励起した場合には亜鉛イオン濃度の上昇とともに蛍光強度が減少するように選択することができる。レシオ法についてはＭａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．の著書（Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）などに詳細に記載されており、本明細書の実施例にも本発明の化合物を用いた測定方法の具体例を示した。
また、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。従って、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブとして極めて有用である。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。
本発明の亜鉛蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の亜鉛プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩からなる群から選ばれる物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、適宜選択された異なる２波長により励起して、それぞれの蛍光強度を測定すればよい。
例えば、上記スキーム中の化合物１１の励起波長は３５４ｎｍ、蛍光波長は５３２ｎｍであり、２０μＭで亜鉛蛍光プローブとして用いると２０μＭ程度の濃度までの亜鉛イオンを捕捉し、亜鉛イオンの濃度に依存して励起スペクトルのピークが２０ｎｍ程度ブルーシフトする。従って、この化合物をプローブとして用いる場合には、励起波長として例えば３３５ｎｍ及び３５４ｎｍを用い、それぞれの励起波長における蛍光強度を求めて比を算出すればよい。なお、本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中の化合物番号は、上記のスキーム中の化合物番号に対応している。
例１
化合物（２）をＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，６１１，ｐｐ．５８６−５９２に記載の方法に従って合成した。化合物（２）４．７ｇ（２９ｍｍｏｌ）をエタノール１５０ｍｌに溶かし、炭酸ナトリウム１２ｇ（０．１２ｍｏｌ）と２−（クロロメチル）ピリジン塩酸塩９．６ｇ（５８ｍｍｏｌ）を加え、１日加熱還流した。エタノールを減圧下留去し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に懸濁した後、ジクロロメタンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥し、ジクロロメタンを減圧下留去した。残渣をアルミナカラムにて精製して化合物（３）９．９ｇを得た（収率：定量的）。
褐色油状物質
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５５（ｍ，２Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．１６（ｍ，２Ｈ），５．８０（ｂｒ，１Ｈ），３．８７（ｓ，４Ｈ），３．２３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），２．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０）
化合物（３）１．１ｇをジクロロメタン２５ｍｌに溶かし、トリフルオロ酢酸２５ｍｌに氷冷下滴下した。室温で１時間撹拌し、４５℃でトリフルオロ酢酸を減圧下に留去した。残留物に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２５ｍｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をアルミナカラムで精製して化合物（４）０．６４ｇを得た（収率８５％）。
褐色油状物質。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５４（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８），７．１５（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｓ，４Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），１．４２（ｂｒ，２Ｈ）
２，５−ジメトキシブロモベンゼン（５）７．０ｍｌ（４７ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンに溶かした溶液に、アルゴン下−７８℃で塩化チタン（ＩＶ）１３ｍｌ（０．１２ｍｏｌ）、続いてジクロロメチルメチルエーテル８．２ｍｌ（０．１４ｍｏｌ）を加え、−７８℃で１時間撹拌した。反応液を氷水６００ｍｌに少しずつ加えた後にジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物（６）９．９ｇを得た（収率８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．４０（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ）
化合物（６）５．０ｇをニトロメタン１３０ｍｌに溶かし、塩化亜鉛を飽和させたニトロメタン８０ｍｌ、続いて１．０Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液６０ｍｌを加え、室温で４時間撹拌した。さらに１．０Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液２０ｍｌを加え、室温で２時間撹拌した。反応液に水：メタノール＝１：１を１００ｍｌ加え、室温で３０分間撹拌した後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（７）３．５ｇを得た（収率７４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．７２（ｓ，１Ｈ），９．８５（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ）
化合物（７）２．０ｇ（８．７ｍｍｏｌ）と４−ブロモメチル安息香酸メチルエステル２．８ｇ（１２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム４．８ｇ（３５ｍｍｏｌ）を加え１００℃で２時間撹拌した。室温まで冷却後、酢酸エチル３００ｍｌに溶かし、水及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（８）１．９ｇを得た（収率５８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．４７（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ）
化合物（８）１．９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を７５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液にＫＦ−Ａｌｕｍｉｎａ（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８３，５６，１８８５−１８８６に示す方法で合成）２．９ｇを加え、１００℃で３時間撹拌した。反応液を濾過した後、酢酸エチルを加え、水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧下に留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（９）０．６６ｇを得た（収率３６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ）
化合物（４）０．３３ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン２０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（９）０．１６ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド８９ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド１５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン２３ｍｇ（０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間撹拌した。反応液に少量の水を加えた後、炭酸水素ナトリウム水溶液とジクロロメタンを加え、不溶物をグラスフィルターで濾去した。濾液をジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製して化合物（１０）０．３９ｇを得た（収率３２％）。
黄色固体
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５４（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３），７．１４（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９３（ｓ，４Ｈ），３．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５）
ＭＳ（ＦＡＢ）：５２３（Ｍ＋＋１）
メタノール２５ｍｌに１．０ｇの水酸化カリウムを溶かし、この溶液に化合物（１０）６３ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を溶解して４０℃で１２時間撹拌した。メタノールを減圧下に留去した後、残渣を１００ｍｌの水に溶解した。この溶液に塩酸を加えて酸性にした後、水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ７．０になるまで加え、析出した固体を濾取し、化合物（１１）４３ｍｇを得た（収率７０％）。得られた化合物（１１）は酢酸エチル／ｎ−ヘキサンにて再結晶して精製した。黄色固体。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．６１（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３），７．２０（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，４Ｈ），３．３３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），１．５７（ｂｒ，１Ｈ）
化合物（７）０．５６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、エチル２−クロロメチルオキサゾール−５−カルボキシレート（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，３４４０−３４５０に示す方法で合成）０．４６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１．３ｇ（９．７ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１．５時間撹拌した。反応液を２Ｎ塩酸にて中和した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物（１２）０．５１ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を得た。収率５７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：
７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），４．４４（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．９６（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＩ）：３６４，３６６
化合物（４）０．２０ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下８０℃で２時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、ＮＨシリカゲルカラムで精製して化合物（１３）５．０ｍｇ（９．５ｍｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率３．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），５．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），４．４１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），１．４１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１５９．２３，１５７．８６，１５７．４６，１５３．１１，１４９．１０，１４５．８２，１４１．４８，１４０．１７，１４０．０６，１３６．４０，１３５．６３，１２３．０３，１２２．１２，１１５．６８，１１１．２９，１００．５５，９１．８６，６１．４７，６０．４０，５６．００，５２．３１，４１．０４，１４．３１
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ（Ｍ＋Ｈ＋）ｍ／ｚ ５２８．２２４７，Ｆｏｕｎｄ ５２８．２２５５
化合物（４）０．２０ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下８０℃で２時間撹拌した。反応液に数ｍｌのメタノールを加えて室温にて１５分撹拌した後、２Ｎ塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して化合物（１４）２０ｍｇ（４０ｎｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率１５％。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）：８．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４８（ｍ，２Ｈ），８．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｔ，２Ｈ），３．０５（ｔ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：１６０．２７，１５８．６０，１５４．０３，１５３．５０，１４８．５４，１４７．４９，１４３．６８，１４１．３２，１４１．１５，１４０．３０，１３５．８７，１２５．７２，１２５．６１，１１７．７９，１１２．５９，１０２．３６，９２．５５，５８．９９，５６．７１，５３．９８，４０．１８
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ（Ｍ＋Ｈ＋）ｍ／ｚ ５００．１９３４，Ｆｏｕｎｄ ５００．１９３６
ジ−（２−ピコリル）アミン０．２０ｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下１００℃で３．５時間撹拌した。反応液に数ｍｌのメタノールを加えて室温にて１５分撹拌した後、２Ｎ塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して化合物（１４）２ｍｇ（４．４ｎｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率１．６％。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）：８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．３９（ｍ，２Ｈ），７．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．８８（ｓ，４Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ）
例２：化合物（１１）の蛍光特性
化合物（１１）の蛍光特性を調べた。化合物（１１）を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．４％ＤＭＳＯを共溶媒として含有）に２０μＭとなるように溶解して励起スペクトルを測定した。
測定条件
日立Ｆ−４５００蛍光測定装置
スリット：Ｅｘ、Ｅｍ ２．５ｎｍ
スキャン速度：２４０ｎｍ／ｍｉｎ
ホトマル電圧：９５０Ｖ
測定温度：２５℃
亜鉛イオンの添加前及び亜鉛イオン（２０μＭ ＺｎＳＯ４）添加後の化合物（１１）の蛍光特性を下記表１に示す。
亜鉛イオンと配位することによって化合物（１１）には約２０ｎｍの波長シフトが認められた。化合物（１１）２０μＭにおいて亜鉛イオンの濃度変化に対する励起スペクトルを第１図に示す。亜鉛イオン濃度に依存して励起スペクトルの極大波長が低波長側にシフトした。
例３：化合物（１１）のレシオ測定
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、化合物（１１）の２０μＭ溶液に２０μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加した。蛍光波長５３０ｎｍに固定したときの励起波長３３５ｎｍと３５４ｎｍにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第２図（Ａ））。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、化合物（１１）の２０μＭ溶液に４００μＭになるまでナトリウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンを添加した。蛍光波長５３０ｎｍに固定したときの励起波長３３５ｎｍと３５４ｎｍにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第２図（Ｂ））。亜鉛イオンを添加した場合には亜鉛イオンの濃度依存的にレシオが変化するが、他のイオンを加えた場合にはレシオの変化がみられないことから、化合物（１１）が亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが分かった。
例４：化合物（１４）及び（１５）の蛍光特性とレシオ測定
化合物（１４）及び（１５）について例２及び例３と同様の方法により蛍光特性の確認とレシオ測定を行った。亜鉛イオンの添加前及び亜鉛イオン（２０μＭ ＺｎＳＯ４）添加後の化合物（１４）及び（１５）の蛍光特性を下記表２に示す。
化合物（１１）と同様に、亜鉛イオンと配位することによって化合物（１４）及び（１５）には約３０ｎｍの波長シフトが認められた。同時にナトリウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンの添加ではレシオの変化が観察されず、亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが確認された。
例５：化合物（１４）及び（１５）のスペクトル測定
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、１５μＭの化合物（１４）の溶液に１５μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加し、例２の測定条件でスペクトルを測定した。このとき、化合物（１１）も同様にスペクトルを測定し対照とした。第３図に、ａ）化合物（１４）のＵＶスペクトル変化、ｂ）化合物（１４）の蛍光波長を４９５ｎｍに固定したときの励起スペクトル、ｃ）化合物（１１）のＵＶスペクトル変化、ｄ）化合物（１１）の蛍光波長を５３０ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。また、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、１０μＭの化合物（１５）溶液に２００μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加し、例２の測定条件でスペクトルを測定した。第４図に、ａ）化合物（１５）の励起波長を３２５ｎｍに固定したときの蛍光スペクトル、ｂ）化合物（１５）の蛍光波長を４４５ｎｍに固定したときの励起スペクトルを示す。
亜鉛イオンの添加により化合物（１４）では３６５ｎｍ、化合物（１１）では３５４ｎｍの吸光度が減少し、化合物（１４）、（１１）とも３３５ｎｍに吸光度が増加した（図３ａ）、ｃ））。同時に亜鉛イオンの添加により化合物（１４）では３６５ｎｍ、化合物（１１）では３５４ｎｍで励起したときの蛍光が減少した（図３ｂ）、ｄ））また、亜鉛イオンの添加により化合物（１５）では４９５ｎｍの蛍光が減少し４４５ｎｍの蛍光が増加（図４ａ））する一方、亜鉛イオンの添加により３５５ｎｍで励起したときの蛍光強度が減少し３２５ｎｍで励起したときの蛍光強度が増加（図４ｂ））した。以上より化合物（１４）及び（１５）が化合物（１１）と同様レシオ法による亜鉛イオンの測定に使用できることが確認された。
例６：化合物（１３）による生細胞中の亜鉛イオン測定
生きた細胞内の亜鉛イオン濃度の変化をイメージングによって測定した。マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、１０μＭの化合物（１３）を含むＰＢＳバッファー中で室温下３０分インキュベートし、細胞外液を化合物（１３）を含まないＰＢＳバッファーに置換した後、蛍光顕微鏡にて３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起したときの蛍光強度のレシオ変化を観察した。第５図に示すように、測定開始から５分後にピリチオン（亜鉛選択的イオノフォア）とＺｎＳＯ４をそれぞれ１０μＭ、１５０μＭになるように細胞外液に加えた（第５図、矢印１）。さらに１５分後にＴＰＥＮ（膜透過性亜鉛キレーター）を４００μＭになるように細胞外液に加えた（第５図、矢印２）。細胞の透過光像及び蛍光強度比の変化を擬似カラー表示した画像を第６図に示す。
視野内にある６個のマクロファージいずれでも、ピリチオンとＺｎＳＯ４の添加後にレシオの上昇、ＴＰＥＮの添加後にレシオの低下が観察された。
産業上の利用可能性
本発明の化合物は亜鉛測定のための蛍光プローブとして有用である。本発明の化合物は亜鉛イオンとの錯体を形成すると励起スペクトルのピークに波長シフトが生じるので、異なる２種類の励起波長を用いて亜鉛イオンをレシオ法により正確に測定できる。レシオ法による亜鉛イオン濃度の測定では、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができるため、本発明の化合物は生体内における亜鉛イオンを正確に測定するためのプローブとして極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の化合物（化合物（１１））における亜鉛イオンの濃度に依存した励起スペクトル変化を示す。
第２図は、化合物（１１）における亜鉛イオン及び他の金属イオンを用いたレシオ測定の結果を示す。図中、（Ａ）は亜鉛イオン添加によるレシオ変化を示し、（Ｂ）は亜鉛以外の金属イオンを添加した場合のレシオ変化を示す。
第３図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。ａ）化合物（１４）のＵＶスペクトル変化、ｂ）化合物（１４）の蛍光波長を４９５ｎｍに固定した時の励起スペクトル、ｃ）化合物（１１）のＵＶスペクトル変化、ｄ）化合物（１１）の蛍光波長を５３０ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。
第４図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。ａ）化合物（１５）の励起波長を３２５ｎｍに固定した時の蛍光スペクトル、ｂ）化合物（１５）の蛍光波長を４４５ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。
第５図は、化合物（１３）を使用した場合の細胞内の亜鉛イオン濃度の変化を、蛍光顕微鏡にて３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起したときの蛍光強度比の変化により示した図である。矢印（１）の時点において硫酸亜鉛１５０μＭとピリチオン１５μＭを添加し、矢印（２）の時点でＴＰＥＮ ４００μＭを添加した。
第６図は、化合物（１３）を使用した場合の細胞の透過光像及び蛍光強度比の変化を示した図である。（ａ）は透過光像、（ｂ）は刺激前、（ｃ）は硫酸亜鉛とピリチオンを用いて細胞内亜鉛イオン濃度を上昇させた後、（ｄ）はＴＰＥＮを用いて細胞内亜鉛イオン濃度を下降させた後の結果を示す。
本発明は、亜鉛イオンを特異的に捕捉するための蛍光プローブに関するものである。
背景技術
亜鉛はヒトの体内において鉄に次いで含量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛イオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在するフリーの亜鉛イオン（通常はμＭレベル以下である）の生理的役割についても、種々の報告がある。特に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛イオンが深く関わっていると考えられており、アルツハイマー病の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。
従来、組織内の亜鉛イオンを測定するために、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴って蛍光を発する化合物（亜鉛蛍光プローブ）が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、ＴＳＱ（Ｒｅｙｅｓ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，２７，４９，１９９４）、Ｚｉｎｑｕｉｎ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｔｓｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，６６７８，１９９７）、Ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｃｙｃｌｅｎ（Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，１２６８６，１９９６）、Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のカタログである”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｐｐ．５３１−５４０）などが実用化されている。
本発明者らは、ＴＳＱなどの亜鉛蛍光プローブの欠点を克服した高感度な亜鉛蛍光プローブとして、環状アミン又はポリアミンを置換基として有し、亜鉛イオンを捕捉して長波長領域の励起光で強い蛍光を発するプローブを提供しており（特開平２０００−２３９２７２号公報）、亜鉛イオンと瞬時に反応して蛍光性の錯体を形成し、生体内の亜鉛を極めて正確かつ高感度に測定できるプローブも提供している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，１２３９９−１２４００）。
一方、細胞に蛍光プローブを適用するときには、細胞内に導入される蛍光プローブの濃度が細胞の種類によってばらつく場合があり、また細胞膜の厚さの違いによって測定部位でも蛍光強度に差が生じ、膜などの疎水性の高い部分に蛍光プローブが局在してしまう可能性があるなど、測定に影響を与える要因も多い。
これらの要因による測定誤差を減少させ、正確な定量的解析を行える方法としてレシオ（ｒａｔｉｏ）測定法が開発され使用されている（Ｋａｗａｎｉｓｈｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３９（１９），３４３８，２０００）。この方法は、蛍光スペクトル又は励起スペクトルにおいて異なる２波長での蛍光強度を測定してその比を検出する工程を含んでおり、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、１つの波長で観測を行った場合に生じる蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができる。
例えば、カルシウムイオンの測定用の蛍光プローブとしてＦｕｒａ ２（１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ペンタカリウム塩：Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ第２１版／総合カタログ、１３７〜１３８頁、１９９８年４月２０日発行、株式会社同仁化学研究所）が実用化されている。この化合物は、カルシウムイオン結合により励起波長のピークが低波長側にシフトする性質を有しており、３３５ｎｍ付近で励起した場合にはカルシウムイオン濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大するのに対して、３７０〜３８０ｎｍ付近で励起したときにはカルシウムイオン濃度の増加とともに蛍光強度が減少する。従って、この化合物を適当な２波長を用いて励起し、そのときの蛍光強度の比をとることにより、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なくカルシウムイオンを正確に測定できる。
また、前記Ｆｕｒａ ２あるいはその類似構造化合物がカルシウムイオン以外のイオンも捕捉してしまう性質を利用し、亜鉛イオン検出への応用を検討した報告もある（Ｈｙｒｃ Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，２７（２），７５，２０００）。
しかしながら、従来、亜鉛蛍光プローブに関しては、亜鉛イオンと特異的に結合して励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルのピークに十分な波長シフトを生じるプローブが開発されておらず、細胞中の亜鉛イオンを正確に測定するためにレシオ法を利用することができなかった。
発明の開示
本発明の課題は、高感度な亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物又はその塩を提供することにある。より具体的には、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルのピークに波長シフトを生じる化合物を提供することが本発明の課題である。また、本発明の課題は、亜鉛イオンをレシオ測定法により測定するための蛍光プローブとして利用可能な化合物を提供することにある。さらに本発明の別な課題は、上記の特徴を有する化合物を含む亜鉛蛍光プローブ、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物が亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、亜鉛イオンを捕捉することによって励起スペクトルのピークに顕著な波長シフトを生じること、及び該化合物を用いてレシオ法により亜鉛イオンを極めて正確に測定できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）：
この発明の好ましい態様によれば、ｍが０又は１であり、ｎが０である上記の化合物又はその塩；Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、ｍが１である場合にはＸ３が水素原子である上記の化合物又はその塩；Ｙが単結合である上記の化合物又はその塩；Ｒ１がメトキシ基である上記の化合物又はその塩；Ｒ３がカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基である上記の化合物又はその塩；アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基が保護基を有している上記の化合物又はその塩；保護基を有するカルボキシル基がメトキシカルボニル基又はアセトキシメチルオキシカルボニル基である上記の化合物又はその塩が提供される。
特に好ましい態様によれば、
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３がｐ−カルボキシフェニル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−カルボキシオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが０であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−カルボキシオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３がｐ−アセトキシメチルオキシカルボニルフェニル基である上記の化合物又はその塩；
ｍが１であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｘ３が水素原子であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩；及び
ｍが０であり、ｎが０であり、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であり、Ｙが単結合であり、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ３が５−アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール−２−イル基である上記の化合物又はその塩
が提供される。
別の観点からは、上記の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ；上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとにより形成された亜鉛錯体；及び上記の化合物又はその塩を含む亜鉛イオンの測定用試薬が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
（ａ）上記の化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程；及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法；及び測定をレシオ法により行う上記の方法が提供される。
また、亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
（ａ）カルボキシル基が保護された上記の化合物又はその塩を細胞内に取り込ませる工程；
（ｂ）細胞内に取り込まれた該化合物又はその塩の加水分解により生じた化合物又はその塩（ただしそのカルボキシル基は保護基を有しない）と亜鉛イオンとの反応により生じた亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法；及び測定をイメージングにより行う上記の方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜１２個、好ましくは炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数１〜６個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。Ｒ１が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、Ｒ１が示すアルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。特に好ましいのはメトキシ基である。Ｒ２におけるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が示すアルキル基としてはメチル基が好ましい。
Ｒ３が示すカルボキシ置換アリール基におけるアリール基としては、単環性又は縮合環性のアリール基を用いることができ、例えばフェニル基又はナフチル基などが好ましい。特に好ましいのはフェニル基である。Ｒ３が示すカルボキシ置換ヘテロアリール基におけるヘテロアリール基としては、単環性又は縮合環性のヘテロアリール基を用いることができる。ヘテロアリール基に含まれるヘテロ原子の個数及び種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原子、及びイオウ原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個含んでいてもよい。ヘテロアリール基を構成するヘテロアリール化合物として、例えばオキサゾール、イミダゾール、チアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、又はベンゾチアゾールなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。ヘテロアリール基としてはオキサゾリル基が好ましい。
Ｒ３が示すカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基において、アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基の個数は特に限定されないが、好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基は保護基を有していてもよい。カルボキシル基の保護基については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９８１年）などを参照することができる。保護基を有するカルボキシル基の好ましい例としては、エステル類、特にアルコキシカルボニル基を挙げることができる。アルコキシカルボニル基の特に好ましい例としてメトキシカルボニル基を挙げることができる。また、膜透過性を高めたい場合には、カルボキシル基の保護基としてアセトキシメチル基を用い、保護基を有するカルボキシル基をアセトキシメチルオキシカルボニル基とすることが特に好ましい。アリール環又はヘテロアリール環上に置換するカルボキシル基の位置は特に限定されないが、アリール基としてフェニル基を用いる場合にはパラ位が好ましい。
式（Ａ）で表される基において、ｍが０又は１であり、ｎが０であることが好ましい。この場合、Ｘ１及びＸ２がともに２−ピリジルメチル基であることが好ましく、ｍが１である場合にはＸ３が水素原子であることが好ましい。Ｙは単結合又は−ＣＯ−を示すが、Ｙが単結合であることが好ましい。Ｙが単結合を示す場合には、Ｒ３がカルボキシ置換アリール基又はカルボキシ置換ヘテロアリール基であることが好ましく、より具体的にはＲ３がカルボキシ置換フェニル基又はカルボキシ置換オキサゾリル基であることが好ましい。
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
本発明の上記一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を、下記のスキームに示す。本明細書の実施例には、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。
また、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。従って、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブとして極めて有用である。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。
本発明の亜鉛蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の亜鉛プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩からなる群から選ばれる物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、適宜選択された異なる２波長により励起して、それぞれの蛍光強度を測定すればよい。
例えば、上記スキーム中の化合物１１の励起波長は３５４ｎｍ、蛍光波長は５３２ｎｍであり、２０μＭで亜鉛蛍光プローブとして用いると２０μＭ程度の濃度までの亜鉛イオンを捕捉し、亜鉛イオンの濃度に依存して励起スペクトルのピークが２０ｎｍ程度ブルーシフトする。従って、この化合物をプローブとして用いる場合には、励起波長として例えば３３５ｎｍ及び３５４ｎｍを用い、それぞれの励起波長における蛍光強度を求めて比を算出すればよい。なお、本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中の化合物番号は、上記のスキーム中の化合物番号に対応している。
例１
化合物（２）をＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，６１１，ｐｐ．５８６−５９２に記載の方法に従って合成した。化合物（２）４．７ｇ（２９ｍｍｏｌ）をエタノール１５０ｍｌに溶かし、炭酸ナトリウム１２ｇ（０．１２ｍｏｌ）と２−（クロロメチル）ピリジン塩酸塩９．６ｇ（５８ｍｍｏｌ）を加え、１日加熱還流した。エタノールを減圧下留去し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に懸濁した後、ジクロロメタンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥し、ジクロロメタンを減圧下留去した。残渣をアルミナカラムにて精製して化合物（３）９．９ｇを得た（収率：定量的）。
褐色油状物質
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５５（ｍ，２Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．１６（ｍ，２Ｈ），５．８０（ｂｒ，１Ｈ），３．８７（ｓ，４Ｈ），３．２３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），２．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０）
化合物（３）１．１ｇをジクロロメタン２５ｍｌに溶かし、トリフルオロ酢酸２５ｍｌに氷冷下滴下した。室温で１時間撹拌し、４５℃でトリフルオロ酢酸を減圧下に留去した。残留物に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２５ｍｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をアルミナカラムで精製して化合物（４）０．６４ｇを得た（収率８５％）。
褐色油状物質。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５４（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８），７．１５（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｓ，４Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０），１．４２（ｂｒ，２Ｈ）
２，５−ジメトキシブロモベンゼン（５）７．０ｍｌ（４７ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンに溶かした溶液に、アルゴン下−７８℃で塩化チタン（ＩＶ）１３ｍｌ（０．１２ｍｏｌ）、続いてジクロロメチルメチルエーテル８．２ｍｌ（０．１４ｍｏｌ）を加え、−７８℃で１時間撹拌した。反応液を氷水６００ｍｌに少しずつ加えた後にジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物（６）９．９ｇを得た（収率８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．４０（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ）
化合物（６）５．０ｇをニトロメタン１３０ｍｌに溶かし、塩化亜鉛を飽和させたニトロメタン８０ｍｌ、続いて１．０Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液６０ｍｌを加え、室温で４時間撹拌した。さらに１．０Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液２０ｍｌを加え、室温で２時間撹拌した。反応液に水：メタノール＝１：１を１００ｍｌ加え、室温で３０分間撹拌した後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（７）３．５ｇを得た（収率７４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．７２（ｓ，１Ｈ），９．８５（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ）
化合物（７）２．０ｇ（８．７ｍｍｏｌ）と４−ブロモメチル安息香酸メチルエステル２．８ｇ（１２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム４．８ｇ（３５ｍｍｏｌ）を加え１００℃で２時間撹拌した。室温まで冷却後、酢酸エチル３００ｍｌに溶かし、水及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（８）１．９ｇを得た（収率５８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１０．４７（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ）
化合物（８）１．９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を７５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液にＫＦ−Ａｌｕｍｉｎａ（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８３，５６，１８８５−１８８６に示す方法で合成）２．９ｇを加え、１００℃で３時間撹拌した。反応液を濾過した後、酢酸エチルを加え、水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧下に留去し、残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物（９）０．６６ｇを得た（収率３６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ）
化合物（４）０．３３ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン２０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（９）０．１６ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド８９ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド１５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン２３ｍｇ（０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間撹拌した。反応液に少量の水を加えた後、炭酸水素ナトリウム水溶液とジクロロメタンを加え、不溶物をグラスフィルターで濾去した。濾液をジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製して化合物（１０）０．３９ｇを得た（収率３２％）。
黄色固体
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５４（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３），７．１４（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９３（ｓ，４Ｈ），３．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５）
ＭＳ（ＦＡＢ）：５２３（Ｍ＋＋１）
メタノール２５ｍｌに１．０ｇの水酸化カリウムを溶かし、この溶液に化合物（１０）６３ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を溶解して４０℃で１２時間撹拌した。メタノールを減圧下に留去した後、残渣を１００ｍｌの水に溶解した。この溶液に塩酸を加えて酸性にした後、水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ７．０になるまで加え、析出した固体を濾取し、化合物（１１）４３ｍｇを得た（収率７０％）。得られた化合物（１１）は酢酸エチル／ｎ−ヘキサンにて再結晶して精製した。黄色固体。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．６１（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３），７．２０（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，４Ｈ），３．３３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５），１．５７（ｂｒ，１Ｈ）
化合物（７）０．５６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、エチル２−クロロメチルオキサゾール−５−カルボキシレート（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，３４４０−３４５０に示す方法で合成）０．４６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１．３ｇ（９．７ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１．５時間撹拌した。反応液を２Ｎ塩酸にて中和した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物（１２）０．５１ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を得た。収率５７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：
７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），４．４４（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．９６（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＩ）：３６４，３６６
化合物（４）０．２０ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下８０℃で２時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、ＮＨシリカゲルカラムで精製して化合物（１３）５．０ｍｇ（９．５ｍｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率３．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：８．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），５．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），４．４１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），１．４１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１５９．２３，１５７．８６，１５７．４６，１５３．１１，１４９．１０，１４５．８２，１４１．４８，１４０．１７，１４０．０６，１３６．４０，１３５．６３，１２３．０３，１２２．１２，１１５．６８，１１１．２９，１００．５５，９１．８６，６１．４７，６０．４０，５６．００，５２．３１，４１．０４，１４．３１
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ（Ｍ＋Ｈ＋）ｍ／ｚ ５２８．２２４７，Ｆｏｕｎｄ ５２８．２２５５
化合物（４）０．２０ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下８０℃で２時間撹拌した。反応液に数ｍｌのメタノールを加えて室温にて１５分撹拌した後、２Ｎ塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して化合物（１４）２０ｍｇ（４０ｎｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率１５％。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）：８．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４８（ｍ，２Ｈ），８．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｔ，２Ｈ），３．０５（ｔ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：１６０．２７，１５８．６０，１５４．０３，１５３．５０，１４８．５４，１４７．４９，１４３．６８，１４１．３２，１４１．１５，１４０．３０，１３５．８７，１２５．７２，１２５．６１，１１７．７９，１１２．５９，１０２．３６，９２．５５，５８．９９，５６．７１，５３．９８，４０．１８
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ（Ｍ＋Ｈ＋）ｍ／ｚ ５００．１９３４，Ｆｏｕｎｄ ５００．１９３６
ジ−（２−ピコリル）アミン０．２０ｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶かした溶液に、化合物（１２）０．１０ｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ナトリウム−ｔ−ブトキシド５４ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５ｍｏｌ％、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン１０ｍｏｌ％を加え、アルゴン気流下１００℃で３．５時間撹拌した。反応液に数ｍｌのメタノールを加えて室温にて１５分撹拌した後、２Ｎ塩酸にて中和し減圧下留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して化合物（１４）２ｍｇ（４．４ｎｍｏｌ）を得た。黄色オイル状物質。収率１．６％。これを塩酸塩として沈殿させ、測定に用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）：８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．３９（ｍ，２Ｈ），７．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．８８（ｓ，４Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ）
例２：化合物（１１）の蛍光特性
化合物（１１）の蛍光特性を調べた。化合物（１１）を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．４％ＤＭＳＯを共溶媒として含有）に２０μＭとなるように溶解して励起スペクトルを測定した。
測定条件
日立Ｆ−４５００蛍光測定装置
スリット：Ｅｘ、Ｅｍ ２．５ｎｍ
スキャン速度：２４０ｎｍ／ｍｉｎ
ホトマル電圧：９５０Ｖ
測定温度：２５℃
亜鉛イオンの添加前及び亜鉛イオン（２０μＭ ＺｎＳＯ４）添加後の化合物（１１）の蛍光特性を下記表１に示す。
例３：化合物（１１）のレシオ測定
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、化合物（１１）の２０μＭ溶液に２０μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加した。蛍光波長５３０ｎｍに固定したときの励起波長３３５ｎｍと３５４ｎｍにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第２図（Ａ））。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、化合物（１１）の２０μＭ溶液に４００μＭになるまでナトリウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、又はマグネシウムイオンを添加した。蛍光波長５３０ｎｍに固定したときの励起波長３３５ｎｍと３５４ｎｍにおける蛍光強度のレシオ変化を示す（第２図（Ｂ））。亜鉛イオンを添加した場合には亜鉛イオンの濃度依存的にレシオが変化するが、他のイオンを加えた場合にはレシオの変化がみられないことから、化合物（１１）が亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが分かった。
例４：化合物（１４）及び（１５）の蛍光特性とレシオ測定
化合物（１４）及び（１５）について例２及び例３と同様の方法により蛍光特性の確認とレシオ測定を行った。亜鉛イオンの添加前及び亜鉛イオン（２０μＭ ＺｎＳＯ４）添加後の化合物（１４）及び（１５）の蛍光特性を下記表２に示す。
例５：化合物（１４）及び（１５）のスペクトル測定
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、１５μＭの化合物（１４）の溶液に１５μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加し、例２の測定条件でスペクトルを測定した。このとき、化合物（１１）も同様にスペクトルを測定し対照とした。第３図に、ａ）化合物（１４）のＵＶスペクトル変化、ｂ）化合物（１４）の蛍光波長を４９５ｎｍに固定したときの励起スペクトル、ｃ）化合物（１１）のＵＶスペクトル変化、ｄ）化合物（１１）の蛍光波長を５３０ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。また、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、１０μＭの化合物（１５）溶液に２００μＭになるまでＺｎＳＯ４を添加し、例２の測定条件でスペクトルを測定した。第４図に、ａ）化合物（１５）の励起波長を３２５ｎｍに固定したときの蛍光スペクトル、ｂ）化合物（１５）の蛍光波長を４４５ｎｍに固定したときの励起スペクトルを示す。
亜鉛イオンの添加により化合物（１４）では３６５ｎｍ、化合物（１１）では３５４ｎｍの吸光度が減少し、化合物（１４）、（１１）とも３３５ｎｍに吸光度が増加した（図３ａ）、ｃ））。同時に亜鉛イオンの添加により化合物（１４）では３６５ｎｍ、化合物（１１）では３５４ｎｍで励起したときの蛍光が減少した（図３ｂ）、ｄ））また、亜鉛イオンの添加により化合物（１５）では４９５ｎｍの蛍光が減少し４４５ｎｍの蛍光が増加（図４ａ））する一方、亜鉛イオンの添加により３５５ｎｍで励起したときの蛍光強度が減少し３２５ｎｍで励起したときの蛍光強度が増加（図４ｂ））した。以上より化合物（１４）及び（１５）が化合物（１１）と同様レシオ法による亜鉛イオンの測定に使用できることが確認された。
例６：化合物（１３）による生細胞中の亜鉛イオン測定
生きた細胞内の亜鉛イオン濃度の変化をイメージングによって測定した。マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、１０μＭの化合物（１３）を含むＰＢＳバッファー中で室温下３０分インキュベートし、細胞外液を化合物（１３）を含まないＰＢＳバッファーに置換した後、蛍光顕微鏡にて３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起したときの蛍光強度のレシオ変化を観察した。第５図に示すように、測定開始から５分後にピリチオン（亜鉛選択的イオノフォア）とＺｎＳＯ４をそれぞれ１０μＭ、１５０μＭになるように細胞外液に加えた（第５図、矢印１）。さらに１５分後にＴＰＥＮ（膜透過性亜鉛キレーター）を４００μＭになるように細胞外液に加えた（第５図、矢印２）。細胞の透過光像及び蛍光強度比の変化を擬似カラー表示した画像を第６図に示す。
視野内にある６個のマクロファージいずれでも、ピリチオンとＺｎＳＯ４の添加後にレシオの上昇、ＴＰＥＮの添加後にレシオの低下が観察された。
産業上の利用可能性
本発明の化合物は亜鉛測定のための蛍光プローブとして有用である。本発明の化合物は亜鉛イオンとの錯体を形成すると励起スペクトルのピークに波長シフトが生じるので、異なる２種類の励起波長を用いて亜鉛イオンをレシオ法により正確に測定できる。レシオ法による亜鉛イオン濃度の測定では、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができるため、本発明の化合物は生体内における亜鉛イオンを正確に測定するためのプローブとして極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の化合物（化合物（１１））における亜鉛イオンの濃度に依存した励起スペクトル変化を示す。
第２図は、化合物（１１）における亜鉛イオン及び他の金属イオンを用いたレシオ測定の結果を示す。図中、（Ａ）は亜鉛イオン添加によるレシオ変化を示し、（Ｂ）は亜鉛以外の金属イオンを添加した場合のレシオ変化を示す。
第３図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。ａ）化合物（１４）のＵＶスペクトル変化、ｂ）化合物（１４）の蛍光波長を４９５ｎｍに固定した時の励起スペクトル、ｃ）化合物（１１）のＵＶスペクトル変化、ｄ）化合物（１１）の蛍光波長を５３０ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。
第４図は、本発明の化合物のスペクトル特性を示した図である。ａ）化合物（１５）の励起波長を３２５ｎｍに固定した時の蛍光スペクトル、ｂ）化合物（１５）の蛍光波長を４４５ｎｍに固定した時の励起スペクトルを示す。
第５図は、化合物（１３）を使用した場合の細胞内の亜鉛イオン濃度の変化を、蛍光顕微鏡にて３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起したときの蛍光強度比の変化により示した図である。矢印（１）の時点において硫酸亜鉛１５０μＭとピリチオン１５μＭを添加し、矢印（２）の時点でＴＰＥＮ ４００μＭを添加した。
第６図は、化合物（１３）を使用した場合の細胞の透過光像及び蛍光強度比の変化を示した図である。（ａ）は透過光像、（ｂ）は刺激前、（ｃ）は硫酸亜鉛とピリチオンを用いて細胞内亜鉛イオン濃度を上昇させた後、（ｄ）はＴＰＥＮを用いて細胞内亜鉛イオン濃度を下降させた後の結果を示す。
Claims (1)
- 下記の一般式(I)：
(a)mが1であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、X 3 が水素原子であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 がp-カルボキシフェニル基である化合物又はその塩；
(b)mが1であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、X 3 が水素原子であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 が5-カルボキシオキサゾール-2-イル基である化合物又はその塩；
(c)mが0であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 が5-カルボキシオキサゾール-2-イル基である化合物又はその塩；
(d)mが1であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、X 3 が水素原子であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 がp-アセトキシメチルオキシカルボニルフェニル基である化合物又はその塩；
(e)mが1であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、X 3 が水素原子であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 が5-アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール-2-イル基である化合物又はその塩；又は
(f)mが0であり、nが0であり、X 1 及びX 2 がともに2-ピリジルメチル基であり、Yが単結合であり、R 1 がメトキシ基であり、R 3 が5-アセトキシメチルオキシカルボニルオキサゾール-2-イル基である化合物又はその塩。
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