JP3618572B2 - Ｄ−システインの測定法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−システインの測定法およびＤ−システインの測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内に存在するアミノ酸は、そのほとんどがＬ−アミノ酸であると考えられていたが、近年、ほ乳類を含めた高等動物に高濃度のＤ−アミノ酸が相次いで見いだされており、その由来や役割に関心が寄せられている。このため、Ｄ−アミノ酸を簡便、短時間かつ高感度に測定する方法を確立することは、バイオテクノロジー、臨床検査、医学等の分野において非常に重要である。
Ｄ−システインは、Ｄ−アミノ酸の一種である。従来、試料中のＤ−システインの測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法などがあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便かつ高感度なＤ−システインの測定法およびＤ−システインの測定用試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、Ｄ−システインとＤ−ルシフェリン前駆体との反応により生成したＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼと反応させることにより、Ｄ−システイン量を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明はＤ−システインの測定法に関する。また、本発明はＤ−システインの測定用試薬に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
１．試料中のＤ−システインの測定法について
本発明における試料中のＤ−システインの測定法は、以下の２工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
（１）第１工程
第１工程では、Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン前駆体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させる。
「Ｄ−ルシフェリン前駆体」とは、Ｄ−システインと反応することによりＤ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させることができる化合物を意味する。Ｄ−ルシフェリン前駆体としては、例えば２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールが使用できる。Ｄ−システインと２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの反応は以下の通り。
【０００７】
【化１】

【０００８】
本発明でいう「Ｄ−ルシフェリン誘導体」とは、Ｄ−ルシフェリンの本質的な構造を有する化合物であり、例えば、Ｄ−ルシフェリンの塩、エステルあるいは配糖体等が挙げられる。配糖体としては、例えば、ルシフェリン−β−Ｄ−ガラクトシド、ルシフェリン−β−Ｄ−グルコシド等が挙げられる。ルシフェリン−β−Ｄ−ガラクトシドは、糖加水分解酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼを作用させることにより、Ｄ−ルシフェリンを生成する。Ｄ−ルシフェリン誘導体がルシフェリン−β−Ｄ−ガラクトシドである場合、本発明のＤ−ルシフェリン前駆体としては、２−シアノ−６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールが使用できる。
【０００９】
試料としては、特に限定されず、Ｄ−システインを含むと思われるもの、例えば、飲食物、医薬、化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、生物学的材料（尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、皮膚・臓器・毛髪等の生体組織、生体からの各種抽出物）、微生物の培養物等が挙げられる。また、上記の試料を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。試料が固形分を含む場合には、該検体液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等等）に懸濁するか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱うことができる。
【００１０】
第１工程を実施する場合、任意の方法が採用し得るが、試料とＤ−ルシフェリン前駆体を含む溶液とを接触させる方法が簡便である。Ｄ−ルシフェリン前駆体を含む溶液は、Ｄ−ルシフェリンの他に、反応促進や試薬の保存性向上のために通常使用される成分、例えば、緩衝剤、キレート剤、塩類、界面活性剤等を含んでいてもよい。該溶液としては、後述するＤ−システインの測定用試薬が使用できる。
試料と、Ｄ−ルシフェリン前駆体を含む溶液との接触条件（混合比、接触温度、接触時間、ｐＨ条件等）は、試料またはＤ−ルシフェリン前駆体の種類、試料の形態等に応じて適宜設定すればよい。
【００１１】
（２）第２工程
第２工程では、生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘導体の量を測定することにより、Ｄ−システイン量を測定する。Ｄ−ルシフェリン量を測定する方法としては、例えば、Ｄ−ルシフェリンと生物発光試薬を反応させて生じた発光量を測定する方法が挙げられる。
生物発光とは、発光基質であるルシフェリンと、酵素であるルシフェラーゼとが関与する発光反応である。昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタル、ヒカリコメツキムシ等）の系では、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下、Ｄ−ルシフェリンと、昆虫ルシフェラーゼとの反応により光が生じる。
昆虫の系を用いる場合、第２工程では、昆虫ルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む生物発光試薬と、第１工程で生成したＤ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を溶液状態で接触させればよい。この時に生じる発光量を測定することにより、Ｄ−ルシフェリン量を求めることができる。発光量は、ルミノメーター、例えばルミテスター Ｃ−１００、Ｋ−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（いずれもキッコーマン社製）、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（アロカ社製）、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０１（ベルトールド社製）により測定することができる。
発光量から、Ｄ−システイン量を算出するには、予め検量線を作成しておくことが望ましい。検量線は、市販のＤ−システインを定量し、水もしくは緩衝液に溶解後適宜希釈したＤ−システイン溶液に、Ｄ−ルシフェリン前駆体、例えば２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを加え、生成したＤ−ルシフェリンを生物発光試薬と反応させ、その発光量を測定することにより作成することが出来る。
【００１２】
以上により、試料中のＤ−システイン量の測定が可能となる。なお、本発明の方法は、遊離の形で存在するＤ−システインの測定法のみならず、Ｄ−システイン誘導体の測定法としても有用である。ここでいう「Ｄ−システイン誘導体」とは、Ｄ−ルシフェリン前駆体と反応することによりＤ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させることができる化合物を意味する。本発明でいう「Ｄ−システイン」の概念には、Ｄ−システイン誘導体も含まれる。
【００１３】
例えば、Ｄ−ルシフェリン前駆体が２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールである場合、Ｄ−システインのカルボキシル基は、第２工程が実施可能であればどのように修飾されていてもよい。この場合、Ｄ−システイン誘導体とは、例えば、Ｎ末端にＤ−システイン残基を有するポリペプチド鎖である。そのようなポリペプチド鎖は、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールと反応することにより、Ｄ−ルシフェリン誘導体（Ｄ−ルシフェリンのカルボキシル基の部分が、ペプチド結合を介してポリペプチド鎖と結合している化合物）を生成することができる。該Ｄ−ルシフェリン誘導体を測定するときは、プロテアーゼ等で処理してＤ−ルシフェリンを遊離させ、これを測定すればよい。
Ｄ−システイン誘導体の測定も可能であることから、本発明は、生体を構成する高分子（例えばタンパク質）中のＤ−システイン量、生体組織（例えば、臓器、皮膚、毛髪）中のＤ−システイン量の測定法として、特に有用である。
【００１４】
３．Ｄ−システインの測定用試薬について
本発明のＤ−システインの測定用試薬は、Ｄ−ルシフェリン前駆体を含むことを特徴とする。Ｄ−ルシフェリン前駆体としては、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−シアノ−６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールなどが挙げられる。該測定用試薬は、Ｄ−ルシフェリン前駆体の他に、反応促進や試薬の保存性向上のために通常使用される成分、例えば、緩衝剤、キレート剤、塩類、界面活性剤等を含んでいてもよい。試薬の形態は溶液状態、凍結状態、乾燥状態のいずれであってもよいが、溶液状態でＤ−システインと反応可能な形態であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の測定用試薬は、Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物発光試薬からなるものであってもよい。この場合、Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物発光試薬とは、分けて保存されていてもよく、また混合状態であってもよい。
本発明の測定用試薬を用いることにより、上記したＤ−システインの測定法を好適に実施することができる。
Ｄ−システインの測定用試薬が２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール溶液であり、かつ生成したＤ−ルシフェリンを測定する方法が、ホタルルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む生物発光試薬を用いる方法である場合、本発明の測定法は、以下のように実施することができる。
まず、第１工程として、Ｄ−システインを含むと思われる試料に、Ｄ−システインの測定用試薬を添加する。Ｄ−システインと２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールと反応し、Ｄ−ルシフェリンが生成する。次いで、第２工程として、試料に生物発光試薬を添加し、生じた発光量をルミノメーターにより測定する。予め作成した検量線により、発光量から試料中のＤ−システイン量を算出する。
【００１６】
【実施例】
以下実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例では、試料として濃度既知のＤ−システイン溶液、Ｄ−システイン量の測定用試薬として２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール溶液を使用した。また、生成したＤ−ルシフェリンの測定法として、ホタルルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む生物発光試薬を用いる方法を採用した。
【００１７】
［２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの合成］
２−シアノ−６−メトキシベンゾチアゾール（シグマ社製）０．４８ ｇと塩化ピリジニウム（和光純薬工業社製）１．０ ｇを混合したものを、窒素ガスを封入した金属製チューブ内に入れ、密閉した。このチューブを２００ ℃で４５分間加熱した。その後、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）の飽和水溶液を加え、ＰＨを７に合わせ、析出した沈澱を濾紙で分離した。得られた沈澱は水で洗った後、減圧乾固させた。このようにして得られた粉末を、１ ｍｌのジクロロメタンに溶解後、シリカゲルカラムに添加し、ジクロロメタンでクロマトを行った。２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの画分は分取した後、エバポレータで濃縮乾固させた。これにより、約０．４ｇの２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを取得した。
【００１８】
［試薬の調製］Ｄ−システイン量を測定するため、以下の試薬を調製した。
（１）Ｄ−システイン量の測定用試薬（２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール溶液）
２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール１ ｍｇを１ ｍｌのエタノールに溶解させた。
（２）０．２ Ｍ炭酸カリウム溶液
（３）活性測定用緩衝液
５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ ７．８）
０．３ Ｍ ＭｇＳＯ_４
（４）ルシフェラーゼ、ＡＴＰ溶液
５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ ７．８）
４０ ｍＭ ＡＴＰ
１０ ｍｇ／ｍｌ ゲンジボタルルシフェラーゼ
（５）試料（Ｄ−システイン溶液）
Ｄ−システイン（和光純薬社製）を純水に溶解させ、各種濃度（５０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）のＤ−システイン溶液を調製した。
【００１９】
［Ｄ−システイン量の測定］
１０マイクロリットルの２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール溶液に、８０μｌの０．２ Ｍ炭酸カリウム溶液と１０μｌのＤ−システイン溶液を加え、３０℃で１０分間反応させた。本反応液１０μｌに活性測定用緩衝液９０μｌを加え、さらにルシフェラーゼ、ＡＴＰ緩衝液１００μｌを添加し、ルミネッセンスリーダー（アロカ社製）で発光量を２０秒間測定した。なお、反応液は必要に応じ活性測定用緩衝液で希釈したうえで、同様の測定を行った。結果を図１に示した。図１の横軸は試料中のＤ−システイン濃度を、縦軸はルミネッセンスリーダーで測定された発光量を示す。
図１より、Ｄ−システイン濃度と発光量とは直線性を有することが明らかである。本発明の測定法および測定用試薬により、精度良くＤ−システイン量を求めることができることが確認された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、簡便かつ高感度なＤ−システインの測定法およびＤ−システインの測定用試薬が提供された。本発明は、試料中に遊離の形で存在するＤ−システインのみならず、Ｄ−システイン誘導体の測定法、例えば生体由来のタンパク質中のＤ−システイン残基の測定法として利用可能である。
【００２１】
本発明はバイオテクノロジー、臨床検査、医学等の分野において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における、試料中のＤ−システイン濃度と発光量との関係を示す図

Claims (6)

1. 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＤ−システインの測定法。
   （１）Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン前駆体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させる第１工程。
   （２）生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘導体の量を測定することにより、Ｄ−システイン量を測定する第２工程。
2. Ｄ−ルシフェリン前駆体が、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールまたは２−シアノ−６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールである、請求項１記載のＤ−システインの測定法。
3. 生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘導体の量を測定する方法が、Ｄ−ルシフェリンまたはその誘導体と、生物発光試薬とを反応させて生じた発光量を測定する方法である、請求項１または２記載のＤ−システインの測定法。
4. 以下の工程を含むことを特徴とするＤ−システインの測定法。
   （１）Ｄ−システインを２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールと反応させて、Ｄ−ルシフェリンを生成させる第１工程。
   （２）生成したＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンと反応させて生じた発光量を測定することにより、Ｄ−システイン量を算出する第２工程。
5. Ｄ−ルシフェリン前駆体を含むことを特徴とする、Ｄ−システインの測定用試薬。
6. Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物発光試薬からなるＤ−システインの測定用試薬。

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