JPH01502431A - アミノルシフェリン誘導体、その製造方法、及び酵素活性測定への適用 - Google Patents

アミノルシフェリン誘導体、その製造方法、及び酵素活性測定への適用

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JPH01502431A JP63501138A JP50113888A JPH01502431A JP H01502431 A JPH01502431 A JP H01502431A JP 63501138 A JP63501138 A JP 63501138A JP 50113888 A JP50113888 A JP 50113888A JP H01502431 A JPH01502431 A JP H01502431A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノルシフェリン誘導体、その製 造方法、及び酵素活性測定への適用 本発明はアミノルシフェリン誘導体、その製造方法、及び酵素活性測定へのその 用途に関する。
例えば生物学的物質の酵素活性を測定する一般的分析方法では、酵素の助けによ って放出基を解離することのできる蛍光原性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｇｉｃ）基質ま たは色原性（ｃｈｒｏ＋ｓｏｇｅｎｉｃ）基質が用いこのような放出基は例えば 染料である。インジケータ反応の過程で発色する染料は測光法によって測定する ことができる。
従って、その濃度を測定して、得られたデータから酵素活性を演えきすることが できる、「酵素分析方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ）　Ｊフェルラグ　ケミ−（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ）１〜１１巻 、ワインハイム　ベルグシュトラーゼ（１９８４）　、エッチ。
ニー、ベルグマイヤ−（Ｈ，Ｕ、　Ｂｅｒｇａ＋ｅｙｅｒ）　ｌｉ集を参照のこ と。
濃度を測光法によって測定可能な、このような放出基の例として、次の基が挙げ られる。
上記の蛍光原性基質を用いる場合には、放出基を測光法に測定することができる 。蛍光原性基質の放出基の例として、次の基を挙げることができる： 公知の基質を用いて、１回のテストにつき約５ｎｇまでの酵素濃度をそれぞれ決 定または測定することができる。この場合に、これは酵素活性（Ｕ）°と呼ばれ る。比活性（Ｌｌ／＋ｎｇ）から酵素量を算出することができる。
酵素活性（ＩＪ）はμ＋＊ｏｌ／分として定義され、主として２５℃で測定する 。前記酵素活性は触媒活性とも呼ばれ、Ｋａｌａｌ　（Ｋａｔ、　＝＋ｗｏｌ／ ｓ）としてＳｌ単位によって表現される。触媒濃度（触媒活性／量）はＫａｔ／ ｌ　として表現される。
本発明では、新規な基質を提供する。この基質を用いると、酵素活性を測定する ための前記分析方法の感度を以外にも高めることができる０例えば１回のテスト につき、約１０〜１１００ｆまでの酵素濃度を測定することができる。このこと は、検出限界が下げられたことを意味する。感度は当然被検酵素と使用酵素から それぞれ解離または放出しうろことが、本発明によって提供する全ての酵素に共 通している： 従って、前記アミノルシフェリンは最初に述べた放出基を表す、放出されたアミ ノルシフェリンはごく低濃度であっても発光学的に検出可能である。このために 、ホタルのホチナス　ビラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）またはホ タルのホチナス　ピラチオフタマス（Ｐｈｏｔｉｎｎｓ　ｐｌａｔｈｉｏｐｈｔ ｈａｌａｍｕｓ）の酵素ルシフェラーゼまたは他の種のルシフェラーゼまたは化 学的もしくは遺伝的に変性したルシフェラーゼと前記アミノルシフェリンとをＡ 　Ｔ　Ｐ　＋　ＭｇＣ１ｚの存在下で反応させる。前記反応の過程でフォトンが 放出される、すなわちホタル　ホチナス　ビラリスの酵素との６０５ｒ＋＋ｓに おける反応の過程及びホタル　ホチナス　ピラチオフタマスの酵素との５４９も しくは５７０ｎｍにおける、すなわちそれぞれ使用するりシフニリン／ルシフェ ラーゼ系に対応する波長における反応の過程においてフォトンが放出される。
酵素がホタルの背側器官から生ずる場合には５４９ｎｍにおける発光が生じ、酵 素の腹側器官から生ずる場合には、５７０ｎ−における発光が生ずる。
上記発光は生物発光である０発光する光を測光法によって測定する。
さらに詳細に関しては、下記の文献を参照のこと。
ケイ、ウルツ（Ｋ、Ｗｕｌｆｆ）、　「ルミツメトリー（Ｌｕｍｉｎｏ　ｍｅｔ ｒｙ）　Ｊ酵素分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ）＋第１巻（編集者：エッチ、ニー、ベルブマイヤー）　３４０− ３６８頁。
フェルラグ　ケミ−（ワインハイム　ベルグシュトラーセ）（１９８３）及びジ ャーナル　オブ　ディ　アメリカン　ケミカルソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　８８巻 、　２０１５〜２０１８頁、　１９６６　イー、エッチ、ホワイト（Ｅ、Ｈ。
Ｗｈｉｔｅ）等による。
得られたデータによって、被検酵素の濃度を算出することができる。「種々な生 物発光」による前記測定の正確な実施ならびに計算は実施例でさらに詳しく説明 する。
それ故、本発明は一般式： 〔式中、Ｒ１はＬ−アミノ酸ラジカルまたは、１０Ｌアミノ酸成分までを有する ペプチドラジカルであり、共通の保護基によって任意に保護されているアミドま たは遊離アミノ基として末端カルボキシル基を介して結合している、またはＲ１ は単糖または三糖ラジカルを表す〕 で示されるＤ−アミ九フェリンに関する。
本発明のアミノ酸ラジカルはカルボキシル基を介して、アミドとしてルシフェリ ンのアミノ基に結合する。アミノ酸はＬ−立体配置を有する。アミノ基はカルボ キシル基のα−Ｉに結合する。
アミノ酸ラジカルＲ１は例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ イシン、プロリン及びフェニルアラニンのような非極性基を有するアミノ酸、例 えばチロシンミ　トリプトファン、セリン、スレオニン、システィン、シスチン 、メチオニン、ヒドロキシプロリン、アロスレオニン、ホモセリン及びホモシス ティンのような非イオン化極性基を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸とグ ルタミン酸のような酸性アミノ酸（及びそのアミドも、すなわちアスパラアミド とグルタミンも）、及び例えばリシン、アルギニン及びヒスチジンのような塩基 性アミノ酸のような一般アミノ酸から誘導される。
Ｒ′ラジカルをヒドロキシリシン、α−アミノアジピン酸、オルニシン、シトル リン、ホモアルギニン、α、ε−ジアミノピメリン酸、Ｔ−アミノ酪酸及びフェ ニルセリンから誘導することができる。
アミノ酸ラジカルは次の一般式■に対応するものであることが好ましい： Ｒ３は水素原子または一般的な保護基を表し、Ｒ１は−Ｈ，−ＣＨ３，−ＣＨ２ ０Ｈ，−ＣＨ（Ｏ）ｌ）Ｃ）１３．−ＣＨ（ＣＨｓ）ｚ。
−ＣＨｚＣＨ（ＣＢりｚ、−ＣＨ（ＣＴｏ）ＣＨｚＣＨ３，−ＣＨｚＣＯＯＨ， −ＣＨｚＣＯＮＨｚ。
−ＣＨｚＣＨｚＣＯＯＨ，−ＣＨｚＣｌｈＣＯＮＨｚ、　−ＣＨｚＣＨｚＣＨｚ ＣＨｚＮＨ□−ＣＨｚＣＪａＯＨ，−ＣＨｚＣＪｓ。
−ＣＨｘＣＨｚＣＨｚ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨｚ、　ｏｒ−ＣＨｚＣＨｔ− ＳＣＨｘである〕プロリンとヒドロキシプロリンラジカルも好ましいラジカル一 般的な保護基をアミノ保護基として用いることができる。
アセチル、ベンゾイル、トシル、ベンゾイルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキ シカルボニル、スクシニル、及びメトキシスクシニル保護基が好ましい。
本発明の化合物の一般式■のペプチドラジカルは上記アミノ酸のいずれからか成 り、このようなアミノ酸成分を１０個まで含む、ペプチドラジ九ルは末端カルボ キシル基を介して塩基性ルシフェリン単位に接合する。
前記ペプチドラジカルは５アミノ酪酸分を含むラジカルが好ましい、２アミノ酪 酸分を含むペプチドラジカルが最も好ましい。
本発明の化合物の一般式ＩのＲ１ラジカルが単糖ラジカルを表す場合、前記ラジ カルは例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、リボース、デ スオキシリボース、フラクトース及びラクトースのような、−ａ的なヘキソース またはペントースから誘導される。前記ラジカルはＣＩを介して塩基性ルシフェ リン単位に結合する。
三糖ラジカルは前記塘ラジカルから成る。
本発明は一般式■のＤ−アミノルシフェリン誘導体の製造方法に関する。前記方 法は、 （ａ）　Ｒ’がＬ−アミノ酸またはペプチドラジカルを表す、一般式Ｉの化合物 を製造するために、それぞれ上記で定義したようなアミノ酸またとペプチドラジ カルに対応するＮ−保護アミノ酸またはペプチドラジカルを弐ｍの２−シアノー ６−アミ一般式■の化合物を得、 このようにして得られた一般弐■の化合物をＤ−システィンと反応させて、一般 式■の化合物を得、通常の方法で任意にアミノ保護基を解離する、またはカルボ キシル基が式Ｖａの一般的な保護基によって保護されているＤ−アミノルシフェ リンと反応させて、 〔式中、Ｒ４はカルボキシル基の一般的保護基を表す〕る場合には）を一般的な やり方で除去する、または（ｂ）Ｒ’が単糖ラジカルまたは三糖ラジカルを表す 一般式■の化合物を製造するためには、カルボキシル基が対応するＢｒ’単糖ま たはＢｒ’二糖三糖って保護されている式Ｖａのアミノルシフェリンと反応させ てから、カルボキシル基の保護基を解離する 符表千１−５０２４３１（４） ことを特徴とする。
化合物■を三塩化リンの存在下で反応させると、化合物■が得られる。この反応 は例えばＴＨＦ、　ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような、反応に不活性な無水゛溶媒 中で、特にピリジン中で低温、特に−５°Ｃ〜−２０℃において、攪拌しながら 実施するのが好ましい、前記反応はホスホ−アゾ方法と呼ばれる。
前記方法を実施するために、Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドを反応に 不活性な溶媒、好ましくは無水ピリジン、ＴＨＦ、　Ｄ？ｔＦまたは［１Ｍ５Ｏ 中に溶解する。クロロギ酸イソブチルエステルと第三アミン、好ましくはトリエ チルアミンとを前記溶液に加える０次に化合物■を前記溶液に加える。
アミノルシフェリンを製造するための化合物■とＤ−システィンとの反応は、Ｎ ｚを飽和させた水中で実施するのが好ましい。
式Ｖａの保護されたアミノルシフェリンから出発する場合には、アミノ酸（また はペプチド）をホスホ−アゾ方法かまたは混合無水物方法によって同様に導入す ることができる０反応条件は上記条件に対応する。
アミノ保護基は一般的な方法で、例えばメタノール中炭素担体つきパラジウムを 用いた触媒水素化によってまたはヒドラジン分解（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｌｙｓｉ ｓ）によってまたは緩和な酸処理によって除去することができる。
カルボキシル基の保護基としてはメチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル及びフ ェナシル基を用いるのが好ましい、これらは一般的な方法で、例えば塩基性触媒 加水分解によって除去することができる。ベンジルエステルも炭素担体付きパラ ジウムと反応することができる。カルボキシル基はメチルエステルに転化するこ とによって保護するのが好ましい、前記エステルは好ましくはカルボキシルエス テラーゼとの処理によって遊離酸とメタノールに解離する。
従って、アミノ酸（またはペプチド）は２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾー ル（ＩＩＩ）またはアミノルシフェリンに２方法によって、すなわちホスホ−ア ゾ方法と混合無水物方法によって結合することができる。
前記反応は次の反応式Ｉと■によってさらに説明される。
反息式土 及玉δ（ｌ アミノルシフェリンは文献に述べられている方法に従って下記のように製造する ことができる： （■）　（■） （Ｖ） ■：市販されている。
■と■：カッ゛ン（Ｋａｔｚ）のジエイ　アム　ム　ツク　（Ｊ、へ鋼。
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）　７３巻、　４００７　；■とＶ：ホワイト（Ｗｈ　ｉ　 ｔｅ）等のジェイ、アム、ケム、ツク。
８８巻、　（１９６６）、　２０１５゜遊離アミノルシフェリンならびにアミノ 酸誘導体（Ｒ’は上記の意味を有する）がＤ−立体配置を有することを強調すべ きである。
−ｍ式Ｉ　（Ｒ’は単糖または三糖ラジカルである）の本発明の化合物はアミノ ルシフェリンからも出発することができる。アミノルシフェリンのカルボキシル 基を例えばメチル化によって保護する。この保護された化合物を次にＢｒ’−単 糖またはＢｒ’−三糖と反応させる０次にメチル基をカルボキシル基エステラー ゼによって開裂する。
本発明の化合物を用いてかなり種々な酵素の酵素活性を測定することができる。
これらの酵素は本発明の化合物からアミノルシフェリンＶを放出できなければな らない、すなわちＲ１ラジカルを解離できなければならない。従って、前記酵素 はアミノルシフェリンとアミノ酸ラジカルとの間のアミド結合を開裂しなければ ならない。
酵素がアミド結合とアミノ酸とに関して多少特異的であることは当業者に周知で ある。従って、幾つかの酵素は例えば非常に特異的なアミノ酸のアミド結合を開 裂することができるにすある一定酵素の測定を望むならば、次のように進めるこ とが適当である： 前記酵素が特定のアミノ酸のアミド結合を開裂するにすぎないことが分っている 場合には、酵素が特に反応する前記アミノ酸単位をＲ１ラジカルとして有するよ うな本発明のアミノルシフェリンを用いる。
本発明によって用いる測光試験法を下記でさらに説明する：前記測光試験には下 記の組成を有する「生物発光カクテル」を用いる： ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルとベラＭｇＣ１ｚ　６　ｍｍｏｌ／ Ｉ ＡＴＰ　６　ｓｍｏｌ／Ｉ ＥＤＴＡ　０．５＋ｍｏｌ／Ｉ ＤＴＴ　（ジチオスレイトール）　８０　ｕ　ｗ＋ｏｌ／１ルシフェラーゼ（ホ タル　ホチナス　ビラリスまたはプーチオーフ　−マス亡たは　の　の　の　ｌ ｅｅ全量：　０．４　ｄ　；　ｐＨ７，７５未知酵素濃度を測定するためには、 校正曲線を作成することが必要である。このためには、アミノルシフェリンの種 々な既知濃度の溶液をある一定の既知量の生物発光カクテルと反応させる。この 場合に１０秒間の光パルス数を測定する。
従って、光パルス数はアミノルシフェリン濃度と相関する。
未知の酵素活性の測定中に、−ｉ式Ｉの本発明の化合物からある一定量のアミノ ルシフェリンが放出される。前記アミノルシフェリン放出量は測定法によって測 定することができる。これによって放出されたアミノルシフェリン量を知り、こ れから酵素活性を算出することができる。
前記測光法を実施するために、被検サンプル０．１ｄに生物発光カクテル０．１ ４ｄを混合し、次に光パルスを１０秒間測定する。
次に、種々な酵素活性を測定するための種々な試験法を説明例えば糞便中のキモ トリプシン酵素活性とキモトリプシン様酵素活性との測定。
本発明の化合物として、Ｎｃｋ−アセチル−し−フェニル−アラニル−アミノル シフェリンを用いる。
次の被検サンプル（試験サンプル）を用意する：緩衝液０．９０ｍ　（）リエタ ノールアミン０．１ｍｏｌ／ｌ。
ＣａＣ１ｚ　０．０２ｓｏｌ／１　；　ｐＨ＝７．８）基質ｔ８１’ｆｆ１（Ｎ ｏ−アセチル−し−フェニルアラニルアミノルシフェリン；　１　ｗｏｏｌ／１ 水中） これを２５°Ｃにおいて５分間インキュベートする０次にキモトリプシン含有溶 液０．０５ｄを加える。
正確に１分間後に、試験サンプル０．１成を採取し、上記生物発光カクテル０． ４　ｄを混合する。次に光パルスを１０秒間測定する。
前記測定において、Ｎ′″−アセチル−し−フェニルアラニン−アミノルシフェ リンの代りに同量のＮｏ−アセチル−し−チロシル−アミノ−ルシフェリンを用 いることができる。
この試験によって、１０ｆｇ、までのキモトリプシン量を測定することができる 。試験濃度（試験中のインキュベーション時間、反応温度）を変えることによっ て、検出限界をさらに下げることができる。
圀りｍ１ トリプシン酵素活性とトリプシン様酵素活性との測定。
本発明の化合物として、Ｎｏ−アセチル−し−アルギニル−アミノルシフェリン を用いる。
試験サンプルは次の組成を有する： 緩衝液０．７５ｄ　（）リエタノールアミン０．２ｍｏｌ／１゜ＣａＣ１ｚ　Ｏ ，０２ｓｏｌ／１　；ｐＨ＝７．８）基質溶液０．ｄ５Ｉｄ（Ｎｏ−アセチル− し−アルギニルアミノルシフェリン　１＋＋ｍｏｌ／１．水中） ２５°Ｃにおいて５分間インキュベートする０次にトリプトシン溶液０．３−を 加える。
正確に１分間後に、試験サンプル０．１ｄを採取し、生物発光カクテル０．４　 ｄを混合し、上記のような測光試験を実施する。
前記試験によって、１０ｆｇまでのトリプシン量を測定することができる。この 場合にも、試験条件を変えることによって、検出限界をさらに下げることができ る。
前記試験でＮｃｋ−アセチル−し−アルギニル−アミノルシフェリンの代りにＮ Ｏ−アセチル−し−リシル−アミノルシフェリンを用いることができる。
前記試験はカリクレインの測定にも用いることができる。
エラスターゼ活性とエラスターゼ様活性の測定。
本発明の化合物としてＨＣｋ−アセチル−し−アラニル−アミノルシフェリンを 用いる。
試験サンプルは次の組成を有する： 緩衝液０．８５ｄ　（）リエタノールアミン０．２ｍｏｌ／１　：　ｐＨ＝７． ８）基質溶液０．０５ｄ　（Ｎ”−アセチル−Ｌ−アラニル−アミノルシフェリ ン１ｍａ＋ｏｌ／１．水中） ２５°Ｃにおいて５分間インキュベートする０次にエラスターゼ含有溶液０．１ ０ｊｄを加える。
１分間後に、試験サンプル０．１　ｄを採取し、上記生物発光カクテル０．４　 ｍを混合する０次に光パルスを１０秒間測定する。
前記試験ば１０ｆｇまでのエラスターゼ量を測定することができる。
製造■ −ｉ式１　（Ｒ”はアミノ酸ラジカルまたはペプチドラジカルを表す）のアミノ ルシフェリン誘導体の製造。
ａ）弐■の２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾールから出発するホスホ−アゾ 一方法による製造。
２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾール（Ｉ［［）　１７．５ｍｇ（０，１ｍ ｍｏｌ）を−１０″Ｃにおいて無水ピリジンに溶解し、撹拌しながら三塩化リン ５　ｊｌＲ（０，０５６ｓ＋ｍｏｌ）と反応させる。−１０℃において１時間後 、水冷ピリジン中保護アミノ酸またはペプチド０．１１ｓｎｏｌの懸濁液を反応 サンプルに加える。緩慢に室温（ＲＴ）にまで温度上昇させて、室温で２０時間 攪拌する０次にピリジンを真空留去し、残渣をブタノール（水で飽和）に入れ、 ｙ過し、最後に濃縮する。残渣を少量の水に加え、）ＩＰＬＣによって精製する （溶液Ａ）。
Ｄ−システィン０．１１ｓｎｏｌをＮ２飽和水中に溶解する。　ｐＨを７．５に 調節し、Ｎ、でパージする０次に、予め窒素で飽和した溶液Ａを加え、光を遮断 して窒素下、室温において２時間攪拌する。
次に溶液を濃縮で、水／エタノール（５０１５０）中に入れる。任意にアミノ保 護基を一般的な方法で除去した後、ＨＰＬＣによって精製する。
ｂ）式、■の２−シアノ−６−ベンゾチアゾールから出発する混合無水物方法に よる製造。
無水テトラヒドロフラン（ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）中に溶解したアミノ酸または ペプチド０．１３５＋ｍｏｌを一１５°Ｃに溶解する０次に、この溶液にトリエ チルアミン１４ｐｊ！　（０，１ｍｍｏｌ）とクロロギ酸イソブチルエステル１ ：Ｍ！　（０，１＋ｓ＋＋＋ｏｌ）を加え、−１５°Ｃにおいて３０分間攪拌す る０次にジメチルホルムアミド（予め冷却）に２−シアノ−４−アミノ−ベンゾ チアゾール（Ｉ［Ｉ　）　１７．５＋＋＋ｇ（０，１ｍｍｏｌ）を加え、緩慢に 室温にまで温度上昇させ、さらに１晩撹拌する（溶液Ｂ）。
Ｎ、飽和水にＤ−システィン０．１＋＋ａ＋ｏｌを溶解し、ｐＨ７，５に調節し 、さらにＮ２でパージする。これに予めＮ２を飽和した溶液Ｂを加え、光を遮断 して窒素下、室温において２時間攪拌する。次に溶液を濃縮し、水／エタノール （５０１５０）中に入れ、任意にアミノ保護基を分離し、ＨＰＬＣによって精製 する。
Ｃ）　式（Ｖ）のアミノルシフェリンから出発するホスホ−アゾ方法による製造 。
保護されたアミノルシフェリン（Ｖａ）（好ましくはメチルエステル）　０．０ ５ａ＋ｍｏｌを一１Ｏ℃において無水ピリジンに溶解し、攪拌しながら一１０° Ｃにおける１時間後、水冷ピリジン中に懸濁した、保護されたアミノ酸またはペ プチド０．０５５ｍｍｏｌを反応サンプルに加える。ゆっくりと室温にまで温度 上昇させ、室温において２０時間攪拌する。
回転蒸発器においてピリジンを真空除去し、残渣を水で飽和したブタノール中に 入れる。次に、これを炉遇し、濃縮する。
残渣を少量の水に入れ、カルボキシル基の保護基（メチルエステルの場合にはカ ルボキシル・エステラーゼによって）ならびにアミノ基の保護基（存在する場合 には）を除去し、ＨＰＬＣによって精製する。
ｄ）弐Ｖのアミノルシフェリンから出発する混合無水物法による製造。
無水テトラヒドロフラン（Ｄ？ＩＰ、ＤＭＳＯ）に溶解した、保護されたアミノ 酸またはペプチド０．０１３５ｍｍｏｌを一１５゛Ｃに冷却する。この溶液に次 にトリエチルアミン１．４　ｐｉ　Ｃ０，０１ｔａｔａｏ１）　とクロロギ酸イ ソブチルエステル１３　ｐｉ　（０，ＯＬ＋ａｍｏｌ）を加え、−１５°Ｃにお いて３０分間攪拌する。
ノルジフェリン０．０１１１ＲＩＯ１を加える。これをゆっ（りと室温にまで温 度上昇させ、１晩攪拌する。沈殿した塩酸トリエチルアンモニウムをが別し、Ｉ 液を濃縮し、少量の水に入れ、カルボキシル基の保護基ならびにアミノ基の保護 基（存在する場合には）を除去し、最後にＨＰＬＣによって精製する。
下記のアミノルシフェリンを上記製造法によって製造する二Ｎ０−アセ　ルーし 一フェニルアーニルーアミノールシフェ１−ン。
ＣｚｚＨｚｔｓＮａＳｚＯａ　ＣｍＨ−４６８，５６）としての分析値：ＣＨＮ 計算値　５６．３％　４．３％　１２．０％実測値　５６．２％　４．３％　１ ２．１％アミノ酸含１１： 計算値　３５．２１％ 実測値　３４．１５％ ＩＪＱ−アセチル−し−アルギニルーアミノールシフエ１ンＣｌ９Ｈ２３Ｎ？５ ２０４　（ｍ＋＋＝４７７．５８）としての分析値：ＣＨＮ 計算値　４７．７％　４．８％　２０．５％実測値　４７．５％　４．７％　２ ０．４％アミノ酸含量： 計算値　３６．４３％ 実測値　３５．７０％ Ｃ２□Ｈ８゜Ｎａ５ｚＯｓ　（ｍｗ＝４８４．５７）としての分析値：ＣＨＮ 計算値　５４．５％　４．１％　１１．６％実測イ直　５４．６％　４．０％　 １１．６％アミノ酸含量： 計算値　４４．７８％ 実測値　４３．５４％ Ｎｏ−アセチル−し　１シルーアミノールシフエ１ンＣＩｑＨｔｓＮｓＳｚＯａ 　（ｅａｗ＝４４９．５６）としての分析値；ｃ　ＨＮ 計算値　５０．７％　５．１％　１５．６％実測値　５０．６％　５．０％　１ ５６８％アミノ酸含Ｉ： 計算値　３２．４８％ 実測値　、　３１．８３％ Ｎｏ−アセチル−し−アラニルアミノルシフェリンＣｌ６Ｈ１６’Ｎ−３０４（ ｍ−＝３６０．３９）としての分析値：ｃ　ＨＮ 計算値　５３．３％　４．５％　１５．６％実測値　５３．２％　４．５％　１ ５．６％アミノ酸含量： 計算値　２４．７０％ 実測値　２３．９６％ 上記製造方法によって、次の化合物を製造した：ミノルシフエリ７　ＣＣｔａＨ ｓｚＮｍＳｚＯｓ　（ｍｗ＝６２４．７５））プロリル−し−バリル−アミノル シフェリンＣＣｓｚＨａｒＮｔＳｔＯｑ（ｍｗ　＝　７３１　、８５）　） Ｌ−プロリル−し−フェニルアラニルアミノルシフェリンｅ）　Ｎ（ｋ−アセチ ル−Ｌ−アルニル−Ｌ−アラニル−アラニルアミノルシフェリンＣＣｚ＋Ｈｔｈ ＮｂＳｚＯｂ　（ｍｗ＝５２２．６１））ｆ）　Ｎｃｋ−アセチル−Ｌ−フェニ ルアラニル−Ｌ−グリシルアミノルシフェリン（ＣｚＪｚＪｓＳｚｓＯ（静＝　 ５２５．６１））ｇ）　Ｎｃｋ−アセチル−し−グリシル−し−アルギニルアミ ノルシフェリン（Ｃｚ＋ＨｚＪ＠５ｔＯｓ　（畦＝５３４．６２））ｈ）　ピロ グルタミル−し−グリシル−し−アルギニルアミノルシフェリン（Ｃｚ４Ｈｚｑ ＮｑＳｚＯｈ　（ａ１ｗ＝６０３．６８））ｉ）　ピログルタミル−し−フェニ ルアラニル−Ｌ−ロイシルアミノルシフェリン（Ｃ！＋ＨユａＮｂｓｚｏｈ　（ ｌ＋ｗ＝６５０．７８））ｊ）　スクシニル−し−アラニル−し−アラニル−し −プロリル−メチオニルアミノルシフェリン（Ｃ３＋ＨｚＪｔＳｓＯ＊（ｏ＋ｗ ＝７０７．８７））ｋ）　Ｎｏ−ベンゾイル−し−プロリル−し−フェニルアラ ニル−し−アルギニルアミノルシフェリン（ＣｉｓＨａ＋ＮｖｈＯｈ（＋＋＋ｗ ＝７８３．９３）） １）　Ｎｏ−トシル−グリシル−し−プロリル−し−リシルアミノルシフェリン （Ｃｉ＋１ｈＪｉＳｓ（ｌｒ　（ｍｗ＝７０１．８７’））ｍ）　Ｎ’−ベンゾ イル−Ｂ−アラニル−グリシル−し−アルギニルアミノルシフェリン＜ＣｚｑＨ ｚｚＮｑＳｚＯｈ　（ｇ＋ｗ＝６６７．７７））ｎ）　Ｎｏ−カルボベンゾキシ −し−バリル−グリシル−し−アルギニルアミノルシフェリン（ＣｚＪｉｓＮｑ ＳｔＯｓ　（＋１ｗ−７４０，８４））ｏ）Ｎ’−）シル−グリシル−し−プロ リル−し−アルギニルアミノルシフェリン（Ｃ３＋Ｈ＊Ｊｗｈ（１＋　（ａｗ＝ ７４３．８９））ａ）　、　ｇ）及びｈ）に上述したアミノルシフェリン誘導体 は混合無水物法によって、製造するのが好ましい。
次表は本発明のアミノルシフェリン誘導体によって測定できる酵素を示す。基質 として用いることのできるアミノルシフェリン誘導体を開裂して、遊離アミノル シフェリンならびに対応するアミノ酸または対応するペプチドをそれぞれ生ずる ことのできる酵素を挙げる。
アミノルシフ上１ン　、 ａ）　組織カリクレインＥ　Ｃ３，４，２１，３５ｂ）　白血球エラスターゼＥ 　Ｃ３，４，２１，３７０）　白血球エラスターゼＥ　Ｃ３，４，２１，３７ｄ ）　キモトリプシンＥ　Ｃ３，４，２１，１ｅ）　膵臓エラスターゼＥ　Ｃ３， ４，２１，３６ｆ）　パパインＥ　Ｃ３，４，２２，２ｇ）＋１）　プラスミン Ｅ　Ｃ３，４，２１，７ｈ）＋ｍ）　ウロキナーゼＥ　Ｃ３，４，２１，６１） 　チオールプロテイナーゼ： カテプシンＢ　Ｅ　Ｃ３，４，２２，１カテプシンＬ　Ｅ　Ｃ３，４，２２，１ ５カテプシンＨＥ　Ｃ３，４，２２，１６フイシンＥ　Ｃ３，４，２２，３゜ ブロモアラインＥ　Ｃ３，４，２２，４ｊ）　白血球エラスターゼＥ　Ｃ３，４ ，２１，３７カテプシンＧ　Ｅ　Ｃ３，４，２１，２０ｋ）　プラスマカリクレ インＥ　Ｃ３，４，２１，３４ｎ）　）リプシンＥ　Ｃ３，４，２１，４０）　 ）ロンビンＥ　Ｃ３，４，２１，５上記１（ＰＬＣ精製方法では、移動相として ａ）　水中酢酸アンモニウム０．０５ｍｏｌ／１（ｐＨ＝８．０）ｂ）　メタノ ール からａ：ｂの容量比４０％：６０％から５０％：５０％まで例えＬｉ　ａ　：ｂ ＝４２％＝５８％で成る混合物を用いる。
国際調査報告 国際調査報告

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一般式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中Ｒ１はＬ−アミノ酸ラジカルま たは１０個までのＬ−アミノ酸単位を含むペプチドラジカルを表し、アミドとし て（末端）カルボキシル基を介して結合し、その遊離アミノ基が任意に通常の保 護基によって保護されている、またはＲ１は単糖ラジカルもしくは二糖ラジカル を意味する〕で示されるＤ−アミノルシフェリン。
  2. （２）アミノ酸ラジカルまたはアミノ酸単位が天然に生ずるアミノ酸から誘導さ れたものである請求の範囲第１項記載の化合物。
  3. （３）Ｒ１ラジカルが式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、Ｒ３は水素原子または一般 的な保護基を表し、Ｒ２は−Ｈ，−ＣＨ３，−ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ ３，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２，−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ ＣＨ３，−ＣＨ２ＣＯＯＨ，−ＣＨ２ＣＯＮＨ２，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，− ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ ４ＯＨ，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学 式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ ２ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２または−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３を表す；または一 般式（ＩＩ）の基は対応するプロリン・ラジカルもしくはビドロキシプロリンラ ジカルである〕に相当する請求の範囲第１項記載の化合物。
  4. （４）Ｒ２が−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５・−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）− ＮＨ２，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２または−Ｃ Ｈ３・である請求の範囲第３項記載の化合物。
  5. （５）Ｒ１が請求の範囲第２項〜第４項記載のアミノ酸単位５個までを含むペプ チドラジカルを意味する請求の範囲第１項記載の一般式（Ｉ）の化合物。
  6. （６）Ｒ１ラジカルの遊離アミノ基が一般的な保護基によって保護されている請 求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の一般式（Ｉ）の化合物。
  7. （７）保護基がアセチル、ベンゾイル、トシル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ −ブチルオキシカルボニル、スクシニルまたはメトキシスクシニル基であること を特徴とする請求の範囲第６項記載の一般式（Ｉ）の化合物。
  8. （８）（ａ）Ｒ１が前記定義したＬ−アミノ酸またはペプチドを意味する一般式 （Ｉ）の化合物を製造するために、前記で定義したアミノ酸ラジカルまたはペプ チドラジカルに相当するＮ−保護アミノ酸もしくはペプチドを式（ＩＩＩ）：▲ 数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）で示される２−シアノ−６−アミノ ベンゾチアゾールど反応させて、一般式（ＩＶ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）〔式中、Ｒ１は上記の意味を有する 〕 で示される化合物を得、 得られた一般式（ＩＶ）の化合物をＤ−システインと反応させて一般式（Ｉ）の 化合物を得、任意にアミノ保護基を通常の方法で解離する、またはカルボキシル 基が一般的な保護基によって保護されている、式（Ｖａ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖａ）〔Ｒ４は一般的なカルボキシル保護 基を意味する〕で示される化合物と反応させて、カルボキシル保護基ならびに任 意にアミノ保護基を通常の方法で除去する；または（ｂ）Ｒ１が単糖ラジカルま たは二糖ラジカルを意味する化合物を製造するために、カルボキシル基が保護さ れている式（Ｖａ）のアミノルシフェリンを対応するＢｒ１単糖または二糖と反 応させて、次にカルボキシル基の保護基を解離することを特徴とする請求の範囲 第１項〜第７項のいずれかに記載の一般式（Ｉ）のＤ−アミノルシフェリンの製 造方法。
  9. （９）請求の範囲第１項〜第７項に記載の一般式（Ｉ）の化合物ならびにＤ−ア ミノルシフェリンの酵素活性測定試験への利用。
  10. （１０）請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のアミノルシフェリンを少 なくとも１種類含むことを特徴とする、酵素活性測定用組成物。
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