DE69817186T2

DE69817186T2 - Diaminorhodamin-derivate

Info

Publication number: DE69817186T2
Application number: DE69817186T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Nagano; Adachi Hirotatsu KOJIMA
Original assignee: NAGANO TESTUO
Current assignee: NAGANO TESTUO
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: JP4334622B2; AU7935398A; WO1999001447A1; EP1000941A4; EP1000941A1; EP1000941B1; US6201134B1; US20010001800A1; CA2295880A1; US6469051B2; DE69817186D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rhodamin-Derivat, das als Reagens zur Stickoxidmessung nützlich ist sowie ein Reagens zur Stickoxidmessung, das die genannte Verbindung umfasst.
Stand der Technik
Stickstoffmonoxid (NO) ist eine instabile kurzlebige Radikalsorte, und man hat herausgefunden, dass es wichtige Funktionen als physiologisch aktive Substanz im lebenden Körper hat (Chemistry Today [Gendai Kagaku], April 1994, Spezialausgabe; Pharmacia, Mai 1997, Spezialausgabe). Verfahren zur Messung von Stickoxid werden grob unterteilt in indirekte Verfahren, die NO₂ ^– und NO₃ ^– als oxidative Abbauprodukte von Stickoxid messen, und Verfahren, die auf der direkten Messung von Stickoxid basieren. Die direkten Verfahren wurden aus dem Gesichtspunkt des Nachweises und der Quantifizierung von Stickoxid unter physiologischen Bedingungen vorangetrieben. Es wurde jedoch bis jetzt kein spezifisches und hochempfindliches Verfahren entwickelt, das auf in-vitro-Systeme angewendet werden kann.
Als typische Verfahren sind z. B. folgende bekannt: das Chemilumineszenz-Verfahren, das die bei der Ozonoxidation von NO-Radikalen erzeugte Lumineszenz ausnutzt (Palmer R. M., et al., Nature, 327, S. 524–526, 1987); ein Verfahren, das das Absorptionsspektrum von metHb bestimmt, das durch Oxidation von Oxyhämoglobin (O₂Hb) entsteht (Keim M., et al., Circ. Res., 66, S. 1561–1575, 1990); ein Verfahren zur Quantifizierung, das den elektrischen Stromfluß ausnutzt, der bei der Oxidation entsteht, wenn Elektroden in ein Gewebe eingelegt werden (Shibuki K., Neurosci. Res. 9, S. 69–76, 1990; Malinski, und T., Nature, 356, S. 676– 678, 1992), das Verfahren auf der Basis der Griess-Reaktion (Green L. C., et al., Anal. Biochem., 126, S. 131–138, 1992), und so weiter (als Übersichtsartikel siehe: „Approaches From The Newest Medicine [Saishin Igaku Kara No Approach] 12, NO", herausgegeben von Noboru Toda, S. 42–52, Abschnitt 3, Tetsuo Nagano, Measuring Method of NO, veröffentlicht durch die Medical View Co., Ltd: Archer. S., FASEB J., 7, S. 349–360, 1993).
Dem Verfahren auf der Basis der Griess-Reaktion gelingt der Nachweis, indem eine Azokupplung einer Diazoniumsalzverbindung und Naphthylethylendiamin in Gegenwart von NO₂ ^– benutzt wird, das durch Oxidation eines Stickoxidradikals erzeugt wird. Obwohl durch dieses Verfahren keine direkte Messung von Stickoxid-Radikalen gelingt, hat das Verfahren den Vorteil, dass es keine Spezialapparaturen oder -verfahren erfordert. Darüber hinaus hat dieses Verfahren das charakteristische Merkmal, dass mit Stickoxid verwandte Stoffwechselprodukte quantifiziert werden können, da NO₃ ^– durch Reduktion zu NO₂ ^– mit Cadmium (Stainton M. P., Anal. Chem. 46, S. 1616, 1974; Green L. C., et al., Anal. Biochem., 126, S. 131–138, 1982) oder Hydrazin (Sawicki C. R. und Scaringelli F. P., Microchem. J., 16, S. 657–672, 1971) gemessen werden kann.
In einer dem Verfahren auf der Basis der Griess-Reaktion ähnlichen Methode ist 2,3-Diaminonaphthalen als ein Reagens zur Messung von Stickoxid durch Nachweis von NO₂ ^– bekannt. Dieses Reagens reagiert mit NO₂ ^– unter sauren Bedingungen und bildet ein fluoreszierendes Addukt, Naphthalintriazol (chemischer Name: 1-[H]-Naphtho[2,3-d]triazol; Wiersma J. H., Anal. Lett., 3, S. 123– 132, 1970). Die Reaktionsbedingungen für 2,3-Diaminonaphthalen mit NO₂ ^– wurden genau untersucht und es zeigte sich, dass die Reaktion am schnellsten bei einem pH von 2 oder darunter abläuft und nach etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur beendet ist (Wiersma J. H., Anal. Lett., 3, S. 123–132, 1970; Sawicki, C. R., Anal. Lett., 4, S. 761–775, 1971). Ferner fluoresziert das entstandene Addukt bei pH 10 oder höher am stärksten (Damiani P. und Burini G., Talanta, 8, S. 649–652, 1986).
Die Messung von Stickoxid unter Verwendung von 2,3-Diaminonaphthalin ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisgrenze bei etwa mehreren Dutzend Nanomolekülen liegt und die Empfindlichkeit 50 bis 100 mal höher ist als bei dem Verfahren auf der Basis der Griess-Reaktion (Misko T. P., Anal. Biochem., 214, S. 11–16, 1993). Außerdem sticht dieses Verfahren auch dadurch hervor, dass es problemlos ohne die Verwendung von Spezialapparaturen und -verfahren durchgeführt werden kann (als Übersichtsartikel zu der obigen Beschreibung siehe: DOJIN News, Nr. 74, Information Measurement Reagents for NO: 2,3-Diaminonaphthaline, veröffentlicht durch Dojindo Laboratories Co., Ltd., 1995). Da dieses Verfahren jedoch kein Stickoxid als solches, sondern nur sein Oxidationsprodukt NO₂ ^– als Reaktionspartner verwendet, handelt es sich eher um ein indirektes Verfahren im Vergleich zu einem direkten Verfahren zur Messung von Stickoxid. Da außerdem die Reaktion von 2,3-Diaminonaphthalin und NO₂ ^– unter stark sauren Bedingungen (pH 2 oder darunter) durchgeführt wird, ergibt sich das Problem, dass das Verfahren nicht zum Nachweis und zur Quantifizierung von Stickoxid unter physiologischen Bedingungen zur Verfügung steht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Forschungen durchgeführt, um Mittel bereitzustellen, die eine direkte Messung von Stickoxid bei hoher Empfindlichkeit unter physiologischen Bedingungen ermöglichen. Dabei fanden die Erfinder heraus, dass 2,3-Diaminonaphthalin oder Derivate davon selbst unter neutralen Bedingungen in Gegenwart einer Sauerstoffquelle, wie z. B. gelöstem Sauerstoff oder Oxidverbindungen (z. B. PTIO oder seine Derivate wie z. B. Carboxy-PTIO), wirksam mit Stickoxid unter Bildung von fluoreszierendem Naphthalintriazol oder seinen Derivaten reagiert. Außerdem erkannten die Erfinder, dass ein Verfahren zur Messung von Stickoxid, das diese Reaktion ausnutzt, eine extrem hohe Nachweisempfindlichkeit aufwies und eine genaue Quantifizierung von Stickoxidspuren erreichte (siehe: Beschreibung der japanischen Patentanmeldung Nr. 7-189978/1995).
Für das vorerwähnte, 2,3-Diaminonaphthalin ausnutzende Verfahren ist für den Nachweis der Fluoreszenz eine Bestrahlung mit einem Anregungslicht einer kurzen Wellenlänge, z. B. von etwa 370 bis 390 nm, erforderlich und dementsprechend könnten Zellen und Gewebe in einem solchen Meßsystem möglicherweise geschädigt werden. Das Verfahren hat auch den Nachteil, dass eine starke Autofluoreszenz der Zellen die Messung beeinträchtigen kann und dass das Anregungslicht bei der Fluoreszenzmessung nicht genügend mit einem Fluoreszenzfilter, wie er an üblichen Fluoreszenzmikroskopen vorhanden ist, herausgefiltert werden kann. Ferner weist die aus 2,3-Diaminonaphthalin gewonnene fluoreszierende Triazolverbindung nicht genügend Fluoreszenzintensität auf, und es ist deshalb schwierig, die Fluoreszenz mit konventionellen Fluoreszenzmikroskopen in individuellen Zellen präzise zu messen. Ein weiteres Problem besteht darin, dass 2,3-Diaminonaphthalin selbst nicht als Grundstruktur für verschiedene chemische Modifikationen geeignet ist, so dass das Reagens aufgrund seiner einfachen chemischen Struktur innerhalb von Zellen lokalisiert werden kann.
Vor kurzem wurde berichtet, dass bestimmte Fluorescein-Derivate, die selber keine wesentliche Fluoreszenz emittieren, leicht mit Stickoxid unter neutralen Bedingungen reagieren können und eine Triazolverbindung ergeben, die eine Fluoreszenz mit hoher Leuchtkraft aufweist, wobei das Triazol-Derivat eine starke Fluoreszenz von etwa 515 nm durch Anregung mit Licht einer großen Wellenlänge von etwa 495 nm ausstrahlen kann (Kojima et al., 16. Medicinal Chemistry Symposium, 5. Jahresversammlung der Pharmaceutical Chemistry Section, Vortragszusammenfassungen, S. 166–167, Thema Nr. 2-P-26, veröffentlicht durch die Pharmaceutical Society of Japan, 23. Oktober 1996).
Wenn diese Fluorescein-Derivate als Agens für die Messung von Stickoxid verwendet werden, kann das Anregungslicht problemlos durch einen Fluoreszenzfilter, wie es an üblichen Fluoreszenzmikroskopen vorgesehen ist, herausgefiltert werden, und die intrazelluläre Stickoxidkonzentration kann ohne Schwierigkeiten durch Ablesen der Fluoreszenz in individuellen Zellen gemessen werden. Der Fluoreszenzwellenlängenbereich der vorgenannten Fluorescein-Derivate und der Wellenlängenbereich der Autofluoreszenz der Zellen überlappen sich jedoch zum Teil, und dementsprechend kann es manchmal unmöglich sein, Stickoxid quantitativ genau zu bestimmen. Da die Fluoreszenz unter sauren Bedingungen (z. B. pH 4 oder geringer) abgeschwächt sein kann, besteht außerdem das Problem, dass eine präzise Messung nicht in einem weiten pH-Bereich durchgeführt werden kann.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine chemische Verbindung bereitzustellen, die für die Messung von Stickoxid nützlich ist. Insbesondere ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung vorzuschlagen, die unter neutralen Bedingungen wirksam mit Stickoxid unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz reagieren kann, die eine hervorragende Fluoreszenzintensität aufweist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine Verbindung bereitzustellen, die die vorgenannten Eigenschaften aufweist und eine für lebende Gewebe und Zellen unschädliche Messung von Stickoxid in einem Fluoreszenzwellenlängenbereich ermöglicht, dessen Wellen länger sind als die des Autofluoreszenzwellenlängenbereichs der Zellen. Darüber hinaus ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Verbindung vorzuschlagen, die die vorgenannten Merkmale aufweist und deren Fluoreszenz selbst unter sauren Bedingungen nicht abgeschwächt wird. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Agens für die Stickoxidmessung vorzuschlagen, das eine Verbindung umfasst, die die vorgenannten Merkmale aufweist, insbesondere ein Agens für die Stickoxidmessung, das eine präzise Messung des in jeder individuellen Zelle vorhandenen Stickoxids ermöglicht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ernsthafte Forschungen durchgeführt, um die vorgenannten Aufgaben zu lösen. Als Ergebnis fanden sie heraus, dass die unten genannten Rhodamin-Derivate unter neutralen Bedingungen wirksam mit Stickoxid unter Bildung von Triazol-Derivaten reagieren können, die eine ausgezeichnete Fluoreszenzintensität aufweisen. Ferner erkannten sie, dass der Fluoreszenzwellenlängenbereich jener Triazol-Derivate, im Vergleich zu dem von Fluorscein-Derivaten (16. Medicinal Chemistry Symposium, Vortragszu sammenfassungen, wie oben erwähnt), zu einem Bereich mit längeren Wellen hin verschoben ist und nicht wesentlich mit dem Autofluoreszenzwellenlängenbereich der Zellen überlappt und dass die Triazol-Derivate selbst unter sauren Bedingungen keine Verringerung der Fluoreszenzintensität aufweisen. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Erkenntnisse gemacht.
Somit stellt die vorliegende Erfindung chemische Verbindungen bereit, die durch die folgende Formel (I) dargestellt werden
wobei R¹ und R² Aminogruppen darstellen, die an benachbarten Positionen an dem Phenylring vorhanden sind, wobei eine Aminogruppe optional durch eine C_1-18 Alkylgruppe oder eine C_1-6 Alkylgruppe, die mit einer optional substituierten Arylgruppe substituiert ist, monosubstituiert sein kann; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ stellen jeweils unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar; R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ stellen jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe oder ein Halogenatom dar; R¹¹ stellt ein Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar, und X^– stellt ein Anion dar. Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorgenannten Verbindungen, werden solche vorgenannten Verbindungen bereitgestellt, bei denen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Ethylgruppen und R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ Wasserstoffatome sind. Darüber hinaus werden als ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Agenzien für die Stickoxidmessung bereitgestellt, die die vorgenannten Verbindungen einschließen.
Gemäß einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen vorgeschlagen, die durch die folgende Formel (II) dargestellt werden:
wobei R²¹ und R²² an benachbarten Positionen an dem Phenylring vorhanden sind und sich miteinander verbinden, um eine Gruppe zu bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt wird und einen Ring ausbildet, wobei R⁴¹ ein Wasserstoffatom, eine C_1-18 Alkylgruppe oder eine C_1-6 Alkylgruppe darstellt, die mit einer optional substituierten Arylgruppe substituiert ist, oder R²¹ und R²² eine Kombination aus einer Aminogruppe, die optional mit einer C_1-18 Alkylgruppe oder einer C_1-6 Alkylgruppe monosubstituiert ist, die mit einer optional substituierten Arylgruppe substituiert ist, und einer Nitrogruppe darstellen, die an benachbarten Positionen an dem Phenylring vorhanden sind; R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ stellen jeweils unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar; R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ stellen jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe oder ein Halo genatom dar; R³¹ stellt ein Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar, und Y^– stellt ein Anion dar. Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorgenannten Verbindungen, werden solche vorgenannten Verbindungen bereitgestellt, bei denen R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ Ethylgruppen und R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ Wasserstoffatome sind.
Darüber hinaus wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Messung von Stickoxid vorgeschlagen, das die folgenden Schritte einschließt: (I) Ermöglichen der Reaktion einer durch die vorgenannte Formel (I) dargestellten Verbindung mit Stickoxid, sowie (2) Nachweis einer bei dem vorgenannten Schritt (I) entstandenen Verbindung mit der Formel (II), wobei sich R²¹ und R²² miteinander verbinden, um eine Gruppe zu bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt wird und einen Ring ausbildet.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt Veränderungen in den Fluoreszenzspektren einer Verbindung mit der Formel (I) nach der Zugabe von Stickoxid. In der Figur stellt (a) das Anregungsspektrum (Anregung 580 nm) und (b) das Fluoreszenzspektrum (Emission 565 nm) dar. Die Stickoxidkonzentrationen betrugen: 1: 0,11 μM, 2: 0,21 μM, 3: 0,32 μM, 4: 0,43 μM, 5: 0,53 μM und 6: 0,64 μM;
2 stellt Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Verbindung mit der Formel (I) in Abhängigkeit der Menge des erzeugten Stickoxids dar. In der Figur stellen (a) und (b) die Resultate dar, die unter Verwendung von NOC12 bzw. NOC13 erzielt wurden. Die Kurven 1, 2 und 3 sowie 1', 2' und 3' zeigen die Ergebnisse, die man bei Verwendung der vorgenannten NOCs in den Konzentrationen 10 μM, 50 μM bzw. 100 μM erhielt;
3 zeigt die Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität und der Konzentration einer Verbindung (DAR-1T) mit der Formel (II) (Kalibrierungskurve);
4 zeigt Ergebnisse von Änderungen in der Empfindlichkeit der Verbindung mit der Formel (I) als Funktion des pH-Wertes; und
5 stellt Meßresultate zu in individuellen Zellen vorhandenem Stickoxid dar.
In der Figur zeigt (a) Veränderungen nachdem das Kulturmedium mit stimulierten Zellen durch ein Kulturmedium, das 1 mM L-Arg enthält (Inkubation: 35 Minuten, Stickoxid erzeugende Zellen) ersetzt wurde; (b) Veränderungen nachdem ein Kulturmedium mit nicht-stimulierten Zellen durch ein Kulturmedium, das 1 mM L-Arg enthält (Inkubation: 75 Minuten, Zellen, die kein Stickoxid erzeugen), ersetzt wurde; und (c) Veränderungen nach Ersetzen des Kulturmediums der Stufe (a) durch ein Kulturmedium, das 1 mM L-Arg und 10 mM NMMA enthält (Inkubation: 108 Minuten, in Anwesenheit eines NOS Inhibitors. Die normalen Linien stellen die Fluoreszenzintensität jeder Zelle dar und fettgedruckte Linien stellen Mittelwerte davon dar.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
In der vorgenannten allgemeinen Formel (I) stellen R¹ und R² Aminogruppen dar, die an benachbarten Positionen am Phenylring substituiert sind. Sowohl R¹ als auch R² sind vorzugsweise nicht-substituierte Aminogruppen oder eine von R¹ und R² kann eine monosubstituierte Aminogruppe sein. Der optionale Substituent, der an dieser Aminogruppe vorhanden sein kann, wird ausgewählt aus linearen oder verzweigten C_1-18 Alkylgruppen (vorzugsweise C_1-6 Alkylgruppen) oder C_1-6 Alkylgruppen, die durch eine optional substituierte Arylgruppe (Aralkylgruppe) substituiert sind. Wenn nicht konkret anders angegeben, kann es sich in der Beschreibung um eine lineare oder verzweigte C_1-6 Alkylgruppe handeln. Spezifische Beispiele dazu sind u. a. beispielsweise Methylgruppen, Ethylgruppen, n-Propylgruppen, Isopropylgruppen, n-Butylgruppen, sec-Butylgruppen und Tert-Butylgruppen. Zu den Beispielen für eine Aryl-substituierte Alkylgruppe zählen beispielsweise Benzylgruppen, Phenethylgruppen, p-Methoxybenzylgruppen, p-Ethoxycarbonylbenzylgruppen und p-Carboxybenzylgruppen.
R³, R⁴, R⁵ und R⁶ stellen jeweils unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar, wobei die Alkylgruppen für diese Gruppen identisch oder unterschiedlich sein können. Beispielsweise sind Verbindungen, bei denen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Ethylgruppen sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. R¹¹ stellt ein Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar, vorzugsweise eine C_1-6 Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Ethylgruppe und am meisten bevorzugt ein Wasserstoffatom. Zu der Anionensorte, die durch X^– dargestellt ist, gibt es keine besonderen Beschränkungen. Es können zum Beispiel Halogenionen, wie Chlorionen und Bromionen, anorganische Säure-Ionen, wie Sulfationen, Nitrationen und Perchlorationen, organische Säure-Ionen, wie Methansulfonat-Ionen, p-Tuluolsulfonat-Ionen, Oxalationen, Citrationen oder dergleichen verwendet werden.
R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ stellen jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe (CH₂=CH-CH₂-) oder ein Halogenatom dar. Das Halogenatom kann eines aus der Gruppe aus Fluoratomen, Chloratomen, Bromatomen und Jodatomen sein und ist vorzugsweise ein Chloratom. Bei den Positionen von Substituenten, die bei R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ ausgewählt werden, gibt es keine besonderen Beschränkungen. Ein Substituent, der nicht ein Wasserstoffatom ist, kann vorzugsweise an einer Position substituieren, die aus der 2-, 4-, 5- und der 7-Position der Xanthen-Struktur ausgewählt wird. Vorzugsweise handelt es sich beispielsweise bei jedem der Reste R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ um ein Wasserstoffatom.
In der vorgenannten Formel (II) können sich R²¹ und R²² miteinander verbinden, um eine Gruppe -N=N-NR⁴¹-darzustellen, die einen Ring an benachbarten Positionen am Phenylring ausbildet. R⁴¹ stellt dabei ein Wasserstoffatom, eine lineare oder eine verzweigte C_1-18 Alkylgruppe (vorzugsweise eine C_1-6 Alkylgruppe), oder eine C_1-6 Alkylgruppe dar, die mit einer optional substituierten Arylgruppe substituiert ist. Zu den Beispielen für die Aryl-substituierte Alkylgruppe zählen unter anderem Benzylgruppen, Phenethylgruppen, p-Methoxybenzylgruppen, p-Ethoxycarbonylbenzylgruppen und p-Carboxybenzylgruppen. Alternativ stellen R²¹ und R²² eine Kombination aus Aminogruppe und Nitrogruppe dar, die benachbarte Positionen des Phenylringes substituieren, wobei nämlich eine der R²¹ und R²² die Aminogruppe und die andere die Nitrogruppe ist. Bei der Aminogruppe, die durch R²¹ oder R²² dargestellt wird, kann es sich um eine nicht-substituierte Aminogruppe handeln oder sie kann einen Substituenten aufweisen, der aus einer C_1-18 Alkylgruppe (vorzugsweise einer C_1-6 Alkylgruppe) ausgewählt wird, und die vorgenannte C_1-6 Alkylgruppe kann mit einer optional substituierten Arylgruppe substituiert sein. Die Aminogruppe kann eine Schutzgruppe aufweisen, wie z. B. eine Acylgruppe wie beispielsweise eine Acetylgruppe, Trifluoracetylgruppe und Benzoylgruppe; eine Alkylsilylgruppe wie z. B. eine Trimethylsilylgruppe und dergleichen. Eine Arylalkylgruppe wie z. B. eine Benzylgruppe, kann ebenfalls als Schutzgruppe verwendet werden.
R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ stellen jeweils unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar, wobei die durch die Gruppen repräsentierten Alkylgruppen identisch oder verschieden sein können. Beispielsweise sind Verbindungen, bei denen R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ Ethylgruppen sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. R³¹ stellt ein Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar, dabei ist diese vorzugsweise eine C_1-6 Alkylgruppe, weiter bevorzugt ist es ein Wasserstoffatom oder eine Ethylgruppe und am meisten bevorzugt ist es ein Wasserstoffatom. Bei der Anionensorte, die durch Y^– dargestellt wird, gibt es keine besonderen Beschränkungen. Es können zum Beispiel Halogenionen, wie Chlorionen und Bromionen, anorganische Säure-Ionen, wie Sulfationen, Nitrationen und Perchlorationen, organische Säure-Ionen, wie Methansulfonat-Ionen, p-Tuluolsulfonat-Ionen, Oxalationen, Citrationen oder dergleichen verwendet werden.
R²¹, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ stellen jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe oder ein Halogenatom dar. Das Halogenatom kann aus der Gruppe aus Fluoratomen, Chloratomen, Bromatomen und Jodatomen stammen und ist vorzugsweise ein Chloratom. Bei den Positionen der Substituenten, die bei R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ ausgewählt werden, gibt es keine besonderen Beschränkungen. Ein Substituent, bei dem es sich nicht um ein Wasserstoffatom handelt, kann vorzugsweise an einer Position substituieren, die aus der 2-, 4-, 5- und 7-Position der Xanthen-Struktur ausgewählt wird. Vorzugsweise handelt es sich beispielsweise bei jedem der Reste R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ um ein Wasserstoffatom.
Die Verbindungen mit den vorgenannten Formeln (I) und (II), bei denen R²¹ und R²² eine Kombination aus einer Aminogruppe und einer Nitrogruppe in benachbarten Positionen am Phenylring darstellen, können beispielsweise nach dem folgenden Schema hergestellt werden, wobei Einzelheiten dazu konkret in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung erläutert werden. Es versteht sich deshalb, dass die Verbindungen mit der vorgenannten Formel (II) als synthetische Zwischenprodukte der Verbindungen mit der Formel (I) nützlich sind. Unter den Verbindungen, die durch die Formel (II) dargestellt werden, können außerdem solche hergestellt werden, bei denen sich R²¹ und R²² miteinander verbinden, um eine Gruppe -N=N-NR⁴¹- zu bilden, die einen Ring an benachbarten Positionen am Phenylring ausbildet; dies geschieht, indem eine Reaktion zwischen einer Verbindung mit der vorgenannten Formel (I) und Stickoxid ermöglicht wird. Jene Verbindungen weisen eine starke Fluoreszenz auf, wie nachfolgend beschrieben wird, und können für die Stickoxidmessung verwendet werden.
Dem Fachmann ist klar, dass jede beliebige Verbindung, die durch die Formeln (II) und (I) dargestellt wird, problemlos hergestellt werden kann, indem man die allgemeine Erklärung in dem vorgenannten Schema sowie die spezifische Beschreibung in den Beispielen berücksichtigt. Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von Rhodamin-Derivaten mit verschiedenen Substituenten bekannt und dementsprechend kann jede beliebige Verbindung, die durch die Formeln (I) und (I) dargestellt wird, leicht durch eine Kombination von bekannten Herstellungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, und Verfahren aus den Beispielen dieser Beschreibung hergestellt werden. Die Verbindungen, die durch die Formeln (I) und (II) der vorliegenden Erfindung dargestellt werden, können ein oder mehr asymmetrische Kohlenstoffatome aufweisen. Jegliche optischen Isomere, die sich von einem oder mehreren asymmetrischen Kohlenstoffatomen ableiten, jene in einer optisch reinen Form, jegliche Mischungen von optischen Isomeren, Racemate, Diastereo-Isomere in reiner Form, Mischungen von Diastereo-Isomeren und so weiter, fallen alle in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Verbindung als ein Hydrat oder ein Solvat vorliegen, und es versteht sich, dass diese Substanzen ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen.
Ferner ist bekannt, dass Rhodamin-Derivate einen Lactonring ausbilden und als Verbindungen in freier Form existieren können. Der Fachmann weiß, dass unter den erfindungsgemäßen Verbindungen, die durch die Formeln (I) und (II) dargestellt werden, Verbindungen, bei denen R¹¹ und R³¹ Wasserstoffatome sind, in Strukturisomeren vorkommen können, die einen Lactonring ausbilden. Es versteht sich, dass jene Strukturisomere ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind (der Fachmann weiß auch, dass eine quartäre Aminogruppe nicht in solchen Verbindungen vorkommt und somit das als Gegenion dienende und durch X^– oder Y^– dargestellte Anion nicht vorkommt). Verbindungen, die einen Lactonring ausbilden und in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, werden durch die folgenden Formeln (I)' und (II)' dargestellt (diese Verbindungen entsprechen jenen, die durch die Formeln (I) bzw. (II) dargestellt sind, wobei R¹ bis R¹⁰ und R²¹ bis R³⁰ die gleiche Bedeutung haben, wie vorstehend defi niert ist). Der Einfachheit halber werden nur die Verbindungen, die keinen Lactonring ausbilden, durch die vorgenannten Formeln (I) und (II) und das vorstehende Schema definiert. Ferner ist es für den Fachmann leicht verständlich, dass jene Verbindungen, die keinen Rest R¹¹ oder R³¹ haben, sondern ein Carboxyl-Anion aufweisen, ein intermolekulares Zwitterion bilden und ihre Ladung mit der positiven elektrischen Ladung der quartären Aminogruppe neutralisieren können, so dass solche Verbindungen kein Anion aufweisen, das durch X^– oder Y^– dargestellt ist und als Gegenion dient. Es ist klar, dass solche Verbindungen ebenfalls in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen.
Die durch die Formel (I) der vorliegenden Endung dargestellten Verbindungen haben die Eigenschaft, dass sie unter neutralen Bedingungen wirksam mit Stickoxid reagieren und dass dabei eine Verbindung der Formel (II) mit einer guten Ausbeute entsteht (eine Verbindung, bei der R²¹ und R²² an zueinander benachbarten Positionen am Phenylring vorhanden sind und sich miteinander verbinden und eine Gruppe bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt wird und einen Ring ausbildet). Die durch die Formel (I) dargestellten Verbindungen emittieren selbst keine wesentliche Fluoreszenz, wenn sie durch ein Anregungslicht von etwa 565 nm unter neutralen Bedingungen bestrahlt werden, während die Verbindungen mit der Formel (II) eine extrem starke Fluoreszenz unter gleichen Bedingun gen aussenden (Emission: 580 nm). Folglich kann Stickoxid in lebenden Geweben oder Zellen gemessen werden, indem ermöglicht wird, dass die durch die Formel (I) dargestellten Verbindungen in lebenden Geweben oder Zellen aufgenommen werden und mit Stickoxid reagieren, um fluoreszierende Verbindungen mit der Formel (II) zu bilden und indem anschließend die Fluoreszenz der entstandenen Verbindungen gemessen wird. Da der Fluoreszenzwellenlängenbereich der Verbindungen mit der Formel (II) der vorliegenden Erfindung zu einem Bereich mit größeren Wellenlängen um etwa 80 nm gegenüber konventionellen bekannten Fluoreszein-Derivaten verschoben ist, haben sie insbesondere die ausgezeichnete Eigenschaft, dass sie Fluoreszenzmessungen ermöglichen, die von der Autofluoreszenz der Zellen unbeeinflusst sind.
Das Verfahren zur Messung von Stickoxid, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, umfasst somit den Schritt, dass eine Reaktion zwischen einer durch die Formel (I) der vorliegenden Erfindung dargestellten Verbindung mit Stickoxid ermöglicht wird und anschließend eine Messung der Fluoreszenz der Verbindung mit der Formel (II) erfolgt (eine Verbindung, bei der R²¹ und R²² an benachbarten Positionen am Phenylring vorhanden sind und sich miteinander verbinden, um eine Gruppe zu bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt ist und einen Ring ausbildet). In der Beschreibung sollte der Begriff „Messung" im weitesten Sinne verstanden werden, einschließlich der Messung zu verschiedenen Zwecken wie Nachweis, quantitativer und qualitativer Bestimmung. Die vorgenannte Reaktion kann vorzugsweise unter neutralen Bedingungen durchgeführt werden, zum Beispiel innerhalb eines Bereichs von pH 6,0 bis 8,0, vorzugsweise pH 6,5 bis 7,8, weiter bevorzugt bei einem pH von 6,8 bis 7,6. Die durch die Formel (II) dargestellten Verbindungen haben insbesondere das charakteristische Merkmal, dass ihre Fluoreszenz unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise in einem sauren pH-Bereich bis pH 4, nicht abgeschwächt wird. Die Messung von Stickoxid unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist jedoch nicht auf Messungen unter neutralen Bedingungen oder unter schwach sauren Bedingungen beschränkt, vielmehr kann die Messung auch in einem sehr sauren Medium durchgeführt werden, wie zum Beispiel unter Bedingungen, wie sie in der Umgebung von Magenschleimhautzellen und dergleichen anzutreffen sind.
Unter den Verbindungen mit der Formel (I) können jene, deren Rest R¹¹ eine C_1-18 Alkylgruppe, vorzugsweise eine Ethylgruppe ist, leicht durch lipophile zytoplasmatische Membrane hindurchwandern und in den Zellen eingebaut werden; anschließend wird der Ester hydrolysiert und bildet Verbindungen mit einer Carboxylgruppe aus (Verbindungen, bei denen R¹¹ ein Wasserstoffatom ist). Da die entstandenen Verbindungen sehr hydrophil sind, können sie nicht wieder durch die lipophilen zytoplasmatischen Membrane zurückwandern und werden somit nicht einfach aus dem Innern der Zelle ausgeschieden. Deshalb sind solche Verbindungen, deren R¹¹ eine C_1-18 Alkylgruppe ist, als Agens für die Messung an sich nützlich, und sie können darüber hinaus als Prodrug verwendet werden, um das Agens für die Messung (Verbindungen, bei denen R¹¹ ein Wasserstoffatom ist) in hoher Konzentration in die Zellen zu transportieren. Zusätzlich wird erwartet, dass Verbindungen, bei denen R¹¹ eine C_10-18 Alkylgruppe ist, sich in zytoplasmatischen Membranen anreichern.
Die Fluoreszenzmessung kann durch ein konventionelles Fluoreszenz-Meßverfahren erfolgen (siehe zum Beispiel Veröffentlichungen wie: Wiersma J. H., Anal. Lett. 3, S. 123–132, 1970; Sawicki, C. R., Anal. Lett., 4, S. 761–775, 1971; Damiani P. und Burini G., Talanta, 8, S. 649–652, 1986; Misko T. P., Anal. Biochem., 214, S. 11–16, 1993 und dergleichen). Bei dem erfindungsgemäßen Stickoxid-Meßverfahren erfolgt die Bestrahlung vorzugsweise mit einem Anregungslicht von etwa 565 nm, während die Fluoreszenz bei etwa 580 nm gemessen wird. Durch die Verwendung von Licht mit diesen Wellenlängen können spektrometrische Untersuchungen wirksam mittels eines Fluoreszenzfilters eines üblicherweise verwendeten Fluoreszenzmikroskops durchgeführt werden, wobei die Messung eine hohe Empfindlichkeit ohne die Verwendung eines Spezialfilters erreicht.
Wenn eine besonders hohe Empfindlichkeit erforderlich ist, kann die Stickoxidmessung in Gegenwart einer Sauerstoffquelle durchgeführt werden. Als Sauerstoffquellen können zum Beispiel Sauerstoff, Ozon, Oxidverbindungen und dergleichen verwendet werden. Gelöster Sauerstoff kann allgemein als Sauerstoffquelle benutzt werden und wenn nötig, kann Sauerstoffgas in das Reaktionssys tem eingeleitet oder ein Reagens zur Erzeugung von Sauerstoff (zum Beispiel Wasserstoffperoxid oder dergleichen) hinzugefügt werden. Die Oxidverbindungen unterliegen keinen besonderen Beschränkungen, so lange sie eine Oxidbindung aufweisen, aus der das Sauerstoffatom leicht zu lösen ist, wie zum Beispiel bei N-O, S-O und P-O. Beispielsweise können PTIO (2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid; Maeda H., et al., J. Leuk. Biol., 56, S. 588–592, 1994; Akaike T., et al., Biochemistry, 32, S. 827–832, 1993) oder seine Derivate (Carboxy-PTIO, das durch Einführen einer Carboxylgruppe in die p-Position der Phenylgruppe von PTIO gebildet wird, etc.), Triphenylphosphinoxid, Triethylaminoxid und dergleichen verwendet werden.
Unter den vorgenannten Oxidverbindungen stellen PTIO und seine Derivate (zum Beispiel Carboxy-PTIO, etc.) besonders bevorzugte Verbindungen dar, und sie können leicht vom Fachmann beschafft werden (aufgelistet bei Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Organic Chemicals Catalogue 32, 1994, und dergleichen). Die Oxidverbindungen können allein als Reagenzien verwendet werden oder sie können dabei in Liposomen oder ähnlichen Stoffen eingeschlossen sein. Bei der Menge der Sauerstoffquelle gibt es keine besonderen Beschränkungen, und die Menge kann vorzugsweise 1 μM oder mehr, weiter bevorzugt 10 bis 30 μM und am meisten bevorzugt 10 bis 20 μM betragen, wobei dies Mindestwerte auf der Basis des zu messenden Stickoxids sind. Bei der Messung von biologischem Material und dergleichen kann die Sauerstoffquelle einer Probe vorzugsweise in einer Menge von etwa 10 bis 20 μM zugefügt werden; im allgemeinen kann jedoch gelöster Sauerstoff als Sauerstoffquelle die erforderliche Menge zur Verfügung stellen. Wenn die Menge der Sauerstoffquelle zu gering ist, kann die Meßempfindlichkeit verringert sein und bei einer zu großen Menge der Sauerstoffquelle kann die Fluoreszenzemission nachteilig beeinträchtigt sein. Aus diesem Grund ist es ratsam, die zu messende Stickoxidmenge vorab in einem vorgeschalteten Experiment oder durch ein bekanntes Verfahren zu bestimmen und die Sauerstoffquelle in einem geeigneten Konzentrationsbereich zuzufügen. Die Reaktion kann in einem Temperaturbereich von 0 bis 40°C durchgeführt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt. Bei den Beispielen entspricht „DAR-1" der Verbindung, die in dem obigen Schema gezeigt ist.
Beispiel 1: Herstellung von DAR-1 [9-(2-Carboxy-3,4-diaminophenyl)-6-diethylamino-3H-xanthen-3-yliden]diethyl-iminium]
2,3-Dimethyl-6-nitroanilin wurde in Essigsäure unter Verwendung von 1 Äquivalent Essigsäureanhydrid acetylisiert, und das Produkt aus Ethylalkohol rekristallisiert. Das entstandene 3-Acetamido-4-nitroxylol wurde in kochendem Wasser gelöst, das Magnesiumsulfat enthielt. Zu der Lösung wurden 6 Äquivalente von in Wasser suspendiertem Kaliumpermanganat in mehreren Portionen hinzugefügt und die Lösung wurde unter Rückflusskühlung erhitzt, bis die violette Farbe verschwand. Die heiße Reaktionsmischung wurde gefiltert und gekühlt und anschließend wurde das Filtrat mit Salzsäure angesäuert und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die entstandene 3-Acetamido-4-nitrophthalsäure wurde in Essigsäureanhydrid unter Verwendung von Acetylchlorid dehydriert. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, anschließend wurde eine kleine Menge wasserfreies Methylenchlorid dem Rückstand zugesetzt und der abgesetzte Feststoff durch Filtration aufgefangen, wobei 3-Acetamido-4-nitrophthalsäureanhydrid gewonnen wurde.
Zu der Lösung von 3-Acetamido-4-nitrophthalsäureanhydrid in Xylol wurde in Xylol gelöstes N,N-Diethylaminophenol tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten bei einer Temperatur von etwas unterhalb der Rücklauftemperatur hinzugefügt und sodann wurde die Mischung für 18 Stunden unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Verdunstung des Xylols wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt und man erhielt ein 3-Acetamido-4-nitrorhodamin-Derivat: [9-(2-Carboxy-3-amino-4-nitrophenyl)-6-diethylamino-3H-xanthen-3-yliden]diethyl-iminium].
C₂₈H₃₁N₄O₅ F.W. 503.558
¹H-NMR (300 MHz DMSO-d₆) δ 1,08 (t, 12H, J = 6,8) 3,35 (q, 8H, J = 6,8), 6,38 (d, 1H, J = 8,6) 6,42 (m, 4H), 6,67 (d, 2H, J = 9,8), 8,04 (s, 2H), 8,33 (d, 1H, J = 8,6)
Das oben gewonnene 3-Acetamido-4-nitrorhodamin-Derivat wurde durch Erhitzen unter Rückflusskühlung in Salzsäure acetyliert und das resultierende 3-Amino-4-nitrorhodamin unter Verwendung von Natriumsulfid und Natriumhydrosulfid in Wasser reduziert. Nach der Reduktion wurde das Produkt durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt und man erhielt das gewünschte Zielprodukt (die Verbindung DAR-1, Schmelzpunkt 145°C, zersetzt).
C₂₈H₃₃N₄O₃ F.W. 473.578
MS (EI) (m/z) M⁺ 473
¹H-NMR (300 MHz DMSO-d₆) δ 1,08 (t, 12H, J = 6,78) 3,33 (m, 8H), 4,98 (s, 2H), 5,86 (s, 2H), 6,06 (d, 1 H, J = 7,68), 6,37–6,41 (m, 4H), 6,55 (d, 2H, J = 8,61), 6,78 (d, 1H, J = 7,68), 11,95 (s, 1H)
Beispiel 2: Herstellung von DAR-1 EE [9-(3,4-Diamino-2-ethoxycarbonylphenyl)-6-diethylamino-3H-xanthen-3-yliden]diethyliminium]
Das in Beispiel 1 gewonnene DAR-1 wurde in einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und Ethylalkohol gelöst und die daraus entstandene Mischung wurde für 2 Stunden unter Rückflusskühlung erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser gegossen und in üblicher Weise einer Nachbehandlung unterzogen, um ein Rohprodukt zu erhalten. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Zielprodukt zu erhalten (Schmelzpunkt 300°C oder höher)
C₃₀H₃₇N₄O₃ F.W. 501.628
MS (EI) (m/z) M⁺ 501
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,66 (t, 3H, J = 7,1) 1,33 (m, 12H), 3,61 (q, 8H, J = 7,3), 4,19 (q, 2H, J = 7,1), 4,55 (s, 2H), 6,05 (s, 2H), 6,33 (d, 1H, J = 7,9), 6,74 (d, 2H, J = 2,2), 6,83 (dd, 2H, J = 9,7, 2,2), 6,94 (d, 1H, J = 7,9) 7,45 (d, 2H, J = 9,7)
Beispiel 3: Herstellung von DAR-1T [9-(7-Carboxybenzotriazol-6-yl)-6-diethylamino-3H-xanthen-3-yliden]diethyliminium]
Das in Beispiel 1 gewonnene DAR-1 wurde in Methanol gelöst und NO-Gas wurde eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt, um das gewünschte Zielprodukt zu gewinnen (Schmelzpunkt 300°C oder höher)
C₂₈H₃₀N₅O₃ F.W. 484.558
MS (FAB) (m/z) M⁺ 484
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1,10 (t, 12H, J = 6,4) 3,34 (m, 8H), 6,50–6,71 (m, 7H), 8.01 (d, 1H, J = 8,1)
Maximale Wellenlängen: Anregung 565 nm – Emission 580 nm
Beispiel 4: Veränderungen im Fluoreszenzspektrum einer Verbindung mit der Formel (I) durch Zugabe von Stickoxid
10 μm DAR-1 wurden in 0,1-M Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Stickoxid in verschiedenen Konzentrationen (0,11 μM, 0,21 μM, 0,32 μM, 0,43 μM, 0,53 μM und 0,64 μM) wurde der Lösung zugefügt und anschließend die Veränderungen im Fluoreszenzspektrum gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. In dieser Figur zeigt (a) das Anregungsspektrum (Anregung 565 nm) und (b) das Fluoreszenzspektrum (Emission 580 nm). Es wurde beobachtet, dass die Stärke der maximalen Fluoreszenzwellenlänge durch die im Reaktionssystem erzeugte Triazolverbindung (DAR-1T) mit wachsender Stickoxidkonzentration zunahm.
Beispiel 5: Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Verbindung mit der Formel (I) in Abhängigkeit von der Stickoxidmenge
Als Stickoxidquelle wurden von den NOCs, bei denen es sich um spontan NO erzeugende Agenzien handelt (Hrabie J. A., J. Org. Chem., 58, S. 1472–1476, 1993), NOC-12 (mit einer Halbwertzeit von 327 Minuten in 0,1-M Phosphatpuffer, pH 7,4 bei 22°C) und NOC-13 (13,7 Minuten bei gleichen Bedingungen) verwendet. Es wurde eine Reaktion des im Reaktionsgemisch erzeugten Stickstoffmonoxids mit DAR-1 ermöglicht. Zu 10 μM DAR-1 wurden NOCs in unterschiedlichen Konzentrationen (10 μM, 50 μM, 100 μM) zugefügt und eine Reaktion bei 37°C unter Verwendung von 0,1-M Phosphatpuffer (pH 7,4) als Reaktionslösungsmittel herbeigeführt. Die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität begann 30 Sekunden vor Reaktionsbeginn, wobei als Meßwellenlängen für die Anregung 565 nm und für die Emission 580 nm verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in 2 zu sehen. In dieser Figur stellen (a) und (b) die Meßergebnisse für NOC-12 bzw. NOC-13 dar. Die Kurven 1, 2 und 3 sowie 1', 2' und 3' stellen die Resultate dar, die in Gegenwart von NOCs erzielt wurden, deren Konzentrationen 10 μM, 50 μM bzw. 100 μM betrugen. Diese Resultate zeigen deutlich, dass die Triazolverbindung (DAR-1T) in Abhängigkeit von der erzeugten Stickoxidmenge aus DAR-1 entstanden ist, wobei Veränderungen in der Fluoreszenzintensität, die die Stickoxidkonzentration korrekt reflektieren, zu beobachten waren.
Beispiel 6: Empfindlichkeit der Verbindung mit der Formel (I) für die Stickoxidmessung
Eine synthetische Probe der Triazolverbindung, die dem Reaktionsprodukt von DAR-1 mit Stickoxid entspricht, wurde in 0,1-M Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Es wurde eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Konzentration beobachtet. Die Meßwellenlängen der Fluoreszenz wurden für die Anregung auf 565 nm und für die Emission auf 580 nm eingestellt. Die Meßergebnisse sind in 3 zu sehen.
Beispiel 7: Veränderungen der Empfindlichkeit bei verschiedenen pH-Werten
DAR-1 T wurde in gereinigtem Wasser gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von 100 μm herzustellen. Die Lösung wurde zu einem Phosphatpuffer (78 mM) hinzugefügt, an jeden pH-Wert bei einer Endkonzentration von etwa 1 μm angepaßt und die Extinktion und die Fluoreszenzintensität gemessen. Die Meßwellenlängen der Fluoreszenz wurden für die Anregung auf 565 nm und für die Emission auf 580 nm eingestellt. Die Meßergebnisse sind in 4 zu sehen. In dieser Figur stellt (a) die Resultate der absorptiometrischen Messung und (b) die Ergebnisse der Messung der Fluoreszenzintensität dar. Aus diesen Resultaten ist ersichtlich, dass DAR-1T keine Veränderungen der Fluoreszenzintensität aufwies und eine hohe Empfindlichkeit im neutralen bis leicht sauren, etwa pH 4, Bereich beibehielt.
Beispiel 8: Bilddarstellung von durch glatte Gefäßmuskelzellen erzeugtem Stickoxid
Glatte Gefäßmuskelzellen aus der Aorta von Ratten wurden in einem Glasschälchen kultiviert und mit LPS (12,5 μg/ml), INF-γ (150 U/ml), IL-1β (25 U/ml) und TNF-α (30 ng/ml) stimuliert, um eine Stickoxidsynthase zu induzieren. Die Kultur wurde über 12 Stunden fortgesetzt und anschließend wurde das Kulturmedium in einen Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (KRP) gewechselt, in welchem DAR-1EE gelöst war (Beispiel 2, 10 μM), um eine Aufnahme von DAR-1EE in die Zellen zu ermöglichen. Die Zellen wurden bei 37°C für 1 Stunde kultiviert und dann gewaschen und das Kulturmedium wurde in KRP gewechselt, in welchem L-Arg oder L-NMMA gelöst war. Unter einem Fluoreszenzmikroskop (Anregung 530–560 nm, Emission 550–610 nm, Vergrößerung: X20) wurden Veränderungen der intrazellulären Fluoreszenz über die Zeit beobachtet.
Die Ergebnisse der Messung von Stickoxid, das in jeder Zelle produziert worden war, sind in 5 dargestellt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit der Zeit in den Stickoxid produzierenden Zellen größer (a), während im wesentlichen keine Änderungen der Fluoreszenzintensität bei den Zellen beobachtet wurden, die kein Stickoxid produzierten (nicht-stimulierte Zellen, (b)) sowie bei den Zellen, denen ein NOS-Inhibitor zugefügt worden war (c). Durch diese Ergebnisse wurde bestätigt, dass DAR-1 EE in die Zellen aufgenommen und hydrolisiert worden ist und dass DAR-1 anschließend mit Stickoxid reagiert hat, um Fluoreszenz auszustrahlen.
Industrielle Anwendung
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind als Agens für die Stickoxidmessung nützlich. Die Verbindungen mit der erfindungsgemäßen Formel (I) haben die charakteristische Merkmal, dass sie wirksam mit Stickoxid reagieren und dann fluoreszierende Verbindungen mit der Formel (II) bilden, bei denen sich R²¹ und R²² miteinander verbinden, um eine Gruppe zu bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt wird und einen Ring ausbildet. Durch die Bestrahlung mit einem Anregungslicht einer größeren Wellenlänge, die für lebende Gewebe und Zellen unschädlich ist, strahlen diese Verbindungen mit der Formel (II) eine starke Fluoreszenz aus und sind dementsprechend dadurch gekennzeichnet, dass mit ihnen eine korrekte Messung von intrazellulärem Stickstoff in individuellen Zellen durchgeführt werden kann. Insbesondere haben die Verbindungen mit der Formel (II), bei denen sich R²¹ und R²² miteinander verbinden, um eine Gruppe zu bilden, die durch -N=N-NR⁴¹- dargestellt wird und einen Ring ausbildet, erfindungsgemäß die kennzeichnenden Eigenschaften, dass sie in einem Fluoreszenzwellenlängenbereich nachweisbar sind, der kaum von der Autofluoreszenz der Zellen beeinflußt wird und dass ihre Fluoreszenzintensität nicht unter sauren Bedingungen gedämpft wird.

Claims

Eine Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I):
wobei R¹ und R² Aminogruppen vorhanden an angrenzenden Positionen zueinander an dem Phenylring darstellen, eine Aminogruppe kann optional monosubstituiert mit einer C_1-18 Alkylgruppe oder einer C_1-6 Alkylgruppe substituiert mit einer optional substituierten Arylgruppe sein; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ stellen unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar; R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ stellen unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe oder ein Halogenatom dar; R¹¹ stellt ein Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar; und X^– stellt ein Anion dar.
Eine Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (II)
wobei R²¹ und R²² an angrenzenden Positionen des Phenylrings vorhanden sind und aneinander gebunden sind um eine Gruppe, dargestellt als -N=N-NR⁴¹-, darstellen, die einen Ring formt, wobei R⁴¹ ein Wasserstoffatom, eine C_1-18 Alkylgruppe, eine C_1-6 Alkylgruppe, substituiert mit einer optional substituierten Arylgruppe, oder R²¹ und R²² dargestellt als eine Kombination aus einer Aminogruppe optional monosubstituiert mit einer C_1-18 Alkylgruppe oder einer C_1-6 Alkylgruppe substituiert mit einer optional substituierten Arylgruppe und einer Nitrogruppe vorhanden an angrenzenden Postitionen des Phenylrings darstellt; R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ stellen unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe dar; R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ stellen unabhängig voneinander Wasserstoffatom, eine C_1-6 Alkylgruppe, eine Allylgruppe oder ein Halogenatom dar; R³¹ stellt Wasserstoffatom oder eine C_1-18 Alkylgruppe dar; und Y^– stellt ein Anion dar.
Eine Verbindung dargestellt durch die folgende Formel (I)
wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ dieselbe Bedeutung haben, wie in Anspruch 1.
Eine Verbindung dargestellt durch die folgende Formel (II')
wobei R²¹, R²², R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ dieselbe Bedeutung wie in Anspruch 2 haben.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 3, wobei R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander eine Methylgruppe oder Ethylgruppe sind.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 3, wobei R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Ethylgruppen sind; und R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ Wasserstoffatome sind.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 2 oder 4, wobei R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ unabhängig voneinander eine Methylgruppe oder Ethylgruppe sind.
Die Verbindung gemäß Ansprüchen 2 oder 4, wobei R²³, R²⁴, R²⁵ und R²⁶ Ethylgruppen darstellen; und R²⁷, R²⁸, R²⁹ und R³⁰ Wasserstoffatome sind.
Ein Verfahren zur Messung von Stickoxyd, enthaltend (I) einen Schritt, der der Verbindung gemäß den Ansprüchen 1, 3, 5, 6 erlaubt mit dem Stickoxyd zu reagieren und (2) einen Schritt zur Detektion der Verbindung produziert in Schritt (1 ).
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, enthaltend umsetzen der Verbindung gemäß Anspruch 1, 3, 5, 6 mit Stickstoffmonoxyd um eine Verbindung gemäß Anspruch 2, 4, 7, 8 zu bilden, wobei R²¹ und R²² aneinander binden, um eine Gruppe zu formen, die dargestellt wird durch -N=N-NR⁴¹-, die einen Ring formt und Bestrahlen dieser Verbindung gemäß Anspruch 2, 4, 7, 8 mit Licht, um eine Fluoreszenz der bestrahlten Verbindung auszulösen; und Messen der Fluoreszenz.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Umsetzung unter neutralen Bedingungen ausgeführt wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Bestrahlung ausgeführt wird unter Benutzung von Anregungslicht mit einer Wellenlänge von ungefähr 565 nm.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, bestehend aus Messen der intrazellulären Stickstoffmonoxid-Konzentration jeder individuellen Zelle.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Umsetzung in der Gegenwart einer Sauerstoffquelle ausgeführt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Sauerstoffquelle, Sauerstoff, Ozon oder eine Oxidverbindung ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei die Sauerstoffquelle 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxyd oder sein Carboxyderivat ist.
Ein Agens zur Messung von Stickoxyd enthaltend die Verbindungen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 3, 5, 6.
Verwendung der Verbindungen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 3, 5, 6 zur Messung von Stickoxyd.