JP5686308B2 - βグルカンの濃度測定方法および濃度測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれるβグルカンの濃度測定方法および濃度測定用キットに関するものであり、詳しくは、生物発光反応を利用したβグルカンの濃度測定方法および濃度測定用キットに関するものである。

βグルカンは、酵母やカビの細胞壁の骨格構成物、多くの担子菌子実体（キノコ）の主要な多糖成分、血液透析に使用する膜等からの溶出成分等としてその存在が知られている物質である。これを測定することによって重篤な感染症である深在性真菌症の早期診断や真菌による医療用具の汚染の検出を行うことができると考えられている。特に真菌は我々同様に真核生物であり、真菌感染治療薬（抗真菌剤）は人体へもある程度のダメージを与えることから、その副作用は抗細菌用の抗生物質よりもはるかに大きく、慎重な投与が必要である。そのために真菌感染をごく初期の段階で発見することが非常に重要であり、感染が拡大する前に治療することで抗真菌剤の投与量を抑え、これによってダメージを著しく軽減することが可能となる。

従来のβグルカンの測定には、カブトガニの血球抽出液（アメボサイトライセート）成分が真菌細胞壁の構成成分であるβグルカンによって活性化されることによるセリンプロテアーゼのカスケード反応を利用した測定法が用いられている。図１にβグルカンによるカブトガニの血球抽出液のゲル化反応の過程を示す。カブトガニの血球抽出液中にはβグルカンと特異的に反応するＧ因子経路が存在する。「Ｇ因子経路」は、以下の反応カスケードによって構成されている。まず、βグルカンは、Ｇ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｇ）と強固に結合してＧ因子を活性化する。次に、βグルカンの結合により活性化されたＧ因子は前凝固酵素（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を活性化させて凝固酵素（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を生成する。この凝固酵素が、その基質であるコアギュローゲン（ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）を部分水解する。その結果、コアギュローゲンからペプチドＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ）が遊離して凝固タンパク質であるコアギュリン（ｃｏａｇｕｌｉｎ）が生成される。このコアギュリンの凝固作用によってゲル化が生じる（非特許文献１参照）。

リムルステストによるβグルカン測定法は、カブトガニの血球抽出液がβグルカンによってゲル化するプロセスを応用したものである。リムルステストは、判定または測定方法の違いからゲル化転倒法（ゲル化法）、発色合成基質法（比色法）、そして比濁時間分析法（比濁法）等の方法が知られている。

「ゲル化転倒法」は、検査対象試料にＧ因子関連物質を含む液を試験管内で混合し、一定条件下（例えば３７℃で３０〜６０分間）反応させた後に、その試験管を転倒、あるいは傾けた際に、試料が液状のままか、あるいは固化したかによって判定する方法である。前者の場合はβグルカン陰性、後者の場合はβグルカン陽性とされる。この方法は、特別な装置を必要とせず操作も比較的容易ではあるが、原料や製造のロットにより測定結果が変わりやすい点や、人による判定のため光学的方法に比べて客観性に欠けるという問題があることから通常は簡易的に用いられるに過ぎない。

「発色合成基質法」は、凝固酵素の基質に発色合成ペプチド基質を用い、遊離した発色基の量を吸光度により比色定量することでβグルカン量を算出する方法である。発色合成ペプチド基質は、天然基質であるコアギュローゲンを凝固酵素が水解する部位のアミノ酸配列を模したものが使用される。凝固酵素による切断部位にパラニトロアニリン（ｐＮＡ）等の発色基を結合させ、この発色基が酵素による切断で遊離することによって発色する。発色基がパラニトロアニリンの場合は、パラニトロアニリンの吸収波長である４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定する。また、発色基がパラニトロアニリンをジアゾカップリングした場合は、５４５ｎｍの吸光度を経時的に測定する。その後、得られた経時的な透過光量の変化を解析してβグルカン濃度を測定する。当該発色合成基質法は、試薬が比較的高価である点や操作が煩雑である等の問題もあるが、定量性、感度、そして客観性に優れている。

「比濁時間分析法」は、ゲル化による濁度の増加を透過光量の変化として捉え、反応液の透過光量比が一定の閾値（通常９０％前後）まで減少するのに要する時間をゲル化時間とし、ゲル化時間とβグルカン濃度の関係から作成された標準曲線を用いてβグルカン値を算出する方法である。定量性や客観性に非常に優れているが測定には専用装置を必要とする。

Tatsushi Muta, Noriaki Seki, Yoshie Takaki, Ryuji Hashimoto, Toshio Oda, Atsufumi Iwanaga, Fuminori Tokunaga, and Sadaaki Iwanaga, J. Biol. Chem., 270: 892-897 (1995)

ところが、定量性や客観性に優れた前記発色合成基質法や比濁時間分析法等のリムルステストを用いても、なおβグルカンを測定する場合には種々の問題が指摘されている。例えば５ｐｇ／ｍｌ以下の高感度測定には２時間程度の反応時間を要し、さらに０．２ｐｇ／ｍｌ以下のβグルカンの測定は、測定結果が信頼性に乏しく感染初期段階での診断に使用することができない。このように、現状におけるβグルカンのリムルステストによる測定感度には未だ問題点があると考えられる。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、従来のβグルカン測定法では検出できなかったレベルのβグルカンを、専用装置なしに迅速かつ高感度に測定する方法を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］試料中に含まれるβグルカンの濃度測定方法であって、試料と、βグルカンとの結合により活性化されるＧ因子を含有する試薬と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、該発光合成基質から前記発光基質を遊離させる発光基質遊離工程と、前記発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する発光量測定工程と、前記発光量測定工程により得られた測定値に基づいて前記試料中のβグルカン濃度を定量する濃度定量工程とを包含することを特徴とするβグルカンの濃度測定方法。
［２］前記発光合成基質は、前記Ｇ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｇ因子または凝固酵素の作用により、前記発光基質と前記ペプチドとの結合が切断される構造を有することを特徴とする前記［１］に記載のβグルカンの濃度測定方法。
［３］前記発光基質はアミノルシフェリンであり、前記発光酵素はルシフェラーゼであることを特徴とする前記［２］に記載のβグルカンの濃度測定方法。
［４］前記ルシフェラーゼが、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシおよび鉄道虫からなる群より選択される甲虫由来であることを特徴とする前記［３］に記載のβグルカンの濃度測定方法。
［５］前記ルシフェラーゼは変異型ルシフェラーゼであり、該変異型ルシフェラーゼは野生型ルシフェラーゼと比較して発光強度が増大するように、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列が改変されていることを特徴とする前記［３］または［４］に記載のβグルカンの濃度測定方法。
［６］前記変異型ルシフェラーゼが、以下の(i)〜(vi)からなる群より選択された１種であることを特徴とする前記［５］に記載のβグルカンの濃度測定方法。
(i) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(ii) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iii) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iv) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(v) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４７位のイソロイシンがスレオニンに、５０位のアスパラギンがセリンに、５９位のメチオニンがスレオニンに、２５２位のスレオニンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(vi) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５０位のアスパラギンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
［７］前記Ｇ因子を含有する試薬がカブトガニ血球抽出成分であり、反応系の全量に対する該カブトガニ血球抽出成分のタンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍＬ〜３．５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載のβグルカンの濃度測定方法。
［８］以下の(a)、(b)、(c)を構成成分として含むことを特徴とするβグルカンの濃度測定用キット。
(a)βグルカンと特異的に結合して活性化されるＧ因子を含有する試薬
(b)ペプチドに発光基質が結合してなり、Ｇ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｇ因子または凝固酵素の作用によって発光基質とペプチドとの結合が切断される構造を有する発光合成基質
(c)発光酵素

本発明に係るβグルカンの濃度測定方法によれば、βグルカンの濃度測定に生物発光反応を適用し、生じる発光量に基づいてβグルカン濃度を定量するので、従来のβグルカン測定法では検出できなかったレベルのβグルカンを、専用の測定装置を用いることなく、簡便かつ迅速に測定することができる。

βグルカンによるカブトガニの血球抽出液のゲル化反応の過程を示す図である。 本発明に係るβグルカンの濃度測定方法の一例を示す図である。 実施例１の各試料濃度における発光強度をプロットしたグラフである。 比較例の各試料濃度における吸光度をプロットしたグラフである。

１．βグルカンの濃度測定方法
最初に、図１および図２を用いて、本発明に係るβグルカンの濃度測定方法のメカニズムについて説明する。図１は、βグルカンによるカブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）のゲル化反応の過程を示す図であり、図２は、本発明に係るβグルカンの濃度測定方法の一例を示す図である。図１に示すように、βグルカンは、カブトガニの血球抽出液中のＧ因子と強固に結合してＧ因子を活性化し、活性化されたＧ因子（活性型Ｇ因子）は前凝固酵素を活性化し、凝固酵素が生成される。凝固酵素はコアギュローゲンを基質として部分水解し、凝固タンパク質であるコアギュリンを生成する。

図２に示すように、βグルカンを含む試料とカブトガニの血球抽出液とを接触させると、試料中のβグルカンによりリムルス反応系が活性化される。そこで、凝固酵素の基質として「ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン」をこの反応系に添加すると、リムルス反応系の活性化により生成した凝固酵素によりＡｒｇとアミノルシフェリンとの結合が切断され、発光基質であるアミノルシフェリンが遊離する。このアミノルシフェリンにルシフェラーゼ（発光酵素）を作用させることにより、光が発生する。ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応を、下記反応式（Ｉ）に示す。

本発明に係るβグルカンの濃度測定方法は、上述のメカニズムにより発生した光の量を測定し、得られた測定値（発光量）に基づいて、試料中のβグルカン濃度を定量する方法である。

次に、本発明に係るβグルカンの濃度測定方法について詳細に説明する。本発明に係るβグルカンの濃度測定方法は、
（１）試料と、βグルカンとの結合により活性化されるＧ因子を含有する試薬と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、発光合成基質から発光基質を遊離させる発光基質遊離工程
（２）発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する発光量測定工程
（３）発光量測定工程により得られた測定値に基づいて試料中のβグルカン濃度を定量する濃度定量工程
を包含するものであればよい。本発明の測定対象であるβグルカンは、カブトガニの血球抽出液中のＧ因子と結合してＧ因子を活性化できるβグルカンであればよく、好ましくは（１→３）−β−Ｄ−グルカンである。

（１）発光基質遊離工程
発光基質遊離工程は、試料と、βグルカンとの結合により活性化されるＧ因子を含有する試薬（以下、「Ｇ因子含有試薬」と記す）と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、発光合成基質から発光基質を遊離させる工程である。

〔試料〕
試料は特に限定されず、βグルカンを含む可能性のあるものはすべて試料として好適に用いることができる。なかでも、血液（血漿）、体液、尿等の臨床試料は、深在性真菌症の診断のための試料として好適である。また、真菌（カビ類等）の汚染が問題となるものも試料として好適に用いることができる。具体的には、例えば、注射剤、輸液、透析液等の医薬品、医療用具や医療機器からの採取物、クリーンルームからの採取物等が挙げられる。なお、臨床試料において、リムルス反応系の干渉因子（阻害因子や亢進因子）の不活化処理が必要な場合は、公知の不活化処理法（例えば過塩素酸処理法（ＰＣＡ法）やＮｅｗ ＰＣＡ法など）による前処理を施しておくことが好ましい。

〔Ｇ因子含有試薬〕
Ｇ因子含有試薬には、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出成分を好適に用いることができる。例えば、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）属、タキプレウス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ）属、あるいはカルシノスコルピウス（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ）属に属するカブトガニの血球から得られたもので、βグルカンとの反応により凝固酵素が生成されるものであれば、特に限定されるものではない。したがって、βグルカン測定用のリムルス試薬（ＬＡＬ試薬）として市販されているものや、βグルカン測定用キットに付属のリムルス試薬（ＬＡＬ試薬）を好適に用いることができる。

また、カブトガニのＧ因子の遺伝子の一部または全部に基づいて合成された組換え遺伝子由来のリコンビナントＧ因子を用いることも可能である。リコンビナントＧ因子は、公知の遺伝子工学的手法に従ってカブトガニＧ因子の遺伝子が挿入された発現ベクターを作製し、適当な宿主細胞に導入してリコンビナントタンパク質を発現させ、精製することにより取得することができる。

Ｇ因子含有試薬として、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出成分（例えば、市販のβグルカン測定用リムルス試薬）を使用した場合には、βグルカンを含む試料との反応により、活性型Ｇ因子および凝固酵素が生成される。これらはいずれもプロテアーゼ活性を有するタンパク質であることが知られている。したがって、この場合、発光合成基質には活性型Ｇ因子の認識配列を有するものおよび凝固酵素の認識配列を有するものが使用可能である。ただし、本発明に係るβグルカンの濃度測定方法は、活性型Ｇ因子および凝固酵素のいずれか一方のプロテアーゼ活性を指標とするので、指標とする酵素に対応する１種類の発色合成基質が用いられる。

一方、Ｇ因子含有試薬として、リコンビナントＧ因子を用いた場合には、当該試薬中に前凝固酵素は存在しないので、βグルカンを含む試料との反応により生成されるのは活性型のリコンビナントＧ因子のみである。したがって、この場合、発光合成基質には活性型Ｇ因子の認識配列を有するものが用いられる。

Ｇ因子含有試薬として、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出成分（例えば、βグルカン測定用市販のリムルス試薬）を使用した場合、その使用量は、従来の使用量の約４０％〜約８０％であることが好ましい。従来の使用量（１００％）では発光反応が阻害され、発光強度が低下すること、および、従来の使用量の約４０％〜約８０％を使用した場合に高い発光強度が得られることが明らかとなったからである。従来の使用量の約４０％〜約８０％は、測定系の全量に対するカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）のタンパク質濃度に換算した場合、１．５ｍｇ／ｍＬ〜３．５ｍｇ／ｍＬの範囲に相当する。より好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬ〜３．３ｍｇ／ｍＬである。従来の使用量より少ない量で高感度測定が可能になることから、本発明に係るβグルカンの濃度測定方法は、産業上非常に有用である。

〔発光合成基質〕
発光合成基質はペプチドに発光基質が結合してなるものであり、試料とＧ因子含有試薬と発光合成基質との反応により、当該発光合成基質から発光基質が遊離するものであればよい。このような発光合成基質としては、Ｇ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｇ因子または凝固酵素の作用により、発光基質とペプチドとの結合が切断される構造を有することが好ましい。本明細書において「発光基質」とは、生物発光で反応の基質となって光を発する物質を意味する。発光基質としてはルシフェリンを好適に用いることができる。なかでも下記式（ＩＩ）で表されるアミノルシフェリンが好ましい。アミノルシフェリンのアミノ基が、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成させることができるからである。

アミノルシフェリンと結合するペプチドは、当該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｇ因子または凝固酵素のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。この条件を充足する限りにおいてアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は限定されないが、特異性、合成コスト、取扱い易さ等の観点からアミノ酸残基数は２個〜１０個が好ましい。

具体的には、凝固酵素の認識配列を有するペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号２）、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号３）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号４）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号５）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号７）などが挙げられる。また、活性型Ｇ因子の認識配列を有するペプチドとしては、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号８）、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−（配列番号９）などが挙げられる。

ペプチドのＮ末端は、保護基で保護されていてもよい。保護基としては、通常この分野で用いられるものであれば限定されることなく用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ基、ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基、ｂｅｎｚｏｙｌ基、ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ基などが挙げられる。

本発明に用いられる発光合成基質は、例えば、特表２００５−５３０４８５（国際公開番号：ＷＯ２００３／０６６６１１）の実施例６および実施例７に記載の方法を参照することにより合成することができる。また、Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されている「Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ‐Ｇｌｏ^ＴＭ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」に付属の発光合成基質（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）を使用することができる。発光合成基質中に遊離のアミノルシフェリンが含まれる場合は、これを予め除去しておくことが好ましい。発光合成基質から遊離のアミノルシフェリンを除去することにより、バックグラウンド発光を抑制することができる。遊離のアミノルシフェリンを除去する方法としては、例えば、２０ｍＭ トリシン、８ｍＭ Ｍｇ^２＋、０．１３ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ７．８）中、０．８ｍＭ 補酵素Ａ、１．５ｍＭ ＡＴＰ、２５０μｇ／ｍｌホタルルシフェラーゼおよび９０ｍＭ ＤＴＴを含む溶液と混合し、室温（２５℃）で１時間〜６時間インキュベートする方法が挙げられる。

〔反応手順（方法）〕
試料とＧ因子含有試薬と発光合成基質との反応手順（方法）は、これら三者が反応することにより発光合成基質から発光基質（例えばアミノルシフェリン）が遊離する条件に適合するものであれば、特に限定されない。例えば、試料とＧ因子含有試薬とをよく混和して３７℃で５分〜６０分間程度インキュベートした後、発光合成基質を加えてよく混和し、３７℃で１分〜３０分間程度インキュベートする方法が挙げられる。

（２）発光量測定工程
発光量測定工程は、前段の発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する工程である。

〔発光酵素〕
本発明に用いられる発光酵素は、発光合成基質から遊離した発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させるものであればよい。発光基質がルシフェリンである場合、発光酵素にはルシフェラーゼが好適に用いられる。また、発光基質が上記式（ＩＩ）で表されるアミノルシフェリンである場合は、発光酵素に甲虫由来のルシフェラーゼを用いることが好ましい。甲虫由来のルシフェラーゼとしては、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシ、鉄道虫などの甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。これらの甲虫由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、表１に記載のアクセッション番号で公知のデータベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database（http://www.ebi.ac.uk/embl/））に登録されている。なお、ルシフェラーゼは、天然タンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。本発明に使用可能なルシフェラーゼは、試薬として各社から市販されている。

また、ルシフェラーゼは野生型のアミノ酸配列を有するものに限定されず、発光基質の生物発光を触媒する機能を有する限りにおいて、野生型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼであってもよい。野生型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。ここで、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、挿入、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されていることが意図される。

変異型ルシフェラーゼのなかでも、発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼを用いることが好ましい。超微量のβグルカンを高感度に測定できるからである。発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼとしては、例えば以下の変異型ルシフェラーゼを挙げることができる。
(i) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(ii) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iii) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iv) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(v) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換され、さらに、４７位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に、５０位のアスパラギン（Ａｓｎ）がセリン（Ｓｅｒ）に、５９位のメチオニン（Ｍｅｔ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に、２５２位のスレオニン（Ｔｈｒ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(vi) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、５０位のアスパラギンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ

上記(i)〜(v)の各変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度は、それぞれ北米ホタルルシフェラーゼ（野生型）の発光強度と比較して(i)１８倍、(ii)１８倍、(iii)８倍、(iv)２０倍、(v)２１倍に増大したことが確認されている（特開２００７−９７５７７号公報参照）。なお、発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼは上記(i)〜(vi)に限定されるものではない。適宜変異の位置および置換されるアミノ酸を選択して発光強度が増大するように改変した変異型ルシフェラーゼを見出し、用いることができる。特に、配列番号１０のアミノ酸配列において、４７位、５０位、５９位、２５２位、４２３位、４３６位、および５３０位のアミノ酸置換を組み合わせることにより、発光強度が増大するように改変された変異型シフェラーゼを取得することが可能である。

変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼの遺伝子を改変して得られた変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、公知の方法により発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に導入して、組換えタンパク質として発現させ、精製することにより得ることができる。遺伝子の改変は、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、有機合成等、当業者に周知の方法により行うことができる。なお、北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列は、アクセッション番号：Ｍ１５０７７としてデータベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database（http://www.ebi.ac.uk/embl/））に登録されている。また、上記(i)〜(v)に記載の変異型ホタルルシフェラーゼは、特開２００７−９７５７７号公報の実施例を参照することにより作製することができる。

また、当業者は、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ヒメボタル、マドボタル、光コメツキムシおよび鉄道虫についても、公知のデータベースに登録されたこれらのルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（表１参照）に基づいて、公知の方法により変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。さらに、上記(i)〜(vi)に記載の北米ホタル由来の変異型ホタルルシフェラーゼの置換アミノ酸を参照すれば、他の甲虫由来のルシフェラーゼにおける同等の位置のアミノ酸を置換することにより、当業者は発光強度が増大した変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。

〔反応および測定手順（方法）〕
前段の発光基質遊離工程により得られる反応液、つまり遊離した発光基質（例えばアミノルシフェリン）を含む反応液に、発光酵素（例えばルシフェラーゼ）を添加する。上記反応式（Ｉ）に示したように、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応には、ＡＴＰおよび２価金属イオンが必要であるので、例えば、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む緩衝液にルシフェラーゼを溶解し、このルシフェラーゼ溶液を添加することが好ましい。具体的には、例えば、室温（２５℃）で反応を行い、ルシフェラーゼ溶液を添加後２秒から１０秒の発光値を計測する方法が挙げられる。

発光量の測定には、市販のルミノメータ（発光測定装置）を用いることができる。メーカーおよび性能については特に限定されないが、相対光量測定値が０から一千万の範囲で測定可能な装置であることが好ましい。具体的には、キッコーマン社のルミテスターＣ１０００やパーキンエルマー社のＡＲＶＯ Ｌｉｇｈｔ等の仕様が好適である。測定は、使用する装置の説明書に従って行えばよい。

（３）濃度定量工程
濃度定量工程は、発光量測定工程により得られた測定値に基づいて試料中のβグルカン濃度を定量する工程である。濃度既知のβグルカン溶液を使用して、予めβグルカン濃度と当該濃度における発光値との関係を表す検量線を作成し、この検量線に上記発光量測定工程により得られた測定対象試料の測定値を当てはめることにより、試料中のβグルカン濃度を求めることができる。

２．βグルカンの濃度測定用キット
本発明に係るβグルカンの濃度測定用キットは、以下の(a)、(b)、(c)を構成成分として含むものであればよい。
(a)βグルカンと特異的に結合して活性化されるＧ因子を含有する試薬
(b)ペプチドに発光基質が結合してなり、Ｇ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｇ因子または凝固酵素の作用によって発光基質とペプチドとの結合が切断される構造を有する発光合成基質
(c)発光酵素
上記(a)、(b)、(c)の詳細については既に説明したので、ここでは説明を省略する。本発明のキットは、上記(a)、(b)、(c)以外のものを構成成分として含んでいてもよい。これら以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、他に必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。本発明に係るキットを用いることにより、上記本発明に係るβグルカンの濃度測定方法を簡便かつ迅速に実施することができる。

本明細書において「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下の実施例に用いた器具、試薬、水等は、βグルカンフリー、あるいはβグルカン測定結果に影響を及ぼさない極めて微量のβグルカンを含有するものを使用した。

〔実施例１：生物発光法によるβグルカンの測定〕
＜方法＞
リムルス試薬（ＬＡＬ）、βグルカン標準液、および精製水は、深在性真菌感染症の体外診断薬であるＧｌｕｃａｔｅｌｌ（アソシエーツ オブ ケープコッド インク（ＡＣＣ社）製）に添付のものを使用した。発光合成基質には、Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ‐Ｇｌｏ^ＴＭ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に付属のベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンを用いた。ルシフェラーゼは、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）において、５０位のアスパラギンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを使用した。当該変異型ルシフェラーゼは、本発明者らが特開２００７−９７５７７号公報の実施例に記載の方法に準じて自製したものである。

まず、βグルカン標準液を精製水で希釈することにより、０．１〜４０ｐｇ／ｍＬの範囲で６段階に調製し、これを試料とした（表１参照）。また、βグルカンを含まない精製水をブランクとした。続いて、各試料およびブランクから５０μＬずつ取り出し、それぞれ別個に５０μＬのリムルス試薬が入った反応試験管に移した後、ボルテックスミキサーで数秒間混合した。混合後、３７±１．０℃の保温器にて１０分間正確に加温した。詳細な取り扱いについてはＧｌｕｃａｔｅｌｌに添付のプロトコルに従った。

次に、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解した１５０μＭ発光合成基質（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）を５０μＬ加えて、３７±１．０℃の保温器にて５分間正確に加温した。加温後、反応液を生物発光測定専用試験管（ルミチューブ、キッコーマン株式会社）に移した後、１０^−５Ｍ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解したルシフェラーゼ５０μＬを添加し、ルミテスターＣ１０００（キッコーマン株式会社）にセットして試料の発光量を測定した。なお、本実施例で用いたリムルス試薬の反応液全量に対する濃度は約２．０ｍｇ／ｍＬであった。このリムルス試薬量は従来の使用量の約５０％の量に相当する。

比較例として、同一の試料について、上記発光合成基質の代わりにＧｌｕｃａｔｅｌｌに添付の発色基質を用いてカイネティック比色法により測定した。操作法はＧｌｕｃａｔｅｌｌに添付のプロトコルに従った。

＜結果＞
結果を表１に示した。また、実施例１の各試料濃度における発光強度をプロットしたグラフを図３に示し、比較例の各試料濃度における吸光度をプロットしたグラフを図４に示した。表１、図３および図４から明らかなように、従来の発色基質を用いるカイネティック比色法では５ｐｇ／ｍＬ未満のβグルカンについては測定値が低すぎて定量的に評価することは不可能であった。一方、発光合成基質を用いて発光強度を測定する方法では０．１ｐｇ／ｍＬ以下の濃度でも測定可能であることが示された。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明は、医療分野、特に臨床検査、医薬品製造などの分野に利用することができる。

Claims (5)

1. 試料中に含まれるβグルカンの濃度測定方法であって、
   試料と、βグルカンとの結合により活性化されるＧ因子を含有する試薬と、ペプチドにアミノルシフェリンが結合してなる発光合成基質とを反応させ、該発光合成基質から前記アミノルシフェリンを遊離させるアミノルシフェリン遊離工程と、
   前記アミノルシフェリン遊離工程により遊離したアミノルシフェリンにルシフェラーゼを作用させ、発光量を測定する発光量測定工程と、
   前記発光量測定工程により得られた測定値に基づいて前記試料中のβグルカン濃度を定量する濃度定量工程と
   を包含し、
   前記発光合成基質は、前記Ｇ因子が活性化されることにより生成される凝固酵素の作用により、アミノルシフェリンと前記ペプチドとの結合が切断される構造を有し、
   前記ペプチドのアミノ酸配列が、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号２）、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号３）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号４）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号６）またはＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号７）であり、
   前記Ｇ因子を含有する試薬がカブトガニ血球抽出成分であり、反応系の全量に対する該カブトガニ血球抽出成分のタンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍＬ〜３．５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とするβグルカンの濃度測定方法。
2. 前記ルシフェラーゼが、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシおよび鉄道虫からなる群より選択される甲虫由来であることを特徴とする請求項１に記載のβグルカンの濃度測定方法。
3. 前記ルシフェラーゼは変異型ルシフェラーゼであり、該変異型ルシフェラーゼは野生型ルシフェラーゼと比較して発光強度が増大するように、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列が改変されていることを特徴とする請求項１または２に記載のβグルカンの濃度測定方法。
4. 前記変異型ルシフェラーゼが、以下の(i)〜(vi)からなる群より選択された１種であることを特徴とする請求項３に記載のβグルカンの濃度測定方法。
   (i) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
   (ii) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
   (iii) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
   (iv) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、４３６位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、５３０位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
   (v) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４７位のイソロイシンがスレオニンに、５０位のアスパラギンがセリンに、５９位のメチオニンがスレオニンに、２５２位のスレオニンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
   (vi) 配列番号１０に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５０位のアスパラギンがセリンに、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
5. 以下の(a)、(b)、(c)を構成成分として含み、(a)のカブトガニ血球抽出成分を、反応系の全量に対して１．５ｍｇ／ｍＬ〜３．５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用することを特徴とするβグルカンの濃度測定用キット。
   (a)βグルカンと特異的に結合して活性化されるＧ因子を含有するカブトガニ血球抽出成分
   (b) Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号２）、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号３）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号４）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号６）およびＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号７）から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドにアミノルシフェリンが結合してなり、Ｇ因子が活性化されることにより生成される凝固酵素の作用によってアミノルシフェリンとペプチドとの結合が切断される構造を有する発光合成基質
   (c)ルシフェラーゼ