WO2007111345A1

WO2007111345A1 - 活性酸素測定用試薬

Info

Publication number: WO2007111345A1
Application number: PCT/JP2007/056558
Authority: WO
Inventors: Hideo Takakura; Yasuteru Urano; Tetsuo Nagano
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2007-10-04
Also published as: JPWO2007111345A1

Description

明細書

活性酸素測定用試薬

技術分野

[0001] 本発明は、活性酸素測定用試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬に関する。背景技術

[0002] ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光法は、励起光を必要としな、ためノックグランドノイズがほぼゼロであり高感度な測定が可能である。また、励起光を必要としないことから簡単な構造の装置で測定をすることができる。これらの特長により、生物発光法は、ブロッテイングにおける目的物質の検出やレポーター酵素など様々なアツセィ系に汎用されている。さらに、最近では、光透過性の悪い生物試料の深部のイメージングも可能であることから、イン' ビボのイメージング系への応用も検討されるようになってきた。

[0003] このようにイン'ビボのイメージングにおいて生物発光法は有効であると考えられているが、従来の生物発光法における発光波長はルシフヱリンが有する 570 nmに限られているため、イン'ビボのイメージングに用いるには波長が短いという問題がある。このため、発光波長をより組織透過性に優れた長波長側にシフトさせる研究が行われているが、これらの研究は、いずれの場合も酵素であるルシフェラーゼの特性を改変することにより行われており、基質であるルシフェリンについてアプローチした報告はほとんどない。

[0004] 本発明者らは、アミノルシフェリンのァミノ基にアルキル基を導入したィ匕合物力ルシフェリンと同様の高、発光性を有し、かつ発光波長がルシフェリンに比べて大幅に長波長側にシフトし 610 nm以上の発光波長を有すること、及びアミノルシフェリンのァミノ基にアミノフエネチル基を導入したィ匕合物がルシフェラーゼの基質としての性質を失わず、基質となって反応した際にも無発光性であること、及び該化合物のアミノ基をァシルイ匕したィ匕合物ではルシフェラーゼの基質としての性質が保持されるとともに、ルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出し、これを原理として生物発光特性の on/o蹄 U御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質が提供可能なことを報告している（第 18回バイオメディカル分析科学シンポジウム講演要旨集， pp.101-102, 200 5)。

[0005] また、生物発光法はその感度に注目が集中していた力標的分子の存在下のみで発光が生じるような生物発光特性の on/o蹄 lj御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質の研究も報告されている（例えば特開 2000-270894号公報、 J. Clin. Chem. Clin. Bio chem., 25, pp.23-30, 1987など）。これらはルシフェリンのメチルエーテル型ゃァミノルシフェリンのアミド型がルシフェラーゼの基質とならず発光しな、ことを利用し、ルシフェリンやアミノルシフェリンに糖やペプチドを結合させて、それらと特異的に反応する酵素の活性を測定するという原理に基づくものである。しかし、この原理では適用可能なプローブの標的は非常に限られてしまうという問題がある。このため、機能性ィン'ビボ発光イメージングを可能にする汎用性の高い生物発光プローブの開発が望まれていた。

[0006] 一方、活性酸素は生体にお!、て様々な重要な役割を演じて、ることが報告されている。例えば、一酸ィ匕窒素は情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系などにぉ、て血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮して、ることが知られており、スーパーオキサイドァニオンや過酸ィヒ水素は免疫系などにおいて重要な生理作用を発揮していることが明らかにされている。ヒドロキシラジカルは血管障害ゃ虚血後の脳障害、あるいは紫外線による DNA修飾に関わる知見が多数報告され、病因'病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。

[0007] また、一酸ィ匕窒素とスーパーオキサイドァ-オンが反応することにより生成するパーォキシナイトライト (ONOO—)は芳香環の-トロ化が可能であるなど高い酸ィ匕能を有し、またチロシンの-トロ化を効率よく行うなど、特徴的な反応性を有する。最近の報告によれば、チロシンが-トロ化されることにより、チロシンのリン酸化が阻害され、 MAPK、 PI3K/Aktカスケードなどの情報伝達に重要な影響を及ぼすことが指摘されて、る。さらに、近年、次亜塩素酸イオンの生体内での作用が注目されている。好中球による殺菌作用は主に次亜塩素酸イオンによると考えられており、ァズール顆粒中のミエ口ペルォキシダーゼにより、過酸ィ匕水素と塩ィ匕物イオン力も次亜塩素酸イオンが生成することがイン 'ビトロで示され（Klebanoff, S. J. et al.， The Neutrophils: Function and Clinical Disorders, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, Netherlands, 1 978)、また、次亜塩素酸イオンは血小板活性化因子に誘導される微小循環障害の血管内皮表面の損傷において重要な役割を果たすとの報告がある（Suematsu, M., e t al, J. Biochem., 106, pp.355- 360, 1989)。

このように活性酸素は炎症、老化、動脈硬化等の各種疾患や情報伝達に関与していることから、種々の活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっており、生体内の活性酸素種を測定するため、いくつかの蛍光プローブが提案されている。例えば、国際公開 WO 01/64664の活性酸素蛍光プローブ (J. Biol. Chem., 278, pp. 3170-3175, 2003)、国際公開 W099/51586、及び国際公開 WO02/18362に記載の一重項酸素蛍光プローブ、特開平 10-226688、及び国際公開 WO 2004/76466に記載の一酸化窒素蛍光プローブ、 H DCFDA(2',7，-ジクロロジヒドロフルォレセインジァ

2

セテート、モレキユラ一'プローブス社、カタログ番号 D- 399)などが知られている。また、ゥミホタルルシフェリン誘導体 MCLAを用いて化学発光法によってスーパーォキサイドア-オンを測定する方法（Clinica Chimica Acta, 179, pp.177- 182, 1989)、及び一重項酸素を測定する方法 (J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69- 72, 1991)も提案されている。しかし、ルシフェリン誘導体を活性酸素に対する生物発光プローブとして使用した活性酸素を測定する方法についてはほとんど知られていな力つた。

特許文献 1：特開 2000-270894号公報

特許文献 2：国際公開 WO01/64664

特許文献 3：国際公開 W099/51586

特許文献 4:国際公開 WO02/18362

特許文献 5：特開平 10-226688号公報

特許文献 6：国際公開 WO2004/76466

非特許文献 1 :J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 25, pp.23- 30, 1987

非特許文献 2 : Clinica Chimica Acta, 179, pp.177- 182, 1989

非特許文献 3 : J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69- 72, 1991

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の課題は、ヒドロキシラジカル、次亜塩素酸イオン、ホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP) /過酸化水素系などの高!ヽ酸ィ匕活性を有する活性酸素種を選択的に可視化可能な試薬を提供することにある。特に、従来法では不可能であった酸化ストレスの動物個体イメージングに適応可能な活性酸素測定用試薬を提供することが本発明の課題である。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、アミノルシフェリンのァミノ基にアルキル基を導入したィ匕合物力ルシフェリンと同様の高、発光性を有し、かつ発光波長がルシフェリンに比べて大幅に長波長側にシフトし 610 nm以上の発光波長を有すること、及びアミノルシフェリンのァミノ基にアミノフエネチル基を導入したィ匕合物がルシフェラーゼの基質としての性質を失わず、基質となって反応した際にも無発光性であること、及び該化合物のアミノ基をァシルイ匕したィ匕合物ではルシフェラーゼの基質としての性質が保持されるとともに、ルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出し、これを原理として生物発光特性の on/o蹄 U御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質が提供可能なことを見出した（特願 2005-286948号明細書)。

[0011] 本発明者らは上記の知見を基にさらに検討を行った結果、特願 2005-286948号明細書に記載された一般式に包含される化合物のうち、アミノルシフェリンのァミノ基にァミノフエ二ルォキシアルキル基を導入した化合物力 S、活性酸素との反応前はルシフエラーゼの基質としての性質を有しており、該化合物が基質となって反応した際には無発光性であること、ヒドロキシラジカルやパーォキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及び HRP/過酸ィ匕水素系などの酸ィ匕力の強、活性酸素種と反応して該ァミノフエ- ルォキシアルキル基にお!、て脱ァリールイ匕反応が起こること、並びに該脱ァリール化反応生成物がルシフェラーゼの基質としての性質を保持しており、かつルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。

[0012] すなわち、本発明により、下記の一般式 (I)：

[化 1]

[式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C ル基、又は下記の式 (A)：

[化 2]

〔式中、 X¹は— N(R³)(R⁴) (式中、 R³及び R⁴はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有して！、てもよ、C アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、置換基を有して!/、てもよ!/、C ァ

1-6 1-6 ルコキシ基、スルファ-ル基又は置換基を有して、てもよ、C アルキルスルファ-ル

1-6

基で表される基を示し; X²はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 3個の一価の置換基を示し; Yは- 0-又は- S-を示し; nは 1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、 R¹及び R²の少なくとも一つは式 (A)で表される基を示す]で表される化合物又はその塩が提供される。

上記の発明の好ま、態様によれば、一般式 (I)にお、て、 R¹及び R²がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、又は式 (A)〔式中、 X¹が

1-6

— N(R³)(R⁴) (式中、 R³及び R⁴がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、又は置換基を有していてもよい C アルコキシ

1-6 1-6 基を示し、 X²がベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個な、し 3個の一価の置換基を示し、 Yが- 0-を示し、 nが 1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、 R¹及び R² の少なくとも一つは式 (A)で表される基を示すィ匕合物又はその塩が提供される。この発明の最も好ましい態様によれば、 R¹が水素原子であり、 R²が式 (A)〔式中、 X¹は N Hを示し、 X²は水素原子を示し、 Yは- 0-を示し、 nは 2を示す〕で表される化合物又

2

はその塩が提供される。 [0014] 別の観点からは、下記の一般式 (II)

[化 3]

〔式中、 R¹¹及び R¹²はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アル

1-6 キル基、又は (CH ) —Ζ—Η (式中、 Ζは- 0-又は- S-を示し; mは 1〜6の整数を示

2 m

す)で表される基を示すが、 R¹¹及び R¹²の少なくとも一つは— (CH ) — Z— Hで表され

2 m

る基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。

[0015] 上記の発明の好ましい態様として、一般式 (II)において、 R¹¹及び R¹²がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、又は (CH ) Z— H (式

1-6 2 m 中、 Zは- 0-を示し; mは 1〜6の整数を示す）で表される基を示す力 R¹¹及び R¹²の少なくとも一つは (CH ) Z— Hで表される基を示すィ匕合物又はその塩が提供される

2 m

。この発明の好ましい態様によれば、 R¹¹が水素原子であり、 R¹²がー (CH ) -Z-H (

2 m 式中、 Zは- 0-を示し; mは 1〜6の整数を示す)で表される化合物又はその塩が提供される。この発明の最も好ましい態様によれば、 R¹¹が水素原子であり、 R¹²がー (CH )

2 2 OHで表される化合物又はその塩が提供される。

[0016] 別の観点力は、上記の一般式 (I)で表される化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬が本発明により提供される。さらに、本発明により、活性酸素の測定方法であって、下記の工程: (A)上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び (B)上記工程 (A)で生成した脱ァリールイ匕合物（上記一般式 (I I)で表される化合物)又はその塩をルシファラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する工程を含む方法が提供される。さらに、上記の活性酸素測定用試薬とルシフエラーゼとを要素として含む活性酸素測定用キットが本発明により提供される。

発明の効果

[0017] 本発明により提供される上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラ一ゼの基質としての性質を有して!/、るものの、基質となって反応しても無発光性である力一方、ヒドロキシラジカルやパーォキシナイトライト、次亜塩素酸イオンなどの極めて酸ィ匕力の強い活性酸素種と接触して脱ァリールイ匕を起こして上記一般式 (II)で表される化合物又はその塩を生じる。該上記一般式 (II)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を保持しつつ、かつ基質となって反応すると発光性の化合物を生じることから、ヒドロキシラジカルやパーォキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及び HRP/過酸ィ匕水素系などの極めて酸ィ匕力の強い活性酸素種と一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドァ-オン、及び一重項酸素などの活性酸素種を区別して測定する活性酸素測定試薬として極めて有用である。さらに、本発明により提供される上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩は、イン'ビボでの活性酸素のイメージングゃ酵素免疫測定法などのイン'ビトロアツセィの測定系として好適に使用できる。

図面の簡単な説明

[図 1]化合物 8と種々の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。

[図 2]化合物 8と各濃度の次亜塩素酸イオンを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光強度を次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットした結果である。

[図 3]化合物 8と HRP/過酸ィ匕水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフエラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。

[図 4]化合物 8と HRP/過酸ィ匕水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフエラーゼと反応させた時の発光強度を過酸ィヒ水素の濃度に対してプロットした結果である。

[図 5]化合物 8と HRP/過酸ィ匕水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフエラーゼと反応させた時の発光強度を HRPの濃度に対してプロットした結果である。

[図 6]化合物 13をルシフェラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。

[図 7]化合物 8と HRP/過酸ィ匕水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフエラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を過酸化水素の濃度に対してプロットした結果である。

[図 8]化合物 8と HRP/過酸ィ匕水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフエラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を HRPの濃度に対してプロットした結果である。

[図 9]化合物 8と次亜塩素酸イオンを反応させ、その生成物をルシフラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を次亜塩素酸イオンの濃度に対してプロットした結果である。

[図 10]化合物 8とパーォキシナイトライトを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をパ一ォキシナイトライトの濃度に対してプロットした結果である。

[図 11]化合物 8とヒドロキシルラジカルを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をヒド口キシルラジカルの濃度に対してプロットした結果である。

[図 12]HRPと ALPの同時検出系において、化合物 8と HRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を HRPの濃度に対してプロットした結果である。

[図 13]HRPと ALPの同時検出系において、 Luphosと ALPを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を ALPの濃度に対してプロットした結果である。

発明を実施するための最良の形態

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基 (例えばアルキルカルボニル基など）のアルキル部分は、直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせ力なる飽和炭化水素基を意味している。より具体的には、アルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、 n- ブチル基、 sec-ブチル基、イソブチル基、 tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基、 n- ペンチル基、 n-へキシル基などを挙げることができる。 [0020] 本明細書にぉ、て、ある官能基にっ、て「置換基を有して、てもよ、」と言う場合には、置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、アルキル基、ハロゲン原子 (フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。また、本明細書においてァリール基という場合には、単環性又は多環性のァリール基の、ずれであってもよ、が、好ましくはフエ-ル基を用いることができる。ァリール環についても同様であり、好ましくはベンゼン環を用いることができる。

[0021] 上記一般式 (I)において、 R¹及び R²は水素原子、置換基を有していてもよい C アル

1-6 キル基、又は式 (A)で表される基を示す力 R¹及び R²の少なくとも一つは式 (A)で表される基を示す。 R¹及び R²の一方が式 (A)で表される基を示し、他方が水素原子、又は置換基を有して、てもよ、C アルキル基であることが好ましく、 R¹及び R²の!、ずれ

1-6

か一方が式 (A)で表される基であり、他方が水素原子であることが特に好ましい。

[0022] R¹及び R²が示す置換基を有していてもよい C アルキル基としては、置換基を有し

1-6

ていてもよい直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせ力なる飽和炭化水素基の何れでもよいが、 C アルキル基が直鎖 C アルキルであることが好ましぐメチ

1-6 1-6

ル基であることが特に好ましい。 R¹及び R²が示す C アルキル基が置換基を有する場

1-6

合、該置換基は特に限定されず、上記一般式 (I)で表される本発明の化合物の活性酸素測定用試薬としての機能を損なわな、ものであれば、かなるものであってもよ!、

[0023] 一般式 (I)中の R¹及び R²に置換する式 (A)で表される基において、 X¹は N(R³)(R⁴) ( 式中、 R³及び R⁴はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキ

1-6 ル基を示す）、ヒドロキシ基、置換基を有して!/、てもよ!/、C アルコキシ基、スルファニ

1-6

ル基又は置換基を有して！/、てもよ!/、C アルキルスルファニル基で表される基を示す

1-6

力 X¹が— N(R³)(R⁴)で表される基である場合には、 R³及び R⁴が共に水素原子であることが好ましい。 X¹が置換基を有していてもよい C アルコキシ基である場合にはメト

1-6

キシ基が好ましく、置換基を有して!/、てもよ!/、C アルキルスルファニル基である場合

1-6

には、メチルスルファニル基であることが好ましい。 X¹は一 (CH )—Y—力置換する位

2 n 置に対してパラ位に結合することが好ま U、。 X²はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 3個の一価の置換基を示すが、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。 X²が示す置換基の置換位置は特に限定されず、ベンゼン環上の置換可能な任意の位置に置換することができる。 Yは— 0 、又は一 S を示すが、 0 であることが好ましい。 nは 1〜6の整数を示す力 nが 1〜3 であることが好ましぐ特に nが 2であることが好ましい。

[0024] 一般式 (I)で表される本発明の化合物又はその塩は、ルシフラーゼの基質となりうる構造を有しており、かつルシフェラーゼの基質として反応した際に電子密度の高い (HOMOエネルギーの高!、）ベンゼン環部位力発光部位であるアミノルシフヱリン部位への電子供与が起こり、その結果、発光を生じない性質を有している。

[0025] 上記一般式 (II)において、 R¹¹及び R¹²はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、又は (CH ) —Z— Hで表される基を示す力 R¹¹及び R¹²

1-6 2 m

の少なくとも一つは— (CH ) —Z— Hで表される基を示す。 R¹¹及び R¹²の一方が— (CH

2 m

) —Z— Hで表される基を示し、他方が水素原子、又は置換基を有していてもよい C

2 m 1 - アルキル基であることが好ましぐ R¹¹及び R¹²のいずれか一方が— (CH ) — Z— Hで

6 2 m

表される基であり、他方が水素原子であることが特に好ましい。 R¹¹及び R¹²が示す置換基を有して、てもよ、C アルキル基は、一般式 (I)が示す R¹及び R²が示す置換基

1-6

を有していてもよい C アルキル基と同様である。 Zは— 0 、又は— S を示すが、

1-6

0 であることが好ましい。 mは 1〜6の整数を示す力 mカ^〜 3であることが好ましぐ特に mが 2であることが好ましい。

[0026] 一般式 (II)で表される本発明の化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質となりうる構造を有し、かつルシフェラーゼの基質として反応した際に発光する性質を有している。

本明細書において「発光性」とはルシフェラーゼとの反応により発光を生じる性質を意味している。一方、本明細書において、本発明の化合物が「無発光性」であるとは、ルシフェラーゼの基質となって化学修飾を受けるものの、酵素反応の生成物が実質的に発光しな、ことを意味して、る。

[0027] 上記一般式 (I)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、 P-トルエンスルホン酸塩、シユウ酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニゥム塩、又はトリエチルァミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほ力グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もある力これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。

[0028] 上記一般式 (I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、 1個又は 2個以上の不斉炭素を有する場合があるが、 1個又は 2個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や 2個以上の不斉炭素に基づくジァステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される

[0029] 本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変をカ卩えることによって、上記一般式 (I)及び一般式 (II)で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。

[0030] 本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素の測定方法は、一般的には、（A)上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び (B)上記工程 (A)で生成した一般式 ( II)で表される化合物又はその塩をルシフェラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する方法を含んでいる。

[0031] ルシフェリンールシフェラーゼ系の発光は、アデノシン三リン酸 (ATP)及びマグネシゥムイオンの存在下、基質の D-ルシフェリンがルシフェラーゼによって発光体であるォキシルシフェリンに酸ィ匕される反応によっておこる。従来は発光が速やかに減衰してしまうためにオートインジェクターを備えたルミノメーターを必要としていた力現在ではコェンザィム A (CoA)を添カ卩した改良法（Promega Protocols and Application Gui de, 2nd edition)により、より強くかつ安定した発光が得られるようになり、特別な装置は不要となっている。

[化 4]

Oxyluciferin

[0032] また、近年、 CCDカメラや画像解析技術の進歩により、従来は捕捉が難し力つた体内（イン'ビボ）の微量ルシフェラーゼ発光を捉えることが可能となっている。ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光イメージング技法は、蛍光プローブを用いたイメージングと比較して励起光照射の必要がないため、（1)バックグラウンドノイズがほとんど無ぐ高 S/Nイメージングが可能であること、及び (2)光透過性の悪、深部のイメージングも可能であることなどの特徴を有する。

[0033] 本発明の一般式 (I)で表される化合物を含む活性酸素測定用試薬は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞 (癌細胞や細菌など）に接触させ、あるいはトランスジェ-ックマウス、又は病態モデル動物などに腹腔内投与することにより、細胞又は生物個体内での酸化ストレスをリアルタイムに測定することが可能であり、疾患病態の原因究明、治療薬の開発などに好適に利用できる。また、本発明の活性酸素測定用試薬は、ノックグラウンドノイズがほとんど無ぐ高感度に HRP/過酸ィ匕水素系の反応を測定することが可能なことから、酵素免疫測定法などのイン'ビトロアッセィ系の測定系としても有用である。

[0034] 本発明の一般式 (I)で表される化合物が活性酸素種およびルシフェラーゼの両方と反応して得られる化合物の発光は長波は 615nm付近にあるので、活性酸素以外の測定対象物及びルシフラーゼの両方と反応して得られる化合物の発光ピーク波長が本発明の発光ピークと異なる化合物を組み合わせて用いることにより、活性酸素種とそれ以外の測定対象物を同時に測定することが可能である。

[0035] 例えば、アルカリホスファターゼ (ALP)及びルシフェラーゼの両方と特的に反応して ALP活性を測定することができる Luphos (Toya, Y. et. al.， Bulletin of the Chemical S ociety of Japan, 65, pp.2604-2610, 1992)と本発明の化合物を組み合わせれば、資料中の ALP活性と活性酸素種を同時に測定できる。

[0036] 本発明の化合物又はその塩を活性酸素測定用試薬として用いる場合、上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、 _PH調節剤、緩衝剤、等張ィ匕剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。

実施例

[0037] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

例 1 :化合物 8の合成

化合物 8の合成スキームを以下に示した。

[化 5]

D-cysteine, H₂0

acetone, BOH

8, APL (A)化合物 2の合成

4-二トロフエノールナトリウム塩（ィ匕合物 1) (1.1 g, 7.0 mmol)を 15 mLのジメチルホルムアミドに溶解し、 2—クロ口エタノール（0.6 mL, 8.9 mmol)をカ卩ぇ 130 °Cで加熱還流して一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン : 1 1 1)で原料の消失を確認した後、反応溶液を留去し、残渣を酢酸ェチルで抽出して飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムク口マトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 1 / 1— 2 / 1)にて精製し、化合物 2 ( 固体）を得た（850 mg, 66%)。

1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 1.96 (t, 1Η, J = 6.2 Hz), 4.00-4.07 (m, 2H), 4.19 (t,

3

2H, J = 4.5 Hz), 6.99 (td, 2H, J = 2.8, 10.1 Hz), 8.22 (td, 2H, J = 2.8, 10.1 Hz). ¹³C-NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 61.0, 69.9, 114.5, 125.9, 141.6, 163.7. MS (EI+) 183, M⁺

[0039] (B)化合物 3の合成

化合物 2 (850 mg, 4.6 mmol)を 20 mLのメタノールに溶解し、 30 mgの 10%パラジウムカーボンを加え水素置換して室温にて一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I n キサン = 2 I 1)で原料の消失を確認した後、反応溶液をろ過してろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 2 / 1)にて精製し、化合物 3 (固体)を得た（590 mg, 84%)。

JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 2.05 (br, 1H), 3.45 (br, 2H), 3.88—3.92 (m, 2H), 3.9

3

9-4.04 (m, 2H), 6.65 (td, 2H, J = 2.7, 8.9 Hz), 6.77 (td, 2H, J = 2.7, 8.9 Hz).

1³C-NMR (75 MHz, acetone— d ) δ 61.4, 70.9, 116.2, 116.4, 142.6, 151.9.

6

MS (EI+) 153, M⁺

[0040] (C)化合物 4の合成

化合物 3 (1.8 g, 12 mmol)を 10 mLのピリジンに溶解し、ベンジルォキシカルボ-ルクロライド（2.2 mL, 15 mmol)を氷浴上でカ卩えて、そのままー晚撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I n キサン = 2 I 1)で反応の進行を確認した後、反応溶液を留去し、残渣を酢酸ェチルで抽出して飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n- へキサン = 1 / 2 — 2 / 1)にて精製して、化合物 4 (白色固体)を得た (2.3 g, 68 %)。 'H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 1.98 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 3.91—3.99 (m, 2H), 4.03—4.

3

09 (m, 2H), 5.19 (s, 2H), 6.53 (br, 1H), 6.87 (td, 2H, J = 2.4, 9.2 Hz), 7.26-7.43 (m , 7H).

¹³C-NMR (75 MHz, acetone— d ) δ 61.4, 66.7, 70.8, 115.5, 120.8, 128.8, 128.9, 12

6

9.2, 133.2, 138.0, 154.5, 155.8.

HRMS (ESI Calcd for [M+Na]⁺, 310.1055, Found, 310.1057.

[0041] (D)化合物 5の合成

ジメチルスルホキシド（2.8 mL, 39 mmol)を 78 °Cで 2 mol/L二塩化ォキサリル（ジクロロメタン溶液) 20 mLに加えた。 5分撹拌した後、ィ匕合物 4 (1.1 g, 3.8 mmol)と 2 mL のジメチルスルホキシドのジクロロメタン溶液を一 78 °Cで滴下し 30分撹拌した。その後、 10 mLのトリメチルァミンを加えた。室温に戻した後、反応溶液に水を加えて有機溶媒層を分離し 1 mol/L塩酸、 0.5w/w%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトダラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 1 / 3— 1 / 1)にて精製して、化合物 5 (白色固体）を得た（700 mg, 64 %)。

1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 4.55 (d, 2Η, J = 1.0 Hz), 5.19 (s, 2H), 6.61 (br, 1H),

3

6.85 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.28-7.44 (m, 7H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 66.9, 73.0, 115.0, 120.6, 128.2, 128.3, 128.5, 132.0,

3

136.0, 153.6, 153.8, 199.2.

HRMS (ES Calcd for [M+Na]⁺, 308.0899, Found, 308.0938.

(E)化合物 6の合成

化合物 5 (140 mg, 0.5 mmol)を 20 mLのテトラヒドロフランに溶解し、 180 mmol/L硫酸 2.8 mL (0.5 mmol)を加え室温で数分撹拌した。 2 シァノ 6 ァミノべンゾチアゾール（93 mg, 0.5 mmol)と水素化ホウ素ナトリウム（23 mg, 0.6 mmol)を 30 mLのテトラヒドロフランに溶力しこれをカ卩え、室温で撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル

I n キサン = 2 I 1)で反応の進行を確認し反応溶液に精製水を加えた後、飽和食塩水を加えてテトラヒドロフラン層と分離した。水層を酢酸ェチルで抽出しテトラヒド口フラン層と合わせ、この有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 1 / 3— 1 / 1)で精製した後、セミ分取 HPLC (溶出液 A =水/ 0.1%トリフルォロ酢酸、溶出液 B = 80%ァセトニトリル I 20%水 I 0.1%トリフルォロ酢酸、 A / B = 50 / 50— 0 / 100 (10分)）で精製し、化合物 6 (黄色固体)を得た（130 mg, 58 %)。

1H-NMR (300 MHz, CD OD) δ 3.49 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 4.07 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 5

3

.05 (s, 2H), 6.79 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 6.97 (dd, 1H, J = 2.3, 9.1 Hz), 7.07 (d, 1 H, J = 2.3 Hz), 7.17-7.33 (m, 7H), 7.75 (d, 1H, J = 9.1 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz, acetone— d ) δ 43.6, 66.8, 67.4, 100.6, 114.8, 115.7, 118.2, 12

6

0.7, 126.0, 128.8, 128.9, 129.3, 129.7, 133.6, 138.0, 139.8, 145.2, 150.9, 154.5, 15 5.5. HRMS (ESI Calcd for [M+H]⁺, 445.1334, Found, 445.1355.

[0043] (F)化合物 8の合成

化合物 6を 5 mLのジクロロメタンに溶解し、トリフルォロ酢酸を 20 mLカ卩えて 60でで加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I n キサン : 1 1 1)で原料の消失を確認した後、トルエンと共沸して溶媒を除去した。残渣を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル I _n—へキサン = 1 / 2— 1 / 1— 2 / 1)で精製し、化合物 7を得た。次に、 D—システィン塩酸塩 ·一水和物（150 mg, 0.85 mmol)をアルゴンで脱気した精製水に溶解し、 0.5 mol/L炭酸カリウム溶液で pHを 8とした D—システィン溶液を調製した。化合物 7 (84 mg, 0.27 mmol)をアルゴンで脱気したエタノール 20 mL、アセトン 2 m Lに溶解し、 D—システィン溶液を加えた。アルゴン置換し、遮光して室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、残った水層を分取 HPLC (溶出液 A =水/ 0.1 %トリフルォロ酢酸、溶出液 B = 80 %ァセトニトリノレ I 20%水 I 0.1%トリフノレオ口酢酸、 A / B = 80 / 20 - 20 / 80 (20分))で精製し、化合物 8を得た（18 mg, 16%, 2段階)。

JH-NMR (300 MHz, CD OD)

3 δ 3.62 (t, 2H, J = 5.3 Hz), 3.65—3.77 (m, 2H), 4.23 (t

, 2H, J = 5.3 Hz), 5.35 (t, 1H, J = 9.1 Hz), 6.96 (dd, 1H, J = 2.3, 9.0 Hz), 7.09 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.29 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.77 ( d, 1H, J = 9.0 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz, CD OD)

3 δ 35.8, 40.4, 43.9, 68.2, 79.3, 101.7, 117.0, 124.6, 1

25.2, 125.5, 140.1, 146.4, 150.2, 155.7, 160.6, 167.7, 173.5.

HRMS (ESI Calcd for [M+H]⁺, 415.0899, Found, 415.0933.

[0044] 例 2 :化合物 13の合成

[化 6]

[0045] (A)化合物 9の合成

エチレングリコーノレ（1 mL, 18 mmol)とべンジノレブロミド（2.1 mL, 18 mmol)を 2 mol /L水酸化ナトリウム水溶液 10 mLとテトラヒドロフラン 5 mLに溶解し、 80 °Cで加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I キサン = 2 / 1)で反応の進行を確認した後、反応溶液を酢酸ェチルで振り取り、水層を 4 mol/L塩酸にて酸性にした。水層を酢酸ェチルで振り取り、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n キサン = 1 / 4 - 1 / 2 - 1 / 1)にて精製し、化合物 9 (液体)を得た (970 mg, 36 %)。

^JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 2.00 (br, 1H), 3.58—3.63 (m, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 4.

3

5 Hz), 4.57 (s, 2H), 7.28-7.38 (m, 5H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 60.9, 71.0, 72.6, 127.1, 127.3, 127.8, 137.6.

3

MS (EI+) 152, M⁺

[0046] (B)化合物 10の合成

ジメチルスルホキシド（2.7 mL, 38 mmol)を— 78 °Cで 2 mol/L二塩化ォキサリル（ジクロロメタン溶液） 20 mLに加えた。 5分撹拌した後、化合物 9 (1.1 g, 3.8 mmol)と 1 m Lのジメチルスルホキシドのジクロロメタン溶液を一 78 °Cで滴下し 30分撹拌した。その後、 10 mLのトリメチルァミンを加えた。室温に戻した後反応溶液に水を加えて、有機溶媒層を分離し 1 mol/L塩酸、 0.5w/w%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗つた。無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル I _n—へキサン = 1 / 4— 1 / 2) にて精製して、化合物 10 (液体）を得た（300 mg, 53 %)。

1H-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 4.11 (d, 2Η, J = 0.8 Hz), 4.64 (s, 2H), 7.28-7.39 (m,

3

5H), 9.73 (t, 1H, J = 0.8 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 73.1, 74.9, 127.6, 127.7, 128.2, 136.6, 199.9.

3

MS (EI+) 150, M⁺

[0047] (C)化合物 11の合成

化合物 10 (120 mg, 0.8 mmol)を 30 mLのテトラヒドロフランに溶解し、 180 mmol/L 硫酸 3.3 mL (0.6 mmol)をカ卩ぇ室温で数分撹拌した。 2—シァノー 6—ァミノべンゾチァゾール（110 mg, 0.6 mmol) と水素化ホウ素ナトリウム（23 mg, 0.6 mmol)を 30 mLのテトラヒドロフランに溶力しこれをカ卩え、室温で撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I _n—へキサン = 2 I 1)で反応が進んでいることを確認し反応溶液に精製水をカ卩えた後、飽和食塩水を加えテトラヒドロフラン層と分離した。水層を酢酸ェチルで抽出しテトラヒドロフラン層と合わせ、この有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 1 / 4—

1 I 2)で精製し、化合物 11 (黄色固体)を得た（70 mg, 38 %)。

^JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 3.36—3.44 (m, 2H), 3.75 (t, 2H, J = 5.1 Hz), 4.57-4.

3

63 (m, 3H), 6.89 (dd, 1H, J = 2.4, 9.0 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.28-7.39 (m, 5H), 7.92 (d, 1H, J = 9.0 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 43.3, 67.9, 73.2, 100.0, 113.8, 117.1, 125.3, 127.7,

3

127.9, 128.4, 129.6, 137.6, 138.6, 144.7, 148.9.

HRMS (ESO Calcd for [M— H]—, 308.0858, Found, 308.0816.

[0048] (D)化合物 12の合成

化合物 11 (30 mg, 0.1 mL)を 2 mLのジクロロメタン〖こ溶解し、トリフルォロ酢酸を 15 mLカ卩え、 60 °Cでー晚加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（酢酸ェチル I n キサン = 2 / 1)で原料の消失を確認した後、トルエンと共沸して溶媒を除去した。残渣を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル I n—へキサン = 1 /3— 1 /1 3 / 1)で精製した後、分取 HPLC (溶出液 A =水/ 0.1%トリフルォロ酢酸、溶出液 B = 80%ァセトニトリル I 20%水 I 0.1%トリフルォロ酢酸、 A / B = 80 / 20— 20 / 80 (20分》で精製し、化合物 12 (黄色固体)を得た（9 mg, 41 %)。

1H-NMR (300 MHz, CD CN) δ 3.25 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.69 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 7

3

.01 (dd, 1H, J = 2.3, 9.1 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 9.1 Hz). 1³C-NMR (75 MHz, CD CN) δ 46.5, 60.7, 100.6, 115.0, 118.1, 125.9, 130.0, 139.

3

9, 145.1, 150.9.

HRMS (ESI") Calcd for [M— H]—, 218.0388, Found, 218.0429.

[0049] (E)化合物 13の合成

D システィン塩酸塩 ·一水和物（18 mg, 0.1 mmol)をアルゴンで脱気した精製水に溶かし、 0.5 mol/L炭酸カリウム水溶液で pHを 8とした D システィン溶液を調製した。化合物 12 (9 mg, 40 μ mol)をアルゴンで脱気したメタノール 10 mLに溶解し、 D —システィン溶液を加えた。アルゴン置換し、遮光して室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、残った水層を酢酸ェチルで抽出、飽和食塩水で洗い減圧濃縮した。残渣を分取 HPLC (溶出液 A =水/ 0.1%トリフルォロ酢酸、溶出液 B = 80%ァセトニトリル I 20%水 I 0.1%トリフルォロ酢酸、 A / B = 80 / 20— 20 / 80 (20分））で精製し、化合物 13を得た (13 mg, 99 %)。

1H-NMR (300 MHz, CD CN) δ 3.26 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.64—3.74 (m, 4H), 5.34 (t

3

, 1H, J = 9.3 Hz), 6.94 (dd, 1H, J = 2.3, 9.0 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 9.0 Hz).

¹³C-NMR (75 MHz, CD CN) δ 35.4, 47.1, 60.5, 78.7, 102.8, 117.0, 125.5, 139.5,

3

146.6, 148.7, 155.7, 166.7, 171.5.

HRMS (ESI Calcd for [M+H]⁺, 324.0477, Found, 324.0450.

[0050] 例 3 :化合物 8と種々の活性酸素種との反応

pH 7.7、 0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液にて化合物 8の溶液 (最終濃度 12 mol/ L、共溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有)を調製して試験に使用した。調製した溶液を以下の条件：

(a)パーォキシナイトライトを終濃度 6 mol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 1分間撹拌

(b)過酸化水素を終濃度 1 mmol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 1分間撹拌

(c)二酸ィ匕カリウムを終濃度 1 mmol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 5分間撹拌

(d)過酸ィ匕水素及び過塩素酸鉄 (Π)をそれぞれ終濃度 lmmol/L、 360 mol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 1分間撹拌

(e)次亜塩素酸ナトリウムを終濃度 6 mol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 1分間撹拌 (DNOC-13 (一酸化窒素放出剤：同仁ィ匕学研究所製)を終濃度 1 mmol/Lとなるよう添加し、 25°Cにて 15分間撹拌

で処理した。

[0051] 次、で、それぞれ反応液に硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L 、 2.6 mmol/Lとなるように加え、最後に最終濃度 40 g / mLのホタルルシフェラーゼを加え発光スペクトルを測定することで、（a)パーォキシナイトライト、（b)過酸ィ匕水素、（ c)一重項酸素、（d)ヒドロキシルラジカル、（e)次亜塩素酸イオン、（1)一酸化窒素との反応性を比較した。測定の装置は F-4500 (日立）を用いた。結果を図 1に示す。化合物 8はパーォキシナイトライト、ヒドロキシルラジカル及び次亜塩素酸イオンと反応して強く発光したが、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素とはほとんど反応せず発光スベクトルに変化が観察されな力つた。従って、化合物 8はパーォキシナイトライト、ヒド口キシルラジカル及び次亜塩素酸イオンなどの酸ィ匕力の強い活性酸素種のみを特異的に認識する生物発光プローブであることが確認された。

[0052] 例 4 :化合物 8と次亜塩素酸イオンとの反応における次亜塩素酸イオン濃度依存性 pH 7.7、 0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液に化合物 8 (最終濃度 12 μ mol/L,補助溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有)を溶解した後、次亜塩素酸ナトリウムを最終濃度 1.87 μ mol/L, 3.74 μ mol/L, 6.2 μ mol/L, 9.34 μ mol/L, 12.4 mol/Lとなるようにそれぞれ添加し、 25 °Cにて 1分間撹拌した。次に硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L, 2.6 mmol/Lとなるように加え、 615 nmにおける発光の測定を開始した。 30秒後に最終濃度 20 μ _§ / mLとなるようにホタルルシフェラーゼを加え、その時の初期発光強度を次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットした。測定の装置は F-4500 (日立）を用いた。

結果を図 2に示す。次亜塩素酸ナトリウム濃度依存的に発光強度が増力!]しており、化合物 8を用いて定量的に次亜塩素酸イオン濃度が測定可能なことが示された。

[0053] 例 5 : HRP I過酸化水素系での化合物 8の発光

(A)発光スペクトルの測定

pH 7.7、 0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液に化合物 8 (最終濃度 12 μ mol/L,共溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有)を溶解し、 HRPを最終濃度 0.2 mol/Lとなるように加えた後で、過酸化水素を 3 mol/Lとなるように加え室温にてピペッティングした。次に硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L、 2.6 mmol/Lとなるように加え、最後に最終濃度 40 ^ g / mLホタルルシフェラーゼをカ卩ぇ測定した。さらに、 pH 7.7、 0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液に化合物 8 (最終濃度 12 μ mol/L,共溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解した溶液に、前記と同量の HRPのみを添カ卩したサンプル、過酸ィ匕水素のみを添カ卩したサンプル、および双方ともに添加していないサンプルを調整し、硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L 、 2.6 mmol/Lとなるようにカ卩えた後、これらにそれぞれ最終濃度 40 ^ g / mLホタルルシフェラーゼをカ卩ぇ測定した。測定の装置は F-4500 (日立）を用いた。

結果を図 3に示す。化合物 8は、 HRPと過酸ィ匕水素が共に存在するときのみ、大きな発光スペクトル変化を示した。これ〖こより HRP/過酸ィ匕水素系の高い酸ィ匕活性を有する活性酸素種についても測定が可能なことが示された。

[0054] (B)発光強度の過酸化水素に対する濃度依存性

pH 7.7、 0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液に化合物 8 (最終濃度 12 μ mol/L,共溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有)を溶解し、 HRPを最終濃度 0.2 mol/Lとなるように加えた後で、過酸化水素を最終濃度 0.12 μ mol/L, 0.36 μ mol/L, 0.6 μ

L、 1.2 μ mol/L, 1.8 μ mol/L, 2.4 μ mol/L, 3.6 mol/Lとなるようにそれぞれ添カロして、室温にてピペッティングした。次に硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L, 2.6 mmol/Lとなるように加え、 615 nmにおける発光の測定を開始した。 30 秒後に最終濃度 20 μ g / mLホタルルシフェラーゼを加え、その時の初期発光強度を過酸ィ匕水素の濃度に対してプロットした。測定の装置は F-4500 (日立）を用いた。結果を図 4に示す。過酸ィ匕水素濃度依存的に発光強度が増カロしていることから、化合物 8とルシフェラーゼ反応を組み合わせることにより過酸ィヒ水素濃度を定量的に測定できることが示された。

[0055] (C)発光強度の HRPに対する濃度依存性

pH 7.7, 0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液に化合物 8 (最終濃度 12 mol/L、共溶媒として 0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解し、 HRPを最終濃度 0.05 nmol/L、 0.1 nmol/L、 0.3 nmol/L、 0.5 nmol/L、 0.75 nmol/L (100 unit I mg)となるように加えた後で、過酸化水素を最終濃度 1 mmol/Lとなるようにそれぞれ添加して、室温にて 10分間撹拌した。次に硫酸マグネシウム、 ATPをそれぞれ最終濃度 5 mmol/L, 2.6 mmol/ Lとなるようにカ卩え、 615 nmにおける発光の測定を開始した。 30秒後に最終濃度 20 μ g / mLホタルルシフェラーゼをカ卩え、その時の初期発光強度を HRPの濃度に対してプロットした。測定は 2回行ない、その平均値をグラフに示した。測定の装置は F-4 500 (日立）を用いた。

結果を図 5に示す。 HRP濃度依存的に発光強度が増カロしていることから、化合物 8 とルシフェラーゼ反応を組み合わせることにより HRP濃度を定量的に測定できることが示された。

[0056] 例 6 :化合物 13の発光スペクトル

発光の測定は pH 7.7、 30 mmol/L N- 2-ヒドロキシェチルピペラジン- N'-2-エタンスルホン酸（HEPES)緩衝液に 5 mmol/L硫酸マグネシウム、 2.6 mmol/L ATP、 3.5 m mol/Lジチオスレィトール（DTT)、 1.5 mmol/L CoA、 40 g / mlホタルルシフェラーゼとなるようにそれぞれ試薬を溶解させておいて、最後に最終濃度が 12 μ mol/L

(共溶媒として 0.2%ジメチルスルホキシド含有）になるように化合物 13をカ卩えた。測定の装置は F-4500 (日立）を用いた。

結果を図 6に示す。化合物 13は化合物 8と活性酸素との反応生成物である。この化合物 13がルシフヱラーゼの基質となって反応し、発光することが確認された。

[0057] 例 7 HRPZ過酸化水素系での化合物 8の発光

例 5では発光を蛍光測定装置 F-4500 (日立)を用いて検出したが、発光測定装置 P erkin- Elmer Envision 2103 Multilabel readerを用いて再度、 HRPZ過酸化水素系での化合物 8の発光測定を実施した。

(A)発光強度の過酸化水素に対する濃度依存性

キュベット中に 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH 7.7)を用意し 12 mol/Lの化合物 8 (最終濃度）を加え、そこに過酸化水素（最終濃度 0 /z mol/L O.Oll μ mol/L 、 0.043 μ mol/L, 0.065 μ mol/L, 0.11 μ mol/L, 0.22 μ mol/L, 0.43 μ mol/L, 0.6 5 ^ mol/ 1.1 μ mol/L, 2.2 ^ mol/L, 4.3 μ mol/L, 6.5 mol/L、過酸化水素溶液の濃度は ε 240 = 43.6 M^-cm"¹を用いて算出した）、 HRP (最終濃度 86 nU/mL) を添加しィ匕合物 8と 10分反応させた。その後、プレートの各ゥエルに 0.1 mol/Lナトリゥムリン酸緩衝液（pH 7.7、 5 mmol/L硫酸マグネシウムおよび 300 ng/mLホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度)を分注し、該ゥエルに対し先のキュベット中から最終濃度 1.8 mol/L (反応開始時の化合物 8の濃度として）となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後 5秒後に 2.6 mmol/L ATP (最終濃度）を添カロし、添加後の 5秒間の発光量を積算し、過酸ィ匕水素の濃度に対してプロットした。 HR Pとの反応は 37 ° Cで行い、発光の測定は室温にて行った。結果を図 7に示す。発光測定装置を用いた場合にも過酸化水素濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物 8とルシフェラーゼを組み合わせることにより過酸ィ匕水素濃度を定量的に測定できることが示された。

(B)発光強度の HRPに対する濃度依存性

キュベット中に 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH 7.7)を用意し 12 mol/Lの化合物 8 (最終濃度）を加え、そこに過酸化水素（最終濃度 100 /z mol/L) HRP (最終濃度 0 nU/mL、 0.086 nU/mL、 0.13 nU/mL、 0.22 nU/mL、 0.43 nU/mL、 0.86 nU/m L、 1.3 nU/mLゝ 2.2 nU/mLゝ HRPの濃度は ε 403 = 102000 M^-cm"¹を用いて算出した。）を添加しィ匕合物 8と 10分反応させた。その後、プレートの各ゥエルに 0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、 5 mmol/L硫酸マグネシウムおよび 300 ng/mLホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ゥエルに対し先のキュベット中から最終濃度 1.8 μ mol/L (反応開始時の化合物 8の濃度として）となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後 5秒後に 2.6 mmol/L ATP (最終濃度 )を添加し、添加後の 5秒間の発光量を積算し、 HRPの濃度に対してプロットした。 H RPとの反応は 37 ° Cで行い、発光の測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite (IWAKI)を用いて Perkin- Elmer Envision 2103 Multilabel readerで行った。結果を図 8に示す。発光測定装置を用いた場合にも HRP濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物 8とルシフェラーゼを組み合わせることにより HRP濃度を定量的に測定できることが示された。

[0059] 例 8 化合物 8の発光強度の各種活性酸素種に対する濃度依存性

キュベット中に 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH 7.7)を用意し 12 μ mol/Lの化合物 8 (最終濃度)を加えた。ここに、次亜塩素酸イオンとの反応性を観察する場合は、最終濃度が 0 μ mol/L, 0.19 μ mol/L, 0.37 μ mol/L, 0.62 ^ mol/ 1.9 μ mol/L 、 3.7 μ mol/L, 6.2 μ mol/L, 9.4 μ mol/L, 12.4 μ mol/Lになるように次亜塩素酸ナトリウムを添加し、パーォキシナイトライトとの反応性を観察する場合は、最終濃度が 0 μ mol/L, 0.24 μ mol/L, 0.40 μ mol/L, 0.60 ^ mol/L, 1.2 ^ mol/L, 2.4 ^ mol /L、4.0 ^ mol/L, 6.0 mol/Lになるように硝酸ナトリウム溶液を添カ卩し、ヒドロキシルラジカルとの反応性を観察する場合は、最終濃度 1 mmol/Lの過酸ィ匕水素に対して過塩素酸鉄を最終濃度 0 μ mol/L, 4 μ mol/L, 8 μ mol/L, 12 μ mol/L, 20 μ mo 1/L、40 ^ mol/L, 80 ^ mol/L, 120 ^ mol/L, 160 mol/Lになるように添カロした。化合物 8と各種活性酸素種を反応させた後、プレートに 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、 5 mmol/L硫酸マグネシウムおよび 300 ng/mLホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ゥエルに対し先のキュベット中から最終濃度 1.8 mol/L (反応開始時の化合物 8の濃度として）となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後 5秒後に 2.6 mmol/L ATP (最終濃度）を添加し、添加後の 5秒間の発光量を積算し、各活性酸素種の濃度に対してプロットした。測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite (IWAKI)を用いて Perkin- Elmer Envisio n 2103 Multilabel readerで行った。結果を図 9、図 10、図 11〖こ示す。いずれの活性酸素種についても化合物 8を用いて定量的に検出できることが確認された。

[0060] 例 9 HRPと ALPの同時検出

化合物 8と自製したアルカリフォスファターゼ (ALP)検出発光プローブ Luphos (Toya , Y. et. al" Bulletin of the Chemical Society of Japan, 65, pp.2604— 2610, 1992)とを用いて、 HRPと ALPの同時活性検出を行った。

キュベット中に 30 mmol/L HEPES緩衝液（pH 7.7)を用意し化合物 8と Luphosをそれぞれ 12 μ mol/L (最終濃度)加え、そこに HRPと ALPを、 HRP濃度が 0 nU/mLのとき ALP濃度 0 μ U/mL、 HRP濃度が 0.13 nU/mLのときALP濃度2.2 μ U/mL、 HRP濃度が 0.22 nU/mLのときALP濃度5.4 μ U/mL、 HRP濃度が 0.43 nU/mLのとき ALP濃度 11 μ U/mL、 HRP濃度が 0.86 nU/mLのとき ALP濃度 22 μ U/mL、 HRP濃度が 1.3 nU/mLのとき ALP濃度 54 μ U/mL、 HRP濃度が 2.2 nU/mLのとき ALP濃度 110 μ U/ mL (いずれも最終濃度）になるように添加し 10分反応させた。過酸化水素濃度は、 10 0 mol/L (最終濃度）である。その後、プレートの各ゥエルに 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、 5 mmol/L硫酸マグネシウムおよび 300 ng/mLホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度)を分注し、該ゥエルに対し先のキュベット中から最終濃度 1.8 mol/L (反応開始時の化合物 8及び Luphosの濃度として）となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後 5秒後に 2.6 mmol/L ATP (最終濃度）を添カ卩した。添加後の 10秒間の発光量を測定した。 HRPと ALPの反応は 37 ° じで行い、発光の測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite (IWAKI)を用いて Perkin- Elmer Envision 2103 Multilabel readerで行った。フィルタ一として 615 n m/8.5 nmと 545 nm/7 nm (Perkin- Elmer)を使用し、解析においては以下の行列式を用いた。

[数 1]

F 、F はそれぞれのフィルターを用いたときの実測値、 κ 、 κ 、 κ 、 κ

615 545 615X 615Y 545Χ 545Υ はそれぞれのフィルターを用いた時のホタルルシフェリンとヒドロキシェチルアミノルシフェリンの発光の透過度で κ = 0.062、 κ = 0.028、 κ = 0.0041、 κ =

545Χ 615X 545Υ 615Y

0.072を用いた。 X(Luphos)は Luphosを用いた時の 10秒間の積算発光強度、 Y (ィ匕合物 8)は化合物 8を用いた時の 10秒間の積算発光強度である。この式を解いて得られた発光量をそれぞれ HRP、 ALPの濃度に対してプロットした結果を図 12、図 13に示す。 HRPと ALPの同時検出系においても、化合物 8を用いて HRPを、 Luphosを用いて ALPをそれぞれ定量的に検出できることが確認された。

産業上の利用可能性

上記一般式 (I)で表される化合物又はその塩は、ルシフラーゼの基質としての性質を有しているものの、基質となって反応しても無発光性である力一方、ヒドロキシラジカルやパーォキシナイトライト、次亜塩素酸イオンなどの極めて酸ィ匕力の強い活性酸素種と接触して脱ァリールイ匕を起こして上記一般式 (II)で表される化合物又はその塩を生じる。該上記一般式 (II)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を保持しつつ、かつ基質となって反応すると発光性の化合物を生じることから、ヒドロキシラジカルやパーォキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及び H RP/過酸ィ匕水素系などの極めて酸ィ匕力の強ヽ活性酸素種と一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドァ-オン、及び一重項酸素などの活性酸素種を区別して測定する活性酸素測定試薬として極めて有用である。

Claims

請求の範囲下記の一般式 (I) :

[化 1]

[式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C ル基、又は下記の式 (Α) :

[化 2]

〔式中、 X¹は— N(R³)(R⁴) (式中、 R³及び R⁴はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有して、てもよ、C アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、 C アルコキシ基、スルファ-ル

1-6 1-6

基又はアルキルスルファ-ル基で表される基を示し; X²はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 3個の一価の置換基を示し; Yは- 0-又は- S-を示し; nは 1〜6 の整数を示す〕で表される基を示すが、 R¹及び R²の少なくとも一つは式 (A)で表される基を示す]で表される化合物又はその塩。

[2] R¹及び R²がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、

1-6

又は式 (A)〔式中、 X¹が— N(R³)(R⁴) (式中、 R³及び R⁴がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、又は C アルコキシ基

1-6 1-6

を示し、 X²がベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個な、し 3個の一価の置換基を示し、 Yカ 0-を示し、 nが 1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、 R¹及び R²の少なくとも一つは式 (A)で表される基である請求項 1に記載の化合物又はその塩。

[3] R¹が水素原子であり、 R²が式 (A)〔式中、 X¹は NHを示し、 X²は水素原子を示し、 Yは

2

- 0-を示し、 nは 2を示す〕である請求項 1又は 2に記載の化合物又はその塩。

[4] 請求項 1な!、し 3の!、ずれ力 1項に記載の化合物又はその塩力なるルシフラーゼ

[5] 下記の一般式 (II) :

[化 3]

1-6 キル基、又は— (CH ) —Ζ—Η (式中、 Ζは- 0-又は- S-を示し; mは 1〜6の整数を示

2 m

る基を示す〕で表される化合物又はその塩。

[6] R¹¹及び R¹²がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、

1-6

又は— (CH ) —Z— H (式中、 Zは- 0-を示し; mは 1〜6の整数を示す）で表される基

2 m

を示すが、 R¹¹及び R¹²の少なくとも一つは— (CH ) —Z—Hで表される基である請求項

2 m

5に記載の化合物又はその塩。

[7] R¹¹が水素原子であり、 R¹²が— (CH ) — Z— H (式中、 Zは- 0-を示し; mは 1〜6の整数

2 m

を示す)である請求項 5又は 6に記載の化合物又はその塩。

[8] R¹¹が水素原子であり、 R¹²がー (CH )— OHである請求項 5ないし 7のいずれ力 1項に

2 2

記載の化合物又はその塩。

[9] 請求項 5な!、し 8の!、ずれ力 1項に記載の化合物又はその塩力なるルシフラーゼ

[10] 請求項 1な!、し 3の、ずれ力 1項に記載の化合物又はその塩を含む活性酸素測定用

[11] 活性酸素の測定方法であって、下記の工程：

(A)請求項 1に記載の一般式 (I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び (B)上記工程 (A)で生成した請求項 5に記載の一般式 (II)で表される化合物又はその塩をルシファラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する工程

を含む方法。

請求項 9に記載の活性酸素測定用試薬とルシフェラーゼとを要素として含む活性酸素測定用キット。