CN1182128C - 活性氧测定用试剂 - Google Patents

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Abstract

下述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐，以及含有该化合物或其盐的活性氧测定用试剂。(式中，R1和R2分别独立地表示可以具有取代基的芳基(被氨基或羟基取代的苯基等)，R3表示可以具有取代基的2-羧基苯基)。

Description

活性氧测定用试剂
技术领域
本发明涉及作为活性氧测定用试剂有用的化合物或其盐。另外，本发明还涉及含有上述化合物或其盐的活性氧测定用试剂。
背景技术
已知在生物体和生命现象中，一氧化氮等游离基种作为信息传递的第二信使发挥作用，在循环系统中发挥控制血压等多种生理作用。游离基种之一的活性氧是超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、单线态氧等的总称，其中已经明确超氧阴离子和过氧化氢在免疫系统等中发挥着重要的生理作用。另一方面，也报道了很多羟基自由基参与血管障碍或缺血后的脑障碍或者紫外线引起的DNA修饰的发现，认为在与病因和病态的关系上是障碍性特别高的活性氧种。关于单线态氧，以前其作用等几乎都不明确，最近，获得了提示它是癌治疗法之一的光动力疗法(photodynamic therapy)的反应种，以及生物体内的各种氧化酶、过氧化物酶生成单线态氧的知识，暗示了其担任重要生理作用的可能性。
因此，明确活性氧在生物体内的作用的重要性日益增高，关于其测定方法的课题很多。对于测定羟基自由基的方法，有采用电子自旋共振(ESR)法进行测定的多种报道，但是按照ESR法使用活细胞作为测定试样本身是很困难的，各个细胞水平上的测定评价实际上是不可能的。另一方面，已知将能够广泛测定活性氧种的DCHF-DA(2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯，Molecular Probes公司，商品目录序号D-399)与其它活性氧种生成抑制剂一起使用并在显微镜下检测羟基自由基的方法，但是抑制剂共存下的结果包含了与生物体内反应不同的要素。另外，由于DCHF-DA非常容易受自动氧化，有必要对同一视野进行几次观察时，自动氧化产生的背景荧光会妨碍检测。而且，在必需于暗处操作等操作性、保存性方面，是非常不方便的方法。
作为测定单线态氧的方法，已知化学发光法、ESR法、发光法等十几种，但是特异性和灵敏度均很低，不能说是可信的方法(关于单重氧的特异性检测法，参照Nagano，T.，et al.，Free radicals inClinical Medicine，Vol.7，pp.35-41，1993等)。也能够将上述DCHF-DA用于单线态氧的测定，但是并没有消除DCHF-DA自身具有的问题。因此，需要开发在活性氧种的研究中能够使用的特异性和灵敏度优良，而且操作简便的测定方法。
发明公开
本发明的课题在于提供一种作为羟基自由基、单线态氧等活性氧的测定用试剂有用的化合物。另外，本发明的另一课题在于提供含有上述化合物的活性氧测定用试剂以及使用上述化合物的活性氧测定方法。特别是提供一种用于采用生物显象术的方法准确且简便地测定局部存在于生物体内的特定细胞或组织中的活性氧的试剂是本发明的课题。
本发明人为了解决上述课题进行了不懈努力，成功地提供了对于单线态氧特异的检测试剂(国际公开99/51586)。本发明人进一步进行研究，结果发现下述通式(I)或(II)表示的实质上为非荧光性的化合物与活性氧在生理条件下有效反应得到脱芳基化的荧光性化合物；以及使用通式(I)或(II)表示的化合物作为羟基自由基或单线态氧测定用试剂，测定与局部存在于活细胞或生物体组织中的活性氧反应生成的脱芳基化合物的荧光，能够非常特异性且高灵敏度地测定活性氧；而且，通式(I)或(II)表示的化合物完全不被自动氧化。基于这些发现完成了本发明。
也就是说，本发明提供下述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐，
(式中，R1和R2分别独立地表示可以具有取代基的芳基，R3表示可以具有取代基的2-羧基苯基)。按照本发明的优选方式，提供R1和R2为被氨基或羟基取代的苯基的上述化合物或其盐；以及R3为2-羧基苯基的上述化合物或其盐。
从另一观点来看，本发明提供含有上述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐的活性氧测定用试剂。而且，按照本发明还提供活性氧的测定方法，包括下述步骤：(A)使上述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐与活性氧反应的步骤，以及(B)测定上述步骤(A)中生成的脱芳基化合物(上述通式(I)中R1为氢原子的化合物或上述通式(II)中R2为氢原子的化合物)或其盐的荧光的步骤。
图面的简单说明
图1表示实施例3得到的本发明化合物(ss-3F)10μM溶液的激发光谱和荧光光谱。
图2表示向实施例3得到的本发明化合物(ss-3F)10μM溶液中添加单线态氧发生系统——EP-1，测定荧光强度的时间变化的结果。
图3表示图2所示反应结束后的溶液的激发光谱和荧光光谱。
图4表示向实施例3得到的本发明化合物(ss-3F)10μM溶液中添加羟基自由基发生系统——过氧化氢和高氯酸亚铁，测定荧光强度的时间变化的结果。
图5表示溶解于磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的本发明化合物(ss-3F)10μM的吸光光谱。
图6表示采用HPLC对含有实施例3得到的本发明化合物(ss-3F)的溶液进行分析得到的结果。图中，(A)表示10μM ss-3F溶液的结果；(B)表示向10μM ss-3F溶液中加入EP-1使最终浓度达到5mM，在37℃下反应8小时得到的反应溶液的结果；(C)表示向10μMss-3F溶液中加入过氧化氢使最终浓度达到1mM，再加入高氯酸亚铁使最终浓度达到500μM，在室温下放置约3小时得到的溶液的结果；(D)表示1μM荧光素溶液的结果。
图7表示实施例1得到的本发明化合物(ss-3)10μM溶液的激发光谱和荧光光谱。
图8表示实施例1得到的本发明化合物(ss-3)10μM溶液与单线态氧反应结束后的激发光谱和荧光光谱。
图9表示讨论本发明化合物(ss-1F和ss-3F)与HRP/H2O2的反应性的结果。图中，(A)表示ss-1F的结果，(B)表示ss-3F的结果。图中的数字表示H2O2浓度。
发明的最佳实施方式
日本专利申请第2000-54557号说明书的公开作为参照全部包括在本说明书的公开中。
作为R1和R2表示的芳基，可以使用例如成环原子数约为6～14个的单环性、二环性或三环性芳基。优选使用苯基或萘基，更优选使用苯基。芳基可以在环上具有1个或2个以上的取代基。具有2个以上的取代基时，这些取代基可以相同也可以不同。取代基的种类和取代位置没有特别的限定，例如可以使用C1-6烷基(烷基可以是直链状、支链状、环状或其组合的任意一种。具有烷基部分的其它取代基的烷基部分也同样)、C1-6卤代烷基、C1-6烯基、C1-6烷氧基、卤素原子(作为卤素原子，可以是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一种)、氰基、硝基、有时具有取代基的氨基、羧基、烷氧基羰基、C1-6烷酰基、C1-6卤代烷酰基、芳酰基、羟基、亚烷基二氧基等作为取代基。
作为R1或R2优选取代苯基，更优选单取代苯基。作为单取代苯基，具有未取代的氨基或羟基的苯基特别合适。作为取代基的位置，优选邻位或对位。R3表示的2-羧基苯基的苯环也可以具有1个或2个以上的取代基。具有2个以上的取代基时，这些取代基可以相同也可以不同。作为苯环上的取代基，可以使用关于上述芳基中记述的基团，作为R3优选未取代的2-羧基苯基。
有时上述通式(I)或(II)的化合物作为盐存在。作为盐，可以例举碱加成盐、酸加成盐、氨基酸盐等。作为碱加成盐，可以例举钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐，铵盐，或三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐等有机胺盐；作为酸加成盐，可以例举盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐，甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、枸橼酸盐、草酸盐等有机酸盐。作为氨基酸盐，可以例举甘氨酸盐等。当然，本发明的化合物的盐并不限于此。
其中，生理学上允许的水溶性盐能够优选用于本发明的试剂以及测定方法。另外，游离形态的通式(I)或(II)的化合物或其盐有时作为水合物或溶剂合物存在，这些物质也均包括在本发明的范围内。形成溶剂合物的溶剂的种类没有特别的限定，可以例举乙醇、丙酮、异丙醇等溶剂。
通式(I)或(II)表示的化合物有时根据取代基的种类具有1个或2个以上的手性碳，有时存在光学异构体或非对映异构体等立体异构体。纯形态的立体异构体、立体异构体的任意混合物、消旋体等均包括在本发明的范围内。另外，本发明式(II)的化合物有时会在分子内形成内酯环，形成内酯环的化合物当然也包括在本发明的范围内。另外，基于上述内酯环的形成产生的光学活性体也包括在本发明的范围内。
通式(I)或(II)表示的本发明化合物一般可以通过将对应的香豆素化合物(通式(I)中R1为氢原子的化合物)或荧光素化合物(通式(II)中R2为氢原子的化合物)芳基化制备。一般情况下，可以制备香豆素化合物或荧光素化合物的碱金属盐，在适当的溶剂中在氯化铜存在下使之与碘化芳基化合物反应。本发明的上述通式(I)或(II)所示化合物的代表性化合物的制备方法如下述方案所示。另外，在本说明书的实施例中，更详细且具体说明该方案记载的制备方法。因此，本领域技术人员以实施例的具体说明为基础，适当选择初始原料和反应试剂，根据需要适当变更反应条件和步骤或进行修饰，能够制备本发明化合物的任意一种。
Figure C0180584700081
另外，有时通过在反应步骤中根据需要保护特定的官能团进行反应，能够有效制备目的物，关于保护基，在Protective Groups inOrganic Synthesis，T.W.Green，John Wiley & Sons，Inc.，1981等中有详细说明，本领域技术人员能够选择适当的保护基。
另外，上述制备方法的产物的分离、精制可以将通常有机合成中采用的方法，例如过滤、萃取、洗涤、干燥、浓缩、结晶、各种层析等适当组合进行。另外，上述步骤中的制备中间体也可以不进行特别精制直接供于以下的反应。制备本发明化合物的盐的场合，在上述制备方法中得到各化合物的盐时，可以直接精制，得到游离形态的化合物时，可以将游离形态的化合物溶解或悬浊于适当的溶剂后，加入碱使之形成盐，根据需要进行精制。
上述通式(I)或(II)表示的本发明化合物或其盐具有在缓和条件下，例如生理条件下与活性氧反应，得到脱芳基体——香豆素化合物(相当于通式(I)中R1为氢原子的化合物)或荧光素化合物(相当于通式(II)中R2为氢原子的化合物)或者它们的盐的性质。通式(I)或(II)的化合物或它们的盐实质上是非荧光性的，另一方面，脱芳基得到的香豆素化合物或荧光素化合物或者它们的盐具有发出高强度荧光的性质。因此，使上述式(I)或(II)表示的化合物或其盐与活性氧反应后，通过测定脱芳基得到的化合物或其盐的荧光，能够选择性且高灵敏度地测定活性氧。
(式中，R4表示对位氨基、邻位氨基、对位羟基、邻位羟基等，活性氧种(active oxygen species)为单线态氧或羟基自由基等。)
采用本发明的试剂能够测定的活性氧的种类没有特别的限定，超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧、过氧化氢等均能够测定，特别是能够高灵敏度且选择性地测定单线态氧和羟基自由基。例如，使用通式(I)或(II)的化合物或其盐作为活性氧测定用试剂，能够准确且简便地测定局部存在于各细胞或特定组织中的活性氧。
本说明书中使用的“测定”这一用语包括以定量、定性或诊断等目的进行的测定、检查、检测等，必须是最广义的解释。本发明的活性氧的测定方法包括(A)使上述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐与活性氧反应的步骤，以及(B)测定上述步骤(A)中生成的脱芳基化合物(相当于上述通式(I)中R1为氢原子的化合物或上述通式(II)中R2为氢原子的化合物)或其盐的荧光的步骤。
测定脱芳基得到的化合物或其盐的荧光能够按照通常的方法进行，可以采用体外测定荧光光谱的方法，或者利用生物显象术的方法在体内测定荧光光谱的方法等。例如进行定量的场合，优选按照常规方法制作标准曲线，作为定量的羟基自由基发生系统，可以利用例如γ-辐射分解法，作为单线态氧的发生系统，可以利用例如萘内过氧化物体系(Saito，I.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，107，pp.6329-6334，1985)等。本发明的试剂具有摄入细胞内的性质，采用生物显象术方法能够高灵敏度地测定局部存在于各细胞内的活性氧。
另外，如果从另一方面来看本发明化合物或其盐的特征，由于能够特异地测定过氧化物酶等酶反应中与活性氧有关的酶的酶活性，含有本发明的化合物或其盐的试剂作为用于测定过氧化物酶等与活性氧有关的酶的酶活性的试剂是有用的。
作为本发明的活性氧测定用试剂，可以直接使用上述式(I)或(II)表示的化合物或其盐，也可以根据需要配合制备试剂通常使用的添加剂作为组合物使用。例如，作为为了在生理环境下使用试剂的添加剂，可以使用溶解助剂、pH调节剂、缓冲剂、等渗剂等添加剂，其配合量可以由本领域技术人员适当选择。这些组合物可以作为粉末形态的混合物、冷冻干燥物、颗粒剂、片剂、液体制剂等适当形态的组合物提供。
实施例
以下，结合实施例更具体的说明本发明，但是本发明的范围并不限定于下述实施例。
实施例1：ss-3(通式(I)中R1为对氨基苯基的化合物)的合成
1)4-碘乙酰苯胺的合成
将4-碘苯胺11.0g(50.4mmol)溶解于乙酸乙酯60mL，向其中加入醋酸酐10mL(10.8g，106mmol)、吡啶7.8mL(7.65g，99.4mmol)，安装CaCl2管在室温下搅拌2小时。减压蒸馏除去溶剂，得到4-碘乙酰苯胺(收量：13.0g，收率：99.0％)。
m.p.174.5℃-175.5℃。
1H-NMR(300MHz丙酮-d6)；δ2.04(s，3H)、7.46(dd，J＝9.0Hz，2.2Hz，1H)、7.60(dd，J＝9.0Hz，2.2Hz，1H)、9.21(br，1H)
EI Mass(M)+＝261
2)per ss-3(乙酰基)的合成
将叔丁醇钾123mg(1.10mmol)溶解于苯8mL/甲醇3mL的混合液中。之后，加入7-羟基香豆素196mg(1.21mmol)，搅拌溶解。之后，减压蒸馏除去溶剂，得到7-羟基香豆素钾盐。向装有该7-羟基香豆素钾盐的25ml茄形烧瓶中加入将4-碘乙酰苯胺1.11g(4.26mmol)溶解于吡啶12mL中得到的溶液以及氯化亚铜124mg(1.25mmol)，在氩气流下加热回流9小时45分钟。放冷至室温后，向反应液中加入水55mL，再加入浓盐酸调节为酸性。用乙酸乙酯(75mL×4)萃取，用饱和食盐水洗涤收集的有机层，用Na2SO4干燥后，减压蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱法精制残留物(2次，展开溶剂均仅为乙酸乙酯)，得到黄色晶体状的pre ss-3(乙酰基)(收量：68.7mg，收率：21.1％)。
m.p.197.0℃-199.0℃。
1H-NMR(300MHz丙酮-d6)；δ2.08(s，3H)、6.27(d，J＝9.5Hz，1H)、6.79(d，J＝2.4Hz，1H)、6.92(dd，J＝8.6Hz，2.4Hz，1H)、7.09(d，J＝9.0Hz，2H)、7.65(d，J＝8.6Hz，1H)、7.74(d，J＝9.0Hz，2H)、7.93(d，J＝9.5Hz，1H)
EI Mass(M)+＝295
3)ss-3的合成
将pre ss-3(乙酰基)67mg(0.227mmol)加入到1.2N盐酸20mL中，完全密闭后加热回流3小时，之后在室温下搅拌1小时30分钟。加入饱和碳酸氢钠水溶液65mL，用乙酸乙酯(75mL×4)萃取，用饱和食盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥后，减压蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱法精制残留物(展开溶剂：二氯甲烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到黄色晶体状的ss-3(收量：38.0mg，收率：66.2％)。
m.p.132.5℃-133.5℃。
1H-NMR(300 MHz丙酮-d6)；δ64.57(br，2H)、6.10(d，J＝9.5Hz，1H)、6.60-6.78(m，5H)、7.47(d，J＝8.6Hz，1H)、7.77(d，J＝9.5Hz，1H)
EI Mass(M)+＝253
实施例2：ss-1F(通式(II)中R2为对羟基苯基，R3为2-羧基苯基的化合物)的合成
1)4-叔丁氧基碘苯的合成
将4-碘苯酚18.7g(85.1mmol)溶解于二氯甲烷150mL，在冰冷条件下向其中通入异丁烯达到饱和。之后，加入浓硫酸10滴，在室温下搅拌1夜。用2N氢氧化钠水溶液50ml洗涤反应液2次，用Na2SO4干燥有机层后，减压蒸馏除去溶剂，得到白色晶体状的4-叔丁氧基碘苯(收量：16.6g，收率：70.7％)。
m.p.40.0℃-41.5℃。
1H-NMR(300 MHz CDCl3)；δ1.33(s，9H)、6.75(dd，J＝9.0Hz，2.4Hz，2H)、7.55(dd，J＝9.0Hz，2.4Hz，2H)
EI Mass(M)+＝276
2)per ss-1F(叔丁基)的合成
将荧光素钠3.75g(9.97mmol)、氯化亚铜3.92g(39.6mmol)、叔丁氧基碘苯8.05g(29.2mmol)加入到吡啶50ml中，在氩气流下加热回流10小时15分钟。向反应液中加入水50ml、浓盐酸80ml，调节为酸性后，用二氯甲烷萃取。用饱和食盐水洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥后，减压浓缩。用硅胶柱色谱法精制残留物(展开溶剂：乙酸乙酯/正己烷＝1/1)，得到黄色固体状的pre ss-1F(叔丁基)(收量：19.6mg，收率：0.4％)。
m.p.136.0℃-138.0℃
1H-NMR(300MHz CD3CN)；δ1.33(s，9H)、6.62-6.82(m，6H)、7.06(m，4H)、7.30(d，J＝7.5Hz，1H)、7.71-7.83(m，2H)、7.98(d，J＝6.4Hz，1H)
FAB Mass(M+1)+＝481
3)ss-1F的合成
将pre ss-1F(叔丁基)9.8mg(20.4μmol)溶解于2，2，2-三氟乙醇10mL中，在冰冷条件下加入三氟甲磺酸的稀释液5滴，在氩气流下，冰冷条件下搅拌25分钟。反应结束后，向反应液中加入二氯甲烷40mL，用水(2次)、饱和食盐水洗涤，用Na2SO4干燥后，减压蒸馏除去溶剂，得到黄色晶体状的ss-1(收量：6.6mg，收率：76.9％)。
m.p.127.0℃-129.0℃。
1H-NMR(300 MHz丙酮-d6)；δ6.48-6.67(m，6H)、6.79(d，J＝9.0Hz，2H)、6.87(d，J＝9.0Hz，2H)、7.17(d，5＝7.5Hz，1H)、7.58-7.71(m，2H)、7.86(d，J＝7.5Hz，1H)
FAB Mass(M+1)+＝425
实施例3：ss-3F(通式(II)中R2为对氨基苯基，R3为2-羧基苯基的化合物)的合成
1)4-碘三氟乙酰苯胺的合成
在冰冷条件下，向4-碘苯胺25.0g(114mmol)的二氯甲烷100ml溶液中加入三氟醋酸酐36.0ml(216mmol，45.0g)以及吡啶17.0ml(210mmol，16.6g)，在冰冷条件下搅拌直到发烟和发热结束。之后，立即返回至室温，接着搅拌19小时。减压蒸馏除去溶剂后，用硅胶柱色谱法(洗脱液：乙酸乙酯)精制，得到淡褐色固体状的4-碘三氟乙酰苯胺(收量：34.1g，收率：94.8％)。
m.p.148.5-149.0℃
1H-NMR(300 MHz，CDCl3/TMS)；δ7.35(d，J＝8.8Hz，2H)，7.71(d，J＝8.8Hz，1H)，7.90(br，1H)
EI Mass(M)+＝315
2)N’-三氟乙酰基-ss-3F(TFA盐)的合成
将荧光素钠3.77g(10.0mmol)溶解于二甲基乙酰胺50ml中，搅拌20分钟。向其中混合4-碘三氟乙酰苯胺12.8g(40.5mmol)的吡啶60ml溶液，再加入氯化铜2.55g(25.8mmol)，在氩气流下加热回流9小时。将该反应溶液放冷至室温后，加入水100ml，再加入浓盐酸65ml调节为酸性。将其用乙酸乙酯萃取3次，收集有机层，用饱和食盐水洗涤后，在硫酸钠上干燥，减压蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱法(洗脱液：乙酸乙酯/正己烷＝1/1)精制残渣，得到黄色固体状的前(プレ)ss-3F(TFA)(收量：76.6mg，收率：1.48％)。
m.p.116.5-118.5℃
1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)；δ6.57-6.87(m，6H)，7.18(d，J＝9.0Hz，2H)，7.30(d，J＝7.5Hz，1H)，7.70-7.82(m，4H)，8.00(d，J＝7.5Hz，1H)
FAB Mass(M+1)+＝520
3)ss-3F的合成
将前ss-3F(TFA)76.6mg(0.148mmol)以及无水碳酸钾90.3mg溶解于乙醇20ml和水1.2ml的混合液中，加热回流4小时。将该溶液放冷至室温后，减压蒸馏除去乙醇和水。向残渣中加入水20ml，再加入2N盐酸10ml调节为酸性(pH1)。将其用二氯甲烷萃取2次，收集有机层，减压蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱法(洗脱液：乙酸乙酯/正己烷＝1/1)精制残渣，得到黄色固体状的ss-3F(收量：13.6mg，收率：21.8％)。
m.p.153.5-155.0℃
1H-NMR(300MHz，丙酮-d6)；δ6.60-6.89(m，10H)，7.29(d，J＝7.5Hz，1H)，7.72(td，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，7.80(td，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，7.98(d，J＝7.5Hz，1H)
FAB Mass(M+1)+＝424
实施例4：
1)荧光光谱
将实施例3得到的ss-3F溶解于DMF中达到10mM的浓度后，加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)溶解使最终浓度达到10μM。使用日立制荧光光时计测定该10μM ss-3F溶液的激发光谱和荧光光谱。这时，狭缝宽是激发光谱和荧光光谱均采用2.5nm，光电压采用950V，没有特别说明的场合，在激发波长490nm，荧光波长510nm下进行测定。结果如图1所示。由图1可知，ss-3F自身不具有荧光。
其次，为了考察ss-3F与单线态氧的反应，向10μM ss-3F溶液中加入EP-1(单线态氧的发生系统——萘内过氧化物类化合物：Saito，I.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，107，pp.6329-6334，1985)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液使最终浓度达到1mM、2mM和5mM，测定荧光强度的时间变化(EP-1系统)。其中，这时溶液的温度为37℃。结果如图2所示。另外，在与上述同样的条件下，测定反应结束后的溶液的激发光谱和荧光光谱。结果如图3所示。由图2可知，使ss-3F与EP-1共存时，荧光强度依赖于EP-1的浓度和时间而上升。而且在图3中认为有荧光发生，确认通过ss-3F与单线态氧的反应产生荧光。
而且，为了考察ss-3F与羟基自由基的反应，向10μM ss-3F溶液中加入过氧化氢使最终浓度达到1mM，之后加入高氯酸亚铁共计5次，每次均使最终浓度达到100μM，测定荧光强度的时间变化(Fenton系统)。结果如图4所示。由图4可知，荧光强度随高氯酸亚铁添加的度而上升，确认通过ss-3F与羟基自由基的反应产生荧光。
2)吸光光谱
将ss-3F溶解于DMF中达到10mM的浓度后，加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)溶解使最终浓度达到10μM。测定该10μM ss-3F溶液的吸光光谱。结果如图5所示。确认ss-3F在455nm附近具有极大吸收。
3)HPLC色谱
用HPLC分析以下所示的溶液。柱使用XTerraTM RP185μM(4.6×250mm)，洗脱液为乙腈/0.1M NaHCO3水溶液＝1/1(含有0.1％的三氟醋酸)，洗脱速度为1ml/分钟，测定460nm处的吸光度。
(A)10μM ss-3F溶液
(B)向10μM ss-3F溶液中加入EP-1使最终浓度达到5mM，在37℃下反应8小时得到的反应溶液
(C)向10μM ss-3F溶液中加入过氧化氢使最终浓度达到1mM，再加入高氯酸亚铁使最终浓度达到500μM，在室温下放置约3小时得到的溶液
(D)1μM荧光素溶液
ss-3F单独的场合(A)，在保留时间3.0分钟检测出峰。单线态氧发生系统(B)检测出与(A)不同的2.3分钟的峰，羟基自由基发生系统(C)检测出与(A)不同的2.3分钟的峰。(B)、(C)检测出的峰与荧光素(D)的峰2.3分钟一致。由上述内容确认ss-3F与单线态氧或羟基自由基反应，生成荧光素。
实施例5：
1)荧光光谱
除了在激发波长370nm、荧光波长450nm下测定实施例1得到的ss-3以外，在与实施例4之1)同样的条件下测定荧光光谱。不存在EP-1时的结果如图7所示，与EP-1反应结束后的溶液的荧光光谱结果如图8所示。由图7和图8可以确认，ss-3自身实质上不具有荧光，通过与单线态氧的反应产生荧光。
实施例6：与各活性氧种的反应(特异)性的比较
对本发明的化合物ss-1F、ss-3F进行试验。使用将作为活性氧种检测用试剂市售的DCHF-DA(2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯，Molecular Probes社，D-399)水解生成的DCHF(2’，7’-二氯二氢荧光素)作为对照。按照Stephen等的方法(Stephen L.Hempel etal.，Free Radical Biology & Medicine，27，146-159，1999)在碱性条件下将DCHF-DA水解得到DCHF。也就是说，在暗处用pH12的氢氧化钠水溶液将DCHF-DA处理30分钟后，立即用100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)稀释至10μM。配制10μM DCHF溶液后直接用于试验。ss-1F、ss-3F也是用100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)配制10μM溶液后用于试验。在a～f的条件下分别将ss-1F、ss-3F、DCHF处理30分钟(仅f为2小时30分钟)，测定处理前后的荧光强度变化。荧光强度的测定在与实施例4同样的条件下进行。荧光探针的浓度均为10μM(100mM磷酸钠缓冲液pH7.4)。结果如表1所示。
表1
活性氧种           ss-1F       ss-3F       DCHF
羟基自由基(a)    3.3×102   6.0×102  4.8×103
单线态氧(b)      4.8         8.7         26
超氧化物(c)      8.3         5.6         67
过氧化氢(d)      1.8         ＜1.0       1.9×102
一氧化氮(e)      6.0         ＜1.0       1.5×102
自动氧化(f)      ＜1.0       ＜1.0       1.6×103
   (a)加入高氯酸铁(II)100μM、过氧化氢1mM。
   (b)加入EP-1 100μM。
   (c)加入KO2 100μM。
   (d)加入过氧化氢1mM。
   (e)加入N0Cl3 100μM。
   (f)在荧光灯正下方放置2小时30分钟。
以羟基自由基(条件a)为首，DCHF也与其它活性氧种充分反应。另外，对于本来不希望反应的自动氧化(条件f)的反应性也同样强。另一方面，ss-1F和ss-3F完全不受自动氧化(条件f)，而且对羟基自由基具有较强的反应性。
实施例7：过氧化物酶活性的特异性检测
将本发明的化合物ss-1F或ss-3F溶解于DMF达到10mM的浓度后，加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)溶解使最终浓度达到10μM。向该ss-1F或ss-3F溶液中加入西洋山嵛菜过氧化物酶的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)，再添加过氧化氢使最终浓度达到0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μM，立即测定荧光光谱。另外，除了在荧光波长515nm下测定以外，在与实施例4之1)同样的条件下进行测定。结果如图9所示。由图9可以确认，ss-1F和ss-3F均在过氧化氢浓度0～5.0μM的范围内荧光强度依赖于浓度上升。
由实施例6的结果已经得知ss-1F和ss-3F与过氧化氢自身不反应，而且不受自动氧化。因此，由本实施例7的结果可以确认本发明的化合物能够仅特异性地测定过氧化物酶的活性。
工业实用性
本发明的化合物作为羟基自由基、单线态氧等活性氧的测定用试剂是有用的。含有本发明化合物的活性氧测定用试剂以及使用上述化合物的活性氧测定方法，特别是作为用于采用生物显象术的方法准确且简便地测定局部存在于生物体内的特定细胞或组织中的活性氧的试剂和测定方法是有用的。

Claims (7)

1.下述通式(I)或(II)表示的化合物或其盐，
式中，R1和R2为被氨基或羟基取代的苯基，R3为2-羧基苯基。
2.活性氧测定用试剂，含有权利要求1所述的化合物或其盐。
3.活性氧的测定方法，包括下述步骤：
(A)使上述权利要求1所述的化合物或其盐与活性氧反应的步骤，以及
(B)测定上述步骤(A)中生成的脱芳基化合物或其盐的荧光的步骤。
4.测定酶活性中与活性氧有关的酶的酶活性的方法，使用权利要求1所述的化合物或其盐。
5.如权利要求4所述的方法，酶为过氧化物酶。
6.用于测定酶活性中与活性氧有关的酶的酶活性的试剂，含有权利要求1所述的化合物或其盐。
7.如权利要求6所述的试剂，酶为过氧化物酶。
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