WO2006093252A1 - 膜アンカー型蛍光プローブ - Google Patents

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Tetsuo Nagano
Hirotatsu Kojima
Takashi Osaki
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The University Of Tokyo
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Definitions

  • the present invention relates to a membrane anchor type fluorescent probe that can be immobilized on a cell membrane.
  • Fluorescent probes capable of measuring nitric oxide and zinc ions in cells and tissues have been developed. Fluorescent probes that have been developed to date are designed to emit fluorescence by capturing intracellular substances and changing potentials. However, since the fluorescent probe itself can move freely inside and outside the cell and between cells, It is difficult to observe the movement of the substance to be measured and the transfer of the intercellular information transmitter.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent probe capable of observing the movement of a substance to be measured from the inside of a cell to the outside and the movement of an intercellular information transmitting substance.
  • the present inventors have found that a compound in which an anchor portion that can be embedded in a cell membrane is bound to a fluorescent probe via a linker is efficiently applied to the cell membrane.
  • the fluorescence of the above-mentioned compound immobilized on the cell membrane is not impaired, and the fluorescence of the cell membrane immobilized type (hereinafter referred to as “membrane anchor type” in this specification) is maintained. It has been found that it functions very well as a probe.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a membrane anchor type fluorescent probe comprising a compound in which a phospholipid residue and a fluorescent probe compound residue are bonded via a linker.
  • the present invention provides a method for measuring the movement of a substance to be measured.
  • FIG. 1 shows an HPLC chart (left figure) and a fluorescence change (right figure) when a nitric oxide solution is placed in DAF_PIPA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the time variation of the reaction with NO with NOC13, which is a nitric oxide releasing agent, added to DAF_PIPA.
  • FIG. 3 is a diagram showing a pH profile of DAF_PIPA_T.
  • FIG. 4 is a photograph showing the state of HeLa cells loaded with FL-PIP_DPPE.
  • the photo on the left is a confocal photomicrograph, and the photo on the right shows the overlay with the transmitted light image.
  • FIG. 5 is a photograph and a diagram showing changes in fluorescence intensity due to changes in extracellular pH in HeLa cells loaded with FL-PIP_DPPE.
  • the membrane anchored fluorescent probe of the present invention is characterized in that a residue of a phospholipid and a residue of a fluorescent probe compound are bound via a linker.
  • the fluorescent probe compound is not particularly limited as long as it is used as a fluorescent probe for measurement of a measurement target substance.
  • the types of substances to be measured are not particularly limited, and proteins, enzymes (for example, -lactamase, cytochrome P450 oxidase, ⁇ -galatatosidase, ⁇ -darcosidase, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -hexosaminidase, ratatase, alkaline phosphatase, etc. Reductase, oxidase, hydrolase, etc.), metal ions (for example, alkali metal ions such as sodium ion and lithium ion)
  • Alkaline earth metal ions such as calcium ions, magnesium ions, zinc ions, etc.
  • non-metal ions such as carbonate ions
  • reactive oxygen species eg, nitric oxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, superoxide, etc.
  • nitric oxide is preferred, for example.
  • the fluorescent probe compound has a group capable of detecting the presence of the measurement target substance, such as a group that captures the measurement target substance, a group that can react with the measurement target substance, or a group that is cleaved by contact with the measurement target substance.
  • the structure is not particularly limited as long as it has a property that the fluorescence intensity changes after detection of the substance to be measured, for example, the fluorescence intensity increases.
  • fluorescent probe compounds include fluorescein, rhodamine, or 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a_diaza-s-indacene (BODIPY, registered trademark, 505/515, Molecular 'Probes Co., Ltd.') has been proposed as a core.
  • Various types of fluorescent probes can be used without being limited to these.
  • 3,4-diaminophenyl group a reagent for measuring nitric oxide
  • other groups that can detect the presence of a substance to be measured.
  • JP 10-226688 A International Publication WO 99/1447, International Publication WO 99/5158 6, JP 2000-239272 A, International Publication WO 01/62755, International Publication WO 01/64664, Fluorescent probe compounds described in International Publication WO 02/18362, International Application PCT / JP2004 / 13185, International Application PCT / JP2005 / 2753, Analyst, 128, 719-723 (2003), etc. are used for the present invention. be able to.
  • the “residue of the fluorescent probe compound” means a residue obtained by removing an appropriate atom such as a hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom from the fluorescent probe compound. Yes, preferably a monovalent group.
  • a residue obtained by removing a hydroxyl group from the carboxyl group of the 2-carboxyphenyl group of a fluorescein derivative is preferred.
  • the type of phospholipid is not particularly limited.
  • phospholipids may be phosphatidylethanolo-noreamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins Sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols, ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, or phosphatidic acids Etc. can be used.
  • the fatty acid residue in these phospholipids is not particularly limited.
  • a phospholipid having 1 or 2 saturated or unsaturated fatty acid residues having about 12 to 20 carbon atoms can be used, and specifically, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid can be used.
  • Phospholipids having one or two fatty acid-derived asinole groups such as oleic acid and linoleic acid can be used.
  • dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE) is particularly preferred, with phosphatidylethanolamines being preferred.
  • the phospholipid residue means a group obtained by removing an appropriate atom such as the above phospholipid or chemically modified phospholipid force hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom.
  • it means a monovalent group.
  • the residue obtained by removing the hydrogen atom of the phospholipid's phosphate moiety, the residue obtained by removing the hydroxyl group of the phosphate moiety of the phospholipid, and the hydrogen atom bonded to the carbon atom of the phospholipid are removed.
  • a residue S obtained by removing a hydrogen atom from the amino group, and the like S are not limited thereto.
  • the type of the linker is not particularly limited. For example, it is preferable to use a linker having about 4 to 6 shortest atoms constituting the linker.
  • minimum number of atoms for a linker means the term “one of two atoms in the linker that is involved in binding to a residue of a phospholipid or a residue of a fluorescent probe compound”. It means the smallest number of atoms that connect an atom to another atom.
  • 1,3-propenylene group the minimum number of atoms is 3, and in the case of 1,2_propenylene group, it is 2, and 1,5- (4-butkin-3-pentene In the case of a (diylene) group, it is 5. It is 3 for 1,3-phenylene groups, 2 for 1,2-phenylene groups, 3 for 2,4-quinoline groups, 1, 5 in the case of naphthylene. 4 for ethylenedioxy groups and 3 for malonyl groups And 4 for phthaloyl groups.
  • the membrane-anchored fluorescent probe of the present invention a fluorescent probe for measuring nitric oxide is shown below.
  • the scope of the present invention is not limited to a specific measurement object.
  • the fluorescent probe compound it is preferable to use diaminofluorescein (DAF) or the like.
  • DAF diaminofluorescein
  • the structure is shown below, but the scope of the present invention is not limited to the following specific compound.
  • the residue of the fluorescent probe compound is the residue obtained by removing the hydroxyl group from the carboxyl group of DAF
  • the phospholipid residue is the residue obtained by removing the hydrogen atom from the terminal amino group of dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE).
  • DPPE dipalmitoylphosphatidylethanolamine
  • the 4_carbonyl piperidine moiety corresponds to a portion of the linker.
  • the membrane-anchored fluorescent probe of the present invention does not have the property of emitting strong fluorescence itself, but emits strong fluorescence in the presence of the measurement target substance. For example, the fluorescence intensity after detection of the measurement target substance is increased. It has a changing property.
  • this membrane anchor type fluorescent probe has a property of being fixed to the outside of the cell membrane by burying an anchor portion (phospholipid portion) outside the cell membrane of living cells. Therefore, the membrane anchor type fluorescent probe of the present invention is useful as a fluorescent probe for measuring the movement of a substance to be measured from the inside of a cell to the outside and the movement of a substance to be measured which is an intercellular information transfer substance.
  • the membrane anchor type fluorescent probe of the present invention when the membrane anchor type fluorescent probe of the present invention is administered into cells by means such as microinjection, the anchor portion (phospholipid portion) can be embedded in the membrane tissue in the cells of living cells. Therefore, since the membrane anchor type probe is fixed to the membrane tissue in the cell, the membrane anchor type fluorescent probe of the present invention is used for the movement of the measurement target substance in the vicinity of the intracellular membrane and the measurement target substance that is an intercellular communication substance. It is useful as a fluorescent probe for measuring the movement of substances. In particular, nitric oxide (NO) gnoretamic acid, etc. Substances that communicate between cells released outside the cell and substances that function in the vicinity of intracellular membranes are preferred as substances to be measured. The term “measurement” used in this specification is to be interpreted in the broadest sense including quantitative and qualitative terms.
  • NO nitric oxide
  • the method of using the membrane-anchored fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and can be used in the same manner as conventionally known fluorescent probes.
  • a membrane anchor type fluorescent probe is used in an aqueous medium such as physiological saline or a buffer, or a mixture of an aqueous medium such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, and dimethylformamide and an aqueous medium. Dissolve and add this solution in an appropriate buffer containing cells and tissues, and measure the fluorescence spectrum.
  • the membrane anchor type fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with an appropriate additive.
  • a fluorescent probe-bound ribosome is prepared using the membrane anchor type 1 fluorescent probe of the present invention as a constituent lipid of lipid microparticles such as ribosome, and this is brought into contact with living cells in the form of an aqueous suspension or the like. Or, it can be administered as a reagent for in vivo measurement to mammals including humans.
  • Example 1 Production of a membrane-anchored fluorescent probe of the present invention
  • DPPE Dipalmitoylphosphatidylethanolamine
  • DIEA diisopropylethanolamine
  • Compound 2 (10 mg, 0.0 19 mmol) dissolved in methanol was slowly added dropwise over 1 hour. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 4.5 hours. Chromium form was added to the reaction solution and washed with hydrochloric acid. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by reverse phase silica gel chromatography (methanol 30% / water 70% -methanolol 90% / water 10%) to obtain compound 3 (14.5 mg, yield 70%).
  • the aqueous solution was diluted 1000 times with a sodium phosphate buffer and fluorescence (excitation wavelength: 498 nm, photometric wavelength: 521 nm) was measured.
  • the retention time of DAF-PIPA in HPLC is 17.3 minutes.
  • the pH profile of the fluorescence intensity of the fluorescent substance DAF-PIPA-T which is a reaction product with NO, is shown.
  • the fluorescence intensity depends on the phenolic hydroxyl group of the xanthene moiety, and the pKa is about 6.3 (Fig. 3).
  • the fluorescence intensity of DAF-PIP-DPPE is NO and weak before reaction. Therefore, in consideration of ease of observation, we decided to confirm using FL-PIP-DPPE bound with fluorescein, which provides strong fluorescence intensity.
  • a 10 ⁇ mol / L FL-PIP-DPPE DMEM solution serum-free, containing 1% DMS ⁇ was used as a cell culture for HeLa cells and allowed to stand at 22 ° C for 10 minutes. Thereafter, the cell culture medium was replaced with a pH 7.4 PBS (+) solution, and the cells were observed using a confocal laser microscope (X60) capable of observing fluorescence by cutting the cells in the direction of the optical axis. It was confirmed that FL-PIP-DPPE fluorescence was distributed in the cell membrane, and that FL-PIP-DPPE was localized in the cell membrane (Fig. 4).
  • Extracellular pH of cells loaded with FL-PIP-DPPE pH 7.4 PBS (+) (1 mL) is aliquoted with 500 ⁇ L of pH 4.5 PBS (+) to adjust the pH of the extracellular fluid from 7.4 ⁇ 6.7 ⁇ Changed to 6.4 and observed the change in fluorescence intensity with a fluorescence microscope (Fig. 5).
  • the fluorescence intensity of fluorescein changes in a pH-dependent manner, as in Fig. 3. Therefore, if there is a fluorescent dye moiety outside the cell, the fluorescence intensity of FL-PI P-DPPE changes in the same manner as in Fig. 3 according to the pH change, and the fluorescence should decrease. In fact, a decrease was observed as expected, and the fluorescence intensity decreased by 40% as the extracellular fluid pH changed. This value is consistent with the 40% reduction seen in the fluorescence intensity change in the pH profile of Figure 3.

Description

明 細 書
膜アンカー型蛍光プローブ
技術分野
[0001] 本発明は、細胞膜に固定化可能な膜アンカー型の蛍光プローブに関する。
背景技術
[0002] 細胞や組織中の一酸化窒素や亜鉛イオンなどを測定可能な蛍光プローブが各種 開発されている。現在までに開発された蛍光プローブは細胞内物質の捕捉や電位の 変化により蛍光を発するように設計されているが、蛍光プローブ自体が細胞の内外や 細胞間を自由移動できるため、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情 報伝達物質の移動を観察することはできないとレ、う問題を有してレ、る。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明の課題は、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質 の移動を観察することができる蛍光プローブを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、細胞膜内に埋 没可能なアンカー部分をリンカ一を介して蛍光プローブに結合させた化合物が細胞 膜に効率的に固定されること、及び細胞膜に固定化された上記化合物の蛍光プロ一 ブ部分の特性が損なわれずに、細胞膜固定型（以下、本明細書において「膜アンカ 一型」と呼ぶ。）の蛍光プローブとして極めて良好に機能することを見出した。本発明 は上記の知見を基にして完成された。
[0005] すなわち、本発明により、リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカ一 を介して結合した化合物からなる膜アンカー型蛍光プローブが提供される。
別の観点からは、上記の膜アンカー型蛍光プローブを用いて、細胞内から細胞外 への測定対象物質の移動を測定する方法、及び上記の膜アンカー型蛍光プローブ を用いて、細胞間情報伝達物質である測定対象物質の移動を測定する方法が本発 明により提供される。 図面の簡単な説明
[0006] [図 1]DAF_PIPAに一酸化窒素溶液をカ卩えたときの HPLCチャート（左図）及び蛍光変 ィ匕 (右図）を示した図である。
[図 2]DAF_PIPAに一酸化窒素放出剤である NOC13を添カ卩して NOとの反応の時間変 化を測定した結果を示した図である。
[図 3]DAF_PIPA_Tの pHプロファイルを示した図である。
[図 4]FL-PIP_DPPEを負荷した HeLa細胞の様子を示した写真である。左の写真は共 焦点顕微鏡写真であり、右の写真は透過光像との重ねあわせを示した写真である。
[図 5]FL-PIP_DPPEを負荷した HeLa細胞における細胞外 pH変化による蛍光強度変 化を示した写真及び図である。左の写真は t=0 (sec.)における顕微鏡写真であり、右 図は蛍光強度時間変化 t=90 (sec), t=230 (se ）において pHを 7.4→6.7→6.4に変化 させたときの結果を示した図である。
[図 6]DAF-PIP_DPPEの HeLa細胞膜上での一酸化窒素用蛍光プローブとしての機 能を示した写真及び図である。 a)及び b)は蛍光顕微鏡写真を示す（（a)は t=0 sec. (b) は t=2800 sec.)。 c)は蛍光強度時間変化 t=120 (sec), 1800 (sec.)にそれぞれ 100 /i mol/L及び 1 μ mol/Lとなるように NOC13を加えた結果を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の 残基とがリンカ一を介して結合したことを特徴としている。
蛍光プローブ化合物としては、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして 用いられるものであれば特に限定されない。測定対象物質の種類は特に限定されず 、タンパク質、酵素（例えば、 —ラクタマーゼ、チトクローム P450酸化酵素、 β —ガ ラタトシダーゼ、 β ダルコシダーゼ、 βーグルクロニダーゼ、 β一へキソサミニダ一 ゼ、ラタターゼ、アルカリホスファターゼなどの還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素な ど）、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン
、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン など）、非金属イオン (炭酸イオンなど）、活性酸素種 (例えば、一酸化窒素、ヒドロキ シラジカル、一重項酸素、及びスーパーォキシドなど）などのいずれであってもよい。 例えば、一酸化窒素などが好ましレ、例として挙げられる。
[0008] 蛍光プローブ化合物は、測定対象物質を捕捉する基、測定対象物質と反応可能な 基、あるいは測定対象物質との接触により切断される基など、測定対象物質の存在 を検出できる基を有しており、測定対象物質の検出後に蛍光強度が高まるなど蛍光 強度が変化する性質を有するものであれば、その構造は特に限定されない。蛍光プ ローブ化合物としては、従来、フルォレセイン、ローダミン、又は 4,4-ジフルォロ- 1,3, 5 ，7-テトラメチル -4-ボラ- 3a，4a_ジァザ- s-インダセン (BODIPY、登録商標、 505/515， モレキュラー 'プローブス社製)などを母核として種々提案されている力 これらに限定 されることなぐ多様な種類の蛍光プローブが利用可能である。また、測定対象物質 の存在を検出可能な基としては、 3，4-ジァミノフエニル基 (一酸化窒素測定用試薬） などのほか、極めて多様な基が知られている。
[0009] 例えば、特開平 10-226688号公報、国際公開 WO 99/1447、国際公開 WO 99/5158 6、特開 2000-239272号公報、国際公開 WO 01/62755、国際公開 WO 01/64664、国 際公開 WO 02/18362、国際出願 PCT/JP2004/13185、国際出願 PCT/JP2005/2753 、 Analyst, 128, 719-723 (2003)などに記載された蛍光プローブ化合物を本発明のた めに用いることができる。また、モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fl uorescent Probes and Research Chemicals, Nintn Editionノの弟 20早 (カノレシゥムィォ ン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオン）、第 21章（pHインディケ一 ター）、及び第 23章 (ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他の無機ィォ ン）に記載された測定対象物を捕捉するための置換基を用いることもできる。これらの 刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。一酸化窒素の測定 用の蛍光プローブ化合物として、例えばジァミノフルォレセイン (DAF) (特開平 10-226 688号公報）などを用いることが好ましい。
[0010] 本明細書において、「蛍光プローブ化合物の残基」とは、蛍光プローブ化合物から 水素原子などの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官能基を除い てできる残基のことであり、好ましくは 1価の基を意味している。例えば、フルォレセィ ンゃフルォレセイン誘導体の 2_カルボキシフヱニル基のカルボキシル基から水酸基 を除レ、た残基などが好ましレ、。 [0011] リン脂質の種類は特に限定されなレ、が、例えば、リン脂質が、ホスファチジルェタノ 一ノレアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシ トール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジォリピン類、スフインゴミエリン類、セ ラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリ ルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイル -1，2-デォキシホスファチジルコリン 類、プラスマロゲン類、又はホスファチジン酸類などを用いることができる。
これらのリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されない。例えば、炭素数 12〜2 0個程度の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を 1個又は 2個有するリン脂質を用いること ができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ォレイン 酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシノレ基を 1個又は 2個有するリン脂質を用いるこ とができる。これらのうち、ホスファチジルエタノールァミン類が好ましぐ特に好ましい のはジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン (DPPE)である。
[0012] リン脂質の残基とは、上記のリン脂質又は化学修飾されたリン脂質力 水素原子な どの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官能基を除いて得られる 基を意味しており、好ましくは 1価の基を意味している。例えば、リン脂質のリン酸部 分の水酸基力 水素原子を除いて得られる残基、リン脂質のリン酸部分の水酸基を 除いて得られる残基、リン脂質の炭素原子に結合する水素原子を除いて得られる残 基、あるいはリン脂質中にアミノ基が存在する場合には、そのアミノ基から水素原子を 除いてできる残基などを例示できる力 S、これらに限定されることはない。
[0013] リンカ一の種類は特に限定されないが、例えば、リンカ一を構成する最短原子数が 4〜6個程度のリンカ一を用いることが好ましレ、。 本明細書において、リンカ一につい て「最短原子数」という用語は、リン脂質の残基又は蛍光プローブ化合物の残基との 結合に関与するリンカ一中の 2個の原子のうちの 1個の原子と他の 1個の原子とを結 ぶ原子の数のうちの最小の数を意味している。例えば、 1，3-プロぺニレン基の場合に は最短原子数は 3であり、 1，2_プロぺニレン基の場合には 2であり、 1,5- (4-ブトキン- 3-ペンテ二レン）基の場合には 5である。また、 1,3-フエ二レン基の場合には 3であり 、 1，2 -フエ二レン基の場合には 2であり、 2,4-キノリンジィル基の場合には 3であり、 1,5 -ナフチレンの場合には 4である。エチレンジォキシ基では 4であり、マロニル基では 3 であり、フタロイル基では 4である。
本発明の膜アンカー型蛍光プローブの一例として、一酸化窒素測定用の蛍光プロ ーブを下記に示す力 本発明の範囲は特定の測定対象物に限定されることはない。 蛍光プローブ化合物は、ジァミノフルォレセイン (DAF)などを用いることが好ましぐ 下記にその構造を示すが、本発明の範囲は下記の特定の化合物に限定されること はない。下記式中、蛍光プローブ化合物の残基は DAFのカルボキシル基から水酸基 を除いた残基であり、リン脂質残基はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ DPPE)の末端アミノ基から水素原子を除いた残基であり、 4_カルボニルピペリジン部 分がリンカ一部分に相当する。
[化 1]
Figure imgf000007_0001
本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、それ自体は強い蛍光を発する性質を有し ていないが測定対象物質の存在下で強い蛍光を発するようになるなど、測定対象物 質の検出後に蛍光強度が変化する性質を有するものである。また、この膜アンカー 型蛍光プローブは、生細胞の細胞膜の外側にアンカー部分 (リン脂質部分）を埋没さ せることにより、細胞膜の外側に固定される性質を有している。従って、本発明の膜ァ ンカー型蛍光プローブは、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝 達物質である測定対象物質の移動を測定するための蛍光プローブとして有用である 。一方、本発明の膜アンカー型蛍光プローブをマイクロインジェクション等の手段によ り細胞内に投与すれば、生細胞の細胞内の膜組織にアンカー部分（リン脂質部分） を埋没させることができる。従って、細胞内の膜組織に膜アンカー型プローブが固定 されるため、本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、細胞内の膜近傍の測定対象物 質の移動や細胞間情報伝達物質である測定対象物質の移動を測定するための蛍 光プローブとして有用である。特に、一酸化窒素 (NO)ゃグノレタミン酸など細胞から細 胞外に放出された細胞間情報伝達物質や、細胞内の膜近傍で機能する物質が測定 対象物質として好ましレ、。本明細書にぉレ、て用いられる「測定」とレ、う用語にっレヽては 、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。
[0016] 本発明の膜アンカー型蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の 蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液など の水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、 ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに膜アン カー型蛍光プローブを溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添 加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の膜アンカー型蛍光プローブを適 切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補 助剤、 pH調節剤などの添加物と組み合わせることができる。また、本発明の膜アンカ 一型蛍光プローブをリボソームなどの脂質微粒子の構成脂質として用いて蛍光プロ ーブ結合リボソームなどを調製し、これを水性懸濁液などの形態で生細胞に接触さ せたり、あるいはヒトを含む哺乳類動物にインビボ測定用試薬として投与するなども可 能である。
実施例
[0017] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1：本発明の膜アンカー型蛍光プローブの製造
[化 2]
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
(a)化合物 2の合成
化合物 1(30 mg, 0.068 mmol)を蒸留ジメチルスルホキシド (DMS〇） 2 mLに溶解し、 氷浴中、 N—ヒドロキシコハク酸イミド（NHS) (9.4 mg, 0.081 mmol), 1 _ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピル）一カルボジイミド（WSCD) (15.6 mg, 0.081 mmol)を加え 、アルゴン雰囲気下 0 °Cにて 30分，室温にて 30分攪拌した。その後、 NHS (5 mg, 0. 043 mmol), WSCD (10 mg, 0.052 mmol)を加え、室温にてさらに 1時間攪拌した。溶 媒を減圧溜去後、シリカゲルクロマトグラフィー (メタノール 5% Iジクロロメタン 95%)に より精製して化合物 2を得た (12 mg,収率 33%)。
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d ) δ ( pm) 1.30 (br, 2H)， 1.79 (br, 2H), 2.54 (br, IH)
6
， 2.70 (br, 1H)， 2.79 (s, 4H), 2.97 (br, IH), 3.54 (br, IH), 3.92 (br, IH), 6.56 (d, 4 H， J = 8.4 Hz), 6.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.43 (m, 1H)， 7.57 (m, 1H)， 7.66 (m, 2H) MS (ESI+) 540(M+H)
[0019] (b)化合物 3 (FL-PIP- DPPE)の合成
ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン (DPPE) (14 mg, 0.020 mmol)を溶 媒 (蒸留クロ口ホルム/蒸留メタノール = 2 / 1)に溶解しジイソプロピルエタノールアミ ン (DIEA) (3.4 μ L, 0.020 mmol)を加えた。メタノールに溶解した化合物 2 (10 mg, 0.0 19 mmol)を 1時間かけてゆっくりと滴下した。その後室温にて 4.5時間攪拌した。反 応溶液にクロ口ホルムをカ卩え、塩酸酸性水により洗浄した。溶媒を減圧溜去し、逆相 シリカゲルクロマトグラフィー (メタノール 30% /水 70% -メタノーノレ 90% /水 10%)により 精製して化合物 3を得た (14.5 mg,収率 70%)。
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d ) δ (ppm) 0.88 (t, 6H， J = 6.8), 1.27 (br, 50H), 1.60
6
(br, 4H), 1.80 (br, 2H), 2.32 (m, 5H)， 2.61 (br, 1H)， 3.10 (br, 1H)， 3.46 (br, 2H), 3 .51 (br, 2H), 3.95 (br, IH), 4.02 (br, 2H), 4.22 (br, 2H), 4.43 (br, IH), 5.24 (br, IH )， 7.00 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 7.41 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.45 (m， IH), 7.66 (m， IH), 7. 75 (m, 2H)
HRMS (ESI+) calcd for C H N O P 1117.6494 (M+H). found 1117.6504
63 94 2 13 1
[0020] (c)化合物 6の合成
化合物 4 (200 mg, 0.51 mmol), NHS (117 mg, 1.0 mmol), N，N'_ジシクロへキシルカ ノレボジイミド（DCC) (210 mg, 1.0 mmol)を蒸留ジメチルホルムアミド 1 mLに溶解し、 アルゴン雰囲気下 80 °Cで 50分攪拌した。室温に戻し、イソ二ペコチン酸メチルエス テル (206 μ L， 1.53 mmol), DIEA (252 μ L, 15.3 mmol)を加え室温にて 3時間攪拌 した。溶媒を溜去後、シリカゲルクロマトグラフィー (メタノール 7% Iジクロルメタン 93% )により分離して得られた粗精製物を、溶媒 20 mL (メタノーノレ /水 = 1 / 1)に懸濁し た。 2 mLの 2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液を加え室温にて 1.5時間攪拌した。反応 終了後 2 mol/L塩酸にて中和後、溶媒を溜去し、シリカゲルクロマトグラフィー (メタノ 一ノレ 7% Iジクロルメタン 93% -メタノール 25% Iジクロロメタン 75%)にて精製して化 合物 6を得た (220 mg，収率 86%)
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d ) δ ( pm) 1.23 (br, 2H)， 1.68 (d, 2H, J = 12.4 Hz),
6
2.34 (br, 1H), 3.83 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 4.10 (br, 2H), 6.44 (s， 2H)， 6.50 (d， 2H, J = 9.5 Hz), 6.99 (s， 1H)， δ 7.05 (d， 2H, J = 9.5 Hz), 7.80 (br, 2H), 8.06 (s, 1H) MS (ESI+) 504(M+H)
[0021] (d)化合物 7 DAF-ピぺリジン酸（DAF-PIPA)の合成
化合物 6 (20 mg, 0.040 mmol)を 4 mLの溶媒 (メタノール Iジクロロメタン = 8 / 2)に 溶解し、ここへパラジウムカーボン (Pd_C) (2%)を加え水素（1気圧)雰囲気下で 30分 攪拌した。反応溶液をセライト濾過して Pd-Cを除き、母液を濃縮して化合物 7を得た ( 15 mg,収率 80%)。
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d ) δ (ppm) 1.22 (br, 2H), 1.65 (d
6 ， 2H, J = 12.0 Hz),
2.30 (br, 1H), 3.80 (d, 2H， J = 12.0 Hz), 4.09 (br, 2H), 5.04 (br, 4H), 6.46 (s, 2H), 6.47 (d, 2H， J = 2.1 Hz), 6.51 (dd, 2H， J = 9.2 Hz, 2.1 Hz), 6.66 (s, 1H)， 7.12 (d, 2 H, J = 9.2 Hz)
HRMS (ESI+) calcd for C H N O 474.1665 (M+H). found 474.1714
26 24 3 6
[0022] (e)化合物 8の合成
化合物 7(20 mg, 0.042 mmol)を塩酸酸性水に溶解し、ここへ亜硝酸ナトリウム (3 mg, 0.042 mmol)の水溶液を氷浴下ゆっくり滴下し、室温にて 30分攪拌した。 2 mol/L/X 酸化ナトリウム水溶液により中和後、溶媒を溜去し、逆相シリカゲルクロマトグラフィー (水 100%)により精製した。純度は ODSカラム HPLCにより確認した (12 mg,収率 59%) HRMS (ESI— ) calcd for C H N O 483.1305 (M+H). found 483.1329
26 19 4 6
HPLC(eluent A / B = 80 / 20 (0分)， 60 I 40 (10分)）
溶媒 A =水（0.1%トリフルォロ酢酸含有)， B =ァセトニトリノレ I水（0.1%トリフルォロ酢 酸） = 80 / 20
[0023] (f)化合物 10の合成
まず化合物 1から化合物 2を合成した時と同様に、化合物 6を用いて化合物 9を合成 した。続いて化合物 2から化合物 3を合成した時と同様に、化合物 9を用いて化合物 1 0を合成した。精製はシリカゲルクロマトグラフィー (メタノール 15% Iジクロルメタン 85 %)により行なった (ィ匕合物 6より収率 18%)。
'H-NMR (300 MHz, CDC1 / CD OD = 1 / 1) δ (ppm) 0.89 (t, 6H， J = 6.8 Hz), 1.
3 3
27 (br, 50H), 1.60 (br, 4H), 1.76 (d, 2H， J = 11.9 Hz), 2.32 (m, 5H)， 3.41 (br, 2H), 3.67 (br, 2H), 3.89 (br, 2H), 3.98 (t， 2H, J = 5.7 Hz), 4.17 (br, 2H)， 4.18 (dd， 1H, J = 12.1 Hz, 5.7 Hz), 4.41 (dd， 1H, J = 12.1 Hz, 3.5 Hz), 5.25 (br, 1H), 6.72 (s, 2H)， 6.81 (br, 2H), 7.02 (s, 1H)， 7.25 (d， 2H, J = 9.2 Hz), 8.26 (s, 1H)
HRMS (ESI—) calcd for C H N O P 1175.6297 (M— H). found 1175.6265
63 92 4 15 1
[0024] (g)化合物 11 (DAF-PIP- DPPE)の合成
化合物 10(14 mg， 0.012 mmol)を 4 mLの溶媒 (メタノーノレ /ジクロロメタン = 1 / 1)に 溶解し、 Pd-C(2%)を加え水素（1気圧)雰囲気下 30分攪拌した。反応溶液をセライト 濾過して Pd-Cを除き、母液から目的物を濃縮して化合物 11を得た (9 mg,収率 68%) 'H-NMR (300 MHz, CDC1 / CD OD = 1 / 1) δ (ppm) 0.88 (t, 6H， J = 7.0 Hz), 1.
3 3
27 (br, 50H), 1.61 (br, 4H), 1.80 (d, 2H, J = 12.9 Hz), 2.32 (m, 5H)， 3.41 (br, 2H)， 3.67 (br, 2H), 3.96 (br, 2H), 4.03 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 4.18 (dd， 3H, J = 12.1 Hz, 5. 9 Hz), 4.43 (dd， 1H, J = 12.1 Hz, 3.5 Hz), 5.25 (br, 1H), 6.73 (s, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.17 (s, 2H)， 7.27 (br, 2H)， 7.77 (d, 2H, J = 9.4 Hz)
HRMS (ESI+) calcd for C H N O P 1145.6555 (M— H). found 1145.6555
63 94 4 13 1
[0025] 例 2
DAF-PIPAを 2 mmol/Lになるように溶解した水溶液に一酸化窒素（NO)溶液を NO 濃度がそれぞれ 0.38 mmol/L, 0.76 mmol/Lになるように加えたときの反応を HPLCに より確認した。またその水溶液をナトリウムリン酸バッファ一により 1000倍希釈し蛍光（ 励起波長 498 nm,測光波長 521 nm)を測定した。 HPLCにおいて DAF-PIPAの保持 時間は 17.3分である。 DAF-PIPAが NOと反応した後に保持時間 20.3分の物質が生 成したが、このものは ESト MSより、 DAF-PIPAのジァミノ部分力 SNOと反応してトリァゾ ールとなった DAF-PIPA-Tであることを確認した (図 1)。
[0026] 37。Cの DAF-PIPA 1.27 μ mol/Lの PBS (-)溶液にそれぞれ 5 μ mol/L, 50 μ mol/L, 1 00 μ mol/L, 500 μ mol/Lになるように徐放性の NO放出剤である NOC13を加え、 N〇と の反応の時間変化を測定した。 NO濃度依存的に蛍光強度が大きくなることがわかつ た (図 2)。
NOとの反応生成物である蛍光物質 DAF-PIPA-Tの蛍光強度の pHプロファイルを 示す。蛍光強度はキサンテン部位のフエノール性水酸基に依存し pKaは約 6.3であつ た (図 3)。
[0027] 例 3
(a)膜アンカー型蛍光プローブが膜に存在していることの確認
DAF-PIP-DPPEの蛍光強度は NOと反応前は弱レ、。このため、観察の容易性を考 慮し、強い蛍光強度が得られるフルォレセインが結合した FL-PIP-DPPEを用いて確 認を行なうこととした。 HeLa細胞に対して 10 μ mol/Lの FL-PIP- DPPEの DMEM溶液（ 無血清、 1% DMS〇含)を細胞培養液として用レ、、 22°Cで 10分間静置した。その後、細 胞培養液を pH 7.4 PBS(+)溶液に交換し、細胞を光軸方向に輪切りにして蛍光観察 できる共焦点レーザー顕微鏡 ( X 60)を用いて観察した。細胞膜に FL-PIP-DPPEの蛍 光が分布し、 FL-PIP-DPPEが細胞膜に局在してレ、ることが確認できた (図 4)
[0028] (b)細胞膜内外に存在する蛍光色素部位の量の検証
FL-PIP-DPPEを負荷した細胞の細胞外液 pH 7.4 PBS(+) (1 mL)に pH 4.5 PBS (+) を 500 μ Lずつカロえることにより、細胞外液の pHを 7.4→ 6.7→ 6.4と変化させ、その 蛍光強度変化を蛍光顕微鏡で観察した (図 5)。 フルォレセインの蛍光強度は図 3と 同様に、 pH依存的に変化する。従って細胞外に蛍光色素部分があるならば、 FL-PI P-DPPEの蛍光強度も pH変化に応じて図 3とほぼ同様に変化し、蛍光が減少するは ずである。実際、その予測どおりに確かに減少が認められ、細胞外液 pHの変化に伴 い蛍光強度は 40%減少した。この値は、図 3の pHプロファイルでの蛍光強度変化に ぉレ、て見られる減少量 40%と合致する。
[0029] 一方、対照実験として、細胞膜を透過し、細胞質のエステラーゼにより加水分解さ れることで、細胞内部にフルォレセインを分布させることができるフルォレセインエス テル誘導体（fluorescein diacetate)を細胞に負荷して同様の操作を試みたところ、 pH の変化に伴う蛍光強度の変化は認められなかった。細胞内 pHは細胞外液 pHの変化 の影響を受けにくいと言える。先の FL-PIP-DPPEが細胞膜の外側に負荷した後に、 そのフルォレセイン部分が細胞内に取り込まれているならば、蛍光強度は pHプロファ ィルに合致する 40%も減少しないはずである。従って、 FL-PIP-DPPEのフルォレセィ ン部分は細胞膜の外側にあることが確認できた。
[0030] 以上の検討から、膜アンカー型蛍光プローブのフルォレセイン部分は細胞膜を透 過しないことが確認できた。従って、細胞外液に溶解させる等の方法で細胞膜の外 側に負荷した場合は細胞膜の外側の、マイクロインジェクション等の方法で細胞膜の 内側に負荷した場合は細胞膜の内側の測定対象物の観察が可能であることが確認 できた。
[0031] (c)細胞膜での NOプローブとしての機能
DAF-PIP-DPPE (7.5 μ mol/L)を負荷した細胞の細胞外液（pH 7.4 PBS(+)) 1 mL に、直前に調製した NOC13溶液 500 x Lを観察開始 120秒後にに 100 x mol/L、 1800 秒後にに 1 mmol/Lになるように加え、そのときの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡で観 察した。細胞膜上の蛍光強度の著しい増加が確認され、 HeLa細胞膜上において NO プローブとして機能することが確認された (図 6)。
産業上の利用可能性
[0032] 本発明の蛍光プローブを用いて細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間 情報伝達物質の移動などを観察することができる。

Claims

請求の範囲 リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカ一を介して結合した化合物か らなる膜アンカー型蛍光プローブ。 以下の式で表される請求項 1に記載の膜アンカー型蛍光プローブ。
[化 1]
Figure imgf000015_0001
PCT/JP2006/304054 2005-03-04 2006-03-03 膜アンカー型蛍光プローブ WO2006093252A1 (ja)

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