DE69909611T2

DE69909611T2 - Reagenz zum nachweis von singulett-sauerstoff

Info

Publication number: DE69909611T2
Application number: DE69909611T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Nagano; Naoki Umezawa
Original assignee: NAGANO TESTUO
Current assignee: NAGANO TESTUO
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2019-04-01
Also published as: EP1069121A1; DE69909611D1; JP4373608B2; WO1999051586A1; AU3053599A; US6525088B1; CA2326561A1; EP1069121B1; EP1069121A4

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung oder deren Salz, welche nützlich als ein Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff, welches die zuvor genannte Verbindung oder deren Salz enthält.
Hintergrund
Es ist bekannt, dass in lebenden Organismen und bei Vorgängen des Lebens, freie Radikalspezies wie z. B. Stickstoffmonoxid als sekundäre Botenstoffe für die Weitergabe von Signalen agieren, und dass sie verschiedene physiologische Funktionen ausüben, z. B. die Kontrolle des Blutdrucks im Kreislaufsystem und ähnliches. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Superoxide und Wasserstoffperoxid als aktive Sauerstoff-Spezies ebenfalls wichtige physiologische Funktionen im Immunsystem und ähnlichem ausüben. Hingegen wurde die Bedeutung von Singulett-Sauerstoff, welcher eine analoge elektronische Struktur aufweist, als physiologisch aktive Spezies bislang nur wenig erläutert.
Kürzlich wurde Singulett-Sauerstoff als eine reaktive Spezies in der photodynamischen Therapie, welche eine der Krebstherapien darstellt, identifiziert, und es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Arten von Oxidasen, Peroxidasen und ähnliches in lebenden Organismen Singulett-Sauerstoff erzeugen. Darüber hinaus, wurde ebenfalls entdeckt, dass Sauerstoff-Moleküle als Sensor agieren und signal-ähnliche Wirkungen zeigen, und daher wurde auch vorgeschlagen, dass Singulett-Sauerstoff möglicherweise für wichtige physiologische Funktionen in lebenden Organismen verantwortlich ist.
Zehn oder mehr verschiedene Verfahren sind gewöhnlich bekannt als Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff in lebenden Orga nismen, darunter das Chemilumineszenz-Verfahren, das Elektronenspinresonanz-Verfahren (ESR), das Lumineszenz-Verfahren und ähnliche. Jedoch liefern diese Verfahren gewöhnlich nur eine niedrige Genauigkeit und Empfindlichkeit und stellen daher keine verlässliche Verfahren dar (zum Verfahren zur spezifischen Detektion von Singulett-Sauerstoff siehe: Nagano, T. et al., Free Radicals in Clinical Medicine, Vol. 7, S. 35–41 1993 etc.). Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, ein bezüglich Genauigkeit und Empfindlichkeit überlegeneres Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff zu entwickeln, um zu untersuchen, auf welche Weise Singulett-Sauerstoff in Vorgänge des Lebens verwickelt ist.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Verbindung, welche als Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff nützlich ist, zur Verfügung zu stellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff zur Verfügung zu stellen, welches die oben genannte Verbindung enthält, sowie ein Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff unter Verwendung besagter Verbindung. Insbesondere stellt es ein Ziel der vorliegenden Erfindung dar, ein Agens zur exakten Messung von Singulett-Sauerstoff , welcher in bestimmten Zellen oder Geweben in lebenden Organismen lokalisiert ist, mittels einer Bioimaging-Technik zur Verfügung zu stellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten verschiedenartige Studien durch, um die zuvor genannten Ziele zu erreichen. Als ein Ergebnis fanden sie heraus, dass eine im Wesentlichen nicht fluoreszierende Verbindung, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird, wirksam mit Singulett-Sauerstoff zu einer fluoreszierenden Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (II), reagiert. Zudem fanden sie heraus, dass Singulett-Sauerstoff mit extrem hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit gemessen werden kann, indem eine durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung als Agens für die Messung von Singulett-Sauerstoff verwendet wird, und indem die Fluoreszenz von einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (II) gemessen wird, welche als Ergebnis der Reaktion der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindung und Singulett-Sauerstoff, welcher in lebenden Zellen oder Geweben lokalisiert ist, erzeugt wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnisse erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt daher Verbindungen zur Verfügung, welche durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt werden:
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe darstellen, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander für eine C_1- ₆-Alkyl-Guppe oder eine Aryl-Gruppe stehen, die substituiert sein kann, R⁹ und R¹⁰ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe repräsentieren, und R¹¹ ein Wasserstoffatom oder eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe darstellt, oder Salze derselben.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls Verbindungen dargestellt durch die folgende all-gemeine Formel (II) zur Verfügung gestellt:
worin R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_l- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_l-6-Alkoxy-Gruppe darstellen, R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander für eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe stehen, welche substituiert sein kann, R²⁰ und R²¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6-Alkylgruppe oder eine C_1- ₆-Alkoxy-Gruppe repräsentieren, und R²² ein Wasserstoffatom oder eine C_1-22-Alkanoyl-Gruppe darstellt, oder Salze derselben.
Unter weiteren Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung werden Agenzien zur Messung von Singulett-Sauerstoff zur Verfügung gestellt, welche eine Verbindung dargestellt durch die oben erwähnte Formel (I) oder ein Salz derselben umfassen; und es werden Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff bereit gestellt, welche die Schritte: (A) Reaktion einer Verbindung der zuvor genannten Formel (I) oder eines ihrer Salze mit Singulett-Sauerstoff, und (B) Messung der Fluoreszenz einer im oben genann ten Schritt (A) hergestellten Verbindung der zuvor genannten Formel (II) oder eines ihrer Salze umfasst.
Zusätzlich zu den oben genannten werden ebenfalls Verbindungen bereit gestellt, welche durch die folgende allgemeine Formel (III) dargestellt werden:
worin R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R²⁸ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe darstellen, R²⁹ und R³⁰ unabhängig voneinander für eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe stehen, die substituiert sein kann, R³¹ und R³² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe repräsentieren, und R³³ und R³⁴ unabhängig voneinander eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe darstellen, sowie Verbindungen dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (IV):
worin R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸, R³⁹ und R⁴⁰ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe darstellen, R⁴¹ und R⁴² unabhängig voneinander für eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe stehen, welche substituiert sein kann, R⁴³ und R⁴⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe repräsentieren, und R⁴⁵ und R⁴⁶ unabhängig voneinander eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe darstellen. Die durch die Formel (III) repräsentierten Verbindungen sind ebenfalls nützlich als Agenzien zur Messung von Singulett-Sauerstoff.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt Fluoreszenz-Spektren einer Verbindung der Formel (I) (Verbindung 13) und einer korrespondierenden Verbindung der Formel (II). In der Figur ist das Fluoreszenz-Spektrum der Verbindung 13 in (a) gezeigt, und das Fluoreszenz-Spektrum der korrespondierenden Verbindung der Formel (II) ist in (b) gezeigt.
2 zeigt die Ergebnisse einer zeitabhängigen Messung der Änderung der Fluoreszenz wenn Singulett-Sauerstoff in Gegenwart der Verbindung 13 erzeugt wurde. In der Figur werden die in Gegenwart von Singulett-Sauerstoff erhaltenen Ergebnisse in (a) ge zeigt, während die in Abwesenheit von Singulett-Sauerstoff (keine Zugabe von Na₂MoO₄) erhaltenen Ergebnisse in (b) gezeigt werden.
3 zeigt die Ergebnisse einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Analyse eines Reaktionsgemisches in welchem Singulett-Sauerstcff in der Gegenwart der Verbindung 16 erzeugt wurde (30 Minuten nach dem Start der Reaktion). In der Figur sind die in Gegenwart von Singulett-Sauerstoff erhaltenen Ergebnisse in (a) gezeigt. und die in Abwesenheit von Singulett-Sauerstoff (keine Zugabe von H₂O₂) erhaltenen Ergebnisse in (b). Peak 1 zeigt Verbindung 16 an, Peak 2 zeigt die korrespondierende Verbindung der Formel (II) und Peak 3 markiert das Frontende des Lösungsmittels.
4 zeigt Ergebnisse einer zeitabhängigen Messung der Änderung der Fluoreszenz, wenn Singulett-Sauerstoff unter einer physiologischen Bedingung in der Gegenwart von Verbindung 13 generiert wurde. Die in Gegenwart von 1 mM EP-1 erhaltenen Ergebnisse sind in der Abbildung unter (a), die in Gegenwart von 2,5 mM EP-1 erhaltenen Ergebnisse sind unter (b) und die in Gegenwart von 5 mM EP-1 erhaltenen Ergebnisse sind unter (c) dargestellt.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Die in dieser Beschreibung verwendeten Ausdrücke haben die folgende Bedeutung. Eine Alkyl-Gruppe oder ein alkylischer Teil einer Alkoxy-Gruppe kann linear, verzweigt oder zyklisch sein. Zum Beispiel bezeichnet der Ausdruck, C_1- ₆ Alkyl-Gruppe' eine lineare, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen. Genauer gesagt können eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, sek-Butyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe, n-Pentyl-Gruppe, n-Hexyl-Gruppe, Cyclohexyl-Gruppe und ähnliches verwendet werden. Als Alkyl-Gruppe und Alkoxy-Gruppe sind solche mit linearer oder verzweigter Kette bevorzugt. Als Halogenatom können sowohl Fluor-Atom, Chlor-Atom, Brom-Atom als auch Iod-Atom verwendet werden. Die Alkanoyl-Gruppe kann sowohl linear als auch verzweigt sein. Als Alkanoyl-Gruppe können beispielsweise die Formyl-Gruppe, die Acetyl-Gruppe, die Propanoyl-Gruppe und ähnliche verwendet werden.
Als Aryl-Gruppe können z. B. eine monozyklische, bizyklische oder trizyklische Aryl-Gruppe mit ungefähr 6 bis 14 ringbildenden Atomen verwendet werden. Vorzugsweise können eine Phenyl-Gruppe oder Naphthyl-Gruppe benutzt werden, wobei die Phenyl-Gruppe bevorzugter benutzt werden kann. Die Aryl-Gruppe kann einen oder mehrere Substituenten am Ring tragen. Trägt die Aryl-Gruppe zwei oder mehrere Substituenten, so können diese gleich oder voneinander verschieden sein. Der Typ und die Substitutionsposition des Substituenten sind nicht besonders eingeschränkt. Als Substituent(en) können eine C_1-6-Alkyl-Gruppe, eine C_1-6-Halogen-Alkyl-Gruppe, eine C_1-6-Alkenyl-Gruppe, eine C_1-6-Alkoxyl-Gruppe, ein Halogenatom, eine Cyano-Gruppe, eine Nitro-Gruppe, eine Amino-Gruppe, welche substituiert sein kann, eine Carboxyl-Gruppe, eine Alkoxycarbonyl-Gruppe, eine C_1-6-Alkanoyl-Gruppe, eine C_1-6-Halogen-Alkanoyl-Gruppe, eine Aroyl-Gruppe, eine Hydroxyl-Gruppe, eine Alkylendioxi-Gruppe und ähnliche verwendet werden. Von diesen sind eine C_1- ₆-Alkyl-Gruppe, eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe, ein Halogenatom und ähnliche bevorzugt.
In Formel (I) ist es bevorzugt, dass jeder der Reste R¹, R³, R⁴ und R⁶ Wasserstoffatome sind. Des weiteren ist es bevorzugt, dass R² und R⁵ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen, und es ist besonders bevorzugt, dass beide entweder Wasserstoffatome oder Halogenatome sind. Sofern R² und / oder R⁵ ein Halogenatom darstellen, so ist ein Chloratom als Halogenatom bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander für eine Phenyl-Gruppe stehen, welche substituiert sein kann, und es ist besonders bevorzugt, dass beide Phenyl-Gruppen darstellen. R¹¹ ist vorzugsweise ein Wasserstoff atom.
In Formel (II) ist es bevorzugt, dass jeder der Reste R¹², R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁷ Wasserstoffatome sind. Des weiteren ist es bevorzugt, dass R¹³ und R¹⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen, und es ist besonders bevorzugt, dass beide entweder Wasserstoffatome oder Halogenatome sind. Sofern R¹³ und / oder R¹⁶ ein Halogenatom darstellen, so ist ein Chloratom als Halogenatom bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander eine Phenyl-Gruppe darstellen, welche substituiert sein kann, und es ist besonders bevorzugt, dass beide Phenyl-Gruppen repräsentieren. R²² ist vorzugsweise ein Wasserstoffatom.
In der Formel (III) ist es bevorzugt, dass jeder der Reste R²³, R²⁵, R²⁶ und R²⁸ Wasserstoffatome sind. Es ist weiterhin bevorzugt, dass R²⁴ und R²⁷ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen und es ist besonders bevorzugt, dass beide entweder Wasserstoffatome oder Halogenatome sind. Sofern R²⁴ und / oder R²⁷ ein Halogenatom darstellen, so ist ein Chloratom als Halogenatom bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass R²⁹ und R³⁰ unabhängig voneinander eine Phenylgruppe darstellen, welche substituiert sein kann, und es ist besonders bevorzugt dass beide Phenylgruppen sind. Es ist bevorzugt, dass sowohl R³³ als auch R³⁴ Acetyl-Gruppen sind.
In der Formel (IV) ist es bevorzugt, dass jeder der Reste R³⁵, R³⁷, R³⁸ und R⁴⁰ Wasserstoffatome sind. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass R³⁶ und R³⁹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen, und es ist besonders bevorzugt, dass beide entweder ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen. Sofern R³⁶ und / oder R³⁹ ein Halogenatom darstellen, so ist ein Chloratom als Halogenatom bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass R⁴¹ und R⁴² unabhängig voneinander eine Phenylgruppe darstellen, welche substituiert sein kann, und es ist besonders bevorzugt, dass beide Phenylgruppen sind. Es ist bevor zugt, dass sowohl R⁴⁵ als auch R⁴⁶ Acetyl-Gruppen sind.
Die Verbindungen der Formel (I) und der Formel (II) können als Salze einer Basen-Addition vorliegen. Beispiele für die Salze einer Basen-Addition schließen zum Beispiel Metallsalze wie Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze sowie Magnesiumsalze, Ammoniumsalze, organische Aminsalze wie Triethylaminsalze, Piperidinsalze sowie Morpholinsalze, und ähnliche ein. Jedoch sind die Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt. Unter ihnen, können physiologisch akzeptable, wasserlösliche Salze einer Basen-Addition geeignet als das Agens der vorliegenden Erfindung genutzt werden und im Verfahren zur Messung der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Des weiteren können die Verbindungen der Formel (I) und der Formel (II), sowohl in freien Formen als auch als Salze dieser, als Hydrate oder Solvat-Komplexe existieren, wobei eine jede dieser Substanzen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fällt. Die Arten der Lösungsmittel, welche die Solvat-Komplexe bilden, sind nicht besonders eingeschränkt. Als Beispiele können Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton und Isopropanol angeführt werden.
Die Verbindungen der Formel (I) und der Formel (II) können abhängig von der Art des / der Substituenten ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome besitzen, und es können optische Isomere oder Diastereoisomere existieren. Des weiteren können, abhängig von der Natur von R¹ und / oder R⁶, oder R¹² und / oder R¹⁷, optische Isomere als Folge einer Behinderung der Rotation vorliegen. Diese Isomere in reiner Form, jedwede Mischungen dieser Isomere, Racemate und ähnliche fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus können die Verbindungen der Formel (I) und der Formel (II) der vorliegenden Erfindung einen Lacton-Ring bilden und als Verbindungen vorliegen, die eine Struktur aufweisen, welche mit der Grund legenden Struktur der Verbindungen der Formel (III) oder der Formel (IV) korrespondiert, oder sie können ebenfalls als andere Tautomere existieren. Es sollte beachtet werden, dass die Verbindungen, welche den Lacton-Ring gebildet haben, sowie andere Isomere in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen. Infolge der zuvor erwähnten Lacton-Bildung fallen ebenfalls optisch aktive Substanzen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise können diese nach dem im folgenden Schema gezeigten Verfahren hergestellt werden.
(Die in dem Schema verwendeten Symbole haben dieselbe Bedeutung wie die zuvor definierten Symbole. R und R' stellen unabhängig voneinander eine Schutzgruppe der Carboxyl-Gruppe, und R^a, R^b und R^c stellen unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1- ₆-Alkoxy-Gruppe dar. )
Verbindung (d) kann hergestellt werden, indem Wasser zu Verbindung (c) hinzugegeben wird, wobei letztere durch die Reaktion von Maleinsäureanhydrid (b) mit Furan (a) erhalten wird. Nachdem die Carboxyl-Gruppe von Verbindung (d) mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist, kann die daraus resultierende Verbindung mit Verbindung (f) zur Reaktion gebracht werden, um Verbindung (g) herzustellen.
Die Schutzgruppe der Carboxyl-Gruppe der Verbindung (d) ist nicht besonders beschränkt, so lange die Gruppe inaktiv ist in Reaktionen, welche auf andere funktionelle Gruppen zielen, und so lange sie wenn erforderlich durch geeignete Maßnahmen entfernt werden kann. Beispielsweise können niedere Alkylester (Methylester etc.) verwendet werden. Wenn der Methylester der Verbindung (d) hergestellt wird, kann beispielsweise Verbindung (d) mit Methyliodid in der Gegenwart eines Lösungsmittels wie z. B. Aceton, oder auch ohne Lösungsmittel zur Reaktion gebracht werden. Es ist bevorzugt, die Reaktion unter Zugabe einer Base, wie beispielsweise Cäsiumcarbonat, durchzuführen.
In Übereinstimmung mit dem in Tetrahedron, 38, S. 1425–1430 (1982) beschriebenen Verfahren kann Verbindung (f) mit der Verbindung (e) umgesetzt werden, um Verbindung (g) herzustellen, welche dann mit einer Säure behandelt werden kann, um Verbindung (h) herzustellen. Die Reaktion kann unter Erwärmen in der Gegenwart eines Lösungsmittels wie z. B. Chloroform durchgeführt werden. Verbindung (f) kann leicht hergestellt werden, beispielsweise entsprechend dem in Tetrahedron, 38, S.1425–1430 (1982) beschriebenen Verfahren.
Die Reaktion zur Umwandlung von Verbindung (g) in Verbindung (h) kann im Allgemeinen in einem inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid durchgeführt werden. Die Reaktion kann durchgeführt werden, indem eine Säure, wie Schwefelsäure, zu einer Lösung von Verbindung (g) hinzu gegeben und die Mischung stark gerührt wird. Abgesehen von dem zuvor erwähnten Verfahren, kann Verbindung (h) auch entsprechend dem in Tetrahedron 39, S.623–627 (1983) oder Can. J. Chem., 53, S.256–262 (1975) beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Darauf folgend kann die Schutzgruppe der Carboxyl-Gruppe von der resultierenden Verbindung (h) entfernt werden, um Verbindung (i) herzustellen, aus welcher dann das Säureanhydrid (j) hergestellt werden kann.
Das Entschützen der Carboxyl-Gruppe kann durch eine Reaktion, geeignet ausgewählt in Abhängigkeit von der Natur der Schutzgruppe, herbeigeführt werden. Zum Beispiel kann die Abspaltung eines niederen Alkylesters wie Methylester durch Behandlung von Verbindung (h) mit einem Alkali wie methanolischem Kaliumhydroxid in der Gegenwart eines inerten Lösungsmittels wie Dioxan erreicht werden. Diese Reaktion kann im Allgemeinen bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen durchgeführt werden, bevorzugt mittels Erhitzen des Lösungsmittels unter Rückfluss.
Die Dehydratisierung von Verbindung (i) kann durch Zugabe eines Dehydratisierungsmittels zu Verbindung (i) in der Gegenwart eines inaktiven Lösungsmittels im Allgemeinen in einem Bereich von hoher Temperatur bis zur Rückfluss-Temperatur des Lösungsmittels erfolgen. Die Art des Dehydratisierungsmittels ist nicht besonders beschränkt und der Fachmann kann das Agens geeignet auswählen. Beispielsweise kann Essigsäureanhydrid verwendet werden, welches gleichsam als Lösungsmittel dient.
Verbindung (j) und Verbindung (k) können miteinander zur Reaktion gebracht werden, um eine durch die Formel (I-a) dargestellte Ver bindung der vorliegenden Erfindung herzustellen. Die Reaktion kann durchgeführt werden, indem die Reaktanden in der Gegenwart einer Lewis-Säure wie Zinkchlorid und Bortrifluorid ohne Lösungsmittel geschmolzen werden, oder durch Reaktion von Verbindung (i) mit Verbindung (k) in Methansulfonsäure ohne die Verwendung von Zinkchlorid. Wenn R¹⁰ und / oder R¹¹ eine C_1-6-Alkoxyl-Gruppe darstellen, ist es bevorzugt, Verbindung (i) mit Verbindung (k) in Methansulfonsäure ohne die Verwendung von Zinkchlorid zur Reaktion zu bringen. Verbindung (k), ein Resorcinol-Derivat, stellt per se eine bekannte Verbindung dar, und die Verbindung kann einfach hergestellt werden. Des weiteren kann eine Verbindung der Formel (I), deren R¹¹ eine Alkanoyl-Gruppe ist, hergestellt werden durch die Reaktion eines Äquivalents eines acylierenden Agens mit Verbindung (I-a), und eine Verbindung der Formel (III-a) kann hergestellt werden durch die Reaktion zweier oder mehr Äquivalente eines Acylierungs-Agens mit der Verbindung (I-a). Wo eine Acetylierung durchgeführt wird, kann ein herkömmliches Acetylierungsmittel wie z. B. Essigsäureanhydrid und Pyridin verwendet werden, und die Reaktion kann bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen durchgeführt werden.
Die durch die Formel (II) dargestellte Verbindung kann hergestellt werden durch Reaktion von Wasserstoffperoxid, hergestellt in einer Lösung, welche ein Salz wie Natriummolybdat (Na₂MoO₄) enthält, mit einer Verbindung der Formel (I), welche wie oben beschrieben synthetisiert werden kann.
Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird genauer und detaillierter in den Beispielen der Beschreibung beschrieben werden. Aus diesem Grund kann der Fachmann jedwede der Verbindungen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Erklärungen der in den obigen Schemata genannten Herstellungsverfahren und auf die speziellen Erklärungen in den Beispielen herstellen, sowie durch geeignete Auswahl der Startmaterialien und Reagenzien, sowie durch geeignetes Ändern oder Modifizieren der Reaktionsbedingungen, Reaktionsschritte und ähnlichem, wie erforderlich.
Eine Zielverbindung kann manchmal effizient hergestellt werden, indem die Reaktion durchgeführt wird nach dem Schutz einer bestimmten funktionellen Gruppe wie in den zuvor erwähnten Reaktionsschritten erforderlich. Detaillierte Erklärungen zu Schutzgruppen werden beispielswweise in Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene, John Wiley & Sons Inc. 1981 und ähnlichem gegeben, und der Fachmann kann geeignete Schutzgruppen auswählen.
In den oben genannten Synthesen kann die Isolierung und Reinigung der Produkte durch eine geeignete Kombination von Techniken, welche für herkömmliche organische Synthesen verwendet werden, erzielt werden, wie z. B. durch Filtration, Extraktion, Waschen, Dehydratisierung, Aufkonzentrierung, Kristallisierung, verschiedene chromatographische Techniken und ähnliche. Die synthetischen Intermediate in den zuvor beschriebenen Schritten können für Folgereaktionen ohne besondere Aufreinigung genutzt werden. Wo die Herstellung eines Salzes der Verbindungen der vorliegenden Erfindung erwünscht ist, so kann, wenn ein Salz jeder Verbindung in der oben genannten Herstellung erhalten wird, das resultierende Salz für sich genommen gereinigt werden. Wenn eine Verbindung in einer freien Form erhalten wird, so kann die Verbindung in einer freien Form in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder suspendiert werden und dann mit einer Base versetzt werden, um ein Salz zu bilden, welches wenn erforderlich gereinigt werden kann.
Die durch die zuvor genannte Formel (I) dargestellten Verbindungen und deren Salze besitzen eine Eigenschaft, dass sie mit Singulett-Sauerstoff unter einer milden Bedingung, beispielsweise unter einer physiologischen Bedingung, zu einer entsprechenden Verbindung der zuvor genannten Formel (II) oder einem ihrer Salze reagieren. Die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze sind im wesentlichen nicht fluoreszierend, wohingegen die Verbindungen mit der Formel (II) und deren Salze eine Eigenschaft besitzen, Fluoreszenz hoher Intensität zu emittieren. Aus diesem Grund kann Singulett-Sauerstoff gemessen werden, indem eine Verbindung der zuvor genannten Formel (I) oder eines ihrer Salze einer Reaktion mit Singulett-Sauerstoff unterworfen, und dann die Fluoreszenz einer produzierten Verbindung der zuvor genannten Formel (II) gemessen wird. Die Verbindungen der Formel (I) oder deren Salze besitzen eine Eigenschaft, dass sie im wesentlichen nicht mit Sauerstoff-Radikalen und ähnlichen, jedoch spezifisch mit Singulett-Sauerstoff reagieren. Weiterhin weisen die Verbindungen der Formel (II) und deren Salze eine extrem überdurchschnittliche Fluoreszenz-Intensität auf. Aus diesem Grund kann in individuellen Zellen oder bestimmten Geweben lokalisierter Singulett-Sauerstoff genau gemessen werden durch die Verwendung der Verbindung der Formel (I) oder eines ihrer Salze als Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck, Messung' muss in seinem weitesten Sinne ausgelegt werden, einschließlich Messungen, durchgeführt sowohl zum Zweck der Quantifizierung, Qualifizierung, Diagnose oder ähnlichen, als auch für Tests oder Nachweise oder ähnliche. Das Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff in der vorliegenden Erfindung umfasst im allgemeinen die Schritte (A) der Reaktion einer Verbindung der zuvor genannten Formel (I) oder deren Salz mit Singulett-Sauerstoff, und (B) die Messung der Fluoreszenz einer Verbindung der zuvor genannten Formel (II) oder deren Salz, hergestellt im oben genannten Schritt (A). Die Fluoreszenz der Verbindung der zuvor genannten Formel (II) oder eines ihrer Salze kann mittels herkömmlicher Verfahren gemessen werden. Ein Verfahren zur Messung des Fluoreszenz-Spektrums in vitro sowie ein Verfahren zur Messung des Fluoreszenz-Spektrums in vivo unter Verwendung einer Bioimaging-Technik und ähnliche können angewendet werden. Wenn beispielsweise eine Quantifizierung erwünscht ist, so ist es be vorzugt, zuvor entsprechend einer konventionellen Methode eine Eichkurve zu erstellen. Als System zur quantitativen Erzeugung von Singulett-Sauerstoff kann beispielsweise das Naphthalin-Endoperoxid-System (Saito, I., et. al, J. Am. Chem. Soc., 107, S. 6329–6334, 1985) und ähnliche verwendet werden.
Eine Verbindung der Formel (I), worin R¹¹ eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe oder deren Salz ist, oder eine Verbindung der Formel (III) ergibt, nachdem sie eine Zellmembran passiert hat und in eine Zelle aufgenommen wurde, ein Produkt, in welchem die Alkanoyl-Gruppe durch ein Enzym wie eine intrazellulare Esterase hydrolysiert worden ist [eine Verbindung der Formel (I), worin R¹¹ ein Wasserstoffatom ist, oder deren Salz]. Das Produkt der Hydrolyse reagiert ohne leicht aus der Zelle ausgeschieden zu werden mit Singulett-Sauerstoff in der Zelle, um eine Verbindung mit der Formel (II) zu ergeben, worin R²² ein Wasserstoffatom darstellt. Daher kann, wenn diese Verbindungen als Agenzien zur Messung verwendet werden, in individuellen Zellen lokalisierter Singulett-Sauerstoff mittels einer Bioimaging-Technik mit hoher Sensitivität gemessen werden.
Als Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff der vorliegenden Erfindung kann per se eine Verbindung der Formel (I) oder deren Salz oder eine Verbindung der zuvor genannten Formel (III) verwendet werden. Wenn gewünscht können sie ebenfalls als eine Zusammensetzung, welche mit üblicherweise für die Herstellung von Agenzien benutzten Additiven formuliert wird, verwendet werden. Beispielsweise können als Additive zum Gebrauch des Agens unter einer physiologischen Bedingung solche Additive wie Lösungshilfsmittel, pH-Modifikatoren, Puffer, isotonische Agenzien und ähnliche verwendet werden, wobei die Mengen dieser Additive von dem Fachmann geeignet ausgewählt werden können. Die Zusammensetzungen können als Zubereitungen in geeigneten Formen zur Verfügung gestellt werden, z. B. als Pulvermischungen, gefriergetrocknete Produkte, Granulate, Tabletten, Lösungen und ähnliche.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer erklärt. Jedoch ist der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt. Die Verbindungsnummern in den folgenden Schemata entsprechen den in den Beispielen verwendeten.
Beispiel 1: Herstellung der Verbindungen
Zu Pulver zerkleinertes Maleinsäureanhydrid (2) wurde in Tetrahydrofuran (THF) gelöst, mit 1,05 Äquivalenten von frisch destilliertem Furan (1) versetzt und zehn Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die ausgefallenen Kristalle wurden mittels Filtration gesammelt, um Verbindung (3) zu erhalten (farblose Kristalle, Ausbeute: 46%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 3.18 (s, 2H), 5.46 (m, 2H), 6.58 (m, 2H)
MS (EI⁺) : 121 (M⁺ – COOH)
Schmp.: 120–122°C
Verbindung (3) wurde in Wasser suspendiert und bei Raumtemperatur zwei Stunden gerührt. Die Suspension wandelte sich nach und nach in eine durchsichtige Lösung um. Das Wasser wurde mittels Gefriertrocknung entfernt, um Verbindung (4) zu erhalten (farbloses Pulver, Ausbeute: 100%).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 2.61 (s, 2H), 5.03 (m, 2H) 6.43 (m, 2H)
Schmp.: 134°C
Eine Lösung von Verbindung (4) in Aceton wurde mit 6 Äquivalenten Methyliodid und 1,1 Äquivalenten Cäsiumcarbonat versetzt und sieben Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck filtriert und die unlöslichen Feststoffe ausreichend mit Methylenchlorid gewaschen. Die resultierende organische Phase wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert und mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft, um das Rohprodukt zu erhalten. Das Rohprodukt wurde aus Methanol umkristallisiert, um Verbindung (5) zu erhalten (farblose Plättchen, Ausbeute 56%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 2.83 (s, 2H), 3.71 (s, 6H), 5.27 (m, 2H), 6.46 (m, 2H)
MS (FAB⁺) : 213 (M⁺ + 1)
Schmp.: 121°C
Elementaranalyse für C₁₀H₁₂O₅
ber.: C, 56.60; H, 5.70%
gef.: C, 56,32%, H, 5.66%
Eine Lösung von einem Äquivalent der Verbindung (6) und 1,05 Äquivalenten der Verbindung (5) in Chloroform wurde unter Argonatmosphäre zwei Tage unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abdampfen des Chloroforms unter reduziertem Druck , wurde der Rückstand mit Isopropylether versetzt und die Niederschläge mittels Filtration gesammelt. Die Niederschläge wurde mit Pentan gewaschen, um Verbindung (7) zu erhalten (farbloses Pulver, Ausbeute: 100%). ¹H-NMR-Messung (300 MHz, CDCl₃) ergab, dass das Produkt eine Mischung zweier Isomere darstellte (Mischungsverhältnis der Isomeren: 75/25).

1. Isomer: δ 2.59 (s, 2H), 2.90 (s, 2H), 3.55 (s, 6H), 4.60 (s, 2H), 7.14 (s, 4H), 7.4–7.7 (m, 10H)
2. isomer: δ 3.01 und 3.04 (2s, 2H), 3.64 (s, 6H), 4.65 (s, 2H), 7.14 (s, 4H), 7.4–7.7 (m, 10H) MS (EI⁺) : 482 (M+ schwach) , 451 (M⁺ – CH₃O) Schmp.: 239 °C (Zers.)

Eine Lösung der Verbindung (7) in Methylenchlorid wurde mit konzentrierter Schwefelsäure versetzt und unter starkem Rühren 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Nach Behandlung mit Methanol wurde die organische Phase mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Mag nesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um ein Rohprodukt zu erhalten. Das Produkt wurde mittels Silikagel-Chromatographie gereinigt und nachfolgend aus Methanol umkristallisiert, um Verbindung (8) zu erhalten (gelbe Nadeln, Ausbeute: 43%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 3.85 (s, 6H), 7.40–7,74 (m, 14H), 8.13 (s, 2H)
MS (EI⁺) : 446 (M⁺) , 415 (M⁺ – CH₃O)
Schmp.: 200 – 201 °C
Elementaranalyse für C₃₀H₂₂O₄
ber.: C, 80.70%; H, 4.97%
gef .: C, 80.44%; H, 4.74%
Eine Lösung der Verbindung (8) in Dioxan wurde mit 1 M methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung versetzt und mittels Erhitzen für 30 Minuten refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und die Niederschläge mittels Filtration gesammelt und mit wasserfreiem Methanol gewaschen, um Verbindung (9) zu erhalten (hellgelbes Pulver, Ausbeute: 91%).
¹H-NMR (300 MHz, D₂O): δ 7.29–7.63 (m, 14H), 7.69 (s, 2H)
MS (FAB⁺) : 495 (M⁺ +1)
Schmp.: 300°C oder höher
Eine Lösung, in welcher Verbindung (9) in Wasser suspendiert wurde, wurde durch Zugabe von 2 N Salzsäure angesäuert, und das Produkt wurde mit Ether extrahiert. Die Etherphase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, um Verbindung (10) zu erhalten (gelbes Pulver, Ausbeute: 100%)
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 7.49–7.72 (m, 14H), 7.95 (s, 2H)
MS (EI⁺): 418 (M⁺; schwach) , 400 (M⁺ – H₂O)
Verbindung (10) wurde mit einem großen Überschuss an Essigsäureanhydrid versetzt und mittels Erhitzen für 10 Minuten refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und die abgeschiedenen Kristalle wurden mittels Filtration entnommen, um Verbindung (11) zu erhalten (gelbe Kristalle, Ausbeute: 96%)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.45–7.80 (m, 14H), 8.46 (s, 2H)
MS (EI⁺): 400 (M⁺)
Schmp.: 300°C oder höher
Elementaranalyse für C₂₈H₁₆O₃
ber.: C, 83.99%; H, 4.02%
gef.: C, 84,.27%; H, 3.99%
Ein Äquivalent der Verbindung (11), zwei Äquivalente Resorcinol (12) und ein Äquivalent Zinkchlorid wurden ausreichend vermischt. Diese Mischung wurde als Feststoff unter Argonatmosphäre eine Stunde bei 180°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsprodukt pulverisiert, mit 2 N Salzsäure versetzt und durch Erhitzen für 10 Minuten refluxiert. Die Niederschläge wurden mittels Filtration gesammelt, um das Rohprodukt zu erhalten. Das Produkt wurde mittels Silikagel-Chromatographie gereinigt, um Verbindung (13) zu erhalten (oranges Pulver, Ausbeute 48%).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 6.46 (dd, 2H, Ja = 8.8, Jb = 2.1), 6.57 (m, 2H), 6.66 (d, 2H J = 8.8), 7.28 (s, 1H), 7.34–7.77 (m, 14H) 8.24 (s, 1H)
MS (EI⁺): 584 (M⁺) , 540 (M⁺ – CO₂)
Schmp.: 270°C
Verbindung (13) wurde mit Essigsäureanhydrid und Pyridin versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C in 2%ige Salzsäure gegeben und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2%iger Natriumhydro xid-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wurde unter reduziertem Druck abgedampft, um ein Rohprodukt zu erhalten, und das Produkt wurde aus Benzol umkristallisiert, um Verbindung (14) zu erhalten (gelbe Kristalle, Ausbeute: 67%).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 2.26 (s, 6H), 6.91 (dd, 2H, Ja = 8.7, Jb = 2.2), 6.98 (d, 2H, J = 8.7), 7.24 (d, 2H, J = 2.2) 7.30–7.80 (m, 15H), 8.30 (d, 1H, J = 0.72)
MS (EI⁺): 668 (M⁺), 624 (M⁺ – CO₂)
Elementaranalyse für C₄₄H₂₈O₇
ber.: C, 79.03%; H, 4.22
gef.: C, 79.27%; H, 4.19%
Schmp.: 235°C
Eine Lösung eines Äquivalents der Verbindung (11) in Methansulfonsäure wurde mit zwei Äquivalenten Chlororesorcinol (15) versetzt und unter Argonatmosphäre zwei Tage bei 80°C erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegeben und die Niederschläge mittels Filtration gesammelt. Die Niederschläge wurden getrocknet und mittels Silikagel-Chromatographie gereinigt, um Verbindung (16) zu erhalten (oranges Pulver, Ausbeute: 59%)
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 6.80 (s, 2H), 6.84 (s, 2H), 7.31–7.78 (m, 15H), 8.28 (s, 1H), 11.14 (s, 2H)
MS (FAB+): 653 : 655 : 657 = 9 : 6 : 1 (M⁺ +1)
Schmp.: 243°C (Zers.)
Eine Lösung eines Äquivalents der Verbindung (11) in Methansulfonsäure wurde mit zwei Äquivalenten Chlororesorcinol (15) versetzt und unter Argonatmosphäre zwei Tage bei 80°C erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegeben und die Niederschläge mittels Filtration gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Essigsäureanhydrid und Pyridin versetzt und 5 Minuten bei 80°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0 °C in 2%ige Salzsäure gegeben und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2%iger Natriumhydroxid-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Um ein Rohprodukt zu erhalten wurde das Methylenchlorid unter reduziertem Druck abgedampft. Das Produkt wurde mittels Silikagel-Chromatographie und Umkristallisieren aus Benzol gereinigt, um Verbindung (17) zu erhalten (gelbe Kristalle, Ausbeute: 16%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.36 (s, 6H), 6.88 (s, 2H), 7.12 (s, 2H), 7.35–7.79 (m, 15H), 8.61 (s, 1H)
MS (FAB⁺): 737 : 739 : 741 = 9 : 6 : 1 (M⁺ +1)
Schmp.: 246°C (Zers.)
Elementaranalyse für C₄₄H₂₆Cl₂O₇
ber.: C, 71.65%; H, 3.55%
gef.: C, 71.69%; H, 3.48%
Eine Lösung der Verbindung (16) in Dimethylsufoxid (DMSO) wurde mit einer wässrigen Lösung, enthaltend Natriumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Natriummolybdat (Na₂MoO₄), gemischt. Diese Mischung wurde fünfmal mit einer 30%igen wässrigen Wasserstoffperoxidlösung versetzt, während die Mischung ausreichend gekühlt wurde, um ein unerwünschtes Ansteigen der Reaktionstemperatur zu verhindern. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Phosphorsäure angesäuert und dann mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und danach wurde der Ether unter vermindertem Druck abgedampft. Der daraus resultierende Feststoff wurde mit Essigsäureanhydrid und Pyridin versetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch bei 0 °C in 2%ige Salzsäure gegeben und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2%iger Natriumhydroxid-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, um ein Rohprodukt zu erhalten . Das Produkt wird mittels Silikagel-Chromatographie gereinigt, um Verbindung (18) zu erhalten (hellgelbes Pulver, Ausbeute: 36%)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 2.34 (s, 3H), 2.38 (s, 3H), 6.74, 6.80, 7.08, 7.13 (4s, 4H), 7.04–7.78 (m, 15H), 7.84 (s, 1H)
MS (FAB+): 769 : 771 : 773 = 9 : 6 : 1 (M⁺ +1); 737 : 739 : 741 = 9 : 6 : 1 (M⁺ +1 – O₂)
Schmp.: 189 °C (Zers.)
Beispiel 2: Messung von Singulett-Sauerstoff
Die in Beispiel 1 erhaltene Verbindung (13) wurde in 100 mM Phosphat-Puffer (pH 10,5), enthaltend 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gelöst. Die Lösung wurde dann mit Na₂MoO₄ (1 mM) und DMSO (0,1%) versetzt, und das Fluoreszenz-Spektrum wurde bei 25°C gemessen (1(a)). Die Mischung wurde mit einem Intervall von einer Stunde fünfmal mit wässrigem Wasserstoffperoxid (20 mM) versetzt, und die Fluoreszenz wurde gemessen (6 Stunden nach Reaktionsbeginn) (1(b)). Der Fluoreszenz-Messung lagen die folgenden Bedingungen zu Grunde: Anregungs-Wellenlänge: 495.0 nm; Emissions-Wellenlänge: 515.0 nm; Spalt (Ex/Em): 2.5 nm / 2.5 nm.
Beispiel 3: Messung von Singulett-Sauerstoff
Unter Verwendung eines Systems zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff [0.1 mM EDTA; 100 mM Phosphat-Puffer (pH 10.5); Na₂MoO₄ (1 mM); DMSO (0.1%); wässriges Wasserstoffperoxid (20 mM × 1); 25°C] wurde die Änderung der Fluoreszenz in der Gegenwart von Verbindung (13) in einem Zeitverlauf gemessen (2(a)). Zur Kontrolle wurde die Messung ohne Zugabe von Na₂MoO₄ durchge führt (in Abwesenheit von Singulett-Sauerstoff) (2(b)). Als Ergebnis wurde die Zunahme der Fluoreszenz entsprechend der erzeugten Menge an Singulett-Sauerstoff beobachtet.
Die Messung wurde ebenfalls in einem dem obigen im Wesentlichen gleichen System (31 mM NaOH; 16 mM NaHCO₃; 1 mM Na₂CO₃; 138 mM Na₂MoO₄) unter Verwendung der Verbindung (16) durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie vor dem Reaktionsbeginn und nach zweimaliger Zugabe von Wasserstoffperoxid in einem Intervall von 15 Minuten ( 30 Minuten nach dem Start der Reaktion) analysiert wurde. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Messbedingungen der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie waren die folgenden:
Säule: Inertsil ODS
Elutionsmittel: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.4)/Acetonitril = 6/4
Temperatur der Säule: Raumtemperatur
Detektion: 505 nm
Beispiel 4: Messung von Singulett-Sauerstoff
Singulett-Sauerstoff wurde unter Verwendung einer Naphthalin-Endoperoxid-Verbindung EP-1 (Saito, I., et. al., J. Am. Chem. Soc, 107, S. 6329–6334, 1985) als System zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff kontinuierlich über die Zeit unter einer neutralen Bedingung bei 37 °C in festgesetzten Mengen erzeugt, und die Fluoreszenz wurde in der Gegenwart der Verbindung (13) gemessen [Reaktionsgemisch: 0.1 mM EDTA; 100 mM Phosphat-Puffer (pH 7.4); DMSO (0.1%)]. Als Ergebnis wurde eine Zunahme der Intensität der Fluoreszenz entsprechend der erzeugten Menge an Singulett-Sauerstoff beobachtet, in dem Maße wie die Konzentration von EP-1 von 1 mM über 2.5 mM auf 5 mM erhöht wurde (4).
Industrielle Anwendbarkeit
Die im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Verbindungen, dargestellt durch die allgemeine Formel (I) oder die allgemeine Formel (III) und deren Salze entsprechend der vorliegenden Erfindung reagieren effizient mit Singulett-Sauerstoff zu einer fluoreszierenden Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (II), oder deren Salz. Durch Verwendung der Verbindung, welche durch die allgemeine Formel (I) oder die allgemeine Formel (III) dargestellt wird, oder deren Salz als Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff, und durch die Messung der Fluoreszenz einer Verbindung, welche durch die allgemeine Formel (II) oder die allgemeine Formel (IV) dargestellt wird, hergestellt durch die Reaktion mit Singulett-Sauerstoff, welcher in lebenden Zellen oder Geweben lokalisiert ist, kann daher Singulett-Sauerstoff mit extrem hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit gemessen werden, beispielsweise mittels einer Bioimaging-Technik.

Claims

Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I):
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, R⁹ und R¹⁰ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, und R¹¹ ein Wasserstoffatom oder eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe bedeutet, oder ein Salz derselben.
Verbindung oder deren Salz nach Anspruch 1, worin R¹, R³, R⁴ und R⁸ ein Wasserstoffatom bedeuten, R² und R⁵ unabhängig voneinander ein Halogenatom bedeuten, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander eine Phenyl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, und R¹¹ ein Wasserstoffatom bedeutet.
Verbindung oder deren Salz nach Anspruch 1, worin R¹, R³, R⁴ und R⁶ ein Wasserstoffatom bedeuten, R² und R⁵ ein Chloratom bedeuten, R⁷ und R⁸ eine Phenyl-Gruppe bedeuten, und R¹¹ ein Wasserstoffatom bedeutet.
Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (II):
worin R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, R²⁰ und R²¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, und R²² ein Wasserstoffatom oder eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe bedeutet, oder ein Salz derselben.
Verbindung oder deren Salz nach Anspruch 4, worin R¹², R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁷ ein Wasserstoffatom bedeuten, R¹³ und R¹⁸ unabhängig voneinander ein Halogenatom bedeuten, R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander eine Phenyl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, und R²² ein Wasserstoffatom bedeutet.
Verbindung oder deren Salz nach Anspruch 4, worin R¹², R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁷ ein Wasserstoffatom bedeuten, R¹³ und R¹⁸ ein Chloratom bedeuten, R¹⁸ und R¹⁹ eine Phenyl-Gruppe bedeuten, und R²² ein Wasserstoffatom bedeutet.
Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff, umfassend eine Verbindung oder deren Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren zur Messung von Singulett-Sauerstoff, umfassend die Schritte: (A) Umsetzen einer Verbindung oder eines Salzes derselben nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Singulett-Sauerstoff, und (B) Messen der Fluoreszenz einer Verbindung oder eines Salzes derselben nach einem der Ansprüche 4 bis 6, hergestellt in obigem Schritt (A).
Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (III):
worin R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷ und R² ⁸ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, R²⁹ und R³⁰ unabhängig voneinander eine C_1-6-Alkyl- Gruppe oder eine Aryl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, R³¹ und R³² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, und R³³ und R³⁴ unabhängig voneinander eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe bedeuten, oder ein Salz derselben.
Agens zur Messung von Singulett-Sauerstoff, umfassend eine Verbindung oder deren Salz nach Anspruch 9.
Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (IV):
worin R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸, R³⁹ und R⁴⁰ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, R⁴¹ und R⁴² unabhängig voneinander eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe bedeuten, die substituiert sein kann, R⁴³ und R⁴⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C_1-6-Alkyl-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeuten, und R⁴⁵ und R⁴⁸ unabhängig voneinander eine C_1-12-Alkanoyl-Gruppe bedeuten, oder ein Salz derselben.