DE60123933T2

DE60123933T2 - Fluoreszierende proben zur quantitativen bestimmung von zink

Info

Publication number: DE60123933T2
Application number: DE60123933T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Suginami-ku NAGANO; Kazuya Kikuchi; Tomoya Nerima-ku HIRANO
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: CA2401359A1; CN1222518C; CN1407979A; AU2001235997B2; EP1260510B1; EP1260510A4; USRE40572E1; WO2001062755A1; US20050064308A1; JP4695811B2; US20030162298A1; KR20030010585A; EP1260510A1; ATE342896T1; AU3599701A; US6903226B2; US7074823B2; DE60123933D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine fluoreszierende Sonde für Zink, die durch spezifischen Einfang eines Zink-Ions Fluoreszenz emittiert.
Technischer Hintergrund
Zink ist ein essentielles metallisches Element, das im menschlichen Körper nach Eisen mit der größten Menge vorhanden ist. Die meisten Zink-Ionen in Zellen koppeln stark an Proteine und sind an der Beibehaltung der Struktur oder an der Expression von Funktionen des Proteins beteiligt. Es gibt auch verschiedene Berichte zur physiologischen Rolle von freien Zink-Ionen, die in der Zelle in sehr geringer Menge vorhanden sind (gewöhnlich in Höhe von μM oder niedriger). Insbesondere wird davon ausgegangen, dass Zink-Ionen in erheblichem Maße an einer Art des Zelltods, d.h., der Apoptose, beteiligt sind, und es wird berichtet, dass Zink-Ionen die Altersplaquebildung bei der Alzheimer-Krankheit beschleunigen.
Eine Verbindung (eine fluoreszierende Sonde für Zink), die ein Zink-Ion unter Bildung eines Komplexes spezifisch einfängt und nach Bildung des Komplexes Fluoreszenz emittiert, wird üblicherweise zur Messung von Zink-Ionen in Geweben eingesetzt. Zum Beispiel werden TSQ (Reyes, J. G., et al., Biol. Res. 27, 49, 1994), Zinquinethylester (Tsuda, M. et al., Neurosci. 17, 6678, 1997), Dansylaminoethylcyclen (Koike, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 12686, 1996), und Newport Green (Katalog von Molecular Probe: "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 6. Aufl., von Richard P. Haugland, S. 531–540) in der Praxis als fluoreszierende Sonden für Zink verwendet.
Bei der Messung mit TSQ, Zinquin oder Dansylaminoethylcyclen muss jedoch ein kurzwelliges Anregungslicht verwendet werden (Anregungswellenlängen von 367 nm, 368 nm bzw. 323 nm). Bei Verwendung dieser fluoreszierenden Sonden für Zink zur Messung in lebenden Systemen kann das kurzwellige Anregungslicht somit Schädigungen an Zellen hervorrufen (Saibou Kougaku (Cell Technology), 17, S. 584–595, 1998). Ein Problem entsteht auch dadurch, dass die Messung leicht durch Autofluoreszenz beeinflusst werden kann, die von Zellsystemen per se erzeugt wird (Fluoreszenz, die von NADH oder Flavin emittiert wird). Des Weiteren ist Dansylaminoethylcyclen insofern nachteilig, als die Fluoreszenzintensität je nach der Umgebung, in der das Agens zum Zeitpunkt der Mes sung vorliegt, erheblichen Schwankungen unterworfen ist, z.B. Unterschiede bei den Umgebungen wie etwa Art des Lösungsmittels oder extrazelluläre, intrazelluläre oder intramembranöse Wasserlöslichkeit oder Lipophilie oder dergleichen (Tanpakushitsu, Kakusan, Kouso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), Extraausgabe, 42, S. 171–176, 1997). Bei TSQ besteht insofern ein Problem, als schon die Verteilung in der intakten Zelle aufgrund seiner hohen Lipophilie schwierig ist. Newport Green hat geringe Affinität für Zink-Ionen und ergibt keine praxisnahe Messempfindlichkeit, auch wenn das Agens Messungen mit langwelligem Anregungslicht ermöglicht. Erwünscht ist daher die Entwicklung einer fluoreszierenden Sonde für Zink, die Zink-Ionen mit hoher Empfindlichkeit ohne Schädigung der Zellen messen kann.
Offenbarung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Verbindung oder eines Salzes derselben, die/das als hochempfindliche fluoreszierende Sonde für Zink verwendet werden kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Bereitstellung einer Verbindung, die als fluoreszierende Sonde für Zink verwendbar ist, die Zink-Ionen spezifisch einfangen kann und ausgezeichnete Fluoreszenzintensität des Komplexes nach dem Einfang aufweist, und mit der die Messung der Fluoreszenz mit langwelligem Anregungslicht möglich ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer fluoreszierenden Sonde für Zink, die eine Verbindung mit den obigen Eigenschaften umfasst, sowie eines Verfahrens zur Messung von Zink-Ionen unter Verwendung dieser fluoreszierenden Sonde für Zink.
Zur Lösung der vorstehenden Aufgaben führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Untersuchungen durch. Im Ergebnis fanden sie, dass eine Verbindung mit einem cyclischen Amin oder einem Polyamin als Substituent hohe Spezifität für Zink-Ionen aufweist, und durch Einfangen der Zink-Ionen bildet die Verbindung einen Komplex, der mit Anregungslicht im längerwelligen Bereich eine starke Fluoreszenz emittiert (japanische Patentanmeldung Nr. (Hei) 11-40325). Die Erfinder führten weitere Untersuchungen durch und fanden, dass die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen mit Zink sehr schnell einen Komplex bilden und starke Fluoreszenz emittieren können. Auch fanden sie, dass die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen im lebenden Organismus im Bruchteil einer Sekunde mit Zink-Ionen unter Bildung eines fluoreszierenden Komplexes reagieren können, wenn sie als fluoreszierende Sonde für Zink verwendet werden, so dass Zink im lebenden Organismus mit sehr hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit gemessen werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde verwirklicht.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine durch die allgemeine Formel (IA) oder (IB) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben bereit:
worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Formel (A) dargestellt wird:
worin X¹, X² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethylgruppe und X³ und X⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine 2-Pyridylmethylgruppe oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeuten, und m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten, wobei m und n nicht gleichzeitig null sein können, mit der Maßgabe, dass R¹ und R² nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten; R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylcarbonyl- oder eine Alkylcarbonyloxymethylgruppe bedeuten und R⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet, wobei die folgenden Verbindungen ausgeschlossen sind:

a) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IA), in der R¹, R² NH₂ oder NHMe sind, R³, R⁴ F, Cl oder H sind und R⁵, R⁶ H oder Ac sind;
b) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IA), in der R¹ NH₂ ist, R² H ist, R³, R⁴ H sind, R⁵, R⁶ Ac sind;
c) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IB), in der R¹ NH₂ ist, R² H ist, R⁷ H oder Et ist, R³, R⁴, R⁶ H sind.

Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine durch die allgemeine Formel (II) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben bereitgestellt:
worin R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R¹⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet; und R¹⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeutet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die oben genannte Verbindung oder ein Salz derselben bereitgestellt, worin R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoffatome bedeuten. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die oben genannte Verbindung oder ein Salz derselben bereitgestellt, worin eine substituierte Amino-Gruppe am Benzolring in m-Stellung oder p-Stellung bezüglich der durch -COOR¹⁷ dargestellten Gruppe bindet. Vorzugsweise sind sowohl R¹³ als auch R¹⁴ Wasserstoffatome oder sowohl R¹³ als auch R¹⁴ sind Chloratome.
Des Weiteren macht die vorliegende Erfindung eine durch die allgemeine Formel (IIIA) oder (IIIB) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben verfügbar:
worin R²¹ und R²² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Formel (B) dargestellt wird:
worin X¹¹, X¹² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethylgruppe und X¹³ und X¹⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine 2-Pyridylmethylgruppe oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeuten, und p und q unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, wobei p und q nicht gleichzeitig null sein können, mit der Maßgabe, dass R²¹ und R²² nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten; Y -CO-NH- oder -NH-CO- bedeutet; R²³ und R²⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R²⁵ und R²⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylcarbonyl- oder eine Alkylcarbonyloxymethylgruppe bedeuten; und R²⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die oben genannte Verbindung bereitgestellt, worin Y am Benzolring in m-Stellung zu der durch -COOR²⁷ dargestellten Gruppe bindet (die entsprechende Carbonyl-Gruppe, wenn ein Lacton-Ring gebildet wird).
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung eine fluoreszierende Sonde für Zink verfügbar, die eine durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellte Verbindung umfasst (ausgenommen die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) oder ein Salz derselben; und einen Zink-Komplex, der aus einer durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindung gebildet wird (ausgenommen die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) oder ein Salz derselben zusammen mit einem Zink-Ion. Die oben genannte fluoreszierende Sonde für Zink kann zur Messung von Zink-Ionen in Geweben oder Zellen verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Messung von Zink-Ionen bereitgestellt, bei dem eine durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellte Verbindung (ausgenommen die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) oder ein Salz derselben als fluoreszierende Sonde für Zink verwendet wird; ein Verfahren zur Messung von Zink-Ionen, umfassend die Schritte: (a) Umsetzen einer durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindung (ausgenommen die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) oder eines Salzes derselben mit Zink-Ionen; und (b) Messen der Fluoreszenzintensität des im vorstehenden Schritt erzeugten Zink-Komplexes; sowie die Verwendung einer durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindung (ausgenommen die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) oder eines Salzes derselben als fluoreszierende Sonde für Zink.
Die durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellte Verbindung (beschränkt auf die Verbindung, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist) ist brauchbar als synthetische Zwischenstufe für die vorstehend erwähnte fluoreszierende Sonde für Zink.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt, dass die fluoreszierende Sonde für Zink gemäß vorliegender Erfindung (Verbindung 6) ausgezeichnete Selektivität für Zink-Ionen aufweist.
2 zeigt, dass die fluoreszierende Sonde für Zink gemäß vorliegender Erfindung (Verbindung 12) ausgezeichnete Selektivität für Zink-Ionen aufweist.
3 zeigt, dass die fluoreszierende Sonde für Zink gemäß vorliegender Erfindung (Verbindung 21) ausgezeichnete Selektivität für Zink-Ionen aufweist.
4 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs der zeitlichen Änderungen der Fluoreszenzintensität zwischen den fluoreszierenden Sonden für Zink gemäß vorliegender Erfindung (Verbindung 6 und Verbindung 12) und ACF-1, das eine cyclische Polyamin-Einheit aufweist.
5 zeigt die Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität der fluoreszierenden Sonden für Zink gemäß vorliegender Erfindung (Verbindung 6 und Verbindung 12) und der Zink-Ionen-Konzentration.
6 zeigt die Änderungen der Fluoreszenzintensität von Verbindung 12, Verbindung 21 und deren Zink-Komplexen bei Änderungen des pH.
7 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Änderungen der Fluoreszenzintensität durch ischämischen Reiz unter Verwendung eines Ratten-Hippokampusschnitts.
8 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Änderungen der Fluoreszenzintensität in den jeweiligen Regionen durch ischämischen Reiz unter Verwendung eines Ratten-Hippokampusschnitts.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
"Alkyl-Gruppe" oder Alkyl-Einheit eines Substituenten, der die in der Beschreibung verwendete Alkyl-Einheit enthält (zum Beispiel eine Alkylcarbonyl-Gruppe oder eine Alkylcarbonyloxymethyl-Gruppe), bedeutet zum Beispiel eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkyl-Gruppe oder eine Alkyl-Gruppe, die eine Kombination derselben mit 1 bis 12 Kohlenstoff-Atomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen und besonders bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen umfasst. Insbesondere ist eine Niederalkyl-Gruppe (eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen) als Alkyl-Gruppe bevorzugt. Zu den Beispielen für Niederalkyl-Gruppen gehören die Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, Cyclopropylmethyl-Gruppe, n-Pentyl-Gruppe und n-Hexyl-Gruppe. Wird auf ein "Halogen-Atom" Bezug genommen, so bedeutet der Begriff irgendeines aus Fluor-Atom, Chlor-Atom, Brom-Atom oder Iod-Atom und bedeutet vorzugsweise ein Fluor-Atom, ein Chlor-Atom oder ein Brom-Atom.
Die Arten der Schutzgruppen für die Amino-Gruppen unterliegen keinen speziellen Einschränkungen. Zum Beispiel kann eine p-Nitrobenzolsulfonsäure-Gruppe, eine Trifluoracetyl-Gruppe sowie eine Trialkylsilyl-Gruppe in geeigneter Weise verwendet werden. Was die Schutzgruppen für Amino-Gruppen anbelangt, so sei beispielsweise auf "Protective Groups in Organic Synthesis" (T. W. Greene, John Wiley & Sons, Inc. (1981)) verwiesen.
In den allgemeinen Formeln (IA) und (IB) unterliegen die Stellungen von R¹ und R², mit denen der Benzolring substituiert ist, keinen speziellen Einschränkungen. Ist R² ein Wasserstoff-Atom, so kann R¹ vorzugsweise in meta-Stellung oder para-Stellung zu der durch -COOR⁷ dargestellten Gruppe binden (oder zur entsprechenden Carbonyl-Gruppe, wenn ein Lacton-Ring gebildet wird). Die Position der Amino-Gruppe, mit der der Benzolring in der allgemeinen Formel (II) substituiert ist, unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Bevorzugt ist die meta-Stellung oder para-Stellung zu der durch -COOR¹⁷ dargestellten Gruppe. In den allgemeinen Formeln (IIIA) und (IIIB) unterliegt die Stellung von Y, mit dem der Benzolring substituiert ist, keinen speziellen Einschränkungen. Y kann vorzugsweise in meta-Stellung zu der durch -COOR²⁷ dargestellten Gruppe binden (oder zur entsprechenden Carbonyl-Gruppe, wenn ein Lacton-Ring gebildet wird).
Bei den durch die allgemeinen Formeln (IA) und (IB) dargestellten Verbindungen ist eines der R¹ und R² vorzugsweise ein Wasserstoff-Atom und das andere ist vorzugsweise eine durch Formel (A) dargestellte Gruppe. In der durch die Formel (A) dargestellten Gruppe bedeuten von den X¹ bis X⁴ X¹ und X² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethyl-Gruppe. Vorzugsweise ist in den durch die allgemeinen Formeln (IA) und (IB) dargestellten Verbindungen m 0, n 1 und X⁴ ein Wasserstoff-Atom. In den obigen Verbindungen sind sowohl X¹ als auch X² 2-Pyridylmethyl-Gruppen. R⁵ und R⁶ sind vorzugsweise Wasserstoff-Atome, und für bildgebende Anwendungen sind R⁵ und R⁶ vorzugsweise Acetyl-Gruppen oder Acetoxymethyl-Gruppen. Es ist bevorzugt, dass sowohl R³ als auch R⁴ Wasserstoff-Atome oder Chlor-Atome sind. R⁷ ist vorzugsweise ein Wasserstoff-Atom.
In der durch die allgemeine Formel (II) dargestellten Verbindung sind sowohl R¹³ als auch R¹⁴ vorzugsweise Wasserstoff-Atome oder Chlor-Atome. R¹⁷ und R¹⁸ sind vorzugsweise Wasserstoff-Atome.
In den durch die allgemeinen Formeln (IIIA) und (IIIB) dargestellten Verbindungen ist eines der R²¹ und R²² vorzugsweise ein Wasserstoff-Atom und das andere ist vorzugsweise eine durch Formel (B) dargestellte Gruppe. In der durch die Formel (B) dargestellten Gruppe bedeuten von den X¹¹ bis X¹⁴ X¹¹ und X¹² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethyl-Gruppe. Vorzugsweise ist in den durch die allgemeinen Formeln (IIIA) und (IIIB) dargestellten Verbindungen p 0, q 1, und X¹⁴ ist ein Wasserstoff-Atom. In den obigen Verbindungen sind sowohl X¹ als auch X² 2-Pyridylmethyl-Gruppen. Vorzugsweise sind sowohl R²³ als auch R²⁴ Wasserstoff-Atome oder Chlor-Atome. R²⁵ und R²⁶ sind vorzugsweise Wasserstoff-Atome, und für bildgebende Anwendungen sind R²⁵ und R²⁶ vorzugsweise Acetyl-Gruppen oder Acetoxymethyl-Gruppen. R²⁷ ist vorzugsweise ein Wasserstoff-Atom.
Die durch die allgemeinen Formeln (I) bis (III) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als Säureadditionssalze oder Basenadditionssalze vorliegen. Zu den Beispielen für Säureadditionssalze gehören Mineralsäuresalze wie etwa Hydrochlorid, Sulfat und Nitrat; und Salze organischer Säuren wie z.B. Methansulfonat, p-Toluolsulfonat, Oxalat, Citrat und Tartrat. Zu den Beispielen für Basenadditionssalze gehören Metallsalze wie etwa Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze und Magnesiumsalze; Ammoniumsalze; und Salze organischer Amine wie etwa Triethylamin-Salze. Außerdem können Salze von Aminosäuren wie z.B. Glycin gebildet werden. Die Verbindungen oder deren Salze gemäß vorliegender Erfindung können als Hydrate oder Solvate vorliegen, und diese Substanzen fallen in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die durch die allgemeinen Formeln (IA), (IB), (II), (IIIA) und (IIIB) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können je nach Art der Substituenten ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoff-Atome aufweisen. Stereoisomere wie z.B. optisch aktive Substanzen, basierend auf einem oder mehreren asymmetrischen Kohlenstoffen, und Diastereomere, basierend auf zwei oder mehr asymmetrischen Kohlenstoffen, sowie beliebige Mischungen von Stereoisomeren, Racemate und dergleichen gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Ist R⁷, R¹¹ oder R²⁷ ein Wasserstoff-Atom, so kann die Carboxyl-Gruppe ein Lacton bilden, und auch solche Strukturisomere gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Eine durch die allgemeine Formel (IA) dargestellte Verbindung, in der R⁵ ein Wasserstoff-Atom ist, und eine durch die allgemeine Formel (IB) dargestellte Verbindung, in der R⁷ ein Wasserstoff-Atom ist, sind Tautomere, und in gleicher Weise sind eine durch die allgemeine Formel (IIIA) dargestellte Verbindung, in der R²⁵ ein Wasserstoff-Atom ist, und eine durch die allgemeine Formel (IIIB) dargestellte Verbindung, in der R²⁷ ein Wasserstoff-Atom ist, Tautomere. Der durchschnittlich qualifizierte Fachmann erkennt ohne Weiteres das Vorliegen der wie vorstehend erklärten Tautomere, und daher sei klar, dass alle diese Tautomere zum Umfang der vorliegenden Erfindung gehören.
Verfahren zur Herstellung typischer Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Schemata gezeigt. Die in den Schemata gezeigten Herstellungsverfahren werden in den Beispielen der Beschreibung ausführlicher erläutert. Ein durchschnittlich qualifizierter Fachmann kann demnach jede der durch die allgemeinen Formeln dargestellten Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung herstellen, indem er die Ausgangsmaterialien für die Reaktion, die Reaktionsbedingungen, Reagenzien und dergleichen auf der Grundlage dieser Erklärungen in geeigneter Weise auswählt und diese Verfahren gegebenenfalls abwandelt und verändert. 4-Aminofluorescein, 5-Aminofluorescein und 6-Aminofluorescein, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden können, lassen sich mit Hilfe von Verfahren herstellen, die beispielsweise in "Yuuki Gousei Kagaku (Synthetic Organic Chemistry) IX" (Tetsuji Kametani, Nankodo Co., Ltd., S. 215 (1977)) beschrieben sind.
Die durch die allgemeine Formel (III) dargestellte Verbindung kann zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens, das im folgenden Schema gezeigt ist, durch Verwendung einer im Handel erhältlichen Verbindung und dergleichen als Reagens und eines Ausgangsmaterials für die Reaktion hergestellt werden.
Die durch die allgemeinen Formeln (I), (II) und (III) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung (mit Ausnahme der Verbindungen, die eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe aufweisen) oder Salze derselben sind brauchbar als fluoreszierende Sonden für Zink. Die durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder deren Salze emittieren an sich keine starke Fluoreszenz, ergeben jedoch Emission einer starken Fluoreszenz nach Bildung von Zink-Komplexen durch Einfang von Zink-Ionen. Die obigen Verbindungen oder deren Salze weisen das Merkmal auf, dass sie Zink-Ionen spezifisch einfangen und den Komplex sehr schnell bilden können. Die gebildeten Zink-Komplexe weisen zudem das Merkmal auf, dass sie starke Fluoreszenz unter langwelligem Anregungslicht emittieren, das keine Schädigungen an lebenden Geweben oder Zellen hervorruft. Somit sind die durch die allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder deren Salze überaus brauchbar als fluoreszierende Sonden für Zink zur Messung von Zink-Ionen in lebenden Zellen oder lebenden Geweben unter physiologischen Bedingungen. Der in der Beschreibung verwendete Begriff "Messung" sollte in seinem weitestem Sinn ausgelegt werden, einschließlich quantitative und qualitative Messungen.
Das Verfahren zur Verwendung der fluoreszierenden Sonde für Zink gemäß vorliegender Erfindung unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und die Sonde kann in der gleichen Weise wie herkömmliche Zink-Sonden verwendet werden. Im allgemeinen wird eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen und Salzen derselben, in einem wässrigen Medium gelöst, etwa in einer physiologischen Salzlösung oder einer gepufferten Lösung oder in einer Mischung aus dem wässrigen Medium und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton, Ethylenglycol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, und anschließend wird die resultierende Lösung einer geeigneten gepufferten Lösung zugesetzt, die Zellen oder Gewebe enthält, und es kann ein Fluoreszenzspektrum gemessen werden.
Zum Beispiel haben die Zink-Komplexe von Verbindung 6 und Verbindung 12, die in obigem Schema gezeigt sind, Anregungswellenlängen von 491 nm und 492 nm und Fluoreszenzwellenlängen von 513 nm bzw. 514 nm. Wird die Verbindung in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 μM eingesetzt, so können Zink-Ionen mit einer Konzentration von 10 μM oder darunter gemessen werden. Die fluoreszierende Sonde für Zink gemäß vorliegender Erfindung kann mit einem geeigneten Additiv kombiniert werden, um sie in Form einer Zusammenset zung zu verwenden. Zum Beispiel kann die fluoreszierende Sonde für Zink mit Additiven wie z.B. Puffermitteln, Solubilisierungsmitteln und pH-Regulatoren kombiniert werden.
Die Verbindung 22 zum Beispiel hat eine Lipophilie solchen Ausmaßes, dass sie Zellmembranen leicht durchdringt. Nachdem die Verbindung 22 die Zellmembran durchdrungen hat, wird die Verbindung durch eine im Zytoplasma vorhandene Esterase hydrolysiert, so dass die Verbindung 12 gebildet wird. Die Verbindung 12 kann aufgrund ihrer Wasserlöslichkeit Zellmembranen nur schwer durchdringen, und aus diesem Grund kann die Verbindung 12 über einen längeren Zeitraum im Innern der Zelle gehalten werden. Somit ist die Verbindung 22 überaus brauchbar zur Messung von Zink-Ionen, die in einer einzelnen Zelle vorliegen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispielen eingehender erklärt werden. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Nummern der Verbindungen in den Beispielen entsprechen den in den obigen Schemata verwendeten.
Beispiel 1: Synthese von Verbindung 6
Cäsiumcarbonat (5,2 g, 16 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Aminofluorescein (1) (2,5 g, 7,2 mmol) in 50 ml Dimethylformamid gegeben. Anschließend wurde diese Lösung mit Pivaloylanhydrid (3,1 ml, 15 mmol) versetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung eines Kiriyama-Trichters filtriert, und das Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, um 3,6 g Verbindung 2 zu ergeben (weißer Feststoff; Ausbeute: 97%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 7,19 (m, 1H), 7,02 (d, 2H, J = 2,4), 6,93–6,94 (m, 2H), 6,88 (d, 2H, J = 8,7), 6,77 (dd, 2H, J = 8,7, 2,4), 4,06 (br, 2H), 1,34 (s, 18H).
MS (FAB): 516 (M⁺ + 1).
Schmp.: 206–208°C (umkristallisiert aus Methanol).
Verbindung 2 (1,0 g, 2,0 mmol) wurde in 15 ml Pyridin gelöst, die Lösung wurde mit 4-Nitrobenzolsulfonylchlorid (1,2 g, 5,3 mmol) versetzt, und die Mischung wurde anschließend 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Pyridin wurde unter vermindertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde in 25 ml Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetat-Lösung wurde mit 2 N Salzsäure und gesättigter Salzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Ethylacetats unter vermindertem Druck wurde eine Reinigung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel durchgeführt, um 1,2 g Verbindung 3 zu ergeben (weißer Feststoff; Ausbeute: 88%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,33 (d, 2H, J = 9,0), 8,05 (d, 2H, J = 9,0), 7,69 (d, 1H, J = 2,2), 7,45 (dd, 1H, J = 8,2, 2,2), 7,07 (d, 1H, J = 8,2), 7,06–7,04 (m, 2H), 6,77–6,74 (m, 4H), 1,36 (s, 18H).
MS (FAB): 701 (M⁺ + 1).
Schmp.: 245–247°C (umkristallisiert aus Ethylacetat + n-Hexan).
Cäsiumcarbonat (0,48 g, 1,5 mmol) und 1,2-Dibromethan (1,3 ml, 14 mmol) wurden einer Lösung von Verbindung 3 (0,97 g, 1,4 mmol) in 25 ml Dimethylformamid zugesetzt, und die Mischung wurde 20 Stunden bei 60°C gerührt. Das Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abgedampft, und es wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetat-Lösung wurde mit Wasser und gesättigter Salzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Ethylacetats unter vermindertem Druck wurde eine Reinigung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel durchgeführt, um 0,78 g Verbindung 4 zu ergeben (weißer Feststoff; Ausbeute: 70%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,38 (d, 2H, J = 9,0), 7,86 (d, 2H, J = 9,0), 7,76 (d, 1H, J = 2,0), 7,45 (dd, 1H, J = 8,0, 2,0), 7,17 (d, 1H, J = 8,0), 7,08 (m, 2H), 6,85–6,84 (m, 4H), 4,01 (t, 2H, J = 6,8), 3,45 (t, 2H, J = 6,8), 1,37 (s, 18H).
MS (FAB): 807, 809 (M⁺ + 1).
Schmp.: 280–281°C (umkristallisiert aus Acetonitril).
Die Verbindung 4 (0,10 g, 0,13 mmol) wurde in 4 ml Acetonitril suspendiert, die Suspension wurde mit Kaliumiodid (55 mg, 0,33 mmol), Kaliumcarbonat (43 mg, 0,31 mmol) und 2,2'-Dipicolylamin (78 mg, 0,39 mmol) versetzt, und anschließend wurde die Mischung 14 Stunden am Rückfluss gehalten. Nach Abdampfen des Acetonitrils unter vermindertem Druck wurde das Produkt in einer wässrigen Lösung von 2 N Natriumcarbonat gelöst, wonach mit Methylenchlorid extrahiert wurde. Die Methylenchlorid-Schicht wurde mit gesättigter Salzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck abgedampft, gefolgt von einer Reinigung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel, um 80 mg Verbindung 5 zu ergeben (hellgelbes Öl; Ausbeute: 69%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,47–8,45 (m, 2H), 8,32 (d, 2H, J = 9,0), 7,77 (d, 2H, J = 9,0), 7,69–7,61 (m, 3H), 7,61 (d, 2H, J = 7,9), 7,27–7,23 (m, 1H), 7,14 (m, 2H), 7,07 (d, 2H, J = 2,2), 6,99 (d, 1H, J = 8,0), 6,82 (dd, 2H, J = 8,6, 2,2), 6,72 (d, 2H, J = 8,6), 3,82 (s, 4H), 3,82 (m, 2H), 2,72 (t, 2H, J = 6,4), 1,37 (s, 18H).
MS (FAB): 926 (M⁺ + 1).
Kaliumcarbonat (26 mg, 0,19 mmol) und Thiophenol (12 μl, 0,12 mmol) wurden einer Lösung von Verbindung 5 (34 mg, 37 μmol) in 4 ml Dimethylformamid zugesetzt, und die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von Kaliumhydroxid (70 mg, 1,2 mmol) in 1 ml Methanol und 1 ml Wasser wurde der Reaktionsmischung zugesetzt, und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Versetzen der Mischung mit 2 ml 2 N Salzsäure wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Das Produkt wurde in 10 ml Ethanol suspendiert und filtriert, und anschließend wurde das Ethanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, um 15 mg Verbindung 6 zu ergeben (brauner Feststoff; Ausbeute: 70%).
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): 8,61–8,59 (m, 2H), 8,04–7,98 (m, 2H), 7,63 (d, 2H, J = 7,9), 7,51–7,46 (m, 2H), 7,14 (d, 1H, J = 2,0), 7,02 (d, 2H, J = 9,0), 6,95–6,87 (m, 4H), 6,79 (dd, 2H, J = 9,0, 2,4), 4,46 (s, 4H), 3,50 (t, 2H, J = 6,0), 3,25 (m, 2H).
MS (FAB): 573 (M⁺ + 1).
Beispiel 2: Synthese von Verbindung 12
Die Verbindung 8 (4,4 g) wurde aus 5-Aminofluorescein (7) (3,5 g, 10 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 2 erhalten (weißer Feststoff; Ausbeute: 84%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 7,77 (d, 1H, J = 7,9), 7,01 (d, 2H, J = 2,0), 6,95 (d, 2H, J = 8,6), 6,80–6,75 (m, 3H), 6,22 (d, 1H, J = 1,7), 4,21 (br, 2H), 1,36 (s, 18H).
MS (FAB): 516 (M⁺ + 1).
Schmp.: 161–163°C (umkristallisiert aus Methanol).
Die Verbindung 9 (4,1 g) wurde aus Verbindung 8 (3,6 g, 6,9 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 3 erhalten (weißer Feststoff; Ausbeute: 84%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,61 (br, 1H), 8,20 (d, 2H, J = 9,0), 7,88 (d, 1H, J = 8,3), 7,81 (d, 2H, J = 9,0), 7,33–7,29 (m, 1H), 7,05 (d, 1H, J = 2,2), 6,84 (d, 1H, J = 1,8), 6,74 (dd, 2H, J = 8,6, 2,2), 6,69 (d, 2H, J = 8,6), 1,38 (s, 18H).
MS (FAB): 701 (M⁺ + 1).
Schmp.: 189–191°C (umkristallisiert aus Ethylacetat + n-Hexan).
Die Verbindung 10 (0,35 g) wurde aus Verbindung 9 (0,51 g, 0,73 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 4 erhalten (weißer Feststoff; Ausbeute: 60%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,11 (d, 2H, J = 9,0), 8,10–8,09 (m, 1H), 7,71 (dd, 1H, J = 8,2, 1,8), 7,56 (d, 2H, J = 9,0), 7,02 (d, 2H, J = 2,2), 6,86 (dd, 2H, J = 8,6, 2,2), 6,79 (d, 2H, J = 8,6), 6,43 (d, 1H, J = 1,8), 3,85 (t, 2H, J = 6,6), 3,40 (t, 2H, J = 6,6), 1,38 (s, 18H).
MS (FAB): 807, 809 (M⁺ + 1).
Schmp.: 288–269°C (umkristallisiert aus Acetonitril).
Die Verbindung 11 (0,27 g) wurde aus Verbindung 10 (0,31 g, 0,38 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 5 erhalten (hellgelber Feststoff; Ausbeute: 75%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,45–8,42 (m, 2H), 8,06 (d, 2H, J = 9,0), 7,96 (d, 1H, J = 8,3), 7,64–7,59 (m, 2H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0), 7,53–7,50 (m, 1H), 7,33 (d, 2H, J = 7,7), 7,17 (m, 2H), 7,00 (d, 2H, J = 2,2), 6,78 (dd, 2H, J = 8,6, 2,2), 6,64 (d, 2H, J = 8,6), 6,48 (d, 1H, J = 1,3), 3,71 (s, 4H), 3,67 (t, 2H, J = 6,2), 2,67 (t, 2H, J = 6,2), 1,37 (s, 18H).
MS (FAB): 926 (M⁺ + 1).
Schmp.: 146–148°C (umkristallisiert aus Methanol).
Die Verbindung 12 (6,6 mg) wurde aus Verbindung 11 (20 mg, 22 μmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 6 erhalten (brauner Feststoff; Ausbeute: 53%).
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): 8,44–8,42 (m, 2H), 7,94–7,88 (m, 2H), 7,60 (d, 1H, J = 8,4), 7,49 (d, 2H, J = 7,9), 7,45–7,41 (m, 2H), 6,71 (br, 1H), 6,65 (d, 2H, J = 2,4), 6,61 (d, 2H, J = 8,8), 6,51 (dd, 2H, J = 8,8, 2,4), 6,02 (d, 1H, J = 1,8), 4,30 (s, 4H), 3,28 (t, 2H, J 6,0), 3,03 (t, 2H, J = 6,0).
MS (FAB): 573 (M⁺ + 1).
Beispiel 3: Synthese von Verbindung 15
4-Nitrophthalsäureanhydrid (13) (16 g, 84 mmol) und 4-Chlorresorcin (14) (24 g, 0,17 mol) wurden in 250 ml Methansulfonsäure gelöst, und die Mischung wurde unter Argon 60 Stunden bei 80°C gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend in kleinen Teilen zu 1,4 l Eiswasser gegeben. Der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, um 37 g Verbindung 15 zu ergeben (quantitative Ausbeute).
Synthese von Verbindung 16
Die Verbindung 15 (20 g, 45 mmol) wurde in 700 ml Wasser suspendiert, und die Suspension wurde mit Natriumsulfat-nonahydrat (54 g, 0,23 mol) und Natriumhydrogensulfid-n-hydrat (20 g, 0,25 mol, etwa 70% Natriumhydrogensulfid) versetzt, und die Mischung wurde unter Argon 20 Stunden am Rückfluss gehalten. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung mit Salzsäure versetzt, um den pH auf 3 bis 4 einzustellen. Der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, um 19 g Verbindung 16 zu ergeben (quantitative Ausbeute).
Synthese von Verbindung 17
Die Verbindung 17 (3,9 g) wurde aus Verbindung 16 (4,4 g, 11 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 2 erhalten (Ausbeute: 62%).
MS (FAB): 584, 586, 588 (M⁺ + 1).
Synthese der Verbindungen 18 und 18'
Die Verbindung 18 (1,9 g) und 1,8 g Verbindung 18' wurden aus Verbindung 17 (3,8 g, 6,5 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 3 erhalten (Ausbeute: 38% für Verbindung 18; 35% für Verbindung 18'). Verbindung (18):
¹H-NMR (CDCl₃ 300 MHz): 8,38 (d, 2H, J = 8,7), 8,07 (d, 2H, J = 8,7), 7,72 (d, 1H, J = 2,1), 7,48 (dd, 1H, J = 8,1, 2,1), 7,12 (d, 1H, J = 8,1), 7,11 (s, 2H), 6,77 (s, 2H), 1,40 (s, 18H).
MS (FAB): 769, 771, 773 (M⁺ + 1).
Verbindung 18':

¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,26 (d, 2H, J = 8,6), 7,93 (d, 1H, J = 8,4), 7,84 (d, 2H, J = 8,6); 7,27 (dd, 1H; J = 8,4, 2,0), 7,13 (s, 2H), 6,99 (d, 1H, J = 2,0), 6,75 (s, 2H), 1,42 (s, 18H).
MS (FAB): 769, 771, 773 (M⁺ + 1).

Synthese von Verbindung 19
Die Verbindung 19 (1,2 g) wurde aus Verbindung 18 (1,5 g, 2,0 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 4 erhalten (Ausbeute: 66%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,39 (d, 2H, J = 9,0), 7,85 (d, 2H, J = 9,0), 7,79 (d, 1H, J = 2,0), 7,51 (dd, 1H, J = 8,2, 2,0), 7,18 (d, 1H, J = 8,2), 7,14 (s, 2H), 6,89 (s, 2H), 4,06 (t, 2H, J = 6,8), 3,50 (t, 2H, J = 6,8), 1,40 (s, 18H).
MS (FAB): 875, 877, 879, 881 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 19'
Die Verbindung 19' (0,70 g) wurde aus Verbindung 18' (1,5 g, 2,0 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 4 erhalten (Ausbeute: 40%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,19 (d, 2H, J = 9,0), 8,13 (d, 1H, J = 8,3), 7,70 (br, 1H), 7,62 (d, 2H, J = 9,0), 7,11 (s, 2H), 6,84 (s, 2H), 6,63 (d, 1H, J = 1,8), 3,94 (t, 2H, J = 6,4), 3,46 (t, 2H, J = 6,4), 1,41 (s, 18H).
MS (FAB): 875, 877, 879, 881 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 20
Die Verbindung 20 (0,56 g) wurde aus Verbindung 19 (1,0 g, 1,1 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 5 erhalten (Ausbeute: 49%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,50–8,47 (m, 2H), 8,33 (d, 2H, J = 8,7), 7,76 (d, 2H, J = 8,7), 7,70–7,60 (m, 3H), 7,46 (d, 2H, J = 7,9), 7,32 (br, 1H, J = 8,3), 7,16–7,12 (m, 2H), 7,14 (s, 2H), 7,00 (d, 1H, J = 8,3), 6,79 (s, 2H), 3,87 (t, 2H, J = 6,0), 3,83 (s, 4H), 2,76 (t, 2H, J = 6,0), 1,41 (s, 18H).
MS (FAB): 994, 996, 998 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 20'
Die Verbindung 20' (75 mg) wurde aus Verbindung 19' (0,20 g, 0,23 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 5 erhalten (Ausbeute: 33%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,43–8,41 (m, 2H), 8,17 (d, 2H, J = 9,0), 7,97 (d, 1H, J = 8,3), 7,63–7,57 (m, 2H), 7,56 (d, 2H, J = 9,0), 7,49 (br, 1H, J = 8,3), 7,31 (d, 2H, J = 7,7), 7,16–7,12 (m, 2H), 7,08 (s, 2H), 6,79 (s, 2H), 6,72 (d, 2H, J = 1,1), 3,74 (t, 2H, J = 6,2), 3,71 (s, 4H), 2,74 (t, 2H, J = 6,2), 1,40 (s, 18H).
MS (FAB): 994, 996, 998 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 21
Die Verbindung 21 (98 mg) wurde aus Verbindung 20 (0,26 g, 0,26 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 6 erhalten (Ausbeute: 35%).
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): 8,56 (br, 2H, J = 4,8), 7,98–7,91 (m, 2H), 7,57 (d, 2H, J = 7,9), 7,46–7,41 (m, 2H), 6,94–6,81 (m, 3H), 6,73 (s, 2H), 6,56 (s, 2H), 4,48 (s, 4H), 3,50 (t, 2H, J = 5,5), 3,29 (t, 2H, J = 5,5).
MS (FAB): 641, 643, 645 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 21'
Die Verbindung 21' (58 mg) wurde aus Verbindung 20' (0,20 g, 0,20 mmol) in der gleichen Weise wie bei der Synthese von Verbindung 6 erhalten (Ausbeute: 26%).
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): 8,45–8,43 (m, 2H), 7,93–7,88 (m, 2H), 7,58 (d, 1H, J = 8,6), 7,50 (d, 2H, J = 7,9), 7,45–7,41 (m, 2H), 6,72 (s, 2H), 6,73–6,88 (m, 1H), 6,58 (s, 2H), 6,01 (d, 1H, J = 1,8), 4,30 (s, 4H), 3,27 (t, 2H, J = 5,7), 3,06 (t, 2H, J = 5,7).
MS (FAB): 641, 643, 645 (M⁺ + 1).
Synthese von Verbindung 22
Die Verbindung 12 (140 mg, 0,13 mmol) wurde in 10 ml Acetonitril suspendiert, und die Suspension wurde mit Cäsiumcarbonat (0,19 g, 0,30 mmol) und anschließend portionsweise mit 28 μl Acetanhydrid versetzt. Nach 1 Stunde Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, gefolgt von einer Reinigung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel, um 79 mg Verbindung 22 zu ergeben (Ausbeute: 94%).
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): 8,51–8,49 (m, 2H), 7,73 (d, 1H, J = 8,4), 7,60–7,54 (m, 2H), 7,31 (d, 2H, J = 7,7), 7,15–7,11 (m, 2H), 7,05 (d, 2H, J = 2,2), 6,96 (d, 2H, J = 8,6), 6,80 (dd, 2H, J = 2,2, 8,6), 6,77–6,74 (m, 1H), 6,48 (br, 1H), 6,02 (d, 1H, J = 1,7), 3,86 (s, 4H), 3,06 (br, 2H), 2,82 (t, 2H, J = 5,1), 2,31 (s, 6H).
Beispiel 4
Die in Beispiel 2 erhaltene Verbindung 6 und die in Beispiel 2 erhaltene Verbindung 12 wurden zur Abschätzung der Selektivität für Zink-Ionen herangezogen. 5 μM Verbindung 6 bzw. Verbindung 12 wurden in 100 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) gegeben, der verschiedene Metall-Ionen enthielt (5 μM bzw. 5 mM). Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 491 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 513 nm für Verbindung 6 und einer Anregungswellenlänge von 492 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 514 nm für Verbindung 12 gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 (Verbindung 6) und 2 (Verbindung 12) gezeigt. 1 μM Verbindung 21 wurde in 100 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) gegeben, der verschiedene Metall-Ionen enthielt (1 μM bzw. 5 mM), und die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 505 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 522 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Die Figuren zeigen die Fluoreszenzintensitäten auf der Ordinate als numerische Werte mit Zugabe der jeweiligen Metall-Ionen relativ zur Fluoreszenzintensität ohne Zugabe von Metall-Ionen, die als 1 genommen wird. Es ist klar erkennbar, dass Verbindung 6 und Verbindung 12 der vorliegenden Erfindung äußerst hohe Selektivität für Zink-Ionen aufweisen, und die Verbindungen ergeben absolut keine Zunahme der Fluoreszenzintensität selbst in Gegenwart von Natrium-Ionen, Kalium-Ionen, Calcium-Ionen und Magnesium-Ionen in hoher Konzentration (5 mM), die im lebenden Organismus in großen Mengen vorliegen. Ebenso ist klar erkennbar, dass diese Metall-Ionen keinen Einfluss auf die Zunahme der Fluoreszenzintensität durch Zink-Ionen haben.
Die Verbindung 21 zeigte hohe Selektivität für Zink. Insbesondere ergibt die Zugabe von Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium in hoher Konzentration (5 mM), bei denen es sich um Metall-Ionen handelt, die in lebenden Organismen sehr häufig anzutreffen sind, nahezu keine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Diese Metall-Ionen hatten keinen Einfluss auf die durch Zink hervorgerufene Zunahme der Fluoreszenzintensität.
Beispiel 5
Zink-Ionen (Endkonzentration 5 μM oder 50 μM) wurden in 100 mM HEPES (pH 7,5) gegeben, das 5 μM Verbindung 6, Verbindung 12 bzw. ACF-1 enthielt (eine Verbindung mit einer cyclischen Polyamin-Einheit, die als Verbindung 20 in Beispiel 1 der japanischen Patentanmeldung Nr. (Hei) 11-40325 beschrieben ist), um die Fluoreszenzintensität zu messen. Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 491 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 513 nm für Verbindung 6, einer Anregungswellenlänge von 492 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 514 nm für Verbindung 12 und einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 515 nm für ACF-1 gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. In dieser Figur gibt die Ordinatenachse die relative Fluoreszenzintensität an. Wie aus den Ergebnissen klar hervorgeht, wird die Fluoreszenzintensität durch ACF-1 nicht augenblicklich erhöht, während die Fluoreszenzintensitäten durch Verbindung 6 und Verbindung 12 der vorliegenden Erfindung augenblicklich erhöht wurden. Somit ermöglicht der Einsatz der Verbindung gemäß vorliegender Erfindung einen sehr schnellen Nachweis von Zink und ermöglicht auch den Nachweis einer raschen Änderung der Konzentration von Zink.
Beispiel 6
Zink-Ionen in verschiedenen Konzentrationen wurden in 100 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) gegeben, der 5 μM Verbindung 6, Verbindung 12, ACF-1 bzw. Newport Green (Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. Aufl. von Richard P. Haugland, S. 531–540) enthielt, und die Änderungen der Fluoreszenzintensität wurden gemessen. Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 491 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 513 nm für Verbindung 6, einer Anregungswellenlänge von 492 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 514 nm für Verbindung 12, einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 515 nm für ACF-1 und einer Anregungswellenlänge von 505 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 530 nm für Newport Green gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. In dieser Figur sind die Fluoreszenzintensitäten auf der Ordinatenachse als numerische Werte mit Zugabe der jeweiligen Metall-Ionen relativ zur Fluoreszenzintensität ohne Zugabe von Metall-Ionen gezeigt, die als 1 genommen wird. Die Verbindung 6 und die Verbindung 12 der vorliegenden Erfindung zeigten hohe Nachweisempfindlichkeit. Insbesondere war die Nachweisempfindlichkeit von Verbindung 12 sehr hoch – eine Bestätigung für die optimale Kombination aus Chelator-Einheit und Fluoreszenz emittierender Einheit der Verbindung.
Beispiel 7
Die Änderungen der Fluoreszenzintensität der Verbindung 12, Verbindung 21 und den Zink-Komplexen derselben wurden in Zusammenhang mit pH-Änderungen untersucht. Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 492 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 514 nm für Verbindung 12 und einer Anregungswellenlänge von 505 nm und einer Fluoreszenzwellenlänae von 522 nm für Verbindung 21 gemessen. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
Die verwendeten Puffer sind wie folgt:
100 mM Cl₂CHCOOH-Cl₂CHCOONa-Puffer (pH 2,0)
100 mM ClCH₂COOH-ClCH₂COONa-Puffer (pH 3,0)
100 mM AcOH-AcONa-Puffer (pH 4,0, 4,5, 5,0)
100 mM MES-Puffer (pH 5,5, 6,0, 6,5)
100 mM HEPES-Puffer (pH 7,0, 7,5, 8,0)
100 mM CHES-Puffer (pH 8,5)
Die Fluoreszenzintensität von Verbindung 21 war stabiler als die von Verbindung 12 bei einem pH um 7,4, bei dem es sich um einen intrazellulären pH handelt, womit sich zeigt, dass die Sonde durch intrazelluläre pH-Änderungen kaum beeinflusst wird.
Beispiel 8
Die Änderung der Fluoreszenzintensität durch ischämischen Reiz wurde unter Verwendung eines Ratten-Hippokampusschnitts untersucht.
10 μM Verbindung 22 wurden einem Ratten-Hippokampusschnitt zugesetzt und inkubiert, und dann wurde der Schnitt 10 Minuten einem ischämischen Reiz ausgesetzt (2 bis 12 Minuten in der Zeichnung), um eine zeitliche Änderung in den Fluoreszenzbildern zu beobachten. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Zur Präparation des Hippokampusschnitts wurden Ringer-Lösungen der folgenden Formulierungen verwendet.
(1) Ringer-Lösung

Formulierung: 124 mM NaCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃3, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glucose

(2) Ringer-Lösung für Ischämie

Formulierung: 124 mM NaCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 10 mM 2-Desoxyglucose

(3) Cholin-Ringer-Lösung

Formulierung: 124 mM Cholin, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM KCl, 0,5 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Glucose

Die für die Präparation und Messung der Schnitte verwendeten Ringer-Lösungen wurden unter ständigem Einperlen von 95% O₂/5% CO₂ gehalten.
Eine Wistar-Ratte (200 bis 250 g, männlich) wurde mit Ether anästhesiert. Nach Dekapitation wurde das gesamte Gehirn rasch exstirpiert, in die eisgekühlte Cholin-Ringer-Lösung gelegt und 10 Minuten stehengelassen. Nach Schneiden des Gehirns in linke und rechte Hemisphäre auf einem Shale, das mit der eisgekühlten Cholin-Ringer-Lösung und einer halbgefrorenen Cholin-Ringer-Lösung beschickt war, wurde das Zwischenhirn entfernt und der Hippokampus wurde mit einem Spatel entnommen. Der Hippokampus wurde auf Agar gelegt, mit Nadeln am Agar befestigt und mit einem Drehschneider auf eine Breite von 300 μm geschnitten. Der geschnittene Hippokampus wurde in die auf 30°C erwärmte Ringer-Lösung verbracht und 30 Minuten bis 1 Stunde stehengelassen. Der geschnittene Hippokampus wurde bis zur Verwendung in der Ringer-Lösung bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Anschließend wurde eine 10 mM-Lösung von Verbindung 22 in DMSO mit der Ringer-Lösung auf 10 μM verdünnt. Der geschnittene Hippokampus wurde in die resultierende Lösung gegeben und unter schattigen Bedingungen 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem der geschnittene Hippokampus in die frische Ringer-Lösung verbracht und etwa 30 Minuten bis 1 Stunde und 30 Minuten gewaschen worden war, wurde er in eine Kammer überführt und der Messung unterzogen. Die erwärmte Ringer-Lösung wurde in der Kammer umgepumpt (Fließgeschwindigkeit 2 bis 3 ml/Minute), um die Temperatur konstant bei 33 bis 34°C zu halten. Die Messung wurde mit einem umgekehrten Mikroskop (Olympus IX-70, Objektivlinse: 4×, dichroitischer Spiegel: 505 nm) durchgeführt.
Der ischämische Reiz erfolgte durch Austauschen der in der Kammer umgepumpten Ringer-Lösung in der folgenden Weise:
Ringer-Lösung (Einperlen von 95% O₂ + 5% CO₂): 2 Minuten (0100,00 bis 0200,00 in der Figur) → Ringer-Lösung für Ischämie (Einperlen von 95% N₂ + 5% CO₂): 10 Minuten (0300,00 bis 1200,00 in der Figur) → Ringer-Lösung (Einperlen von 95% O₂ + 5% CO₂): 4 Minuten (1300,00 bis 1600,00 in der Figur).
Im Ergebnis zeigte sich, dass die Fluoreszenzintensität in der CA1-Region, wo der Zelltod berichtetermaßen durch ischämischen Reiz hervorgerufen wird, etwa 3 Minuten nach Initiierung des ischämischen Reizes zunahm.
Des Weiteren nahm die Fluoreszenzintensität nach dem ischämischen Reiz am deutlichsten in der CA1-Region zu (1, 2, 3 in der Zeichnung), wie in 8 gezeigt. Die Fluoreszenzintensität nahm auch in der CA3-Region (Stelle 4 in der Figur) und im Gyrus dentatus zu (Stellen 6 und 7 in der Figur). Die Ordinatenachse des Graphen zeigt die Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt der Einleitung der Messung (0,00 s), die als 1,00 genommen wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist brauchbar als fluoreszierende Sonde für die Messung von Zink. Insbesondere ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie sehr schnell einen Komplex mit Zink bildet und die Nachweisempfindlichkeit sehr hoch ist. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist demnach überaus brauchbar als Agens zur präzisen Messung rascher Änderungen der Konzentration von Zink-Ionen in einem lebenden Organismus.

Claims

Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (IA) oder (IB), oder ein Salz derselben:
worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Formel (A) dargestellt wird:
worin X¹, X² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethylgruppe und X³ und X⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine 2-Pyridylmethylgruppe oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeuten, und m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten, wobei m und n nicht gleichzeitig null sein können, mit der Maßgabe, dass R¹ und R² nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten; R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylcarbonyl- oder eine Alkylcarbonyloxymethylgruppe bedeuten und R⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet, wobei die folgenden Verbindungen ausgeschlossen sind: a) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IA), in der R¹, R² NH₂ oder NHMe sind, R³, R⁴ F, Cl oder H sind und R⁵, R⁶ H oder Ac sind; b) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IA), in der R¹ NH₂ ist, R² H ist, R³, R⁴ H sind, R⁵, R⁶ Ac sind; c) Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IB), in der R¹ NH₂ ist, R² H ist, R⁷ H oder Et ist, R³, R⁴, R⁶ H sind.
Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (II), oder ein Salz derselben:
worin R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R¹⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet; und R¹⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeutet.
Verbindung oder ein Salz derselben nach Anspruch 2, worin R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatome bedeuten.
Verbindung oder ein Salz derselben nach Anspruch 2 oder 3, worin sowohl R¹³ als auch R¹⁴ Wasserstoffatome sind oder sowohl R¹³ als auch R¹⁴ Chloratome sind.
Verbindung, dargestellt durch die aligemeine Formel (IIIA) oder (IIIB), oder ein Salz derselben:
worin R²¹ und R²² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Formel (B) dargestellt wird:
worin X¹¹, X¹² unabhängig voneinander eine 2-Pyridylmethylgruppe und X¹³ und X¹⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine 2-Pyridylmethylgruppe oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe bedeuten, und p und q unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, wobei p und q nicht gleichzeitig null sein können, mit der Maßgabe, dass R²¹ und R²² nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten; Y -CO-NH- oder -NH-CO- bedeutet; R²³ und R²⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten; R²⁵ und R²⁶ unabhängig voneinander ein Was serstoffatom, eine Alkylcarbonyl- oder eine Alkylcarbonyloxymethylgruppe bedeuten; und R²⁷ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeutet.
Fluoreszierende Sonde für Zink, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mit der Maßgabe, dass eine Verbindung ausgeschlossen ist, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist, oder ein Salz derselben.
Zink-Komplex, der mit Hilfe einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einem Salz derselben zusammen mit einem Zink-Ion gebildet wird, mit der Maßgabe, dass eine Verbindung ausgeschlossen ist, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist.
Verfahren zur Messung eines Zink-Ions, wobei eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Salz derselben als fluoreszierende Sonde für Zink verwendet wird, mit der Maßgabe, dass eine Verbindung ausgeschlossen ist, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist.
Verfahren zur Messung eines Zink-Ions, umfassend die Schritte: (a) Umsetzen einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Salzes derselben mit einem Zink-Ion, mit der Maßgabe, dass eine Verbindung ausgeschlossen ist, bei der eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe eingeführt ist; und (b) Messen der Fluoreszenzintensität des im vorstehenden Schritt erzeugten Zink-Komplexes.