ES2577607T3 - Nuevos sensores ultrasensibles basados en células y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un sensor basado en células que comprende: a) Una línea celular 5 hemopoyética con exocitosis regulada de gránulos secretores. b) Granzima B como proteasa reportera transfectada en la línea celular de (a) que se almacena en los gránulos secretores de dicha línea celular. c) Un receptor de superficie heterólogo transfectado usado como un modulador de la exocitosis regulada de los gránulos secretores de la línea celular de (a). d) Un sustrato específico para detección de la proteasa reportera almacenada en los gránulos secretores o un medio de ELISA para detectar la proteasa reportera.
Description
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proteasas es su especificidad de sustrato. La relación kcat/Km define una medida de la eficiencia catalítica de un par enzima-sustrato. Se refiere a las propiedades y reacciones de enzima libre y sustrato libre. La especificidad de una enzima es, por lo tanto, una medida de la especificidad de una enzima para sustratos de competición o de enzimas de competición para un único sustrato. Las proteasas se clasifican como endopeptidasas si su secuencia de corte es interna en un sustrato diana o exopeptidasas si necesitan un grupo amino terminal o uno carboxilo terminal para el corte. Las exopeptidasas se clasifican por lo tanto en aminopeptidasas y carboxipeptidasas.
Los gránulos de varias células hemopoyéticas almacenan de forma natural proteasas como las granzimas, proteasas de mastocitos, elastasa, proteinasa 3, metaloproteasas como MMP-8 y MMP-9, catepsinas de serin proteasa como las catepsinas A y G y cisteín catepsinas. Las granzimas y las proteasas de mastocitos pertenecen a la superfamilia quimotripsina de serin proteasas debido a su alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos con serin proteasas ampliamente documentadas; su capacidad para cortar sustratos de serin proteasa sintéticos y su inhibición por inhibidores de serin proteasa típicos. (Véase por ejemplo Smith MJ et al J. Leukoc. Biol. 1996, 60: 555-562). La actividad enzimática de granzimas y proteasas de mastocitos se ha clasificado como de tipo triptasa(escisión después de Arginina o Lisina), de tipo Asp-asa (escisión después de Ácido Aspártico), de tipo quimasa (escisión después de Fenilalanina, Triptófano o Tirosina) y de tipo elastasa (escisión después de Valina, Alanina, Isoleucina, Metionina o Leucina).
Las catepsinas son una clase de proteasas globulares, inicialmente descritas como hidrolasas peptídicas intracelulares, aunque varias catepsinas tienen también funciones extracelulares. Las catepsinas B, C, F, H, L, K, O, S, V, W y X son cisteín proteasas de la familia papaína, y representan la mayor clase y mejor conocida de las catepsinas. Su función principalmente es como proteasas intracelulares que median en la mayoría de la proteólisis terminal no específica en el ambiente ácido de los lisosomas (véase, por ejemplo, Turk V, Turk B y Turk D. EMBO J 2001; 20: 4629-33). Las catepsinas A y G son ambas serin proteasas, pero la catepsina G es una endopeptidasa mientras que la catepsina A es una carboxipeptidasa. Las catepsinas D y E son proteasas aspárticas. Las catepsinas se sintetizan como proenzimas inactivas y se procesan para convertirse en enzimas maduras y activas.
Granzimas: las granzimas son serin proteasas relacionadas estructuralmente que difieren en su especificidad de sustrato. Se expresan de forma natural en linfocitos citotóxicos tales como linfocitos T CD8 positivos y linfocitos citolíticos naturales, pero también en testículo. Hasta la fecha, se han descrito cinco granzimas diferentes en seres humanos: granzimas A, B, H, K y M (véase por ejemplo Grossman, WJ. et al. Curr. Opin. Immunol. (2003) 15, 544552). En ratones, pueden encontrarse ortólogos claros de cuatro de estas granzimas (A, B, K y M), y la granzima C parece ser el ortólogo murino más probable de granzima H. El genoma murino codifica varias granzimas adicionales (D, E, F, G, L y N), de las que D, E, F y G se expresan por linfocitos citotóxicos; L parece ser un pseudogén y N se expresa en el testículo.
Modulador de la exocitosis regulada, se refiere a un compuesto, una molécula o una composición que es capaz de alterar una o más rutas de transducción de la señal corriente abajo implicadas en el proceso de exocitosis regulada. Esta alteración en la actividad abarca inhibición (es decir, el compuesto, la molécula o la composición es un “inhibidor” de exocitosis), así como estimulación, inducción o potenciación (es decir, el compuesto, la molécula o la composición es un “estimulador”, “inductor” o “potenciador” de exocitosis). Estos moduladores se identifican utilizando ensayos in vitro y/o in vivo. En estos ensayos, se usan controles para permitir comparaciones entre muestras.
Descubrimiento de fármacos, proceso por el que se descubren y/o diseñan fármacos. Como se usa en el presente documento el descubrimiento de fármacos comprende la identificación de fármacos y las modificaciones para afinidad, efectos secundarios, biodisponibilidad, pero también ensayar el efecto de un fármaco previamente lanzado al mercado en una indicación terapéutica nueva, un proceso también conocido como redefinición.
Gen, es la unidad física y funcional fundamental de la herencia. En términos bioquímicos, un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos localizada en una posición particular en un cromosoma particular que codifica un producto funcional específico (es decir, una proteína o molécula de ARN). Como se usa en el presente documento, un gen está compuesto no solamente de secuencias codificantes, sino que puede comprender regiones de ADN adyacentes implicadas en el control de la transcripción de las secuencias codificantes (por ejemplo, promotores, potenciadores) e intrones. Las secuencias que se localizan 5’ de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas 5’. Las secuencias que se localizan 3’ o cadena abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas 3’. El término “gen” abarca tanto ADNc como formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “intrones”, “regiones intermedias” o “secuencias intermedias”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcribe a ARN nuclear heterogéneo (ARNnh); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se retiran o “cortan” del transcrito nuclear o primario; por lo tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm actúa durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de aminoácidos en un polipéptido naciente.
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“Introducido de forma estable” o “transformado de forma estable” o “transducido de forma estable” o “transfectado de forma estable” o “electroporado de forma estable”, se refiere a la fracción de células con el ADN ajeno deseable integrado en su genoma. Dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solamente una fracción de células puede integrar el ADN ajeno en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y puromicina. Puede introducirse ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un producto de traducción detectable o puede introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido mediante selección farmacológica (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
Receptor de superficie, se refiere a moléculas que aparecen en la superficie de las células, interaccionan con el ambiente extracelular y transmiten o transducen la información con respecto al ambiente intracelularmente de manera que se module, en última instancia, la transcripción de promotores específicos dando como resultado la transcripción de genes específicos. Son ejemplos de receptores de superficie receptores tirosina quinasa, receptores de canales iónicos, receptores de citocinas, receptores de quimiocinas o un receptor acoplado a proteína G (GPCR), tales como receptores peptídicos quimioatrayentes, receptores neuropeptídicos, receptores lumínicos, receptores de neurotransmisores o receptores de hormonas polipeptídicas.
Receptores acoplados a proteína G (GPCR), también conocidos como receptores de siete dominios transmembrana, receptores 7TM, receptores heptahelicoidales, y receptores ligados a proteína G (GPLR), son una gran familia de proteínas de receptores transmembrana caracterizados por siete dominios transmembrana con un extremo N extracelular y un extremo C citoplasmático. La unión del ligando al GPCR promueve cambios conformacionales que conducen a un acoplamiento de proteínas G pequeñas, el inicio de rutas de transducción de señales y en última instancia, de respuestas celulares. Los ligandos que se unen y activan estos receptores incluyen compuestos sensibles a la luz, olores, feromonas, hormonas y neurotransmisores, y varían en tamaño de moléculas pequeñas a péptidos a proteínas grandes. Solamente se encuentran receptores acoplados a proteína G en eucariotas superiores, incluyendo levaduras, plantas y, especialmente, animales. Los receptores acoplados a proteína G están implicados en muchas enfermedades, pero también son la diana de aproximadamente la mitad de todos los fármacos medicinales modernos.
Los GPCR actúan mediante un mecanismo molecular similar. La activación del GPCR por estímulos extracelulares provoca cambios conformacionales en el receptor, lo que da como resultado el acoplamiento intermedio y la activación de proteínas de unión a GTP (proteínas G). Las proteínas G son de naturaleza heterotrimérica y están compuestas de las subunidades alfa (α), beta (β) y gamma (γ) codificadas por genes distintos. La subunidad alfa es responsable de la unión de GDP y GTP. La unión de un ligando con un GPCR da como resultado una transición de la subunidad alfa (α) de una forma unida a GDP a una forma unida a GTP y conduce a la activación del heterotrímero mediante disociación del α-GTP del dímero Gβγ. Tanto α-GTP como el dímero Gβγ regulan las actividades de una diversidad de efectores que transmiten la señal al interior celular mediante la producción de moléculas de segundos mensajeros (por ejemplo, calcio, AMPc, etc.). Hay al menos 17 genes Galfa (Gα), y los miembros de proteínas G pueden agruparse en cuatro clases principales denominadas Gαi/0, Gαq/11, Gas y Gα12/13. (Véase, por ejemplo, Preininger AM y Hamm HE. Sci. STKE 2004, re3 y Cabrera-Vera TM et al. Endocr Rev. Dic 2003; 24(6): 765-81). Como se usa en el presente documento, un GPCR comprende receptores acoplados a Gαi/0, Gαq/11, Gas y Gα12/13.
Receptor con actividad enzimática tirosina quinasa intrínseca (RTK), son receptores de superficie celular de alta afinidad para muchos factores de crecimiento polipeptídicos, citocinas y hormonas. De los noventa genes de tirosina quinasa únicos identificados en el genoma humano, 58 codifican proteínas receptoras tirosina quinasa. La mayoría de las RTK son receptores de una única subunidad, pero algunos, por ejemplo, el receptor de insulina, existen como complejos multiméricos. Cada monómero tiene un único dominio transmembrana, una región N terminal extracelular y una región C terminal intracelular. La región N terminal extracelular está compuesta de un dominio proteico muy grande que se une con ligandos extracelulares (por ejemplo, un factor de crecimiento particular). La región C terminal intracelular está comprendida por dominios reguladores y dominios responsables de la actividad quinasa de estos receptores, que específicamente fosforilan aminoácidos de tirosina.
Los receptores quiméricos, se basan en un receptor artificial que combina partes de un receptor con partes de otro receptor, fragmentos proteicos, marcadores y cualquier combinación de los mismos, incluyendo tanto dominios completos como partes de los mismos. En general, una proteína quimérica o “proteína de fusión” es un polipéptido que comprende al menos una parte del producto proteico deseado fusionado con al menos otra secuencia peptídica o con otro polipéptido.
Receptor que porta ITAM: un motivo inmunorreceptor de activación basado en tirosina (ITAM) es una secuencia conservada de cuatro aminoácidos que se repite dos veces en las colas citoplasmáticas de ciertas proteínas de superficie celular del sistema inmunitario. El motivo contiene una tirosina separada de una leucina o isoleucina por
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antibiótico. Aunque podría usarse la transfección transitoria en los métodos de la presente invención son células preferidas las hechas estables por selección de antibióticos.
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1. Dibujo del concepto general de la presente invención, usando una serin proteasa como reportero almacenado en gránulos, el receptor de IgE como el receptor de superficie celular que modula la exocitosis de los gránulos y un sustrato basado en FRET escindido por el reportero proteasa almacenado en los gránulos secretado para la detección. El tratamiento de las células con un antígeno multimérico (por ejemplo, un alérgeno) que se une con un IgE unido al receptor de afinidad, induce la liberación de la proteasa almacenada en los gránulos y dicha proteasa escinde el sustrato para producir un producto final fluorescente. Usando este sustrato específico de la enzima reportera secretada, puede determinarse la interacción del ligando con receptor.
FIGURA 2. Dibujo del concepto general de la presente invención, usando una serin proteasa como reportero almacenado en los gránulos, un GPCR como receptor de superficie celular que modula la exocitosis de los gránulos y un sustrato basado en FRET escindido por el reportero proteasa almacenado en los gránulos secretado para la detección. El tratamiento de las células con un agonista del GPCR induce la liberación de la proteasa almacenada en los gránulos, y dicha proteasa escinde el sustrato para producir un producto final fluorescente y dicha proteasa escinde el zimógeno para producir una enzima activa. Usando un sustrato específico de la enzima reportera secretada, puede determinarse la interacción del ligando con receptor.
FIGURA 3. Estructura general de los vectores plasmídicos representativos de la presente invención. Mapa del vector plasmídico con resistencia a higromicina usado para expresar de forma estable la enzima B bajo el control de un promotor constitutivo fuerte hCMV-MoMLV5’-LTR quimérico (A) o el promotor inducible por tetraciclina (B). Mapa del vector plasmídico con resistencia a neomicina usado para expresar un receptor de superficie funcional, tal como un GPRC, usando el péptido señal de la cadena kappa de la inmunoglobulina de ratón, un marcador cmyc para la detección en superficie con anticuerpo monoclonal anti-cmyc y una secuencia de glucosilación de GPRC viral para la sobreexpresión bajo el control del promotor de MoMLV5’LTR (C) o bajo el control de Promotor Inducible por Tetraciclina (D).
FIGURA 4. Un ejemplo de un ensayo en el que la línea celular RBL-2H3 se transfecta de forma estable tanto con granzima B humana almacenada en gránulos secretores y un receptor muscarínico humano de tipo II marcado con c-myc en N-terminal (CHRM2) bajo el control de un promotor de MoMLV5’LTR y que comprende un péptido señal y una secuencia de glicosilación viral para la expresión eficaz en superficie. (1) El tratamiento con carbacol (un agonista de CHRM2) induce un aumento en la concentración de calcio intracelular (2) que induce la liberación de los gránulos de granzima B secretada (3) que se detecta con 5’FAM-SGIEPDSGVTAMRA, un sustrato de la granzima B basado en FRET (4) usando excitación a 485 nm y emisión a 535 nm. El aumento de la fluorescencia a 535 nm es proporcional a la cantidad de granzima B liberada. Los reporteros secretados pueden detectarse directamente o la señal puede amplificarse por medio de una proenzima como la procaspasa3 humana para la detección aún más sensible del reportero secretado.
FIGURA 5. Dibujo del ensayo de doble cadena realizado con los métodos descritos en la presente invención. Se mezclan dos líneas celulares diferentes (A) y (B), en el mismo recipiente de reacción. La línea celular A expresa una combinación de GPCR1 (modulador de la exocitosis)-proteasa reportera 1 almacenada en los gránulos. El GPCR1 tiene el Ligando 1 como agonista, mientras que la proteasa reportera 1 escinde el sustrato 1 (por ejemplo, un sustrato basado en FRET) que se lee a longitud de onda 1. La línea celular B expresa una combinación de GPCR2 (modulador de exocitosis)- proteasa reportera 2 almacenada en gránulos. El GPCR2 tiene al Ligando 2 como agonista, mientras que la proteasa reportera 2 escinde el sustrato 2 (por ejemplo, un sustrato basado en FRET) que se lee a longitud de onda 2. El tratamiento de una mezcla de células A y B con una mezcla de Ligando 1 y Ligando 2 de los GPCR1 y GPCR2 induce la liberación de las proteasas almacenadas en los gránulos 1 y 2 y podría determinarse el aumento de la fluorescencia a las longitudes de onda 1 y 2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A. Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo sensor basado en células útil para el descubrimiento de fármacos, diagnóstico y determinación de analitos, que comprende una línea celular con exocitosis regulada profesional de gránulos secretores transfectados con granzima B como polipéptido proteasa reportera almacenada en los gránulos secretores regulados de la línea celular con exocitosis regulada profesional, y que tienen un receptor de superficie heterólogo como un modulador de la exocitosis regulada de los gránulos secretores, teniendo dicha proteasa reportera almacenada en los gránulos al menos: una alta resistencia a condiciones ya presentes dentro de los gránulos tales como pH bajo y proteólisis por otras proteasas; actividad enzimática después de la exocitosis; una
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hidrolasas intracelulares, aunque varias catepsinas también tienen funciones extracelulares. Las catepsinas B, C, F, H, L, K, O, S, V, W y X son cisteín proteasas de la familia papaína, y representan la mayor y mejor conocida clase de las catepsinas. Actúan principalmente como proteasas intracelulares que median en la mayoría de la no específica terminal en el ambiente ácido de los lisosomas (véase, por ejemplo, Turk V, Turk B y Turk D. EMBO J 2001; 20: 4629-33). Las catepsinas A y G son ambas serin proteasas, pero la catepsina G es una endopeptidasa mientras que la catepsina A es una carboxipeptidasa. Las catepsinas D y E son proteasas aspárticas. Las catepsinas se sintetizan como proenzimas inactivas y se procesan para convertirse en enzimas maduras y activas. Debido a la función de cisteín catepsinas como proteasas intracelulares en el ambiente ácido de los lisosomas, su pH óptimo es de aproximadamente 5 a 5,5 y al pH fisiológico necesario para la viabilidad y exocitosis del cultivo celular en los métodos de la presente invención, su eficacia catalítica no es la óptima. Por esta razón, las serin proteasas son en general reporteros preferidos para el almacenamiento en los gránulos en los métodos de la presente invención en comparación con cisteína catepsinas. También se sabe en el estado de la técnica que otras proteasas de degradación, incluyendo metaloproteasas, se almacenan en los gránulos y se liberan de células hemopoyéticas tales como neutrófilos, por ejemplo, MMP-8 (colagenasa de neutrófilos) y MMP-9 (gelatinasa de 92 kDa) (véase, por ejemplo, Owen CA y Campbell EJ. J. Leukoc. Biol. (1999) 65, 137-150). No obstante, las serin proteasas de células hemopoyéticas tienen la mayor contribución a la actividad proteolítica liberada de las células preferidas en los métodos de la presente invención, y, por lo tanto, se prefieren serin proteasas frente a metaloproteasas y cisteína catepsinas. Esta mayor contribución a la actividad proteolítica es el resultado tanto de la mayor concentración de serin proteasas en los gránulos como de la mayor actividad catalítica de serin proteasas a pH neutro frente a otras proteasas que también se almacenan en gránulos.
En una realización de la presente invención, podría transfectarse ADN que codifica reporteros para producir una proteína de zimógeno o para producir una enzima activa. Los reporteros de gránulos sintetizados como zimógenos se dirigen a los gránulos secretores en los que se activan mientras que las enzimas activas se dirigen a los gránulos secretores y no necesitan activación. Por ejemplo, las granzimas son zimógenos que se activan por catepsina C dentro de los gránulos por escisión en el dipéptido de activación N terminal para producir una enzima activa. Incluso aunque la granzima B activa constitutiva se dirige correctamente y se almacena dentro de los gránulos, y por lo tanto es útil para los métodos de la presente invención, dicha granzima B activa constitutiva tiene una mayor actividad basal que la granzima B sintetizada como un zimógeno, reduciendo de este modo la señal de fondo del sensor. Otros investigadores han demostrado (véase Isaaz et al. Eur J Immunol 1995; 25(4): 1071-9) que en clones de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) durante la síntesis activa, una cantidad importante de granzimas se secreta de forma constitutiva y hasta un tercio de las granzimas A y B pueden secretarse directamente del CTL mediante la ruta secretora constitutiva, como se muestra por la actividad enzimática de granzima A e inmunotransferencias de granzima B secretada, en las que un tercio de la proteína no consigue adquirir la señal de dirección a gránulos. La secreción constitutiva de las proteínas líticas puede bloquearse tanto por CHX como por brefeldina A (BFA). Aunque la BFA no afecta a la destrucción direccional de dianas reconocidas, anula la destrucción de espectador, lo que indica que la destrucción de espectador surge de proteínas líticas de nueva síntesis, suministradas mediante una vía distinta de gránulos. Por lo tanto, el uso de un zimógeno que es necesario activar dentro del gránulos en lugar de un reportero activo constitutivo, reduce la actividad basal y se produce una línea celular con una mayor relación de señal con respecto al fondo para un sensor más robusto útil para los métodos de la presente invención.
En otra realización de la presente invención, los reporteros útiles para los métodos de la presente invención pueden ser secuencias de origen natural o reporteros con codones optimizados para la alta expresión en líneas celulares útiles. Por ejemplo, la secuencia con codones optimizados de granzima B de caballo se muestra como SEQ ID NO:
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B.4. Promotores para expresión del reportero
La presente invención también comprende promotores adecuados para expresión de reporteros. Los promotores útiles para expresión de reporteros almacenados en los gránulos de la presente invención son promotores adecuados para la expresión de proteínas en células hemopoyéticas, en particular promotores adecuados para expresión media a alta de proteínas. Un promotor con expresión media de proteína produce más de 10 ng de granzima B almacenada en gránulos por millón de células RBL-2H3 mientras que un promotor fuerte produce más de 100 ng de granzima B almacenada en gránulos por millón de células RBL-2H3 cuando se cuantifica por un ELISA específico (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Otra propiedad relevante de los promotores adecuados, es que la expresión de proteínas debe ser estable durante el cultivo. Ciertos promotores heterólogos se regulan negativamente durante el cultivo especialmente en células hemopoyéticas y este proceso se denomina “silenciamiento del promotor”. Los promotores preferidos para los métodos de la presente invención son por lo tanto promotores no silenciables.
En una realización de la presente invención los promotores para expresión del reportero se seleccionan de un grupo que comprende: un promotor quimérico de hCMV y promotor de MoMLV-5’-LTR de SEQ ID NO:10; promotor MoMLV-5’LTR (SEQ ID NO: 3); promotor del factor de elongación 1-alfa (SEQ ID NO:1); promotor de VSR (SEQ ID NO:2) y promotor de timidina quinasa (SEQ ID NO:7). Otros promotores tales como el promotor de citomegalovirus humano, uno de los promotores más fuertes ampliamente usados para transfección de células eucariotas, también es adecuado, pero en las células hemopoyéticas de la presente invención produce al menos 125 veces menos
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TABLA 1. Ejemplos de reporteros almacenados en gránulos usados en los métodos de la presente invención.
- Gen
- Número de Referencia de Genbank Símbolo oficial Cebadores usados para la amplificación
- Serin proteasas de tipo Asp
- Granzima B humana
- NM_004131 GZMB 17, 18
- Granzima B de caballo
- NM_001081881 GZMB 21, 22
- Granzima B de rata
- NM_138517 GZMB 19, 20
- Granzima B bovina
- XM_585453 GZMB 25, 26
- Granzima B de chimpancé
- XM_509879 GZMB 23, 24
- Granzima B de Monodelphis
- XM_001369720 GZMB 33, 34
- Serin proteasas de tipo triptasa
- Granzima A humana
- NM_006144 GZMA 15, 16
- Granzima K humana
- NM_002104 GZMK 29, 30
- Serin proteasas de tipo quimasa
- Granzima H humana
- NM_033423 GZMH 27, 28
- Quimasa humana
- NM_001836 CMA1 85, 86
- Catepsina G humana
- G NM_001911 CTSG 87, 88
- Serin proteasas de tipo elastasa
- Granzima M humana
- NM_005317 GZMM 31, 32
- Elastasa de neutrófilos humana
- NM_001972 ELA2 89, 90
- Proteinasa 3 humana
- NM_002777 PRTN3 81, 82
La siguiente tabla describe un resumen de las líneas celulares usadas en los ejemplos
TABLA 2-. Líneas celulares usadas en ejemplos en los métodos de la presente invención
- Línea Celular
- Número de referencia Fuente OrigenHemopoyético Exocitosis Regulada Profesional
- HEK293
- CRL-1573™ (ATCC) Riñón humano fetal No No
- CHO-K1
- CCL-61™ (ATCC) Ovario de hámster chino No No
- NK-92
- CRL-2407™ (ATCC) Linfoma no Hodgkin maligno humano Sí Sí
- RBL-2H3
- CRL-2256™ (ATCC) Leucemia basófila de rata (cepa Wistar) Sí Sí
- 32D
- CRL-11346™ (ATCC) Médula ósea de ratón Sí Sí
- A-431
- CRL-1555™ (ATCC) Carcinoma epidermoide humano No No
- PC-12
- CRL-1721™ (ATCC) Feocromocitoma de glándula adrenal de rata No Sí
- YT
- ACC 434 (DSMZ) Leucemia de linfocitos T/ NK humana Sí Sí
- Jurkat
- ACC 282 (DSMZ) Leucemia de linfocitos T humana Sí No
La siguiente tabla describe un resumen de los moduladores de la exocitosis utilizados en los ejemplos.
26
TABLA 3-. Ejemplos de receptores de superficie usados como moduladores de la exocitosis en los métodosde la presente invención
- Gen
- Número de referencia de Genbank Símbolo oficial Cebadores usados para amplificación
- GPCR (receptores acoplados a proteína G)
- Receptor de Bradiquina B1 Humano
- N_000710 BDKRB1 35, 36
- Receptor de Adenosina 3 Humano
- NM_001081976 ADORA3 37, 38
- Receptor Alfa Adrenérgico 2A Humano
- NM_000681 ADRA2A 39, 40
- Receptor Beta Adrenérgico 2 Humano
- NM_000024 ADRB2 41, 42
- Receptor de Angiotensina II Humano, tipo 1
- NM_031850 AGTR1 43, 44
- Receptor de Arginina Vasopresina 2 Humano
- NM_000054 AVPR2 45, 46
- Receptor de Quimiocina 1 (motivo C-X3-C) Humano
- NM_001337 CX3CR1 47, 48
- Receptor de Colecistoquinina B Humano
- NM_176875 CCKBR 49, 50
- Receptor Muscarínico Colinérgico 2 Humano
- NM_001006630 CHRM2 53, 54
- Receptor de Hormona Liberadora de Corticotropina 1 Humano
- NM_004382 CRHR1 55, 56
- Receptor de Dopamina D1 Humano
- NM_000794 DRD1 57, 58
- Receptor de Dopamina D2 Humano
- NM_016574 DRD2 59, 60
- Receptor de Endotelina de tipo B Humano
- NM_000115 EDNRB 61, 62
- Receptor de Glutamato, Metabotrópico 4 Humano
- NM_000841 GRM4 67, 68
- Receptor de 5-Hidroxitriptamina/Serotonina 1B Humano
- NM_000863 HTR1B 69, 70
- Receptor de Interleucina 8 Humano
- NM_000634 IL8RA 71, 72
- Receptor de Melanocortina 1 Humano
- NM_002386 MC1R 73, 74
- Receptor Y1 de Neuropéptido Y Humano
- NM_000909 NPY1R 75, 76
- Receptor de Taquiquinina 3 Humano
- NM_001059 TACR3 77, 78
- Receptor de Somatostatina 2 Humano
- NM_001050 SSTR2 79, 80
- Receptores de tirosina quinasa
- Receptor del Factor de crecimiento Epidérmico Humano
- NM_201284 EGFR 83, 84
La siguiente tabla enumera todos los cebadores usados en los ejemplos.
27
Claims (1)
-
imagen1 imagen2
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