BR102021010448A2

BR102021010448A2 - Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem

Info

Publication number: BR102021010448A2
Application number: BR102021010448-1A
Authority: BR
Inventors: Vadim Viviani; Paulo Lee Ho; Jaqueline Rodrigues Silva
Original assignee: Fundação Universidade Federal De São Carlos; Instituto Butantan
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-12-06

Abstract

A presente invenção pertence ao campo da biotecnologia, biomedicina e medicina diagnóstica. Consiste em uma nova proteína de fusão altamente bioluminescente baseada na fusão da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus com a porção N-terminal da luciferase do vagalume Amydetes vivianii. Esta nova proteína possui finalidades de marcação e detecção bioluminescente de anticorpos primários IgG e respectivos antígenos em imunoensaios, Western Blottings, imuno-histoquímica e bioimagem. Sua principal aplicação são os testes para identificação de presença de anticorpos específicos para doenças virais, fúngicas e bacterianas, ou seus respectivos antígenos, em amostras biológicas por bioluminescência.

Description

PROTEÍNA DE FUSÃO BIOLUMINESCENTE PARA MARCAÇÃO E DETECÇÃO DE ANTICORPOS E ANTÍGENOS EM IMUNOENSAIOS, ELETROFORESE E BIOIMAGEM

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente documento pertence ao campo da biotecnologia, biomedicina e medicina diagnóstica. A invenção consiste em uma nova proteína de fusão altamente bioluminescente baseada na porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus e luciferase do vagalume Amydetes vivianii, para finalidades de detecção bioluminescente de anticorpos e antígenos em imunoensaios e Western Blottings. Campo de aplicação biotecnológica e biomédica em testes para identificação da presença de anticorpos específicos ou antígenos em amostras biológicas por bioluminescência, inclusive presença de anticorpos contra vírus como SARS-covid-19.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉNCICA

[002] Imunoensaios sensíveis, rápidos, práticos e baratos são altamente desejáveis para detecção de presença de anticorpos para agentes patogênicos, como vírus e bactérias, especialmente em períodos de pandemia. Técnicas de eletroforese com imunodetecção como Western Blots, as quais são amplamente empregadas em laboratórios de pesquisa, utilizam métodos quimioluminescentes e fluorescentes. Os imunoensaios quimioluminescentes são em geral mais sensíveis e estão entre os mais empregados. Em geral, se baseiam em um anticorpo secundário fusionado ou conjugado à enzima Peroxidase de rabanete (HRP), que reconhece um anticorpo primário específico ligado a um antígeno específico, em geral imobilizado. A revelação da presença dos anticorpos para um dado antígeno em amostras, como o soro sanguíneo, é feita mediante adição de substrato quimioluminescente (geralmente luminol ou um de seus derivados) e peróxido de hidrogênio, gerando uma quimiluminescência azulada que pode ser facilmente detectada por fotodetecção ou, em alguns casos, fotograficamente. Apesar disso, no Brasil ainda se recorre à importação de kits quimioluminescentes, para imunoensaios e realização de eletroforese com imunodetecção.

[003] É de comum conhecimento no estado da técnica que as luciferases de vagalumes são amplamente utilizadas há várias décadas como os reagentes analíticos bioluminescentes para quantificar luminometricamente e fotometricamente a concentração de ATP em amostras biológicas, industriais, farmacêuticas, em ensaios que envolvem a quantificação microbiológica e biomassa, e em ensaios enzimáticos que envolvam enzimas que geram ou consomem ATP.

[004] Também é de conhecimento que os DNAs que codificam as enzimas luciferases de besouros são usados há décadas como genes repórter bioluminescentes de eventos biológicos como regulação da expressão gênica, diferenciação celular, marcação celular, eventos patológicos (como progressão e regressão de infecções bacterianas, fúngicas e virais), e metástases, e seu respectivo tratamento por drogas farmacêuticas.

[005] Outrossim, é sabido que os genes de luciferases podem ser fusionados a DNAs que codificam outras proteínas, gerando proteínas de fusão bioluminescentes bifuncionais para diferentes finalidades, inclusive imunoensaios.

[006] Uma construção usando o DNA da proteína A de Staphylococcus aureus foi ligado ao DNA sem a porção Nterminal da luciferase de Photinus pyralis, para produzir uma proteína de fusão bioluminescente (Kabatake et al., 1993). Entretanto, esta proteína de fusão emitia um sinal mais fraco que a luciferase selvagem não-fusionada. Posteriormente uma versão com mais atividade foi desenvolvida utilizando-se a proteína A fusionada com o gene inteiro da luciferase de P.pyralis, que preservava maior atividade bioluminescente, conseguindo detectar até 5 pg de anticorpo marcador tumoral α-fetoproteína (Zhang et al., 2000).

[007] Os ensaios analíticos acima mencionados envolvem o uso de equipamentos fotométricos sensíveis como luminômetros, fotômetros e câmaras de fotodetecção, geralmente acessíveis somente em laboratórios mais especializados.

[008] A sensibilidade dos ensaios bioluminescentes destas aplicações envolvendo as luciferases depende não somente dos limites de detecção dos equipamentos fotométricos utilizados, mas também da eficiência catalítica e rendimento quântico da luciferase que determinam a intensidade e brilho do sinal luminescente a ser detectado. Além disto, outros fatores são importantes para os ensaios analíticos bioluminescentes mais sensíveis e eficientes, entre os quais: a termoestabilidade da enzima que afeta o tempo de vida do reagente na prateleira ou no próprio ensaio in vivo ou in vitro; a cinética da reação luminescente que influencia o tempo disponível para a detecção do sinal bioluminescente em ensaios, e os espectros de bioluminescência da luciferase utilizada que afetam a detecção do sinal luminescente em amostras pigmentadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[009] O processo de expressão heteróloga das luciferases por engenharia genética é amplamente conhecido no estado da técnica, não constituindo novidade. Relativo as luciferases e proteínas de fusão, as seguintes anterioridades foram encontradas:

[010] O documento PI 0600263-3 trata-se de um produto da área de biotecnologia constituído de luciferase de Amydetes vivianii recombinante, que apresenta espectro de bioluminescência na região do verde-azulado, com sensibilidade a metais como cádmio e mercúrio. Entretanto, dito documento refere-se à aplicação específica da luciferase de Amydetes vivianii como reagente mais sensível e termoestável para medidas de ATP, como biossensor específico para detecção de cádmio e mercúrio, e como biossensor mais termoestável de pH para elevadas temperaturas, diferentemente da proteína de fusão bioluminescente aqui descrita que pode ser utilizada especificamente para detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios. Além disto, a diferença desta patente objeto deste pedido é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão que contém não somente a porção N-terminal ZZ da proteína A, mas também a luciferase na porção C-terminal da primeira, com sequências de DNA e aminoácidos em combinação únicas e inéditas.

[011] A patente US 4,302,534 revela um imunoensaio enzimático heterogêneo, em que a quimioluminescência é empregada como meio de detecção. A quimioluminescência é produzida por uma reação redox catalisada por enzima entre peróxido de hidrogênio e um composto fenólico como pirogalol, resorcinol, floroglucinol e hidroquinona. O ensaio é descrito por ter sensitividade igual aos radioimunoensaios e testes de hemaglutinação reversa, sem algumas desvantagens desses métodos, como o perigo de radioatividade, por exemplo. Tal documento se diferencia do invento aqui pleiteado pelo uso do sistema quimioluminescente ser baseado em HRP conjugada com anticorpo secundário, enquanto o pedido em tela utiliza de sistema bioluminescente baseado em uma proteína de fusão de proteína A com luciferase.

[012] A patente US 8,137,986 revela um método de imunoensaio enzimático quimioluminescente, no qual uma substância alvo, como uma proteína, é testada. Esse método de imunoensaio enzimático quimioluminescente compreende: a etapa de captura de um complexo imune contendo um anticorpo marcado com enzima, o qual é marcado com uma enzima atuando com o substrato quimioluminescente, e a substância alvo em um suporte sem camada de solução; a etapa de sobreposição da membrana de suporte contendo o substrato quimioluminescente o complexo imune capturado anteriormente conjugado com a enzima; e a etapa de medição da luminescência causada pela reação entre o anticorpo marcado como enzima e o substrato quimioluminescente para enfim quantificar a substância alvo. Tal invenção se diferencia do presente pedido por utilizar de sistema quimioluminescente baseado em HRP conjugada com anticorpo secundário, ao invés do uso de sistema bioluminescente baseado em proteína de fusão de proteína A com luciferase.

[013] A patente US 6,395,503 revela um reagente quimioluminescente que produz quimioluminescência na presença de peróxido de hidrogênio, o qual depende da concentração de peroxidase, a ser utilizado para detecção e quantificação de vários tipos de materiais a partir da medição da atividade enzimática da peroxidase, com a enzima peroxidase como marcador. Portanto, se diferencia do pedido em tela, que se trata de uma proteína de fusão bioluminescente.

[014] A patente US 4,950,588 revela um processo quimioluminescente que compreende o contato de um precursor quimioluminescente, um oxidante, uma enzima, um potencializador quimioluminescente e um composto de nitrogênio selecionado do grupo que consiste em amônia e aminas orgânicas solúveis em água. A reação desse processo pode ser utilizada na detecção de híbridos de ácido nucleico, anticorpos, antígenos e enzimas peroxidase. Portanto, o presente documento se relaciona apenas a agentes que aumentam a intensidade e duração da quimioluminescência, não estando relacionado com sistema bioluminescente como o pedido em tela.

[015] A patente US 10,711,185 revela um reagente para realizar uma reação quimioluminescente que inclui luminol ou derivados de luminol, um oxidante, um mediador de elétron e um potencializador. Esse invento se diferencia do pedido em tela por utilizar de sistema quimioluminescente baseado em HRP conjugada com anticorpo secundário, luminol e derivados quimioluminescentes, ao invés do uso de sistema bioluminescente baseado em luciferina de vagalume e proteína de fusão de proteína A com luciferase.

[016] A patente US 8,574,858 revela imunoensaios e kits para detecção ou quantificação de um analito de interesse em uma amostra de teste que potencialmente contenha autoanticorpos produzidos de maneira endógena reativos ao analito. Portanto, se diferencia do pedido em tela, que consiste em sistema bioluminescente baseado em luciferina de vagalume e proteína de fusão de proteína A com luciferase para utilização em imunoensaios e kits diagnóstico.

[017] A patente US 6,596,257 revela método para detecção e visualização de tecidos neoplásicos e outros tecidos. Reivindica o uso de luciferases de várias fontes, mas não revela exemplos práticos e efetivos. As luciferases de vagalumes mencionadas são de Photinus pyralis e Luciola spp, diferentemente do pedido em tela, que utiliza luciferase única de Amydetes vivianii numa nova proteína de fusão.

[018] A patente US4,665,022 revela reagente para imunoensaio, ensaio de ligação de ligante e ensaio de ligação de receptor, nos quais a luciferina é ligada covalentemente a uma molécula com atividade biológica para ligação a um grupo específico biologicamente ativo de um material. É método no qual o conjugado de luciferina e da molécula biologicamente ativa é adicionado a um material contendo um grupo para combinação com a atividade biológica da molécula conjugada, a mistura é incubada para ligação do material com o reagente por meio de atividade biológica e o produto dessa ligação reage com luciferase para produzir bioluminescência, cuja intensidade de luz emitida depende da concentração do material sendo testado. Portanto, o invento se trata de uma conjugação da luciferina com outras biomoléculas, o que diverge do pedido em tela, que se trata de uma proteína de fusão feita a partir da fusão da enzima luciferase à proteína A por engenharia genética.

[019] A patente US 10,973,826 revela conjugados de anticorpo compreendendo agonistas do receptor toll-like e o uso desses conjugados para o tratamento de câncer. Portanto, se diferencia do pedido em tela, o qual se trata de uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos.

[020] As patentes US 10,745,425; US8,563,321; US7,276,343; US9,139,76 se relacionam a agentes que aumentam a intensidade e duração da quimioluminescência de sistema envolvendo HRP e substâncias quimioluminescentes, não estando relacionado com sistema bioluminescente baseado em luciferina-luciferase como o pedido em tela.

[021] Portanto, conclui-se que a maioria dos documentos supracitados se refere a substâncias amplificadoras de quimioluminescência, e algumas a enzimas e kits de quimioluminescência para detecção de substâncias, inclusive antígenos e anticorpos. Entretanto ressalta-se que a maioria desses kits se referem a sistemas quimioluminescentes que empregam o sistema peroxidase (HRP) e luminol, ou outras substâncias quimioluminescentes, e não a sistemas bioluminescentes que empregam luciferina-luciferase, sendo então conceitualmente e praticamente diferentes do pedido em tela. No caso dos sistemas bioluminescentes baseados em luciferina-luciferase como o desse pedido, ressalta-se que nenhum deles teve as mesmas características. Muitos métodos e kits, como o descrito por US 10,973,826, reivindicam o uso de anticorpos ou antígenos conjugados a algum marcador, como marcadores quimioluminescentes ou bioluminescentes, mas nenhum destes descreve a confecção do agente marcador consistindo de proteína de fusão fusionada com as características descritas. Ademais, ressalta-se que não existe qualquer reagente ou kit que use proteína de fusão bioluminescente como a solicitada nesta patente, que empregue a luciferase de Amydetes vivianii com porção ZZ da proteína A, e com a construção específica desenhada no invento.

[022] Assim, não há descrito na anterioridade uma proteína de fusão construída da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus e luciferase do vagalume Amydetes vivianii, altamente bioluminescente, estável e com alta afinidade a imunoglobulinas IgG, que possa ser utilizada em imunoensaios bioluminescentes para detecção de anticorpos primários para diferentes antígenos, ou em técnicas de Western Blot com revelação quimioluminescente, além de variadas outras aplicações que envolvam imunodetecção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[023] A presente invenção é apresentada e caracterizada nas reivindicações independentes, enquanto as reivindicações dependentes descrevem suas outras características ou modalidades, todas relacionadas à ideia inventiva principal.

[024] A presente invenção consiste em uma proteína de fusão construída da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus e luciferase do vagalume Amydetes vivianii, altamente bioluminescente, estável e com alta afinidade a imunoglobulinas IgG, que possa ser utilizada em imunoensaios bioluminescentes.

[025] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que é construída por engenharia genética mediante ligação do DNA da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus ao cDNA da luciferase de Amydetes vivianii, conforme a sequência anexada SEQ ID NO:1.

[026] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, cuja sequência de aminoácidos é codificada a partir da SEQ ID NO:1, conforme a sequência anexada SEQ ID NO:2.

[027] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão da SEQ ID NO:2 codificada a partir da sequência SEQ ID NO:1 como reagente bioanalítico luminescente em ensaios de ATP e ensaios enzimáticos.

[028] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão bioluminescente para ligação e marcação de anticorpos primários com bioluminescência.

[029] Em um quinto aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, em que os anticorpos primários marcados são utilizados em imunoensaios bioluminescentes.

[030] Em um sexto aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, em que a proteína de fusão bioluminescente é utilizada para detecção de determinados antígenos em amostras biológicas como o soro sanguíneo,saliva, secreções nasais, mas não limitado a esses, na presença de seus respectivos anticorpos primários, por meio da bioluminescência.

[031] Em um sétimo aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão bioluminescente na marcação de anticorpos primários com bioluminescência em Dot Blots e Western Blots.

[032] Em um oitavo aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão bioluminescente na marcação de anticorpos primários e os respectivos antígenos imobilizados em diferentes matrizes sólidas e semi-sólidas, com bioluminescência.

[033] Em um nono aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão bioluminescente como fase estacionária no processo de cromatografia de imunoafinidade para purificação de anticorpos primários.

[034] Em um décimo aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da SEQ ID NO:1 como gene repórter mais brilhante para marcar a presença in vivo e ex vivo de anticorpos primários ligados na superfície de células e tecidos, e posterior utilização desses em estudos de bioimagem de processos biológicos e patológicos, bem como em acompanhamento de respostas imunes em infecções bacterianas, fúngicas e virais.

[035] Em um décimo-primeiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da SEQ ID NO:2 como reagente bioanalítico para marcação com bioluminescência e detecção da presença de anticorpos primários para determinados antígenos, ou de determinados antígenos na presença dos respectivos anticorpos primários, para diferentes patologias em soro sanguíneo de pacientes.

[036] Em um décimo-segundo aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, cuja solução de ensaio bioluminescente da proteína de fusão é composta por D-luciferina 0,25 mM, ATP 2 mM, MgSO4 4 mM, CoA 0,10 mM, DTT 2 mM em Tris-HCl 0,10 M, pH 8,0.

[037] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, que utiliza da proteína de fusão bioluminescente na marcação de imunoprecipitados contendo complexos de anticorpos primários ligados aos respectivos antígenos, com bioluminescência.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[038] O principal objetivo da presente invenção é fornecer uma nova proteína de fusão bifuncional altamente bioluminescente para marcação de anticorpos baseada na porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus e luciferase do vagalume Amydetes vivianii, para finalidades de detecção bioluminescente de anticorpos e seus antígenos em imunoensaios e Western Blottings.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[039] Essas e outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição a seguir de algumas modalidades, dadas como exemplo não restritivo com referência às figuras anexas, em que:

[040] A Figura 1 apresenta a sequência de DNA codificante da proteína de fusão ZZ-AmyLuc. Em azul o ATG inicial, em amarelo o ATG da proteína ZZ e em verde o ATG da luciferase de Amydetes vivianii.

[041] A Figura 2 apresenta a tradução em sequência de amino-ácidos da sequência parcial do DNA codificante da proteína de fusão ZZ-AmyLuc, mostrando as partes relevantes para a construção. Em azul o ATG inicial e a cauda de histidina conferidos pelo vetor pCold (Takara), em amarelo o ATG inicial da proteína ZZ e em verde o ATG inicial da luciferase de Amydetes vivianii.

[042] A Figura 3 apresenta a sequência de aminoácidos completa da proteína de fusão ZZ-AmyLuc. Em azul o ATG inicial e a cauda de histidina conferidos pelo vetor pCold, em amarelo o ATG inicial da proteína ZZ e em verde o ATG inicial da luciferase de Amydetes vivianii.

[043] A Figura 4 apresenta o SDS-PAGE do processo de purificação da proteína de fusão ZZ-Amy, em que cada coluna representa: (1) marcadores de peso molecular; (2) luciferase purificada de Amydetes vivianii; (3) extrato bruto de células E. coli expressando a proteína de fusão ZZ-Amy; (4) volume morto; (5) eluato 1; (6) eluato 2; (7) eluato 3; (8) eluato 2 contendo a proteína de fusão ZZ-Amy após diálise; (9) marcadores de peso molecular.

[044] A Figura 5 apresenta cinética da reação bioluminescente da proteína de fusão ZZ-AmyLuc na presença de solução de substrato contendo d-luciferina 0,5 mM, ATP 2 mM e MgSO4 4 mM em Tris-HCl 0,1 M pH 8,0.

[045] A Figura 6 apresenta cinética da reação bioluminescente da proteína de fusão ZZ-AmyLuc na presença de solução de ensaio contendo d-luciferina 0,5 mM, ATP 2 mM, MgSO4 4 mM, CoA 25 mM em Tris-HCl 0,1 M pH 8,0.

[046] A Figura 7 apresenta detecção em câmara de fotodetecção de dot blot evidenciando anticorpos contra nucleoproteína comercial de SARS-COVID-2 marcados com proteína de fusão bioluminescente ZZ-AmyLuc na presença de solução de substrato.

[047] A Figura 8 apresenta detecção em câmera fotográfica de dot blot evidenciando anticorpos contra nucleoproteína comercial de SARS-COVID-2 marcados com proteína de fusão bioluminescente ZZ-AmyLuc na presença de solução de substrato.

[048] A Figura 9 apresenta detecção em câmera de fotodetecção de dot blot evidenciando diferentes quantidades de antígeno nucleoproteína comercial de SARS-COVID-2, imobilizados em membrana de nitrocelulose, e marcados com o respectivo anticorpo e com a proteína de fusão bioluminescente ZZ-AmyLuc, na presença de solução de substrato.

[049] A Figura 10 apresenta Western blot de luciferases usando anticorpo policlonal comercial contra luciferase de Photinus pyralis (Promega) e a proteína de fusão ZZ-AmyLuc como anticorpo secundário marcador: (1) proteína de fusão ZZ-AmyLuc; (2) luciferase selvagem de Amydetes vivianii; (3) 10 ng luciferase selvagem de Amydetes vivianii; (4) 50 ng luciferase selvagem de Amydetes vivianii; (5) 100 ng luciferase selvagem de Amydetes vivianii; (6) 200 ng luciferase selvagem de Amydetes vivianii. Exposição 1 min.

[050] A Figura 11 apresenta Western blot da nucleoproteína comercial de SARS-Covid-2 usando anticorpo da Anti-SARS-covid-2 de camundongo (CusaBio) e proteína de fusão ZZ-AmyLuc como anticorpo secundário, com exposição em câmara CCD por 1 min.(da esquerda para a direita)50, 100 e 200 ng.

[051] A Figura 12 apresenta Western blot da nucleoproteína comercial de SARS-Covid-2 (Cusabio) usando anticorpo Anti-SARS-covid-2 de camundongo (CusaBio) e proteína de fusão ZZ-AmyLuc como anticorpo secundário, com exposição em câmara CCD por 5 min.

[052] A Figura 13 apresenta dot blots comparando o sinal luminescente emitido por diferentes anticorpos marcados com: (esquerda) a proteína de fusão ZZ-AmyLuc com solução de luciferina e ATP, e (direita) anticorpo secundário conjugado com HRP e solução de substrato comercial da GE HealthCare. Nota-se que o sinal luminescente emitido usando o sistema de revelação com proteína de fusão ZZ-AmyLuc é mais forte do que aquele que usa o sistema quimioluminescente com HRP, quando utilizado para revelar IgG, conforme mostrado na marcação e titulação do anticorpo anti-Hemocianina (Anti-HMC da SIGMA).

[053] A figura 14 apresenta imagem de colônias de bactérias E. coli BL21 induzidas para expressão de luciferase de Amydetes vivianii selvagem (esquerda) e proteína de fusão ZZ-AmyLuc (a direita), emitindo bioluminescência após adição de D-luciferina em pH ácido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[054] A presente invenção consiste em uma nova proteína de fusão altamente bioluminescente com afinidade a imunoglobulinas G (IgG)de diferentes fontes biológicas, baseada na porção ZZ de proteína A de Staphylococcus aureus na região N-terminal fusionada à luciferase do vagalume Amydetes vivianii, e sua utilização para finalidades de marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios bioluminescentes e Western Blottings.

[055] Neste pedido, é pleiteado não somente a proteína de fusão bioluminescente como reagente analítico para imunoensaios, como também a construção de DNA e respectivas sequencias de cDNA e aminoácidos que levam a produção desta proteína.

[056] A concepção, desenho e construção da proteína de fusão constituem novidade, em usando uma luciferase nova e a porção ZZ da proteína A, em uma combinação sem precedentes.

[057] As técnicas de engenharia genética usadas na construção da proteína de fusão, bem como a metodologia de expressão heteróloga da proteína em bactérias, baseada na transformação e indução de bactérias com plasmídeo contendo o construto em epígrafe, e o processo de purificação da respectiva proteína, não constituem novidade alguma, e serão descritos meramente para informar o processo de produção da proteína de fusão, não constando, portanto, nas reivindicações.

[058] Abaixo, é descrito o processo de construção da proteína de fusão ZZ-AmyLuc, sua expressão em bactérias e purificação, os ensaios que atestam sua funcionalidade bioluminescente e imunológica, e suas aplicações efetivas em imunoensaios e eletroforese.

[059] Construção da proteína de fusão

[060] A proteína de fusão foi construída por engenharia genética mediante ligação do DNA da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus ao cDNA da luciferase de Amydetes vivianii, originalmente inserida em vetor pCold (Takara, Japão).

[061] Para realizar a construção do DNA que codifica a proteína de fusão bioluminescente, foram realizadas as seguintes etapas experimentais:

[062] (1) primeiramente, o DNA da porção ZZ da proteína A foi amplificado com iniciadores (primers) contendo sítios de restrição NdeI nos seus terminais a partir do vetor pCP contendo o gene da proteína ZZ (Davet et al., 1997) por PCR. Os primers utilizados para amplificação do fragmento foram: (ZZ-For) GAT ATA CAT ATG GCG CAA CAC; (ZZ-Rev) GCC GCA TAT GGA TCC ATG GAC TAG TGA TC;

[063] (2) o fragmento de DNA assim amplificado foi digerido com a enzima de restrição NdeI, e purificado com kit de purificação de PCR da PROMEGA;

[064] (3) o vetor pCold (Takara) contendo o DNA da luciferase de Amydetes vivianii (pCold-AmyLuc) foi também digerido com a enzima de restrição NdeI na porção anterior ao seu N-terminal e então defosforilado com fosfatase alcalina e purificado;

[065] (4) o fragmento de DNA de ca 174 bp da proteína ZZ amplificado e digerido com enzima NdeI, e o vetor pColdAmyLuc digerido com NdeI e defosforilado, foram ligados com T4 Ligase de kit de ligação da Takara (Japão);

[066] (5) a reação de ligação foi utilizada para transformar células E.coli XL1-Blue, onde 1 µl de solução de ligação foi misturado a 50 µl de células ultra competentes XL1-Blue (Agilent), submetidas a choque térmico por 30 seg. a 42°C e retorno em gelo por 2 min, adição de 200 µl de meio SOC e incubação a 37°C por 1 h sob agitação, e finalmente plaqueamento de 250 µl da mistura de bactérias transformadas em placas contendo meio Luria-Bertani/ágar suplementado com ampicilina 100 µg/mL, e as placas incubadas durante a noite a 37°C;

[067] (6) as colônias E. coli recombinantes foram induzidas com IPTG (Isopropiltiogalactosídeo) 1 mM, e selecionadas pela bioluminescência emitida mediante adição de luciferina 1 mM em tampão citrato 50 mM pH 5,0;

[068] (7) 4 colônias foram isoladas, cultivadas em 5 mL de meio LB suplementado com ampicilina 100 µg/mL durante a noite a 37°C, e no dia seguinte a cultura de bactérias foi centrifugada e o DNA plasmidial extraído e estocado;

[069] (8) 0.5 µl das amostras de DNA de cada preparação plasmidial foram submetidas à amplificação por PCR utilizando primer forward para DNA da proteína ZZ (ZZ-F) e reverse para pCold (pC-R), ou primers forward (pC-F) e reverse (pC-R)para vetor pCold (Takara), com o intuito de verificar qual amostra continha o DNA codificante da proteína de fusão (o plasmídeo controle contendo apenas a luciferase de Amydetes no vetor pCold irá amplificar um fragmento de ~1,6 kb, menor ao tamanho esperado do fragmento de DNA respectivo à proteína de fusão contendo porção ZZ + luciferase de Amydetes amplificado, de ~1,9 kb, seja com primers pC-F e pC-R, ou com primers ZZ-F e pC-R);

[070] (9) as amostras amplificadas com DNA com peso molecular superior (~2kb) ao DNA controle da luciferase de Amydetes vivianii (~1.6kb) foram então selecionadas; (10) o DNA das amostras selecionadas foi sequenciado e a sequência da proteína de fusão ZZ-AmyLuc confirmada.

[071] Expressão e purificação da proteína de fusão Para a expressão e purificação da proteína de fusão funcional, foram realizadas as seguintes etapas:

[072] (1) foram transformadas 50 µl de células de E. coli BL21-DE3 (Agilent Technologies, EUA) com 2.5 µl de DNA plasmidial contendo o gene da proteína de fusão;

[073] (2) uma das colônias transformantes foi repicada, crescida em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) mais 5 µL ampicilina (100 mg/mL) a 37° C em incubadora sob agitação de 225 rpm durante a noite;

[074] (3) Essa mini-cultura foi transferida para 100 mL de meio líquido LB, permanecendo na incubadora sob agitação de 225 rpm a 37° C até atingir a absorbância em 600 nm ~0,4;

[075] (4) a cultura foi então induzida para expressão de proteína com IPTG 0,4 mM a 18°C durante 15 h;

[076] (5) a cultura foi centrifugada a 2500g por 15 min a 4°C;

[077] (6) o precipitado de bactérias foi novamente suspenso em 3 mL de tampão de extração (Tris-HCl 25 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0; glicerol 10%, triton X-100 1%, DTT 2 mM e coquetel inibidor de protease) gelado e sonicado (Misonix, Nova York, USA) com 4 pulsos em ultrasonicador;

[078] (7) o homogeneizado foi centrifugado a 15.000g a 4°C por 15 min;

[079] (8) o sobrenadante foi utilizado em ensaios iniciais e na purificação posterior da proteína de fusão;

[080] (9) a proteína de fusão foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna contendo resina de Níckel-agarose (QIAGEN), conforme procedimentos conhecidos;

[081] (10) a proteína de fusão purificada foi estocada a 4°C, e empregada para a caracterização cinética de suas propriedades de bioluminescência, bem como quanto a antigenicidade com diferentes anticorpos IgG e em Western Blots, e comparada com ensaio comercial usando kit quimioluminescente baseado em HRP/luminol da GE Health Care.

[082] Medidas de Atividade bioluminescente e quimioluminescente

[083] As atividades bioluminescentes das culturas líquidas de E. coli expressando a proteína de fusão, e os ensaios de atividade bioluminescente in vitro da proteína de fusão ZZ-AMyLuc foram medidas usando o luminômetro AB2200 (ATTO, Japão). Para os ensaios de bioluminescência in vivo, 90 μL da cultura de bactérias induzidas para expressão de proteína de fusão foram misturados com 10 μL de D-luciferina (Promega, EUA) 10 mM diluída em tampão citrato de sódio 50 mM pH 5,0, sendo a intensidade medida em cps (counts por segundo) durante 10 segundos. Para os ensaios in vitro da atividade bioluminescente, 85 μL de tampão Tris-HCl 0,10 M pH 8,0 foram misturados com 5 μL de proteína de fusão ZZAmyLuc ou luciferase selvagem de Amydetes vivianii, 5 μL de D-luciferina 10 mM e 5 μL de solução contendo MgSO4 80 mM e ATP 40 mM. As medidas de atividade quimioluminescente do kit comercial da GE HealthCare foram feitos misturando-se 1 µl de anticorpo secundário conjugado com HRP diluído 10 vezes, 50 µl de solução de substrato 1 e 50 µl de solução de substrato 2, e medindo-se a atividade em luminômetro. Para fins comparativos, a atividade bioluminescente da proteína de fusão ZZ-AMyLuc com solução de substrato foi realizada misturando-se 1 ul de proteína de fusão ZZ-AmyLuc diluída 10 vezes e 99 ul da respectiva solução de ensaio descrita acima. Os valores de atividade reportados são resultado da média de pelo menos três ensaios.

[084] Indução da expressão de bioluminescência das colônias in vivo

[085] Para atestar a potencialidade de uso do DNA da proteína de fusão ZZ-Amy-Luc como gene repórter bioluminescente, colônias de bactérias transformadas com vetor pC-ZZ-AmyLuc, conforme descrito anteriormente, foram repicadas em meio semissólido LB/Amp, crescidas a 37° C. No dia seguinte uma réplica das colônias foi obtida com membrana de nitrocelulose, e então colocada em outra placa de Petri LB/Amp contendo IPTG 1 mM. A placa foi incubada 24 h à 22°C e então borrifada com luciferina 1 mM em tampão citrato 50 mM pH 5,0, e imagem fotográfica da bioluminescência foi obtida com câmera fotográfica Canon Ti5.

[086] Espectros de bioluminescência

[087] Os espectros de bioluminescência foram obtidos utilizando o espectroluminômetro de alta sensibilidade com câmera CCD refrigerada (LumiF SpectroCapture AB-1850, ATTO, Japão). Para os ensaios, 5 µL de luciferase ou proteína de fusão ZZ-AmyLuc foram misturados com 90 μL da solução de ensaio (85 µL de tampão Tris-HCl 0,10 mM pH 8,0; 5 μL de Dluciferina 10 mM) e 5 μL de solução contendo MgSO4 80 mM e ATP 40 mM) num microtubo transparente colocado no espectroluminômetro. A janela de emissão foi mantida em 1 mm, a sensibilidade do equipamento foi mantida em Normal, e o tempo de integração foi de 5 segundos. O espectro reportado é resultado de pelo menos três ensaios independentes.

[088] Ensaios de Termoestabilidade

[089] Ensaios de termoestabilidade foram realizados incubando-se as amostras de proteína de fusãoZZ-AmyLuc purificadas em tubos de microcentrífuga, na ausência ou presença de glicerol 15%, a 4°C e a 37°C durante períodos que variavam de várias horas a meses.

[090] Dot Blots

[091] Os dot blots foram realizados para verificar a ligação da proteína de fusão com anticorpos primários, ligados ou não aos seus respectivos antígenos, e sua atividade bioluminescente.

[092] Para a detecção somente dos anticorpos imobilizados, 1 µl de amostra de diferentes anticorpos primários IgG (anti-luciferase de vagalume comercial da PROMEGA, Anti-Nucleoproteína de SARS-COVID-2 comercial da CusaBio, anti-hemocianina da SIGMA, anti-peroxidase de rabanete PROMEGA) nas concentrações variando entre 1-500 ng/µl foram pipetadas em membrana de nitrocelulose, e deixadas secar. Em seguida, a membrana foi incubada em solução de Blotto contendo leite desnatado na concentração de 5% em tampão PBS-Tween por 1h sob agitação. Terminado o processo, a membrana foi enxaguada 2 vezes rapidamente com PBS-Tween, e então incubada com anticorpo secundário conjugado com HRP do kit da GE HealthCare, ou com a proteína de fusão ZZ-AmyLuc diluída 1/50 a 1/1000 vezes. A revelação foi efetuada por quimiluminescência em ambos os casos, sendo que com o anticorpo conjugado com HRP utilizou-se 1 mL da solução de substrato do próprio kit, enquanto que com a proteína de fusão ZZ-AmyLuc, pipetou-se sobre a membrana 0,5 a 1 mL de solução de ensaio contendo luciferina 0,5 mM, ATP 2 mM, MgSO4 4mM, CoA 0,25 mM em Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. A detecção da luminescência foi efetuada em câmara CCD LumiCapture II (ATTO, Japão), ou fotograficamente usando câmera Canon Ti5.

[093] Para a detecção de anticorpos ligados aos respectivos antígenos, 1 µl de amostra de diferentes antígenos (luciferase de vagalume comercial da PROMEGA Quantilum, Nucleoproteína de SARS-COVID-2 comerciais da CusaBio, hemocianina da SIGMA, peroxidase de rabanete PROMEGA), nas concentrações variando entre 1-500 ng/µl, foram pipetadas em membrana de nitrocelulose, e deixadas secar. Em seguida, a membrana foi incubada em solução de Blotto contendo leite desnatado na concentração de 5% em tampão PBS-Tween por 1h sob agitação. Terminado o processo, a membrana foi enxaguada 2 vezes rapidamente com PBS-Tween, e então incubada na mesma solução contendo o respectivo anticorpo primário em concentração variando de 1/1000 a 1/5000 durante 1 h com agitação. Ao término da incubação, a membrana foi enxaguada rapidamente 2 vezes, e então 2 vezes sob agitação por 10 min. Em seguida a membrana foi incubada com anticorpo secundário conjugado com HRP do kit da GE HealthCare, ou com a proteína de fusão ZZ-AmyLuc diluída 1/50 a 1/1000 vezes. A revelação foi efetuada por quimiluminescência em ambos os casos, sendo que com o anticorpo conjugado com HRP utilizou-se 1 mL da solução de substrato do próprio kit, enquanto que com a proteína de fusão ZZ-AmyLuc, pipetou-se sobre a membrana 0,5 a 1 mL de solução de ensaio contendo luciferina 0,5 mM, ATP 2 mM, MgSO4 4mM, CoA 0,25 mM em Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. A detecção da luminescência foi efetuada em câmara CCD LumiCapture II (ATTO, Japão), ou fotograficamente usando câmera Canon Ti5.

[094] Western Blots

[095] Para os Western Blots realizou-se primeiro eletroforese desnaturante de SDS das proteínas (antígenos), e então a transferência horizontal de proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose, conforme procedimentos já estabelecidos recomendados pelo kit ECL Western Blotting da GE HealthCare. Utilizou-se para este procedimento as seguintes amostras de proteínas: luciferase comercial de Photinus pyralis (PROMEGA); luciferase purificada de Amydetes vivianii, amostras das etapas de purificação da proteína de fusão ZZ-AMyLuc; Nucleoproteína de SARS-COVID2. Em seguida as membranas de nitrocelulose foram tratadas pelos mesmos procedimentos descritos para Dot Blots, e reveladas por quimiluminescência usando kit da GE HealthCare ou por bioluminescência usando a proteína de fusão e sua respectiva solução de ensaio.

[096] Resultados

[097] Construção da proteína de fusão. O DNA da proteína de fusão foi construído pela ligação do DNA correspondente a porção ZZ da proteína A (174 bp) ao cDNA da luciferase de Amydetes vivianii. A proteína de fusão codificada por este DNA quimérico consiste em: uma sequência de DNA conferida pelo vetor pCold (Takara) de poli (CAT), que codifica cauda de poli-histidina no N-terminal da proteína, a qual possibilita a purificação da proteína de fusão por cromatografia de afinidade com níquel; (2) o fragmento de 174 bp que codifica os 58 aminoácidos da proteína ZZ seguido do DNA que codifica aa luciferase (~1,64 kb). A sequência de DNA da proteína de fusão é mostrada na Figura 1, e na listagem de sequências como SEQ ID NO:1. A Figura 2 mostra a respectiva tradução da sequência parcial de DNA para sequência de aminoácidos da porção fusionada da proteína ZZ com a luciferase. A proteína de fusão completa tem 699 resíduos de aminoácidos, codificando um polipeptídio de ca 75 kDa, conforme Figura 3 e SEQ ID NO:2.

[098] Expressão e purificação da proteína de fusão. O plasmídeo pCold-ZZ-AmyLuc foi usado então para transformar células E. coli BL21 e expressar a proteína mediante indução com IPTG a 18°C. A proteína de fusão ZZ-Amy foi expressa em bactérias e purificada por cromatografia de afinidade com níckel-agarose (Figura 4). O rendimento da expressão foi de aproximadamente 10 mg de luciferase/L de cultura de células. O peso molecular aproximado da proteína de fusão foi de ca 75 kDa, conforme esperado.

[099] Caracterização das propriedades cinéticas e de bioluminescência da proteína de fusão

[0100] A seguir, são mostradas as propriedades de bioluminescência que atestam a funcionalidade da proteína de fusão como reagente analítico bioluminescente. A tabela 1 resume as propriedades cinéticas e de bioluminescência da proteína de fusão, e as compara com a luciferase selvagem de Amydetes vivianii e com a enzima HRP conjugada a anticorpo secundário do kit ECL da GE Healthcare.

[0101] Atividade bioluminescente. A atividade bioluminescente específica da proteína de fusão ZZ-AMyLuc foi muito próxima da atividade da luciferase recombinante selvagem de Amydetes vivianii, tendo constante catalítica (kcat) semelhante (Tabela 1). Isto atesta que a anexação da porção ZZ da proteína A ao N-terminal da luciferase de Amydetes vivianii resulta em eficiência catalítica comparável à luciferase selvagem, que é considerada uma das luciferases mais eficientes.

[0102] Cinética. A cinética da reação luminescente na presença de luciferina, ATP e magnésio mostra um rápido flash seguido de uma cinética de decaimento muito lenta que se sustenta por vários minutos em intensidade elevada (Figuras 5 e 6), com tempo de meia vida de 54 min. Esta característica cinética lenta permite que o sinal luminescente, mesmo quando mais fraco, possa ser detectado por longa exposição ou por integração. Na presença de CoA e outros agentes sulfidrílicos na solução de ensaio, a cinética se torna mais lenta e sustentada por várias horas com tempo de meia vida de ~140 min.

[0103] Termoestabilidade. A proteína de fusão mostrou-se muito termoestável, mantendo 38% de atividade quando incubada a 37°C por 24 h, e 60% da atividade quando estocada a 4°C por 37 dias, e 80% de atividade por 60 dias quando incubada na presença de glicerol 15%.

[0104] Espectro de bioluminescência. A emissão de luz é tipicamente na região do verde, com espectro com pico de emissão em ~550 nm (Tabela 1), coincidindo com o espectro da luciferase selvagem.

[0105] Atividade imunogênica da proteína de fusão e uso em imunoensaios e eletroforese

[0106] A seguir, são apresentados experimentos que demonstram a capacidade de ligação da proteína de fusão a anticorpos primários IgG, e sua consequente aplicabilidade em imunoensaios.

[0107] Atividade imunogênica em dot blots. A atividade imunogênica da proteína de fusão ZZ-AmyLuc foi demonstrada com diferentes IgGs, especialmente de coelho, incluindo Anti-SARS-COVID, anti-Firefly luciferase, anti-HRP e anti hemocianina. O sinal bioluminescente é facilmente detectado por câmaras CCD tradicionais (LighTCapture 2 ATTO, Japão) após exposição durante 1 min, e é suficientemente forte para ser detectado também fotograficamente (Figuras 7 e 8). De acordo com exemplo mostrado nas Figuras 7 e 8, podem ser facilmente detectados anticorpos de coelho contra nucleoproteína de SARS-COVID-2 na quantidade > ou = 1 ng por detecção com câmara de fotodetecção CCD, e acima de 10 ng por detecção fotográfica.

[0108] Em ensaio de detecção do antígeno SARS-Covid-2 imobilizado em membrana de nitrocelulose, usando o respectivo anticorpo e proteína de fusão ZZ-AmyLuc, foi possível detectar pelo menos 1 ng de antígeno (Fig.9), sendo possível se detectar em princípio menos do que esta quantidade de antígeno.

[0109] Atividade imunogênica em Western Blots. Em Western Blots, a proteína de fusão se ligou a anticorpos primários contra várias proteínas antigênicas, entre as quais a luciferase de vagalume (Figura 10), Nucleoproteína de SARSCOVID-2 (Figuras 11 e 12), hemocianina e peroxidase de rabanete (HRP).

[0110] Comparação com kit de detecção da Agilent

[0111] Em Western Blots e dot blots, a revelação bioluminescente de anticorpos e respectivos antígenos ligados, usando o sistema ZZ-AmyLuc e sua solução de ensaio contendo luciferina e ATP, mostrou-se ligeiramente mais brilhante e eficiente que o sistema quimioluminescente do kit da GE HealthCare que usa anticorpo secundário conjugado com HRP, mostrando sinal de maior intensidade (Figura 13). A medida de atividade luminescente comparativa mostrou que o sistema usando a proteína de fusão ZZ-AmyLuc com sua solução de substrato produziu um sinal luminescente ligeiramente superior ao da enzima HRP do kit da GE Healthcare, nas respectivas condições de ensaio (Tabela 1). Além disto, a duração da bioluminescência da reação bioluminescente da proteína ZZ-Amy foi muito mais prolongada do que usando o sistema quimioluminescente comercial, tendo um tempo de meia vida de 54 min em ensaio clássico com luciferina, ATP e magnésio, 138 min com solução de ensaio com aditivos, enquanto que o sistema HRP teve um tempo de meia vida de apenas 12 min. Além disto, o reagente Amy-Luc mostrou-se extremamente estável, podendo ser estocado a 4°C por mais de 2 meses na presença de glicerol 15%, sem perda considerável de atividade.

[0112] Uso do gene da proteína de fusão como gene repórter para marcar células

[0113] O DNA da proteína de fusão ZZ-AmyLuc pode ser utilizado também como gene repórter para marcar células com bioluminescência verde-azulada para diferentes finalidades já estabelecidas na literatura. Na Figura 14, mostramos foto de colônia de bactérias E. coli BL21 transformadas e induzidas para expressão da proteína de fusão, emitindo bioluminescência após adição de D-luciferina em pH ácido.

[0114] Aplicações

[0115] Assim, de acordo com os experimentos mostrados acima, a presente proteína de fusão ZZ-AMyLuc pode ser utilizada para as seguintes finalidades:

[0116] 1. Uso da proteína de fusão ZZ-AMyLuc como “anticorpo secundário” bioluminescente para marcação bioluminescente de anticorpos IgG e detecção fotográfica em imunoensaios tipo Elisa;

[0117] 2. Uso da proteína de fusão como “anticorpo secundário” bioluminescente para marcação de anticorpos primários e detecção por bioimagem em câmaras de fotodetecção de anticorpos IgG em imunoensaios tipo Elisa;

[0118] 3. Uso da proteína de fusão como “anticorpo secundário” bioluminescente para marcação bioluminescente e revelação de proteínas antigênicas em Western Blotting por bioluminescência;

[0119] 4. Uso da proteína de fusão como “anticorpo secundário” bioluminescente para detecção de determinados antígenos presentes em amostras biológicas como saliva, swab nasal, urina ou soro sanguíneo (mas não restritas a estes), imobilizados em diferentes matrizes, como nitrocelulose (mas não limitadas a esta), na presença dos respectivos anticorpos primários, e detecção fotográfica ou por bioimagem em câmaras de fotodetecção em imunoensaios;

[0120] 5. Detecção in vivo e in situ de interação de anticorpos primários IgG com seus respectivos antígenos por marcação bioluminescente com proteína de fusão em imunohistoquímica, utilizando microscópios de fluorescência e bioluminescência;

[0121] 6. Marcação com a proteína de fusão e detecção bioluminescente de imunoprecipitados contendo complexos de anticorpos primários ligados aos respectivos antígenos, com bioluminescência;

[0122] 7. O gene da proteína de fusão pode ser utilizado como gene repórter mais efetivo para marcação celular em estudos de expressão gênica e bioimagem em ensaios que requeiram maior sensibilidade, por se tratar de um gene altamente expresso em bactérias, cuja luciferase apresentase cataliticamente eficiente e brilhante e estabilizada pelo domínio ZZ. Cita-se como exemplo a transformação de bactérias com o vetor plasmidial contendo o gene da luciferase, como exemplo de gene repórter (Figura 13). Utilizando as técnicas anteriormente descritas, bactérias E. coli são transformadas e induzidas por IPTG a expressar a enzima luciferase, tornando as células bioluminescentes aptas para avaliar o grau de expressão gênica de promotores mediante uso de indutores (no presente exemplo o IPTG) ou inibidores (Figura 14). Para avaliar e quantificar a expressão gênica por bioluminescência utilizam-se técnicas corriqueiras de luminometria e fotodetecção. Analogamente, usando-se técnicas específicas de domínio público de transformação e transfecção de outros tipos de células como leveduras e células de mamíferos, pode-se utilizar o gene da luciferase como gene repórter nessas células.

[0123] O depositante, ao depositar este pedido de patente perante o órgão competente/garante, busca e pretende: (i) nomear os inventores em respeito a seus respectivos direitos morais; (ii) indicar inequivocamente que é possuidor do segredo industrial e titular de qualquer forma de propriedade intelectual que dele derivar e o depositante desejar; (iii) descrever em detalhes o conteúdo objeto do segredo, comprovando sua existência nos planos físico e jurídico; (iv) estabelecer a relação entre os exemplos/concretizações e o conceito inventivo segundo a cognição do depositante e seu contexto, para demonstrar com clareza o alcance de seu bem intangível tutelado e/ou tutelável; (v) requerer e obter os direitos adicionais previstos para as patentes, se o depositante optar por prosseguir com o procedimento administrativo até o final.

[0124] Desde logo adverte-se que eventual uso comercial requer autorização do possuidor/titular e que o uso não autorizado enseja sanções previstas em Lei. Neste contexto, dado o amplo detalhamento segundo o qual o conceito foi revelado pelo depositante, os versados na arte poderão, sem muito esforço, considerar outras formas de concretizar a presente invenção de formas não idênticas às meramente exemplificadas acima. Entretanto, tais formas são ou poderão ser consideradas como dentro do escopo de uma ou mais das reivindicações anexas.

Claims

Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, caracterizada pela sequência de DNA que codifica a proteína de fusão ser construída por engenharia genética mediante ligação do DNA da porção ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus ao cDNA da luciferase de Amydetes vivianii, conforme a sequência anexada SEQ ID NO:1.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, caracterizada pela sequência de aminoácidos codificada a partir da SEQ ID NO:1, conforme a sequência anexada SEQ ID NO:2.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão da SEQ ID NO:2 codificada a partir da SEQ ID NO:1 como reagente bioanalítico luminescente em ensaios de ATP e ensaios enzimáticos.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente para marcação de anticorpos primários com bioluminescência.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela utilização dos anticorpos primários marcados em imunoensaios bioluminescentes.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação de anticorpos e antígenos e detecção de antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente para detecção de determinados antígenos em amostras biológicas como saliva, swab nasal, urina e soro sanguíneo, mas não limitado a esses, na presença dos respectivos anticorpos primários, por meio da bioluminescência.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente na marcação de anticorpos primários com bioluminescência em Dot Blots e Western Blots.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente na marcação de anticorpos primários e os respectivos antígenos imobilizados em diferentes matrizes sólidas e semi-sólidas, com bioluminescência.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente como fase estacionária no processo de cromatografia de imunoafinidade para purificação de anticorpos primários.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizada pela utilização da SEQ ID NO:1 como gene repórter mais brilhante para marcar a presença in vivo de anticorpos primários ligados na superfície de células e tecidos, e posterior utilização desses em estudos de bioimagem de processos biológicos e patológicos, bem como em acompanhamento de respostas imunes em infecções bacterianas, fúngicas e virais.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela utilização da SEQ ID NO:2 como reagente bioanalítico para marcação com bioluminescência e detecção da presença de anticorpos primários para determinados antígenos para diferentes patologias em soro sanguíneo de pacientes.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização da proteína de fusão bioluminescente para marcação de imunoprecipitados contendo complexos de anticorpos primários ligados aos respectivos antígenos, com bioluminescência.
Proteína de fusão bioluminescente para marcação e detecção de anticorpos e antígenos em imunoensaios, eletroforese e bioimagem, caracterizada pelo uso de solução de ensaio bioluminescente da proteína de fusão ser composta por luciferina 0,25 mM, ATP 2 mM, MgSO4 4 mM, CoA 0,10 mM, DTT 2 mM em Tris-HCl 0,10 M, pH 8,0.