JP5813723B2 - エンドトキシンの濃度測定方法および濃度測定用キット - Google Patents
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Description
(i) 配列番号13に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(ii) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iii) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iv) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(v) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、47位のイソロイシンがスレオニンに、50位のアスパラギンがセリンに、59位のメチオニンがスレオニンに、252位のスレオニンがセリンに、423位のイソロイシンがロイシンに、530位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
最初に、図1および図2を用いて、本発明に係るエンドトキシンの濃度測定方法のメカニズムについて説明する。図1は、エンドトキシンによるカブトガニの血球抽出液(LAL:Limulus Amebocyte Lysate)のゲル化反応の過程を示す図であり、図2は、本発明に係るエンドトキシンの濃度測定方法の一例を示す図である。
(1)試料と、エンドトキシンとの結合により活性化されるC因子を含有する試薬と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、発光合成基質から発光基質を遊離させる発光基質遊離工程
(2)発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する発光量測定工程
(3)発光量測定工程により得られた測定値に基づいて試料中のエンドトキシン濃度を定量する濃度定量工程
を包含するものであればよい。
発光基質遊離工程は、試料と、エンドトキシンとの結合により活性化されるC因子を含有する試薬(以下、「C因子含有試薬」と記す)と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、発光合成基質から発光基質を遊離させる工程である。
試料は特に限定されないが、例えば、注射剤、輸液、透析液等の医薬品、血液(血漿)、尿等の臨床試料が挙げられる。臨床試料において、リムルス反応系の干渉因子(阻害因子や亢進因子)の不活化処理が必要な場合は、公知の不活化処理法(例えば過塩素酸処理法(PCA法)やNew PCA法など)による前処理を施しておく。
C因子含有試薬には、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出成分を好適に用いることができる。例えば、リムルス(Limulus)属、タキプレウス(Tachypleus)属、あるいはカルシノスコルピウス(Carcinoscorpius)属に属するカブトガニの血球から得られたもので、エンドトキシンとの反応により凝固酵素が生成されるものであれば、特に限定されるものではない。したがって、リムルス試薬(LAL試薬)として市販されているものや、エンドトキシン測定用のキットに付属のリムルス試薬(LAL試薬)を好適に用いることができる。
発光合成基質は、ペプチドに発光基質が結合してなるものであればよい。本明細書において「発光基質」とは、生物発光で反応の基質となって光を発する物質を意味する。発光基質としてはルシフェリンを好適に用いることができる。なかでも下記式(II)で表されるアミノルシフェリンが好ましい。アミノルシフェリンのアミノ基が、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成させることができるからである。
試料とC因子含有試薬と発光合成基質との反応手順(方法)は、これら三者が反応することにより発光合成基質から発光基質(アミノルシフェリン)が遊離する条件に適合するものであれば、特に限定されない。例えば、試料とC因子含有試薬とをよく混和して37℃で5分〜60分間程度インキュベートした後、発光合成基質を加えてよく混和し、37℃で1分〜30分間程度インキュベートする方法が挙げられる。
発光量測定工程は、前段の発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する工程である。
本発明に用いられる発光酵素は、発光合成基質から遊離した発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させるものであればよい。発光基質がルシフェリンである場合、発光酵素にはルシフェラーゼが好適に用いられる。また、発光基質が上記式(II)で表されるアミノルシフェリンである場合は、発光酵素には甲虫由来のルシフェラーゼが用いられる。甲虫由来のルシフェラーゼとしては、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシ、鉄道虫などの甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。これらの甲虫由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、表1に記載のアクセッション番号で公知のデータベース(例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/))に登録されている。なお、ルシフェラーゼは、天然タンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。本発明に使用可能なルシフェラーゼは、試薬として各社から市販されている。
(i) 野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号13)において、423位のイソロイシン(Ile)がロイシン(Leu)に置換され、436位のアスパラギン酸(Asp)がグリシン(Gly)に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(ii) 北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシン(Ile)がロイシン(Leu)に置換され、530位のロイシン(Leu)がアルギニン(Arg)に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iii) 北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、436位のアスパラギン酸(Asp)がグリシン(Gly)に置換され、530位のロイシン(Leu)がアルギニン(Arg)に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iv) 北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシン(Ile)がロイシン(Leu)に置換され、436位のアスパラギン酸(Asp)がグリシン(Gly)に置換され、530位のロイシン(Leu)がアルギニン(Arg)に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(v) 北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシン(Ile)がロイシン(Leu)に、530位のロイシン(Leu)がアルギニン(Arg)に置換され、さらに、47位のイソロイシン(Ile)がスレオニン(Thr)に、50位のアスパラギン(Asn)がセリン(Ser)に、59位のメチオニン(Met)がスレオニン(Thr)に、252位のスレオニン(Thr)がセリン(Ser)に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
前段の発光基質遊離工程により得られる反応液、つまり遊離した発光基質(アミノルシフェリン)を含む反応液に、発光酵素(ルシフェラーゼ)を添加する。上記反応式(I)に示したように、ルシフェリン/ルシフェラーゼの発光反応には、ATPおよび2価金属イオンが必要であるので、例えば、ATPおよびマグネシウムイオンを含む緩衝液にルシフェラーゼを溶解し、このルシフェラーゼ溶液を添加することが好ましい。具体的には、例えば、室温(25℃)で反応を行い、ルシフェラーゼ溶液を添加後2秒から10秒の発光値を計測する方法が挙げられる。
濃度定量工程は、発光量測定工程により得られた測定値に基づいて試料中のエンドトキシン濃度を定量する工程である。濃度既知のエンドトキシン溶液を使用して、予めエンドトキシン濃度と当該濃度における発光値との関係を表す検量線を作成し、この検量線に上記発光量測定工程により得られた測定対象試料の測定値を当てはめることにより、試料中のエンドトキシン濃度を求めることができる。
本発明に係るエンドトキシンの濃度測定用キットは、C因子含有試薬、発光合成基質および発光酵素を構成成分として含有するものであればよい。これらの詳細については既に説明したので、ここでは説明を省略する。これら以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、他に必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。本発明に係るキットを用いることにより、上記本発明に係るエンドトキシンの濃度測定方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
<方法>
エンドトキシン測定試薬QCL−1000(Lonza Walkersville, Inc.)に添付のリムルス試薬(LAL)、エンドトキシン標準液(大腸菌0111:B4由来エンドトキシン)、およびパイロジェンフリー水を用いた。発光合成基質には、Proteasome‐GloTM Assay Systems(Promega)に付属のベンゾイル−Leu−Arg−Arg−アミノルシフェリンを用いた。ルシフェラーゼは、本発明者らが大腸菌を用いて発現、精製した野生型北米ホタルルシフェラーゼを使用した。具体的には、ピッカジーンカセットベクター(東洋インキ製)から切り出した北米ホタルルシフェラーゼ(野生型)遺伝子を大腸菌用発現ベクターpET28a(Novagen)へ組み込み、これを大腸菌に導入して発現させ、精製した。
実施例1の結果を図3に示した。また、比較例の結果を図4に示した。図3は、実施例1の各試料濃度における発光強度をプロットしたグラフであり、図4は、比較例の各試料濃度における吸光度をプロットしたグラフである。図4に示すように、従来の発色基質を用いる比色エンドポイント法では、0.025EU/mL以下のエンドトキシンについては測定値が低すぎて定量的に評価することは不可能であった。一方、図3に示すように、発光合成基質を用いて発光強度を測定する方法では、0.01EU/mL以下の濃度でも測定可能であった。
本発明に係るエンドトキシンの濃度測定方法に、野生型ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有することが確認されている変異型ルシフェラーゼを用いることを試みた。
本実施例で使用した変異型ルシフェラーゼは、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに、530位のロイシンがアルギニンに置換され、さらに、47位のイソロイシンがスレオニンに、50位のアスパラギンがセリンに、59位のメチオニンがスレオニンに、252位のスレオニンがセリンに置換されたアミノ酸配列からなるものであり、本発明者らが特開2007−97577号公報の実施例14に記載の方法により自製したものである。
結果を表2に示した。表2から明らかなように、エンドトキシン濃度が0.0001EU/mLのときの発光強度は、約400RLUであり、野生型ルシフェラーゼを用いた場合の10倍以上であった。この結果から、変異型ルシフェラーゼを用いれば、微量のエンドトキシンを高感度に測定できることが示された。生物発光測定におけるバックグラウンドの値は20−30RLUであることから、0.0001EU/mL以下の超微量のエンドトキシンも変異型ルシフェラーゼを使用することで測定可能であることが示唆された。
実施例2と同じ材料および方法で、エンドトキシン濃度を測定した。なお、実施例2では、ブランク値を差し引いた数値を測定値として示したが(表2参照)、本実施例3では、ブランク値を差し引いていない実測値を測定値として示した。
<方法>
エンドトキシン標準液をパイロジェンフリー水で希釈し、0.05エンドトキシン単位(EU)/mLの試料を調製した。リムルス試薬(LAL)にパイロジェンフリー水を添加して、90%(LAL:水=9:1)〜10%(LAL:水=1:9)の9段階の濃度のLALを調製した。リムルス試薬(LAL)としては、原液(100%)と、リムルス試薬(LAL)を含有しないもの(0%:パイロジェンフリー水のみ)を含む11段階の濃度のものを使用した。
Claims (5)
- 試料中に含まれるエンドトキシンの濃度測定方法であって、
試料と、エンドトキシンとの結合により活性化されるC因子および活性型C因子により活性化されるB因子を含有する試薬と、ペプチドにアミノルシフェリンが結合してなる発光合成基質とを反応させ、該発光合成基質からアミノルシフェリンを遊離させるアミノルシフェリン遊離工程と、
前記アミノルシフェリン遊離工程により遊離したアミノルシフェリンにルシフェラーゼを作用させ、発光量を測定する発光量測定工程と、
前記発光量測定工程により得られた測定値に基づいて前記試料中のエンドトキシン濃度を定量する濃度定量工程と
を包含し、
前記発光合成基質が、活性型B因子の作用により、アミノルシフェリンと前記ペプチドとの結合が切断される構造を有し、
前記ペプチドのアミノ酸配列が、Thr−Thr−Thr−Thr−Arg−(配列番号11)またはSer−Arg−Gln−Arg−Arg−(配列番号12)であることを特徴とするエンドトキシンの濃度測定方法。 - 前記ルシフェラーゼが、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシおよび鉄道虫からなる群より選択される甲虫由来であることを特徴とする請求項1に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 前記ルシフェラーゼは変異型ルシフェラーゼであり、該変異型ルシフェラーゼは野生型ルシフェラーゼと比較して発光強度が増大するように、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列が改変されていることを特徴とする請求項1または2に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 前記変異型ルシフェラーゼが、以下の(i)〜(v)からなる群より選択された1種であることを特徴とする請求項3に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
(i) 配列番号13に示される野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(ii) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iii) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(iv) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、423位のイソロイシンがロイシンに置換され、436位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、530位のロイシンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
(v) 配列番号13に示される北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、47位のイソロイシンがスレオニンに、50位のアスパラギンがセリンに、59位のメチオニンがスレオニンに、252位のスレオニンがセリンに、423位のイソロイシンがロイシンに、530位のロイシンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ - エンドトキシンと特異的に結合して活性化されるC因子および活性型C因子により活性化されるB因子を含有する試薬と、ペプチドにアミノルシフェリンが結合してなる発光合成基質と、ルシフェラーゼとを構成成分として含み、前記発光合成基質が、活性型B因子の作用により、アミノルシフェリンと前記ペプチドとの結合が切断される構造を有し、前記ペプチドのアミノ酸配列が、Thr−Thr−Thr−Thr−Arg−(配列番号11)またはSer−Arg−Gln−Arg−Arg−(配列番号12)であることを特徴とするエンドトキシンの濃度測定用キット。
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