JP4759200B2 - 活性酸素測定用試薬 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、活性酸素測定用試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬に関する。
背景技術
生体および生命現象において一酸化窒素などのフリーラジカル種が情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系などにおいて血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮していることが知られている。フリーラジカル種の一つである、活性酸素はスーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等を総称するものであるが、これらのうち、スーパーオキサイドアニオンや過酸化水素は免疫系などにおいて重要な生理作用を発揮していることが既に明らかにされている。一方ヒドロキシラジカルは血管障害や虚血後の脳障害、あるいは紫外線によるＤＮＡ修飾に関わる知見が多数報告され、病因・病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。一重項酸素については、従来、その役割等についてほとんど解明されていなかったが、最近、癌治療法の一つであるフォト・ダイナミックセラピー（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）の反応種であることや、生体内の各種酸化酵素、ペルオキシダーゼが一重項酸素を生成していることを示唆する知見が得られ、重要な生理作用を担っている前能性が示唆されている。
このように活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっているが、その測定方法については課題が多い。ヒドロキシラジカルを測定する方法については、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法で測定した多数の報告があるが、ＥＳＲ法では生細胞を測定試料として使用すること自体が困難であり、個々の細胞レベルでの測定評価は実際上不可能である。一方、活性酸素種を広く測定可能なＤＣＨＦ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキュラー・プローブス社、カタログ番号Ｄ−３９９）を他の活性酸素種生成の阻害剤と共に使用して顕微鏡下でヒドロキシラジカルを検出する方法も知られているが、阻害剤共存下の成績は生体内での反応とは異なる要素を含んだものになる。またＤＣＨＦ−ＤＡは、極めて自動酸化をうけやすいため、同一視野を何度も観察する必要がある場合に、自動酸化によるバックグラウンド蛍光が検出を妨害してしまう。さらに、暗所での操作を必要とするなど操作性、保存性の点で極めて不便な方法であった。
一重項酸素を測定する方法としては、化学発光法、ＥＳＲ法、発光法など十数種が知られているが、いずれも特異性及び感度が低く、信頼のおける方法とは言えない（一重項酸素の特異的検出法についてはＮａｇａｎｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．３５−４１，１９９３などを参照のこと）。前記ＤＣＨＦ−ＤＡを、一重項酸素の測定に使用することもできるが、ＤＣＨＦ−ＤＡ自体が有する問題点は解消されない。従って、活性酸素種の研究に使用可能な、特異性及び感度に優れ、かつ操作が簡便な測定方法の開発が要求されていたのである。
発明の開示
本発明の課題は、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素の測定用試薬として有用な化合物を提供することにある。また、本発明の別な課題は、上記化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法を提供することにある。特に、生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって正確かつ簡便に測定するための試薬を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力し、一重項酸素に対して特異的な検出試薬を提供することに成功した（国際公開ＷＯ９９／５１５８６号）。本発明者らはさらに研究を続けた結果、下記の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される実質的に非蛍光性の化合物が活性酸素と生理的条件下で効率的に反応して脱アリール化された蛍光性の化合物を与えること、並びに一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物をヒドロキシラジカルあるいは一重項酸素測定用試薬として用い、生細胞や生体組織中に局在する活性酸素と反応して生成する脱アリール化合物の蛍光を測定すると、極めて特異的かつ高感度に活性酸素を測定できること、さらには、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物が自動酸化を全くうけないことを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、下記の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）：

（式中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアリール基を示し、Ｒ^３は置換基を有していてもよい２−カルボキシフェニル基を示す）で表される化合物又はその塩を提供するものである。本発明の好ましい態様によれば、Ｒ^１及びＲ^２がアミノ基又は水酸基で置換されたフェニル基である上記化合物又はその塩；及びＲ^３が２−カルボキシフェニル基である上記化合物又はその塩が提供される。
別の観点からは、上記の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬が本発明により提供される。さらに、本発明により、活性酸素の測定方法であって、下記の工程：（Ａ）上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び（Ｂ）上記工程（Ａ）で生成した脱アリール化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ^１が水素原子である化合物又は上記一般式（ＩＩ）においてＲ^２が水素原子である化合物）又はその塩の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
日本国特許出願第２０００−５４５５７号明細書の開示を参照として全て本明細書の開示に含める。
Ｒ^１又はＲ^２が示すアリール基としては、例えば、環構成原子数が６個から１４個程度の単環性、二環性、又は三環性アリール基を用いることができる。好ましくはフェニル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基を用いることができる。アリール基は環上に１個又は２個以上の置換基を有していてもよい。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基の種類及び置換位置は特に限定されないが、例えば、Ｃ_１−６アルキル基（アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分についても同様である。）、Ｃ_１−６ハロアルキル基、Ｃ_１−６アルケニル基、Ｃ_１−６アルコキシル基、ハロゲン原子（ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、シアノ基、ニトロ基、置換基を有することもあるアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、Ｃ_１−６アルカノイル基、Ｃ_１−６ハロアルカノイル基、アロイル基、水酸基、アルキレンジオキシ基などを置換基として用いることができる。
Ｒ^１又はＲ^２としては置換フェニル基が好ましく、モノ置換フェニル基がより好ましい。モノ置換フェニル基としては、無置換のアミノ基又は水酸基を有するフェニル基が特に好適である。置換基の置換位置としては、オルト位又はパラ位が好ましい。Ｒ^３が示す２−カルボキシフェニル基のベンゼン環は１個又は２個以上の置換基を有していてもよい。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。ベンゼン環上の置換基としては上記のアリール基について説明した基を用いることができ、Ｒ^３としては無置換の２−カルボキシフェニル基が好ましい。
上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の試薬及び測定方法に好適に使用できる。また、遊離形態の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。なお、本発明の式（ＩＩ）の化合物は分子内でラクトン環を形成することがあるが、ラクトン環を形成した化合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。また、上記ラクトン形成に基づく光学活性体も本発明の範囲に包含される。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、一般的には、対応のクマリン化合物（一般式（Ｉ）においてＲ^１が水素原子である化合物）又はフルオレセイン化合物（一般式（ＩＩ）においてＲ^２が水素原子である化合物）をアリール化することにより製造することができる。一般的には、クマリン化合物又はフルオレセイン化合物のアルカリ金属塩を調製しておき、適当な溶媒中で塩化銅の存在下にヨウ化アリール化合物と反応させればよい。本発明の上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を下記のスキームに示す。また、本明細書の実施例には、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具体的に示されている。従って、当業者は実施例の具体的説明を基にして、出発原料及び反応試薬を適宜選択し、必要に応じて反応条件や工程を適宜変更ないし修飾することにより、本発明の化合物をいずれも製造することが可能である。

なお、反応工程において特定の官能基を必要に応じて保護して反応を行うことにより、目的物を効率的に製造することができる場合があるが、保護基については、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１）などに詳しく説明されており、当業者は適宜の保護基を選択することが可能である。
また、上記製造法における生成物の単離、精製は通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ行うことができる。また、上記工程における製造中間体は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。本発明の化合物の塩を製造する場合には、上記製造法においてそれぞれの化合物の塩が得られる場合はそのまま精製すればよればよく、遊離形態の化合物が得られる場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁した後、塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて精製を行えばよい。
上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される本発明の化合物又はその塩は、緩和な条件下、例えば生理的条件下で活性酸素と反応して、脱アリール体であるクマリン化合物（一般式（Ｉ）においてＲ^１が水素原子である化合物に相当する）若しくはフルオレセイン化合物（一般式（ＩＩ）においてＲ^２が水素原子である化合物に相当する）又はそれらの塩を与える性質を有している。一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又はその塩は実質的に非蛍光性であり、一方、脱アリール化されたクマリン化合物若しくはフルオレセイン化合物又はそれらの塩は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を活性酸素と反応させた後、脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光を測定することによって、活性酸素を選択的かつ高感度に測定することが可能である。

（式中、Ｒ^４はｐ−アミノ基、ｏ−アミノ基、ｐ−ヒドロキシ基、ｏ−ヒドロキシ基などを示し、活性酸素種（ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）は一重項酸素又はヒドロキシラジカルなどである）
本発明の試薬により測定可能な活性酸素の種類は特に限定されず、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素などのいずれも測定可能であるが、特に一重項酸素及びヒドロキシラジカルを高感度かつ選択的に測定することができる。例えば、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又はその塩を活性酸素測定用試薬として用いると、個々の細胞や特定の組織中に局在する活性酸素を正確にかつ簡便に測定できる。
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素の測定方法は、一般的には、（Ａ）上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び（Ｂ）上記工程（Ａ）で生成した脱アリール化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ^１が水素原子である化合物又は上記一般式（ＩＩ）においてＲ^２が水素原子である化合物に相当する）又はその塩の蛍光を測定する工程を含んでいる。
脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましいが、定量的なヒドロキシラジカルの発生系として、例えば、ガンマーラジオリシス法などを利用することができ、一重項酸素の発生系として、例えば、ナフタレンエンドパーオキシド系（Ｓａｉｔｏ，Ｉ，．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７，ｐｐ．６３２９−６３３４，１９８５）などを利用することができる。本発明の試薬は細胞内に取り込まれる性質を有しており、個々の細胞内に局在する活性酸素をバイオイメージング手法により高感度に測定できる。
また、本発明の化合物又はその塩の特徴を別の面からみれば、ペルオキシダーゼなど酵素反応に活性酸素が関与する酵素の酵素活性を特異的に測定できることから、本発明の化合物又はその塩を含む試薬はペルオキシダーゼなどの活性酸素に関与する酵素の酵素活性を測定するための試薬として有用である。
本発明の活性酸素測定用試薬としては、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：ｓｓ−３（一般式（Ｉ）においてＲ^１がｐ−アミノフェニル基である化合物）の合成
１）４−ヨードアセトアニリドの合成
４−ヨードアニリン１１．０ｇ（５０．４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル６０ｍＬに溶かし、そこに無水酢酸１０ｍＬ（１０．８ｇ、１０６ｍｍｏｌ）、ピリジン７．８ｍＬ（７．６５ｇ、９９．４ｍｍｏｌ）を加え、ＣａＣｌ_２管をつけて室温下２時間攪拌した。溶媒を減圧溜去することにより、４−ヨードアセトアニリドを得た（収量：１３．０ｇ，収率：９９．０％）。
ｍ．ｐ．１７４．５℃−１７５．５℃。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６）；δ ２．０４（ｓ，３Ｈ）、７．４６（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ）、９．２１（ｂｒ，１Ｈ）
ＥＩ Ｍａｓｓ（Ｍ）^＋＝２６１
２）ｐｒｅ ｓｓ−３（アセチル）の合成
カリウムｔ−ブトキシド１２３ｍｇ（１．１０ｍｍｏｌ）をベンゼン８ｍＬ／メタノール３ｍＬの混合液に溶かした。その後、７−ヒドロキシクマリン１９６ｍｇ（１．２１ｍｍｏｌ）を加え攪拌して溶かした。その後、減圧溜去により溶媒を除き、７−ヒドロキシクマリンカリウム塩を得た。この７−ヒドロキシクマリンカリウム塩の入った２５ｍＬナスフラスコに４−ヨードアセトアニリド１．１１ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）をピリジン１２ｍＬに溶かした溶液と、塩化第一銅１２４ｍｇ（１．２５ｍｍｏｌ）とを加え、アルゴン気流下で９時間４５分間加熱還流を行った。室温まで放冷してから、反応液に水５５ｍＬを加え、さらに濃塩酸を加えて酸性にした。酢酸エチル（７５ｍＬｘ４）で抽出し、集めた有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２回、展開溶媒はいずれも酢酸エチルのみ）により精製し、ｐｒｅ ｓｓ−３（アセチル）を黄色結晶として得た（収量：６８．７ｍｇ，収率：２１．２％）。
ｍ．ｐ．１９７．０℃−１９９．０℃。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６）；δ ２．０８（ｓ，３Ｈ）、６．２７（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ）、６．７９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．９２（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．６５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．９３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＥＩ Ｍａｓｓ（Ｍ）^＋＝２９５
３）ｓｓ−３の合成
ｐｒｅ ｓｓ−３（アセチル）６７ｍｇ（０．２２７ｍｍｏｌ）を１．２規定塩酸２０ｍＬに加え、完全に密閉系にしてから３時間加熱還流し、その後１時間３０分間室温で攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６５ｍＬを加え、酢酸エチル（７５ｍＬｘ４）で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン／酢酸エチル＝３／１）により精製し、ｓｓ−３を黄色結晶として得た（収量：３８．０ｍｇ，収率：６６．２％）。
ｍ．ｐ．１３２．５℃−１３３．５℃。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６）；δ ４．５７（ｂｒ，２Ｈ）、６．１０（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ）、６．６０−６．７８（ｍ，５Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＥＩ Ｍａｓｓ（Ｍ）^＋＝２５３
例２：ｓｓ−１Ｆ（一般式（ＩＩ）においてＲ^２がｐ−ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ^３が２−カルボキシフェニル基である化合物）の合成
１）４−ｔｅｒｔ−ブトキシヨードベンゼンの合成
４−ヨードフェノール１８．７ｇ（８５．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１５０ｍＬに溶かし、氷冷下で飽和するまでイソブテンをバブルした。その後、濃硫酸１０滴を加え室温で一晩攪拌した。反応液を２規定水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌで２回洗い、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧溜去することにより４−ｔｅｒｔ−ブトキシヨードベンゼンを白色結晶として得た（収量：１６．６ｇ，収率：７０．７％）。
ｍ．ｐ．４０．０℃−４１．５℃。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ ＣＤＣｌ_３）；δ １．３３（ｓ，９Ｈ）、６．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．５５（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．４Ｈｚ，２Ｈ）
ＥＩ Ｍａｓｓ（Ｍ）^＋＝２７６
２）ｐｒｅ ｓｓ−１Ｆ（ｔ−ブチル）の合成
フルオレセインナトリウム３．７５ｇ（９．９７ｍｍｏｌ）、塩化第一銅３．９２ｇ（３９．６ｍｍｏｌ）、４−ｔｅｒｔ−ブトキシヨードベンゼン８．０５ｇ（２９．２ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍｌに加え、アルゴン気流下で１０時間１５分加熱還流した。反応液に水５０ｍｌ、濃塩酸８０ｍｌを加え酸性にした後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝１／１）で精製し、ｐｒｅ ｓｓ−１Ｆ（ｔ−ブチル）を黄色固体として得た（収量：１９．６ｍｇ，収率：０．４％）。
ｍ．ｐ．１３６．０℃−１３８．０℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ ＣＤ_３ＣＮ）；δ １．３３（ｓ，９Ｈ）、６．６２−６．８２（ｍ，６Ｈ）、７．０６（ｍ，４Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．７１−７．８３（ｍ，２Ｈ）、７．９８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）
ＦＡＢ Ｍａｓｓ（Ｍ＋１）^＋＝４８１
３）ｓｓ−１Ｆの合成
ｐｒｅ ｓｓ−１Ｆ（ｔ−ブチル）９．８ｍｇ（２０．４μｍｏｌ）を２，２，２−トリフルオロエタノール１０ｍＬに溶かし、氷冷下トリフルオロメタンスルホン酸の希釈液を５滴加え、アルゴン気流下、氷冷下で２５分間攪拌した。反応終了後、反応液にジクロロメタン４０ｍＬを加え、水（２回）、飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、溶媒を減圧溜去し、ｓｓ−１を黄色結晶として得た（収量：６．６ｍｇ，収率：７６．９％）。
ｍ．ｐ．１２７．０℃−１２９．０℃。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６）；δ ６．４８−６．６７（ｍ，６Ｈ）、６．７９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．１７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．５８−７．７１（ｍ，２Ｈ）、７．８６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＦＡＢ Ｍａｓｓ（Ｍ＋１）^＋＝４２５
例３：ｓｓ−３Ｆ（一般式（ＩＩ）においてＲ^２がｐ−アミノフェニル基であり、Ｒ^３が２−カルボキシフェニル基である化合物）の合成
１）４−ヨードトリフルオロアセトアニリドの合成
４−ヨードアニリン２５．０ｇ（１１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１００ｍｌ溶液に、トリフルオロ無水酢酸３６．０ｍｌ（２１６ｍｍｏｌ，４５．０ｇ）及びピリジン１７．０ｍｌ（２１０ｍｍｏｌ，１６．６ｇ）を氷冷下で加え、発煙及び発熱が終結するまで氷冷下攪拌した。その後、直ちに室温に戻し、引き続き１９時間攪拌した。溶媒を減圧溜去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル）で精製し、４−ヨードトリフルオロアセトアニリドを薄褐色固体として得た（収量：３４．１ｇ，収率：９４．８％）。
ｍ．ｐ．１４８．５−１４９．０℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３／ＴＭＳ）；δ ７．３５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｂｒ，１Ｈ）
ＥＩ Ｍａｓｓ（Ｍ）^＋＝３１５
２）Ｎ’−トリフルオロアセチル−ｓｓ−３Ｆ（ＴＦＡ塩）の合成
フルオレセインナトリウム３．７７ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）をジメチルアセトアミド５０ｍｌに溶かし、２０分間攪拌した。これに４−ヨードトリフルオロアセトアニリド１２．８ｇ（４０．５ｍｍｏｌ）のピリジン６０ｍｌ溶液を混合し、さらに塩化銅２．５５ｇ（２５．８ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン気流下９時間加熱還流した。この反応溶液を室温まで放冷した後、水１００ｍｌを加え、さらに濃塩酸６５ｍｌを加えて酸性にした。これを酢酸エチルで３回抽出し、有機層を集めて飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウム上で乾燥させて溶媒を減圧溜去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝１／１）で精製し、プレｓｓ−３Ｆ（ＴＦＡ）を黄色固体として得た（収量：７６．６ｍｇ，収率：１．４８％）。
ｍ．ｐ．１１６．５−１１８．５℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）；δ ６．５７−６．８７（ｍ，６Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．８２（ｍ，４Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＦＡＢ Ｍａｓｓ（Ｍ＋１）^＋＝５２０
３）ｓｓ−３Ｆの合成
プレｓｓ−３Ｆ（ＴＦＡ）７６．６ｍｇ（０．１４８ｍｍｏｌ）及び無水炭酸カリウム９０．３ｍｇをエタノール２０ｍｌ及び水１．２ｍｌの混合液に溶解して４時間加熱還流した。この溶液を室温まで放冷した後、エタノール及び水を減圧溜去した。残渣に水２０ｍｌを加え、さらに２Ｎ塩酸１０ｍｌを加えて酸性にした（ｐＨ１）。これをジクロロメタンで２回抽出し、有機層を集めて溶媒を減圧溜去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝１／１）で精製し、ｓｓ−３Ｆを黄色固体として得た（収量：１３．６ｍｇ，収率：２１．８％）。
ｍ．ｐ．１５３．５−１５５．０℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６）；δ ６．６０−６．８９（ｍ，１０Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＦＡＢ Ｍａｓｓ（Ｍ＋１）^＋＝４２４
例４
１）蛍光スペクトル
例３で得られたｓｓ−３ＦをＤＭＦに１０ｍＭの濃度に溶解した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて最終濃度が１０μＭになるように溶解した。この１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを、日立製蛍光光時計Ｆ４５００を用いて測定した。この際、スリット幅は励起スペクトル及び蛍光スペクトルともに２．５ｎｍ、フォトマル電圧は９５０Ｖを用い、特に言及しない場合には励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで測定した。結果を第１図に示す。第１図より明らかなように、ｓｓ−３Ｆそれ自体は蛍光を有さないことが確認された。
次に、ｓｓ−３Ｆと一重項酸素との反応を調べるために、１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が１ｍＭ、２ｍＭ及び５ｍＭになるようにＥＰ−１（一重項酸素の発生系であるナフタレンエンドパーオキシド系化合物：Ｓａｉｔｏ，Ｉ，．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７，ｐｐ．６３２９−６３３４，１９８５）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を加えて、蛍光強度の時間変化を測定した（ＥＰ−１系）。ただし、この時の溶液の温度は３７℃とした。結果を第２図に示す。また、反応終了後の溶液の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを上記と同様の条件で測定した。結果を第３図に示す。第２図から明らかなように、ｓｓ−３ＦとＥＰ−１を共存させた場合、ＥＰ−１の濃度及び時間依存的に蛍光強度の上昇が認められた。さらに第３図においても蛍光の発生が認められｓｓ−３Ｆが一重項酸素との反応により蛍光を生じることが確認された。
さらに、ｓｓ−３Ｆとヒドロキシラジカルとの反応を調べるために、１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が１ｍＭになるように過酸化水素を加え、その後１回につき最終濃度が１００μＭになるように計５回、過塩素酸第一鉄を加え、蛍光強度の時間変化を測定した（Ｆｅｎｔｏｎ系）。結果を第４図に示す。第４図から明らかなように、過塩素酸第一鉄添加の度に蛍光強度の上昇が認められ、ｓｓ−３Ｆがヒドロキシラジカルとの反応により、蛍光を生じることが確認された。
２）吸光スペクトル
ｓｓ−３ＦをＤＭＦに１０ｍＭの濃度に溶解した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて最終濃度が１０μＭになるように溶解した。この１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液の吸光スペクトルを測定した。結果を第５図に示す。ｓｓ−３Ｆは４５５ｎｍ付近に吸収極大を有することが確認された。
３）ＨＰＬＣスペクトル
以下に示す溶液をＨＰＬＣで分析した。カラムはＸＴｅｒｒａ^ＴＭＲＰ_１８５μｍ（４．６×２５０ｍｍ）を使用し、溶出液はアセトニトリル／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３水溶液＝１／１（０．１％のトリフルオロ酢酸を含む）、溶出速度は１ｍｌ／分とし、４６０ｎｍの吸光度を測定した。
（Ａ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液
（Ｂ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が５ｍＭになるようにＥＰ−１を加えて、３７℃で８時間反応させた反応溶液
（Ｃ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が１ｍＭになるように過酸化水素を加え、さらに最終濃度が５００μＭになるように過塩素酸第一鉄を加えて、約３時間室温に放置した溶液
（Ｄ）１μＭ フルオレセイン溶液
ｓｓ−３Ｆ単独の場合（Ａ）、保持時間３．０分にピークが検出された。一重項酸素発生系である（Ｂ）では（Ａ）と異なる２．３分のピークが、ヒドロキシラジカル発生系である（Ｃ）では（Ａ）と異なる２．３分のピークが検出された。（Ｂ）、（Ｃ）で検出されたピークは、フルオレセイン（Ｄ）のピーク２．３分と一致した。以上により、ｓｓ−３Ｆは一重項酸素あるいはヒドロキシラジカルと反応し、フルオレセインが生成することが確認された。
例５：
１）蛍光スペクトル
例１で得られたｓｓ−３を、励起波長は３７０ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍで測定する以外は例４の１）と同様の条件で蛍光スペクトルを測定した。ＥＰ−１が存在しない場合の結果を第７図に、ＥＰ−１との反応終了後の溶液の蛍光スペクトルの結果を第８図に示した。第７図及び第８図より明らかなように、ｓｓ−３それ自体は実質的に蛍光を有さず、一重項酸素との反応により蛍光を生じることが確認された。
例６：各活性酸素種との反応（特異）性の比較
本発明の化合物ｓｓ−１Ｆ、ｓｓ−３Ｆについて試験した。活性酸素種検出用試薬として市販されているＤＣＨＦ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート；モレキュラー・プローブス社、Ｄ−３９９）を加水分解することにより生成するＤＣＨＦ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン）を対照として使用した。ＤＣＨＦ−ＤＡをステファンらの方法（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｌ．Ｈｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２７，１４６−１５９，１９９９）に準じてアルカリ性下、加水分解してＤＣＨＦを得た。即ち、暗所においてＤＣＨＦ−ＤＡをｐＨ１２の水酸化ナトリウム水溶液で３０分間処理後、直ちに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１０μＭとなるよう希釈した。１０μＭ ＤＣＨＦ溶液は調整後、直ちに試験に使用した。ｓｓ−１Ｆ、ｓｓ−３Ｆも１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１０μＭ溶液を調整し試験に使用した。ｓｓ−１Ｆ、ｓｓ−３Ｆ、ＤＣＨＦのそれぞれをａ〜ｆの条件で３０分（ｆのみ２時間３０分）処理し、処理前後の蛍光強度の変化を測定した。蛍光強度の測定は例４と同様の条件で行なった。蛍光プローブの濃度はいずれも１０μＭ（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．４）とした。結果を表１に示す。

ＤＣＨＦはヒドロキシラジカル（条件ａ）をはじめ、その他の活性酸素種ともよく反応した。また、本来反応することが望ましくない自動酸化（条件ｆ）に対する反応性も同様に強かった。一方、ｓｓ−１Ｆおよびｓｓ−３Ｆは自動酸化（条件ｆ）を全く受けず、さらにヒドロキシラジカルに強い反応性を有していた。例７：ペルオキシダーゼ活性の特異的な検出
本発明の化合物ｓｓ−１Ｆあるいはｓｓ−３ＦをＤＭＦに１０ｍＭの濃度に溶解した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて最終濃度が１０μＭになるよう溶解した。このｓｓ−１Ｆあるいはｓｓ−３Ｆ溶液に、最終濃度が０．２μＭになるよう西洋ワサビペルオキシダーゼの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、さらに最終濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．０、５．０μＭになるよう過酸化水素を添加し、直ちに蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光波長５１５ｎｍで測定する以外は例４の１）と同様の条件で測定した。結果を第９図に示した。第９図より明らかなようにｓｓ−１Ｆおよびｓｓ−３Ｆとも、過酸化水素濃度０〜５．０μＭの範囲で濃度依存的な蛍光強度の上昇が認められた。
既に例６の結果より、ｓｓ−１Ｆおよびｓｓ−３Ｆは過酸化水素自体とは反応せず、また自動酸化も受けないことが分かっている。従って、本例７の結果より、本発明の化合物はペルオキダーゼ活性のみを特異的に測定できることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明の化合物は、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素の測定用試薬として有用である。本発明の化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法は、特に生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって正確かつ簡便に測定するための試薬及び測定方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、例３で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３Ｆ）１０μＭ溶液の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
第２図は、例３で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３Ｆ）１０μＭ溶液に一重項酸素発生系であるＥＰ−１を添加して蛍光強度の時間変化を測定した結果を示す。
第３図は、第２図に示した反応終了後の溶液の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
第４図は、例３で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３Ｆ）１０μＭ溶液にヒドロキシラジカルの発生系である過酸化水素及び過塩素酸第一鉄を加えて蛍光強度の時間変化を測定した結果を示す。
第５図は、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した本発明の化合物（ｓｓ−３Ｆ）１０μＭの吸光スペクトルを示す。
第６図は、例３で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３Ｆ）を含む溶液をＨＰＬＣで分析した結果を示す。図中、（Ａ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液；（Ｂ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が５ｍＭになるようにＥＰ−１を加えて、３７℃で８時間反応させた反応溶液；（Ｃ）１０μＭ ｓｓ−３Ｆ溶液に最終濃度が１ｍＭになるように過酸化水素を加え、さらに最終濃度が５００μＭになるように過塩素酸第一鉄を加えて、約３時間室温に放置した溶液；（Ｄ）１μＭフルオレセイン溶液の結果を示す。
第７図は、例１で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３）１０μＭ溶液の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
第８図は、例１で得られた本発明の化合物（ｓｓ−３）１０μＭ溶液と一重項酸素の反応終了後の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
第９図は、本発明の化合物（ｓｓ−１Ｆ及びｓｓ−３Ｆ）とＨＲＰ／Ｈ_２Ｏ_２との反応性を検討した結果を示す。図中、（Ａ）はｓｓ−１Ｆ、（Ｂ）はｓｓ−３Ｆの結果を示す。図中の数字はＨ_２Ｏ_２濃度を示す。

Claims (9)

1. 下記の一般式(I)又は(II)：
   

   

   （式中、R¹及びR²はそれぞれ独立にモノ置換フェニル基を示し、R³は置換基を有していてもよい2-カルボキシフェニル基を示す(ただし、該モノ置換フェニル基の置換基及び該2-カルボキシフェニル基が置換基を有する場合の該置換基はC _1-6 アルキル基、C _1-6 ハロアルキル基、C _1-6 アルケニル基、C _1-6 アルコキシル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、C _1-6 アルカノイル基、C _1-6 ハロアルカノイル基、アロイル基、水酸基、及びアルキレンジオキシ基からなる群から選ばれる置換基である)）で表される化合物又はその塩。
2. R¹及びR²がアミノ基又は水酸基で置換されたフェニル基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
3. R³が2-カルボキシフェニル基である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬。
5. 活性酸素の測定方法であって、下記の工程：
   (A) 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び
   (B) 上記工程(A)で生成した脱アリール化合物又はその塩の蛍光を測定する工程
   を含む方法。
6. 酵素活性に活性酸素が関与する酵素の酵素活性を測定する方法であって、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を用いる方法。
7. 酵素がペルオキシダーゼである請求項６に記載の方法。
8. 酵素活性に活性酸素が関与する酵素の酵素活性を測定するための試薬であって、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む試薬。
9. 酵素がペルオキシダーゼである請求項８に記載の試薬。

Images