JPS6122254A - バイオルミネツセンス連結結合定量法 - Google Patents
バイオルミネツセンス連結結合定量法Info
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- JPS6122254A JPS6122254A JP59214022A JP21402284A JPS6122254A JP S6122254 A JPS6122254 A JP S6122254A JP 59214022 A JP59214022 A JP 59214022A JP 21402284 A JP21402284 A JP 21402284A JP S6122254 A JPS6122254 A JP S6122254A
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- G01—MEASURING; TESTING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
免役定量法は、臨床医学の分野において、診断の目的に
広く利用されている。生物学的液体中には、多棟の分子
、たとえばタンパク質−ホルモン−ウィルス、外因性薬
剤等が存在するが、これらは、上述の技術によって定量
的に測定することができる。これらの方法は、すべて、
抗体による抗原の特異的認識を基盤とするものである。
広く利用されている。生物学的液体中には、多棟の分子
、たとえばタンパク質−ホルモン−ウィルス、外因性薬
剤等が存在するが、これらは、上述の技術によって定量
的に測定することができる。これらの方法は、すべて、
抗体による抗原の特異的認識を基盤とするものである。
放射免疫定量法（Ｒ工Ａ）は、最初ヤロー（Ｙａｌｏｗ
）とパーツｙ （Ｂｅｒｅｏｎ ） Ｋより、１９６０
年に開発され、放射性同位元素を標識として使用するも
のであるが、今なお、広範囲−利用されている。
）とパーツｙ （Ｂｅｒｅｏｎ ） Ｋより、１９６０
年に開発され、放射性同位元素を標識として使用するも
のであるが、今なお、広範囲−利用されている。
以下の式（１）に示すように、Ｒ１は、限られた数の抗
体（Ａｂ ）結合部位に対する非標識抗原（Ａｇ ）と
標識抗原（Ａｇ” ）のｍ」の競合に基づくもので、そ
の結果、標識は遊離状態と結合状態に分配される。遊離
または結合４ｆＡ識抗原のいずれかを測定すれは、抗原
の定置が可能になる。Ｒ１，すなわち競合的結合測定法
は、式（１）のように例示することができる。
体（Ａｂ ）結合部位に対する非標識抗原（Ａｇ ）と
標識抗原（Ａｇ” ）のｍ」の競合に基づくもので、そ
の結果、標識は遊離状態と結合状態に分配される。遊離
または結合４ｆＡ識抗原のいずれかを測定すれは、抗原
の定置が可能になる。Ｒ１，すなわち競合的結合測定法
は、式（１）のように例示することができる。
Ａｇ−Ａ、ｂ
ＲＩＡは広く応用でき、感度、％異性の高い方法ではあ
るが、本質的な欠点もある。すなわち、遊離標識と結合
標識の分離工程の必要性、同位元素による健康上の危険
、放射性同位元素の処理の問題、高価な装置の使用、同
位元素標識試薬の貯蔵寿命か短いことなどである。通常
、標識は１２５Ｉであるが １２５１−標識試薬の貯蔵
寿命は数週間のオーダーである。
るが、本質的な欠点もある。すなわち、遊離標識と結合
標識の分離工程の必要性、同位元素による健康上の危険
、放射性同位元素の処理の問題、高価な装置の使用、同
位元素標識試薬の貯蔵寿命か短いことなどである。通常
、標識は１２５Ｉであるが １２５１−標識試薬の貯蔵
寿命は数週間のオーダーである。
以上概述したＲＩＡの欠点のため、非同位元素標識に基
づく定量法が、この１０年間に開発されてきた。広く利
用されている例は、放射性同位元素ではなく、酵素を抗
原に結合させる酵素免疫定量法（ＲＩＡ）である。遊離
標識抗原と結合標識抗原の分離が必要な定量法（ＲＩＡ
のような）は不均一定量法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ
ａｓｓａｙ ）と呼ばれる。抗原−抗体反応に除して
のインディケータ−分子の性質の修飾により、上述のよ
うな分離工程を要しない定量法は均一定量法（ｈｏｍｏ
ｇｅｎｏｕａ ａｓｓａｙ ）と呼ばれる。
づく定量法が、この１０年間に開発されてきた。広く利
用されている例は、放射性同位元素ではなく、酵素を抗
原に結合させる酵素免疫定量法（ＲＩＡ）である。遊離
標識抗原と結合標識抗原の分離が必要な定量法（ＲＩＡ
のような）は不均一定量法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ
ａｓｓａｙ ）と呼ばれる。抗原−抗体反応に除して
のインディケータ−分子の性質の修飾により、上述のよ
うな分離工程を要しない定量法は均一定量法（ｈｏｍｏ
ｇｅｎｏｕａ ａｓｓａｙ ）と呼ばれる。
不拘−Ｅ工Ａは、米国特ｆｆ第３，６５４，０９０号お
よび第３，７９１．９３２号に記載されているような、
酵素連結イムノソルベント定量法（凪よりム）である。
よび第３，７９１．９３２号に記載されているような、
酵素連結イムノソルベント定量法（凪よりム）である。
１！！ＬＩ ＳＡでは、通常、抗体は固体支持体忙結合
させ、遊離標識と結合標識の分離が単純化されている。
させ、遊離標識と結合標識の分離が単純化されている。
標識として最も共通して用いられる酵素は、ワサビダイ
コン（ｈｏｒｓθｒａｄｉｓｈ ）ノぐ一オキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダ一ゼおよ
びアルカリホスファターゼである。
コン（ｈｏｒｓθｒａｄｉｓｈ ）ノぐ一オキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダ一ゼおよ
びアルカリホスファターゼである。
均−Ｅ工Ａは、米国特許第３，８１７，８３７号に記載
されているような、酵累徐合免役定量法（ｅｎｚｙｍｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ；
ＦＩＭ工Ｔ）である。ＩＭ■Ｔの原理は結合および遊
離抗原−酵素の性質が異なることに基づくものである。
されているような、酵累徐合免役定量法（ｅｎｚｙｍｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ；
ＦＩＭ工Ｔ）である。ＩＭ■Ｔの原理は結合および遊
離抗原−酵素の性質が異なることに基づくものである。
活性がリガンド特異的抗体によって変わり、最も一般的
に使用される＃：木はリゾチーム、マレートデヒドロゲ
ナーゼおよびグルコース−６−ホス７エートデヒドロゲ
ナーゼである。
に使用される＃：木はリゾチーム、マレートデヒドロゲ
ナーゼおよびグルコース−６−ホス７エートデヒドロゲ
ナーゼである。
ＥＬ工８ＡおよびＮｆＭ工Ｔの例はいずれも、１診断免
疫学（Ｄｉａｇｎ０８ｔｉＣ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）
’ （ケイジエス他（Ｗ、ＫｅｉｔｇｅｓおよびＭ＋
Ｎａｋａｍｕｒａ ） Ｈａ ）、ＣｏＣｏ１１ｅ ｏ
ｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏ：Ｌｏｇｉａｔｓ、
８ｋｏｋｉｅ、工１１゜１９８０に論じられている。こ
れらの定量法は、標識として放射性同位元素の代わりに
酵素を用いるので、試薬の貯蔵寿命が伸びるなど、ＲＩ
ｊｌＣ比べていくつかの利点がある。ＩＩＭ工Ｔには、
さ・らに、分離工程を安しないという利点がある。この
定量法の欠点は、環境の変化に高い感受性を示し、触媒
活性が著しく変動するという、酵素の固有の性質に基づ
くものである。すなわち、ｍｓとして使用する酵素は、
その定量法１ｃ要求される感度条件を満たすため例、高
い触媒活性を示すよ５に注意深く選択されねばならない
。しかも、環境の変化によって生じやすい酵素の固有の
不安定性から、酵素活性をほとんど破壊しないカップリ
ング操作を選ぶのも難しい。したがって、これらの定量
法の使用には厳しい制限があり、一般に低分子化合物の
定量にしか応用できない。
疫学（Ｄｉａｇｎ０８ｔｉＣ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）
’ （ケイジエス他（Ｗ、ＫｅｉｔｇｅｓおよびＭ＋
Ｎａｋａｍｕｒａ ） Ｈａ ）、ＣｏＣｏ１１ｅ ｏ
ｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏ：Ｌｏｇｉａｔｓ、
８ｋｏｋｉｅ、工１１゜１９８０に論じられている。こ
れらの定量法は、標識として放射性同位元素の代わりに
酵素を用いるので、試薬の貯蔵寿命が伸びるなど、ＲＩ
ｊｌＣ比べていくつかの利点がある。ＩＩＭ工Ｔには、
さ・らに、分離工程を安しないという利点がある。この
定量法の欠点は、環境の変化に高い感受性を示し、触媒
活性が著しく変動するという、酵素の固有の性質に基づ
くものである。すなわち、ｍｓとして使用する酵素は、
その定量法１ｃ要求される感度条件を満たすため例、高
い触媒活性を示すよ５に注意深く選択されねばならない
。しかも、環境の変化によって生じやすい酵素の固有の
不安定性から、酵素活性をほとんど破壊しないカップリ
ング操作を選ぶのも難しい。したがって、これらの定量
法の使用には厳しい制限があり、一般に低分子化合物の
定量にしか応用できない。
上述の酵素標識法のほかに、免疫定量法の放射性同位元
素に代えて螢光性分子を用いる方法が、たとえば仏画特
許第２，２１７，３５０号に記載されている。螢光極性
法をはじめて免疫定量法に用いたのはダントリカー（Ｄ
ａｎｄｌｉｋｅｒ ）ら（免疫化学（工ｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ、） ｅ １ ： １６５ ＊ １９６４ ；免疫
化学（工ｍｍｕｎｏｏｈｅｍ、） ｓ １０ ： ２１
９ ＋ １９７３ ）である。その原理には、低分子量
螢光性分子が高分子量＆（抗体）に結合すると、その螢
光極性の増大が観察されることが関与している。螢光極
性は結合処よって修飾されるので均一免役定量が可能に
なる。螢光励起転位の原理を利用して、ウルマン（Ｕｌ
ｌｍａｎ ）ら（ジャーナルオブバイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍＪ Ｉ ２５１ ：
４１７２．１９７６）は抗原−抗体複合体の形成を検知
した。一般に、エネルギー供与体として働く螢光標識抗
原と、エネルギー受容体として働く帛二の螢光像瞭で欅
欣された抗体によって均一免疫定量が可能になる。供与
体分子と受容体分子の間のエネルギー転位効率は、両者
の距離の６乗に逆比例するので、エネルギー転位は知合
体を形成した場合にのみ起こり、分離工程が不必要にな
る。
素に代えて螢光性分子を用いる方法が、たとえば仏画特
許第２，２１７，３５０号に記載されている。螢光極性
法をはじめて免疫定量法に用いたのはダントリカー（Ｄ
ａｎｄｌｉｋｅｒ ）ら（免疫化学（工ｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ、） ｅ １ ： １６５ ＊ １９６４ ；免疫
化学（工ｍｍｕｎｏｏｈｅｍ、） ｓ １０ ： ２１
９ ＋ １９７３ ）である。その原理には、低分子量
螢光性分子が高分子量＆（抗体）に結合すると、その螢
光極性の増大が観察されることが関与している。螢光極
性は結合処よって修飾されるので均一免役定量が可能に
なる。螢光励起転位の原理を利用して、ウルマン（Ｕｌ
ｌｍａｎ ）ら（ジャーナルオブバイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍＪ Ｉ ２５１ ：
４１７２．１９７６）は抗原−抗体複合体の形成を検知
した。一般に、エネルギー供与体として働く螢光標識抗
原と、エネルギー受容体として働く帛二の螢光像瞭で欅
欣された抗体によって均一免疫定量が可能になる。供与
体分子と受容体分子の間のエネルギー転位効率は、両者
の距離の６乗に逆比例するので、エネルギー転位は知合
体を形成した場合にのみ起こり、分離工程が不必要にな
る。
これらの定蓋法も、エネルギー転位を達成するためには
抗体中の標識の位置が重要なので、その使用は限定され
る。第二に、螢光性分子によって螢光の量子収量は著し
く変動するが、かなり高い量子収量をもつ螢光性分子し
か使用できない。一般に、これらの螢光を用いる免疫定
量法はＲ工Ａに比べると感度がずっと低く、この理由で
もその有用性には限界がある。
抗体中の標識の位置が重要なので、その使用は限定され
る。第二に、螢光性分子によって螢光の量子収量は著し
く変動するが、かなり高い量子収量をもつ螢光性分子し
か使用できない。一般に、これらの螢光を用いる免疫定
量法はＲ工Ａに比べると感度がずっと低く、この理由で
もその有用性には限界がある。
さらに最近になって、化学ルミネッセンス化合物を標識
として用いる免役定蓋法が開発された。
として用いる免役定蓋法が開発された。
化学ルミネッセンス化合物は、適当な条件下に酸化され
て、−重積電子励起状態の螢光性物質を生成する。基底
状態への崩壊時に光童子を生じる。
て、−重積電子励起状態の螢光性物質を生成する。基底
状態への崩壊時に光童子を生じる。
例にはルミノール、イソルミノール、シアクリジニウム
塩、ロフィンおよびオキデル敵エステルがある。可視光
の発光は容易に測定、定量できるので、化学ルミネッセ
ンスはある種の免疫定ｊＩｔ法に有効に用いられてきた
。化学ルミネッセント免疫定量法（０ＬｌＡ）は通常、
化学ルミネッセンス化合物の抗原へのカップリングと、
最終的には放射能でな（光の測定によって行われる。化
学ルミネッセンス定量法の例は、米国特許第４，２２０
，４５０号および第４，１０４，０２９号、英国４ｉｈ
−軒第１，４６１，８７７号に開示されている。化学ル
ぐオンセンス免役定量法の分野における最近の進歩は、
１発光検定（Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｓａｙｓ
） ” （セリオ他（Ｍ、５ｅｒｉｏおよびＭ、Ｐａｚ
ｚａｇｌｉ ） ＠ ）、第１巻、Ｒａｖｅｎ Ｐｒθ
８θ、１９８２にも要約されて（Ｓる。
塩、ロフィンおよびオキデル敵エステルがある。可視光
の発光は容易に測定、定量できるので、化学ルミネッセ
ンスはある種の免疫定ｊＩｔ法に有効に用いられてきた
。化学ルミネッセント免疫定量法（０ＬｌＡ）は通常、
化学ルミネッセンス化合物の抗原へのカップリングと、
最終的には放射能でな（光の測定によって行われる。化
学ルミネッセンス定量法の例は、米国特許第４，２２０
，４５０号および第４，１０４，０２９号、英国４ｉｈ
−軒第１，４６１，８７７号に開示されている。化学ル
ぐオンセンス免役定量法の分野における最近の進歩は、
１発光検定（Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｓａｙｓ
） ” （セリオ他（Ｍ、５ｅｒｉｏおよびＭ、Ｐａｚ
ｚａｇｌｉ ） ＠ ）、第１巻、Ｒａｖｅｎ Ｐｒθ
８θ、１９８２にも要約されて（Ｓる。
均一化学）占、ツセンス免疫定量法については、エネル
ギー転位に関して最近、報告されている（パーチル（Ｆ
ａｔａｌ ）ら：パイオクミ ソサイエテイー トラン
ス（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｏ、Ｔｒａｎｓ、）＋ １
’ｌ ：１９６．１９８３）。アミノブチルエチルイン
ルミノール（ＡＢＢ工）を櫟職として抗原にカップリン
グさせ、抗体はエネルギー転位受容体、フルオレスセイ
ンのような併九性分子で標識された。
ギー転位に関して最近、報告されている（パーチル（Ｆ
ａｔａｌ ）ら：パイオクミ ソサイエテイー トラン
ス（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｏ、Ｔｒａｎｓ、）＋ １
’ｌ ：１９６．１９８３）。アミノブチルエチルイン
ルミノール（ＡＢＢ工）を櫟職として抗原にカップリン
グさせ、抗体はエネルギー転位受容体、フルオレスセイ
ンのような併九性分子で標識された。
ＡＢＭ工襟臓抗加がそれぞれのフルオレスセイン標詭抗
体に結合すると、４６０ｎｍ（１１ｊ色）と５２５ｎｍ
（緑色）Ｋおける化学ルミネッセンスの割合が変化す
る。このエネルギー転位過程が数棟の抗原の均−ＯＬ工
Ａ定童法の開発に用いられた。
体に結合すると、４６０ｎｍ（１１ｊ色）と５２５ｎｍ
（緑色）Ｋおける化学ルミネッセンスの割合が変化す
る。このエネルギー転位過程が数棟の抗原の均−ＯＬ工
Ａ定童法の開発に用いられた。
０ＬＩＡの感度は、化学ルミネッセンスの童子収量によ
って決定される。このような化合物の量子収量は、免疫
定量法に用いられる水性環境では一般にきわめて低い（
約０．１％）。しかし、上述のＡ３Ｂ工のような数種の
標識はＲ］：Ａの場合に匹敵する０ＬＩＡの感度を提供
する。
って決定される。このような化合物の量子収量は、免疫
定量法に用いられる水性環境では一般にきわめて低い（
約０．１％）。しかし、上述のＡ３Ｂ工のような数種の
標識はＲ］：Ａの場合に匹敵する０ＬＩＡの感度を提供
する。
本発明は、上述の化学ルミネッセンス標鍬とは異なり、
標識として化物発光（バイオルミネッセンス）タンパク
質、とくに腔腸動物由来の発光タンパク質および腔腸動
物由来のルシフェラーゼを使用する。これらの生物発光
タンパク質標識は、一般にリガンド−リガンド相互作用
の検知に利用できる。このようなリガンド−リガンド相
互作用の例には、抗ルー抗体、ノ・ゾテンー抗体、ホル
千ンー受容体、タンパク質−核酸、核酸−核酸等の間で
の相互作用がある。リガンドーリガンＰ相互作用の例を
以下に挙げるが、このようなリガンド−リガンド相互作
用によって本発明の範囲が限定されるものではない。
標識として化物発光（バイオルミネッセンス）タンパク
質、とくに腔腸動物由来の発光タンパク質および腔腸動
物由来のルシフェラーゼを使用する。これらの生物発光
タンパク質標識は、一般にリガンド−リガンド相互作用
の検知に利用できる。このようなリガンド−リガンド相
互作用の例には、抗ルー抗体、ノ・ゾテンー抗体、ホル
千ンー受容体、タンパク質−核酸、核酸−核酸等の間で
の相互作用がある。リガンドーリガンＰ相互作用の例を
以下に挙げるが、このようなリガンド−リガンド相互作
用によって本発明の範囲が限定されるものではない。
バイオルミネッセンス連結ルミネッセンス免疫定量法（
ＢＬＩＡ）は、化学ルミネッセンスな標識に用いる０Ｌ
ＩＡとは異なる。ホタルやａ菌のルシフェラーゼ／１−
それぞれの基質（たとえばＡＴＰやＮＡＤＨ）の検知に
使用され、それらがａｔ Ｉｌｌ！ Ｋなっている場合
はあるが、生物発光タンパク質がルミネッセンス免疫定
量法における標識として用いた報告は、わずか１報を除
いてこれまでにない。ホタルやａ菌のルシフェラーゼを
それぞれの基質の検知に使用した例は、米国％ｆｆ第１
，５２２．６０７号および最近の不（発光検定（Ｌｕｍ
１ｎｅｓｃｅｎｔＡｓｓａｙｓ ） ： Ｍ、５ｅｒｉ
ｏおよびＭ、Ｐａｇｚａｇｌｉ １ｆＡｉｉｌｓ第１巻
、ｆｌａｖｅｎＰｒｅｓｓ、 ｉ ９８２ 、５７ 、
８９および１１５頁）。この本に（１１５および１２５
頁）、ホタルのルシフェラーゼを不均一免役定量法の標
識として用い、ピコモル蓋のメトトレキセートおよびト
リニトロトルエンの定量を行った例が記載されている。
ＢＬＩＡ）は、化学ルミネッセンスな標識に用いる０Ｌ
ＩＡとは異なる。ホタルやａ菌のルシフェラーゼ／１−
それぞれの基質（たとえばＡＴＰやＮＡＤＨ）の検知に
使用され、それらがａｔ Ｉｌｌ！ Ｋなっている場合
はあるが、生物発光タンパク質がルミネッセンス免疫定
量法における標識として用いた報告は、わずか１報を除
いてこれまでにない。ホタルやａ菌のルシフェラーゼを
それぞれの基質の検知に使用した例は、米国％ｆｆ第１
，５２２．６０７号および最近の不（発光検定（Ｌｕｍ
１ｎｅｓｃｅｎｔＡｓｓａｙｓ ） ： Ｍ、５ｅｒｉ
ｏおよびＭ、Ｐａｇｚａｇｌｉ １ｆＡｉｉｌｓ第１巻
、ｆｌａｖｅｎＰｒｅｓｓ、 ｉ ９８２ 、５７ 、
８９および１１５頁）。この本に（１１５および１２５
頁）、ホタルのルシフェラーゼを不均一免役定量法の標
識として用い、ピコモル蓋のメトトレキセートおよびト
リニトロトルエンの定量を行った例が記載されている。
これが屑述の唯一の例である。
上述のように、ホタルのルシフェラーゼを不均一免役定
量法の標識として使用することに関しては報告が１報あ
る。しかしながら、このタンパク質な標識として使用す
るには、いくつかの問題点がある。第一に、ホタルのル
シフェラーゼの供給は野外でのホタルの捕獲に依存し、
ホタルの発生は年によって著しく変動するので、化学市
場は標識としてホタルのルシフェラーゼに頼るよウナコ
とはできない。第二に、ホタルのバイオルミネッセンス
は発光［ＡＴＰを安水し、ＡＴＰはすべての生物学的組
織および液体中に存在するので、ホタルのルシフェラー
ゼを用いる迅速均−ＢＬＩＡでは、望丈しくないバンク
グラウンドが現れる。腔腸動物由来のバイオルミネッセ
ンスのシステムの成分を、腔腸動物限定すると、この種
のパックグラウンドの問題は消失する。第三に、エネル
ギー転位過程はホタルの系の成分ではないので、この原
理に基ツくホタルのルシフェラーゼでの均−免疫定量法
の開発は不可能である。
量法の標識として使用することに関しては報告が１報あ
る。しかしながら、このタンパク質な標識として使用す
るには、いくつかの問題点がある。第一に、ホタルのル
シフェラーゼの供給は野外でのホタルの捕獲に依存し、
ホタルの発生は年によって著しく変動するので、化学市
場は標識としてホタルのルシフェラーゼに頼るよウナコ
とはできない。第二に、ホタルのバイオルミネッセンス
は発光［ＡＴＰを安水し、ＡＴＰはすべての生物学的組
織および液体中に存在するので、ホタルのルシフェラー
ゼを用いる迅速均−ＢＬＩＡでは、望丈しくないバンク
グラウンドが現れる。腔腸動物由来のバイオルミネッセ
ンスのシステムの成分を、腔腸動物限定すると、この種
のパックグラウンドの問題は消失する。第三に、エネル
ギー転位過程はホタルの系の成分ではないので、この原
理に基ツくホタルのルシフェラーゼでの均−免疫定量法
の開発は不可能である。
免疫定量法における襟瞭として、Ｍ腸動物由来のタンパ
ク質を用いると、以上概説した問題は回避される。たと
えは、腔腸動物由来のタンパク質は、ホタルのルシフェ
ラーゼの多重ポリペプチド鎖と比較的大きい分子量に比
べて、低分子量、単一ポリペプチドタンパク質である。
ク質を用いると、以上概説した問題は回避される。たと
えは、腔腸動物由来のタンパク質は、ホタルのルシフェ
ラーゼの多重ポリペプチド鎖と比較的大きい分子量に比
べて、低分子量、単一ポリペプチドタンパク質である。
この差により、（１）カップリング過程での標識の安定
性増大、（２）本技術分野で公知の組換えＤＮＡ操作を
用いた容易かつ無限の供給が可能になる。さらに、これ
らの系では自然に起こるエネルギー転位過程により、腔
腸動物由来のルシフェラーゼおよび発光タンパク質を用
い、ホモ（ならびにヘテＵ）免疫定量法が鮨発できる。
性増大、（２）本技術分野で公知の組換えＤＮＡ操作を
用いた容易かつ無限の供給が可能になる。さらに、これ
らの系では自然に起こるエネルギー転位過程により、腔
腸動物由来のルシフェラーゼおよび発光タンパク質を用
い、ホモ（ならびにヘテＵ）免疫定量法が鮨発できる。
また、アポ発光タンパク質の再チャージは各種の腔腸動
物由来ルシフェリン類縁体（式１）によって実施でき、
新規な均−ＥＬＩＡの開発が可能になる。結局、ルシフ
ェラ−ゼやルシフェリンの語は一般名称である。すなわ
ち、腔腸動物のルシフェラ−ゼ、ルシフェリンはホタル
や細菌のルシフェリン、ルシフェリンとは全く別個の分
子であって、互いに種似した点は知られていない。
物由来ルシフェリン類縁体（式１）によって実施でき、
新規な均−ＥＬＩＡの開発が可能になる。結局、ルシフ
ェラ−ゼやルシフェリンの語は一般名称である。すなわ
ち、腔腸動物のルシフェラ−ゼ、ルシフェリンはホタル
や細菌のルシフェリン、ルシフェリンとは全く別個の分
子であって、互いに種似した点は知られていない。
本発明はその多（の特性により、臨床医学において有利
に使用できる。以下の例に示すように、本発明の標識は
リガンドまたは抗体とカップリングさせると安定である
。貯蔵寿命は、Ｒ工Ａの場合の週のオーダーに対し、月
ないし年のオーダーである。本発明忙使用される４Ｍ臓
は、童子収電が比較的高い（約１５％）バイオルミネッ
センスを生じる。この方法ではリガンドのフェムトモル
のオ′−グーの感度が得られる。一般的には、本発明の
定量法（ＢＬＩＡ ）の感度は椀在用いられている他の
免疫定量法の場合と等しいかそれ以上である。
に使用できる。以下の例に示すように、本発明の標識は
リガンドまたは抗体とカップリングさせると安定である
。貯蔵寿命は、Ｒ工Ａの場合の週のオーダーに対し、月
ないし年のオーダーである。本発明忙使用される４Ｍ臓
は、童子収電が比較的高い（約１５％）バイオルミネッ
センスを生じる。この方法ではリガンドのフェムトモル
のオ′−グーの感度が得られる。一般的には、本発明の
定量法（ＢＬＩＡ ）の感度は椀在用いられている他の
免疫定量法の場合と等しいかそれ以上である。
光の発注は瞬間的で、定量を迅速にする。光の測定は迅
速かつ高感度であるばかりでなく、利用される市販装置
が安価で、不さな病院、診療所でもＢＬＩＡを実施でき
る。ＢＬＩＡの試薬も比較的安価である。
速かつ高感度であるばかりでなく、利用される市販装置
が安価で、不さな病院、診療所でもＢＬＩＡを実施でき
る。ＢＬＩＡの試薬も比較的安価である。
本発明の目的は、リガンド−リガンド相互作用、たとえ
ば抗原−抗体、へゾテンー抗体、小ルモンー受容体、タ
ンパク質−核酸、核酸−核酸相互作用の検知に襟瞭とし
て、生物発光、低分子量、単一ポリペプチド鎖タンパク
質を使用すること忙ある。本発明の目的はまた、不均一
および均−生物発光免疫定量法（ＢＬＩＡ ）の開発の
ため、標識として１腔腸動物由来の発光タンパク質およ
びルシフェラーゼを使用することにある。さらに、本発
明の目的は、均−ＢＬＩＡの開発のため、天然の腔腸動
物由来および合成エネルギー転位過程体を使用すること
Ｋある。さらに５年波長測定に基づく均−ＢＬ工Ａ開発
のために、腔腸動物ルシフェリン類縁体ン使用すること
が本発明の目的である。またさらに、本発明の目的は、
アポ発光タンパク質な腔腸動物ルシフェリンまたはその
合成類縁体の存在下に再チャージすることにより、ＥＬ
ＩＡの標識として使用することにある、 本発明のこれらの目的およびその他の目的、態様、利点
は、以下の記載から明しρ箋であろう。
ば抗原−抗体、へゾテンー抗体、小ルモンー受容体、タ
ンパク質−核酸、核酸−核酸相互作用の検知に襟瞭とし
て、生物発光、低分子量、単一ポリペプチド鎖タンパク
質を使用すること忙ある。本発明の目的はまた、不均一
および均−生物発光免疫定量法（ＢＬＩＡ ）の開発の
ため、標識として１腔腸動物由来の発光タンパク質およ
びルシフェラーゼを使用することにある。さらに、本発
明の目的は、均−ＢＬＩＡの開発のため、天然の腔腸動
物由来および合成エネルギー転位過程体を使用すること
Ｋある。さらに５年波長測定に基づく均−ＢＬ工Ａ開発
のために、腔腸動物ルシフェリン類縁体ン使用すること
が本発明の目的である。またさらに、本発明の目的は、
アポ発光タンパク質な腔腸動物ルシフェリンまたはその
合成類縁体の存在下に再チャージすることにより、ＥＬ
ＩＡの標識として使用することにある、 本発明のこれらの目的およびその他の目的、態様、利点
は、以下の記載から明しρ箋であろう。
本発明は、バイオルミネッセンス連結免疫定量法におけ
る標識として、化物発光、低分子量、単一ポリペプチド
鎖タンパク質を使用するりガン１？−リガンド相互作用
の検知方法である。本発明のリガンド−リガンド相互作
用の代表例としては、抗原−抗体、バッテン−抗体、ホ
ルモン−受容体、タンパク質−核酸、核酸−核酸相互作
用がある。
る標識として、化物発光、低分子量、単一ポリペプチド
鎖タンパク質を使用するりガン１？−リガンド相互作用
の検知方法である。本発明のリガンド−リガンド相互作
用の代表例としては、抗原−抗体、バッテン−抗体、ホ
ルモン−受容体、タンパク質−核酸、核酸−核酸相互作
用がある。
本発明において定量されるリガンドは、それに対して形
成される％異的抗体を有する分子である。
成される％異的抗体を有する分子である。
標識は腔腸動物由来ルシフェラーゼまたは腔腸動物由来
の発光タンパク質である。腔腸動物由来綱の動物、たと
えばレニン（Ｒｅｎ１１１ａ ） 、カベルヌ゛（５ｔ
ｙｌａｔｕｌａ ）などは、生物発光腔腸動物すべてに
共通の発色団（ルシフェリン）の生物発光酸化を触媒す
る共通の酵系（ルシフェラーゼ）を含有する〔コルミｘ
（Ｏｏｒｍｉｅｒ２Ｍ、Ｊ、） （１９８１） ’バ
イオルミネッセンスおよびクミルミネツセンス（Ｂｉｏ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｏｈｅｍｉｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ）（ＤｅＬｕｃａ、 Ｍ、 ＆ｌ
ＭｃＥｌｒｏｙ、 Ｗ、 編）、ＡＣａｄｅｍｉ。
の発光タンパク質である。腔腸動物由来綱の動物、たと
えばレニン（Ｒｅｎ１１１ａ ） 、カベルヌ゛（５ｔ
ｙｌａｔｕｌａ ）などは、生物発光腔腸動物すべてに
共通の発色団（ルシフェリン）の生物発光酸化を触媒す
る共通の酵系（ルシフェラーゼ）を含有する〔コルミｘ
（Ｏｏｒｍｉｅｒ２Ｍ、Ｊ、） （１９８１） ’バ
イオルミネッセンスおよびクミルミネツセンス（Ｂｉｏ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｏｈｅｍｉｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ）（ＤｅＬｕｃａ、 Ｍ、 ＆ｌ
ＭｃＥｌｒｏｙ、 Ｗ、 編）、ＡＣａｄｅｍｉ。
Ｐｒｅｓｓ、 ２２５〜２３３頁； Ｏｏｒｍｉｅｒ、
Ｍ、 Ｊ。
Ｍ、 Ｊ。
（１９７８）：バイオルミネッセンス イン アクシミ
ｙ （Ｂｉｏ’ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｃ
ｔｉｏｎ ）（Ｈｅｒｒｉｎｇ、 Ｐ、編）、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ７５〜１０８頁参照〕。
ｙ （Ｂｉｏ’ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｃ
ｔｉｏｎ ）（Ｈｅｒｒｉｎｇ、 Ｐ、編）、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ７５〜１０８頁参照〕。
腔腸動物ルシフェリンは、以下の式（１）に示すような
構造を有し、各種の腔腸動物ρ）ら単能されている〔コ
ルミニ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、Ｍ、Ｊ、）ら（１９７３）：
ジャーナルオブセルフイジオロジ−（Ｊ、ａｅｌｌ。
構造を有し、各種の腔腸動物ρ）ら単能されている〔コ
ルミニ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、Ｍ、Ｊ、）ら（１９７３）：
ジャーナルオブセルフイジオロジ−（Ｊ、ａｅｌｌ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ、） 、 ８１ ： ２９１ ；ワード
他（Ｗａｒｄ、 Ｗ。
他（Ｗａｒｄ、 Ｗ。
＆ Ｏｏｒｍｉｅｒ、Ｍ、Ｊ、） （１９７５） ：プ
ロシーデイングナショナルアカデミーオブサイエンス（
Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａａａｄ、Ｓｃｉ、） 、 ７２
： ２５３０ ；ホリ（Ｈｏｒｉ、 Ｋ、）ら（１９７
７）：プロシーデイングナショナル アカデミ−オブ
サイエンス（Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ｓ
ａｔ、） ｐ ７４ ： ４２８５）。
ロシーデイングナショナルアカデミーオブサイエンス（
Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａａａｄ、Ｓｃｉ、） 、 ７２
： ２５３０ ；ホリ（Ｈｏｒｉ、 Ｋ、）ら（１９７
７）：プロシーデイングナショナル アカデミ−オブ
サイエンス（Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ｓ
ａｔ、） ｐ ７４ ： ４２８５）。
腔腸動物ルシフェリンは、式（１）
（式中、Ｒ１はｐ−ヒドロキシフェニル基、Ｒ２はペン
シル基、Ｒ３はｐ−ヒドロキシベンジル基である）で表
される。本発明は上述の特定の腔腸動物ルシフェリンを
バイオルミネッセンス因子として使用するものであるが
、本発明はさらに、バイオルミネッセンス因子としてル
シフェリン様化合物、すなわち、上記式（１）において
Ｒ１は芳香族基、異項環基、アルキル基および水素より
なる群から選ばれ、Ｒ２は芳香族基、異項環基、アルキ
ル基および水素よりなる群から選ばれ、Ｒ，は芳香族基
、異項環基、アルキル基および水素よりなる群から選ば
れる化合物の使用も包含する。このようなルシフェリン
様化合物の芳香族基は、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベ
ンジル基およびｐ−ヒト四キシベンジル基よりなる群か
ら選ぶことができる。
シル基、Ｒ３はｐ−ヒドロキシベンジル基である）で表
される。本発明は上述の特定の腔腸動物ルシフェリンを
バイオルミネッセンス因子として使用するものであるが
、本発明はさらに、バイオルミネッセンス因子としてル
シフェリン様化合物、すなわち、上記式（１）において
Ｒ１は芳香族基、異項環基、アルキル基および水素より
なる群から選ばれ、Ｒ２は芳香族基、異項環基、アルキ
ル基および水素よりなる群から選ばれ、Ｒ，は芳香族基
、異項環基、アルキル基および水素よりなる群から選ば
れる化合物の使用も包含する。このようなルシフェリン
様化合物の芳香族基は、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベ
ンジル基およびｐ−ヒト四キシベンジル基よりなる群か
ら選ぶことができる。
上述の腔腸動物ルシフェリンと比べて、量子収量もしく
は発光色またはその両者が異なってもよい。
は発光色またはその両者が異なってもよい。
腔腸動物由来のルシフェラーゼは、腔腸動物ルシフェリ
ンの溶解酸素による化学酸化の結果として青色光（ψ
−４８０ｎｍ ）の生成を触媒する。
ンの溶解酸素による化学酸化の結果として青色光（ψ
−４８０ｎｍ ）の生成を触媒する。
ａｘ
主成物はオキジルシフェリン、二酸化炭素および光であ
る（式２）、。
る（式２）、。
ルシフェラーゼ
ルシフェリン＋０２
オキジルシフェリン＋００２＋元 （２）腔腸動物
由来発光タンパク質は、本発明で使用される第２のタイ
ツの標識を提供する。発光タンパク質は上記式（２）に
示したと同じ反応を触媒する〔ワード他（Ｗａｒｄ、Ｗ
、 ｓｏ Ｏｏｒｍｉｅｒ、Ｍ、Ｊ、） （１９７５）
：プロシーデイング ナショナル アカデミーォブサイ
エンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、） 。
由来発光タンパク質は、本発明で使用される第２のタイ
ツの標識を提供する。発光タンパク質は上記式（２）に
示したと同じ反応を触媒する〔ワード他（Ｗａｒｄ、Ｗ
、 ｓｏ Ｏｏｒｍｉｅｒ、Ｍ、Ｊ、） （１９７５）
：プロシーデイング ナショナル アカデミーォブサイ
エンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、） 。
７２：２５３０〜２５３４］。この種の腔腸動物由来タ
ンパク質の例には、イクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）、
オペリｙ（ｏｂθ１１ｎ）、ネミオプシ７ （ｍｎｅｍ
ｉｏｐｓｉｎ）およびベロビン（ｂθｒｏｖｉｎ ）が
ある〔ワード他（Ｗａｒｄ、 ｗ、 ｓｃ ０ｏｒｎ＋
ｉｅｒ、 Ｍ、 ；Ｊ、） （１９７５） ：プロシー
デイング ナショナル アカデミ−オプ サイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｏｉ、） 。
ンパク質の例には、イクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）、
オペリｙ（ｏｂθ１１ｎ）、ネミオプシ７ （ｍｎｅｍ
ｉｏｐｓｉｎ）およびベロビン（ｂθｒｏｖｉｎ ）が
ある〔ワード他（Ｗａｒｄ、 ｗ、 ｓｃ ０ｏｒｎ＋
ｉｅｒ、 Ｍ、 ；Ｊ、） （１９７５） ：プロシー
デイング ナショナル アカデミ−オプ サイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｏｉ、） 。
７２：２５３Ｕ〜２５３４］。これらの腔腸動物由来タ
ンパク質は遊離Ｏａ”＋の非存在下圧は安定で、腔腸動
物ルシフェリンとタンパク質に結合した０２の両省を含
有する。腔腸動物由来の発光タンパク質を用いる場合、
この棟の腔腸動物由来タンパク質の溶液に１バイオルミ
ネツセンス因子、Ｏａ”＋を加えると、式（３）に示す
ように青色光が生成する。
ンパク質は遊離Ｏａ”＋の非存在下圧は安定で、腔腸動
物ルシフェリンとタンパク質に結合した０２の両省を含
有する。腔腸動物由来の発光タンパク質を用いる場合、
この棟の腔腸動物由来タンパク質の溶液に１バイオルミ
ネツセンス因子、Ｏａ”＋を加えると、式（３）に示す
ように青色光が生成する。
発光タンパク質＋Ｏａ ２ ＋
−〉オキシルフェリン＋００２十光（λｍａｘ悶４６９
ｎｍ） 式（３）の反応はＯａ″“促進発光タンパク質バイオル
ミネッセンスと呼ばれる。生成物のひとつ、オキジルシ
フェリンは消費された発光タンパク質に結合したままで
あるが、タンパク質から除去することもできる。放電し
た発光タンパク質（アポ発光タンパク質）は、Ｃａ２＋
の非存在下に再チャージすることができる。また、放電
した発光タンパク質（アポ発光タンパク質）は、上記式
（１）に示したような合成腔腸動物ルシフェリンまたは
他のルシフェリン、溶解酸素および２−メルカプトエタ
ノールの存在下に再チャージすることもできる〔コルミ
ニ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、） （１９８１）
’ ”バイオルミネッセンスおよびケミルミネッ
センス（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｏ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ） ”。
ｎｍ） 式（３）の反応はＯａ″“促進発光タンパク質バイオル
ミネッセンスと呼ばれる。生成物のひとつ、オキジルシ
フェリンは消費された発光タンパク質に結合したままで
あるが、タンパク質から除去することもできる。放電し
た発光タンパク質（アポ発光タンパク質）は、Ｃａ２＋
の非存在下に再チャージすることができる。また、放電
した発光タンパク質（アポ発光タンパク質）は、上記式
（１）に示したような合成腔腸動物ルシフェリンまたは
他のルシフェリン、溶解酸素および２−メルカプトエタ
ノールの存在下に再チャージすることもできる〔コルミ
ニ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、） （１９８１）
’ ”バイオルミネッセンスおよびケミルミネッ
センス（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｏ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ） ”。
ＤｅＬｕｃａ、 Ｍ、 ＆ ＭａＦ４１ｒｏｙ、 Ｗ、
編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
２２５〜２３３頁）。Ｃａ２＋の非存在下におけるアポ
発光タンパク質の再チャージは式（４）で表される。
発光タンパク質の再チャージは式（４）で表される。
＋０２十ン−メルカプトエタノール
（４３式（４）のように再チャージされたアポ発光
タンパク質にＣａ２＋を加えると、発光が起こる。上記
式（３）および（４）のサイクルが無限にくり返される
。
（４３式（４）のように再チャージされたアポ発光
タンパク質にＣａ２＋を加えると、発光が起こる。上記
式（３）および（４）のサイクルが無限にくり返される
。
本発明の目的においては、リガンドは、それに対する特
異的な抗体が産生され、腔腸動物由来のルシフェラーゼ
または発光タンパク質に共有結合できる、任意の体液中
または組織中に見出される分子であってよい。このよう
なリガンドの例としては、ホルモン（ステロイドまたは
小すペプチド）、酵素および抗体のようなタンパク質、
＃１１たとえばＮｅ１ｓａｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａ、ビタミン類、代納ｊ物、有害生物殺滅剤、ンエロ
モン、炭水化物、脂質、核酸、薬理学的に亜賛な化合物
たとえばオヒエート、ジギタリス配扼体たとえばジゴキ
シン、７寸ルビタール類、コカイン、マリノ・す、フェ
ノチアジン類、腫瘍抗原たとえばＯＫＡ等を挙げること
がでキ７）。本発明はこの棟のリガンドの定量法である
が、以上挙げた例は本発明を例示するもので、限定する
ものではない。
異的な抗体が産生され、腔腸動物由来のルシフェラーゼ
または発光タンパク質に共有結合できる、任意の体液中
または組織中に見出される分子であってよい。このよう
なリガンドの例としては、ホルモン（ステロイドまたは
小すペプチド）、酵素および抗体のようなタンパク質、
＃１１たとえばＮｅ１ｓａｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａ、ビタミン類、代納ｊ物、有害生物殺滅剤、ンエロ
モン、炭水化物、脂質、核酸、薬理学的に亜賛な化合物
たとえばオヒエート、ジギタリス配扼体たとえばジゴキ
シン、７寸ルビタール類、コカイン、マリノ・す、フェ
ノチアジン類、腫瘍抗原たとえばＯＫＡ等を挙げること
がでキ７）。本発明はこの棟のリガンドの定量法である
が、以上挙げた例は本発明を例示するもので、限定する
ものではない。
Ａ、不拘−ＢＬ工Ａ
式（５）のように％定の抗原に共有結合的にカップリン
グしたルシフェラーゼにより、競合的結合定量が可能で
ある。
グしたルシフェラーゼにより、競合的結合定量が可能で
ある。
式（５）に示すように、腔腸動物ルシフェラーゼを用い
た競合的結合ＢＬｌＡは前述の式（１）のＲ工ＡＫ類似
している。この褌の定量法では、抗体（Ａｂ ）を固体
支持体に結合しておけは、迅速な１工程分離が可能にな
る。上溝またはペレット中に見出されるルシフェラーゼ
標識抗Ｎ（リガンド−標識）の量は、前記式（１）に示
した腔腸動物ルシフェリン（バイオルミネッセンス因子
）または任意のルシフェリン様化合物を加え、ついでピ
ーク元の強度または単位時間あたりの総光量を測定すれ
は、容易に定量できる。ルシフェリンおよびルシフェリ
ン様化合物を合成するためには化学合成法が用いられる
〔ホリ他（Ｈｏｒｉ、 Ｋ、 ＆ Ｏｏｒｍｉｅｒ、
Ｍ、 Ｊ、）（１９７３）ニブ四シーディング ナショ
ナルアカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ。
た競合的結合ＢＬｌＡは前述の式（１）のＲ工ＡＫ類似
している。この褌の定量法では、抗体（Ａｂ ）を固体
支持体に結合しておけは、迅速な１工程分離が可能にな
る。上溝またはペレット中に見出されるルシフェラーゼ
標識抗Ｎ（リガンド−標識）の量は、前記式（１）に示
した腔腸動物ルシフェリン（バイオルミネッセンス因子
）または任意のルシフェリン様化合物を加え、ついでピ
ーク元の強度または単位時間あたりの総光量を測定すれ
は、容易に定量できる。ルシフェリンおよびルシフェリ
ン様化合物を合成するためには化学合成法が用いられる
〔ホリ他（Ｈｏｒｉ、 Ｋ、 ＆ Ｏｏｒｍｉｅｒ、
Ｍ、 Ｊ、）（１９７３）ニブ四シーディング ナショ
ナルアカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ。
Ａｃａｄ、 Ｂａ１．） ｐ ７０ ： １２０〜１２
５ ； Ｈｏｒｉ、 Ｋ。
５ ； Ｈｏｒｉ、 Ｋ。
ら（１９７３）：バイオケミストリー（Ｅｉｏａｈｅｍ
−１ｓｔｒｙ） 、１２ ： ４４６６〜４４６８；イ
ノウニ（工ｎｏｕｅ ）ら（１９７５）：ケム レター
（Ｏｈｅｍ。
−１ｓｔｒｙ） 、１２ ： ４４６６〜４４６８；イ
ノウニ（工ｎｏｕｅ ）ら（１９７５）：ケム レター
（Ｏｈｅｍ。
Ｌｅｔｔ、） ＃ １ ４ １ ； ／％
−） （Ｈａｒｔ、 Ｒ，） ら （１９７９）
：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、 ｉ ８ ：２２０４〜２２１０〕。上記式（５）
を示した本発明の方法をさらに詳細に記述すれば、以下
の各工程になる。すなわち、（ａ）反応混合物中でリガ
ンド−標識を定量すべきリガンドおよびその特異的抗体
と反応させて、抗体−リガンド−Ｗ＝および抗体−リガ
ンドを形成させる工程、Ｃｂ）％異的抗体を固体支持体
に結合させて反応混合物から特異的抗体を分離する工程
、（ｃ）反応混合物にバイオルミネッセンス因子を添加
する工程、（ｄ）光を測定する工程、および光量に基づ
きリガンド−標識の量を決定する工程である。
−） （Ｈａｒｔ、 Ｒ，） ら （１９７９）
：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、 ｉ ８ ：２２０４〜２２１０〕。上記式（５）
を示した本発明の方法をさらに詳細に記述すれば、以下
の各工程になる。すなわち、（ａ）反応混合物中でリガ
ンド−標識を定量すべきリガンドおよびその特異的抗体
と反応させて、抗体−リガンド−Ｗ＝および抗体−リガ
ンドを形成させる工程、Ｃｂ）％異的抗体を固体支持体
に結合させて反応混合物から特異的抗体を分離する工程
、（ｃ）反応混合物にバイオルミネッセンス因子を添加
する工程、（ｄ）光を測定する工程、および光量に基づ
きリガンド−標識の量を決定する工程である。
競合的結合定量法は腔腸動物由来発光タンパク質たとえ
ばイクオリンを式（６）に示すように抗原と共有結合的
にカップリングさせることによって確立された。
ばイクオリンを式（６）に示すように抗原と共有結合的
にカップリングさせることによって確立された。
抗体（Ａｂ ）は固体支持体に結合され、上溝またはペ
レット中に見出される発光タンパク質標識抗原の量は、
混合物にＯａ”＋を加え、ついで単位時間あたりの総光
督またはピーク元強度を測定することにより簡単に定量
できる。標識は、さらに詳しくは、腔腸動物由来発光タ
ンパク質に結合した化合物を有する腔腸動物出来発光タ
ンパク質である。この種の化合物には腔腸動物ルシフェ
リンまたはルシフェリン様化合物がある。定量すべき抗
原は共有結合的カップリングによってアポ発光タンパク
質と共有結合的にカップリングさせ、ついでこのアポ発
光タンパク質を腔腸動物ルシフェリンまたはルシフェリ
ン様化合物で再チャージしてもよい。
レット中に見出される発光タンパク質標識抗原の量は、
混合物にＯａ”＋を加え、ついで単位時間あたりの総光
督またはピーク元強度を測定することにより簡単に定量
できる。標識は、さらに詳しくは、腔腸動物由来発光タ
ンパク質に結合した化合物を有する腔腸動物出来発光タ
ンパク質である。この種の化合物には腔腸動物ルシフェ
リンまたはルシフェリン様化合物がある。定量すべき抗
原は共有結合的カップリングによってアポ発光タンパク
質と共有結合的にカップリングさせ、ついでこのアポ発
光タンパク質を腔腸動物ルシフェリンまたはルシフェリ
ン様化合物で再チャージしてもよい。
天然の発光タンパク質は、標識のタンパク質−タンパク
質またはタンパク質〜ハプテンカップリング操作を用い
て抗原または抗体にカンプリングさせてきた〔オ 丈す
バン他（０’５ｕｌｌｉｖａｎ、 Ｍ、 ＆ＩＭａｒｋ
ｓ、 Ｖ、） （１９８１） ：酵素学の方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ ＦｌｎｓａＪ ｔ ７３ ： １４７〜
１６６；アーランガー（Ｆｉｒｌａｎｇｅｒｓ Ｅ、）
（１９８０） ：酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚ、） 、 ７０ ： ８５〜１０４ ）。本
発明においても、このカップリング法が採用できる（以
下のＢ、均−ＢＬｌＡの項参照）。ルシフェラーゼまた
は発光タンパク質なその機能型に維持する限り、任意の
カップリング操作が本発明の目的に使用できる。また、
化学的により安定なアポ発光タンパク質をへブテンまた
はタンパク質に共有結合的にカップリングさせ、ついで
上記式（４）に示すようにアポ発光タンパク質のルシフ
ェリン依存再チャージを行ってもよい。これらの定量法
は不均一法であって、分離工ｓを包含するが、ＲＩＡに
比べて明らかな利点を有する。標識試薬の貯蔵寿命は無
限で、検出限界は低く、測定時間（約１５秒）も短い。
質またはタンパク質〜ハプテンカップリング操作を用い
て抗原または抗体にカンプリングさせてきた〔オ 丈す
バン他（０’５ｕｌｌｉｖａｎ、 Ｍ、 ＆ＩＭａｒｋ
ｓ、 Ｖ、） （１９８１） ：酵素学の方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ ＦｌｎｓａＪ ｔ ７３ ： １４７〜
１６６；アーランガー（Ｆｉｒｌａｎｇｅｒｓ Ｅ、）
（１９８０） ：酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚ、） 、 ７０ ： ８５〜１０４ ）。本
発明においても、このカップリング法が採用できる（以
下のＢ、均−ＢＬｌＡの項参照）。ルシフェラーゼまた
は発光タンパク質なその機能型に維持する限り、任意の
カップリング操作が本発明の目的に使用できる。また、
化学的により安定なアポ発光タンパク質をへブテンまた
はタンパク質に共有結合的にカップリングさせ、ついで
上記式（４）に示すようにアポ発光タンパク質のルシフ
ェリン依存再チャージを行ってもよい。これらの定量法
は不均一法であって、分離工ｓを包含するが、ＲＩＡに
比べて明らかな利点を有する。標識試薬の貯蔵寿命は無
限で、検出限界は低く、測定時間（約１５秒）も短い。
Ｂ、均−ＥＬ工Ａ
腔腸動物ルシフェラーゼ標識抗原を用いる均−ＢＬ工Ａ
も可能である。上述の腔腸動物ルシフエリンールシンエ
ラー′ｔ／′反応は、広いスペクトルの放出を有する青
色光（λｍａｘ−４８０ｎｍ）を発するが、花虫綱動物
のバイオルミネッセンスのｉｎ ｖｉｖｏにおける調査
により、これらの動物は、せまいスペクトル範囲の緑色
光（λｍａＸ −５０９ｎｍ ）を発することが明らか
にされた〔ワンブラー（Ｗａｍｐｌ、ｅｒ。
も可能である。上述の腔腸動物ルシフエリンールシンエ
ラー′ｔ／′反応は、広いスペクトルの放出を有する青
色光（λｍａｘ−４８０ｎｍ）を発するが、花虫綱動物
のバイオルミネッセンスのｉｎ ｖｉｖｏにおける調査
により、これらの動物は、せまいスペクトル範囲の緑色
光（λｍａＸ −５０９ｎｍ ）を発することが明らか
にされた〔ワンブラー（Ｗａｍｐｌ、ｅｒ。
Ｊ、）ら（１９７１）：バイオケミストリー（Ｂｉｏａ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ＋ １０ ： ２９０３〜２９
０９］。
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ＋ １０ ： ２９０３〜２９
０９］。
ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｔｔｒｏにおける発光の差は
、花虫綱動物におけるバイオルミネッセンスが感作過程
であることによる。感作体（エネルギー転位受容体）は
、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ ）と呼ばれるタンパク
質で、単離され、性質が明らかにされている〔ワード他
（Ｗａｒｄ、 Ｗ、 ＆ Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 、
ｒ、）（１９７９）：ジャーナル オプ バイオロジカ
ル ケミストリー（；ｒ、 Ｂ１０１． ａｈｅｍ、）
＋ ２５４ ニア８１〜７９０〕。
、花虫綱動物におけるバイオルミネッセンスが感作過程
であることによる。感作体（エネルギー転位受容体）は
、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ ）と呼ばれるタンパク
質で、単離され、性質が明らかにされている〔ワード他
（Ｗａｒｄ、 Ｗ、 ＆ Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 、
ｒ、）（１９７９）：ジャーナル オプ バイオロジカ
ル ケミストリー（；ｒ、 Ｂ１０１． ａｈｅｍ、）
＋ ２５４ ニア８１〜７９０〕。
ＧＦＰｏ）螢光は、Ｒθｎ１ｌｌａのような花虫綱動物
の緑色のｉｎ ｖｉｖｏ発九と発光である。さらに、緑
色１７） ｉｎ ＶｉＶＯ発光は、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応混合物ｔこＧＦＰ Ｑ、ｉ ミリモル磯
度を加えればｉｎ ｖｉｔｒｏでも竹現できる。広い宵
色ρ）らせまい緑色発光へスペクトル分布の変位が起こ
るのである。このようなスペクトル変位は、上記式（Ｉ
Ｊに示すような腔腸動物ルシフェリンの酸化における量
子収量が数倍に増力１１する事実から、非照射エネルギ
ー転位過程によるものである。４８０ ｎ１ｌ１１と５
０９ｎｍにおける発光を同時に槙Ｕ定した場合、ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応混合物に０１？’Ｐを加え
ると４８０ ／ ５０９ ｎｍ比に大きな変化が認めら
れる。このような理由から、均−ＢＬＩＡの１例は式（
力で示すことができる。
の緑色のｉｎ ｖｉｖｏ発九と発光である。さらに、緑
色１７） ｉｎ ＶｉＶＯ発光は、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応混合物ｔこＧＦＰ Ｑ、ｉ ミリモル磯
度を加えればｉｎ ｖｉｔｒｏでも竹現できる。広い宵
色ρ）らせまい緑色発光へスペクトル分布の変位が起こ
るのである。このようなスペクトル変位は、上記式（Ｉ
Ｊに示すような腔腸動物ルシフェリンの酸化における量
子収量が数倍に増力１１する事実から、非照射エネルギ
ー転位過程によるものである。４８０ ｎ１ｌ１１と５
０９ｎｍにおける発光を同時に槙Ｕ定した場合、ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応混合物に０１？’Ｐを加え
ると４８０ ／ ５０９ ｎｍ比に大きな変化が認めら
れる。このような理由から、均−ＢＬＩＡの１例は式（
力で示すことができる。
上述の均−ＢＬ工Ａでは腔腸動物ルシフェラーゼとＧＦ
Ｐを使用する。上記式（力では、リガンド（抗原）はル
シフェラーゼと共有結合によりカンプリングし、一方、
ＧＦＰは抗体にカップリングしている。腔腸動物ルシフ
ェリン〔上記式（υ〕を添加すると、エネルギー転位に
より、ある４８０１５０９ｎｍ比が観察される。分析す
べきリガンド（抗原）の反応混合物中での童が増加する
と、４８０１５０９ ｎｍ比も増加する。分離工程は不
必要になり、均一定電法が可能になる。上記式（力で、
リガンド（抗原ンはＧＦＰともカップリングでき、この
場合、抗体はルシフェラーゼにカップリングする。
Ｐを使用する。上記式（力では、リガンド（抗原）はル
シフェラーゼと共有結合によりカンプリングし、一方、
ＧＦＰは抗体にカップリングしている。腔腸動物ルシフ
ェリン〔上記式（υ〕を添加すると、エネルギー転位に
より、ある４８０１５０９ｎｍ比が観察される。分析す
べきリガンド（抗原）の反応混合物中での童が増加する
と、４８０１５０９ ｎｍ比も増加する。分離工程は不
必要になり、均一定電法が可能になる。上記式（力で、
リガンド（抗原ンはＧＦＰともカップリングでき、この
場合、抗体はルシフェラーゼにカップリングする。
また、Ｇ１１’Ｐも、適当なエネルギー転位受容体の１
例にすぎない。スペクトル特性がエネルギー転位受容体
として適当な任意の螢光分子、たとえばフルオレスセイ
ン、フィコエリスリン、ローダミン、ルシンアー黄色色
素、９．１０−ビスフエネチニルアントラセン等が使用
できる。
例にすぎない。スペクトル特性がエネルギー転位受容体
として適当な任意の螢光分子、たとえばフルオレスセイ
ン、フィコエリスリン、ローダミン、ルシンアー黄色色
素、９．１０−ビスフエネチニルアントラセン等が使用
できる。
本発ＩＪＩＩの目的における、ルシフェリン様化合物の
、シグナル増強に基づく均−ＢＬ工Ａでの利用には著し
い利点がある。他の大多数のルシフェリン様化合物は、
拗起状態の消滅によりパイオルミネツセンスを全くまた
はほとんど住しない〔ハート（Ｈａｙｔ、 Ｒ，）ら（
１９７９）：バイオヶミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ） 、 １８ ： ２２０４〜２２１０）。
、シグナル増強に基づく均−ＢＬ工Ａでの利用には著し
い利点がある。他の大多数のルシフェリン様化合物は、
拗起状態の消滅によりパイオルミネツセンスを全くまた
はほとんど住しない〔ハート（Ｈａｙｔ、 Ｒ，）ら（
１９７９）：バイオヶミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ） 、 １８ ： ２２０４〜２２１０）。
ルシフェリン様化合物のわすかな例は、ペンジルルシン
エリン、クロロンエニルルシフェリン、フェニルルシン
エリン等である。しかしながら、ＧＮＰを添加すると、
パイオルミネッ七ンスの強度は２００倍以上に増加し、
リガンド倉の増加に伴う５０９ ｎｍの発光ンモニタリ
ングするだけで均一 ＢＬＩＡが確立される。上Ｂｂ式
（力において＼腔腸動物ルシフェリンの類縁体を用いる
と、５Ｄ９ｎｍの発光はリガンド（Ａｇ ） 濃度の増
加とともに低下することになる。このような他のルシフ
ェリンの使用によっても、２波長での同時測定を必要と
しない均−ＢＬＩＡの基礎が提供される。
エリン、クロロンエニルルシフェリン、フェニルルシン
エリン等である。しかしながら、ＧＮＰを添加すると、
パイオルミネッ七ンスの強度は２００倍以上に増加し、
リガンド倉の増加に伴う５０９ ｎｍの発光ンモニタリ
ングするだけで均一 ＢＬＩＡが確立される。上Ｂｂ式
（力において＼腔腸動物ルシフェリンの類縁体を用いる
と、５Ｄ９ｎｍの発光はリガンド（Ａｇ ） 濃度の増
加とともに低下することになる。このような他のルシフ
ェリンの使用によっても、２波長での同時測定を必要と
しない均−ＢＬＩＡの基礎が提供される。
腔腸動物由来発光タンパク質な使用する均−ＢＬ工Ａは
、標識としてルシフェラーゼの代わりにＯａ”＋促進発
光タンパク質を用いるほかは、上述の定電法とほぼ同じ
である。発光タンパク質バイオルミネッセンスにおける
エネルギー転位は、適当な条件下に、発光タンパク質由
米励起状態からＧＮＰへ起こる〔モリス（Ｍｏｒｉｓｅ
、 Ｈ，）ら（１９７４）：バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） 、 １３：２６５６〜２６
６２〕。光色の育（λｍａｘ−４６９ｎｍ ）から緑（
−ａＸ−５０９ｎｍ ） Ｋ変化する。
、標識としてルシフェラーゼの代わりにＯａ”＋促進発
光タンパク質を用いるほかは、上述の定電法とほぼ同じ
である。発光タンパク質バイオルミネッセンスにおける
エネルギー転位は、適当な条件下に、発光タンパク質由
米励起状態からＧＮＰへ起こる〔モリス（Ｍｏｒｉｓｅ
、 Ｈ，）ら（１９７４）：バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） 、 １３：２６５６〜２６
６２〕。光色の育（λｍａｘ−４６９ｎｍ ）から緑（
−ａＸ−５０９ｎｍ ） Ｋ変化する。
このような他のルシフェリン（腔腸動物由来発光タンパ
ク質）とＧＦＰを用いる均−ＧＬ工Ａの例を式（６）％
式％ 上記式（８）において、リガンド（抗原）は発光タンパ
ク質に共有結合的にカップリングし、一方（）ＦＰまた
は適当な螢光エネルギー転位受容体たとえばフルオレス
セインは抗体にカップリングする。
ク質）とＧＦＰを用いる均−ＧＬ工Ａの例を式（６）％
式％ 上記式（８）において、リガンド（抗原）は発光タンパ
ク質に共有結合的にカップリングし、一方（）ＦＰまた
は適当な螢光エネルギー転位受容体たとえばフルオレス
セインは抗体にカップリングする。
Ｏａ２＋を添加すると、エネルギー転位により、ある４
６９ ／ ５０９ ｎｍ比が観察される。分析すべき
リガンドの童が反応混合物中に増加すると、４６９ ／
５０９ ｎｍ比も増加する。分離は必要としない。ま
た、リガンドがＧＦＰにカップリングすれば、発光タン
パク質は抗体にカップリングする。
６９ ／ ５０９ ｎｍ比が観察される。分析すべき
リガンドの童が反応混合物中に増加すると、４６９ ／
５０９ ｎｍ比も増加する。分離は必要としない。ま
た、リガンドがＧＦＰにカップリングすれば、発光タン
パク質は抗体にカップリングする。
アポ発光タンパク質は、このような他のルシフェリンに
よっても、上記式（４）に示すように再チャージされ、
バイオルミネッセンスの量子収量か変化する〔マツ力ｙ
（ＭｃＯａｎｎ、 Ｒ，）ら（１９７８Ｃアメリカン
ソサイエティー ンォトバイオロジー アブストラク
ト（Ａｍ、 Ｓｏａ、 Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、Ａｂｓｔ
、）５４頁〕。ルシフェラーゼを＋Ｍ瞳として用いた場
合、このような他のルシフェリンが、単一波長たとえば
ＧＦＰの場合５ ［１９ｎｍの発光を単にモニタリング
すれはよいホモＢＬＩＡが提供される。モニタリングす
べき光の波長は用いたエネルギー転位受容体によって変
動する。フルオレスセイン、ンイコエリトリン、ローダ
ミン、ルシフアー黄色色ｉ、９，１０−ビスンエネチニ
ル アントラセン等、そのスペクトル特性がエネルギー
転位受容体に通した螢光分子が使用される。
よっても、上記式（４）に示すように再チャージされ、
バイオルミネッセンスの量子収量か変化する〔マツ力ｙ
（ＭｃＯａｎｎ、 Ｒ，）ら（１９７８Ｃアメリカン
ソサイエティー ンォトバイオロジー アブストラク
ト（Ａｍ、 Ｓｏａ、 Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、Ａｂｓｔ
、）５４頁〕。ルシフェラーゼを＋Ｍ瞳として用いた場
合、このような他のルシフェリンが、単一波長たとえば
ＧＦＰの場合５ ［１９ｎｍの発光を単にモニタリング
すれはよいホモＢＬＩＡが提供される。モニタリングす
べき光の波長は用いたエネルギー転位受容体によって変
動する。フルオレスセイン、ンイコエリトリン、ローダ
ミン、ルシフアー黄色色ｉ、９，１０−ビスンエネチニ
ル アントラセン等、そのスペクトル特性がエネルギー
転位受容体に通した螢光分子が使用される。
本発明は、分離工程を要しない、２本の波長での測定を
行う均−生物発光定量法を開示する。この方法のバイオ
ルミネッセンス因子は腔腸動物由来のルシフェラーゼか
ら測定可能な発光を誘発する能力を有する。さらに詳し
くは、この方法は以下の各工程よりなる。すなわち、（
ａ）特異的抗体をエネルギー転位受容体に対し共有結合
的カップリング手段によって共有結合的にカップリング
させて抗体−エネルギー転位受容体を形成させる工程、
（ｂ）定量すべきリガンドをエネルギー転位受容体に、
共有結合的カップリング手段によって共有結合的にカン
プリングさせて、リガンド−エネルギー転位受容体を形
成させる工程、（ｃ）抗体−標識を反応混合物中でリガ
ンド−エネルギー転位受容体および定量すべきリガンド
と反応させて、律臓−抗体−リガンドーエネルギー転位
受容体およびリガンド−抗体−標識を形成させる工程、
（ｄ）反応混合物にバイオルミネッセンス因子を加える
工程、（８３２本以上の波長での光を同時に測定して比
を求める工程、（ｆ）その比に基づいて定量すべきリガ
ンドの量ヲ決定する工程である。上記方法において、腔
腸動物由来発光タンパク質を代わりに用いた場合、腔腸
動物由来発光タンパク質から御］定可能な発光を誘発す
る能力のある化合物を腔腸動物由来発光タンパク質に結
合させ、バイオルミネッセンス因子の添加で２本の波長
の発光を住じさせる。上述の均−生物発光免疫定量法は
次のようにして、単一波長における測定だけの定量法に
改良できる。
行う均−生物発光定量法を開示する。この方法のバイオ
ルミネッセンス因子は腔腸動物由来のルシフェラーゼか
ら測定可能な発光を誘発する能力を有する。さらに詳し
くは、この方法は以下の各工程よりなる。すなわち、（
ａ）特異的抗体をエネルギー転位受容体に対し共有結合
的カップリング手段によって共有結合的にカップリング
させて抗体−エネルギー転位受容体を形成させる工程、
（ｂ）定量すべきリガンドをエネルギー転位受容体に、
共有結合的カップリング手段によって共有結合的にカン
プリングさせて、リガンド−エネルギー転位受容体を形
成させる工程、（ｃ）抗体−標識を反応混合物中でリガ
ンド−エネルギー転位受容体および定量すべきリガンド
と反応させて、律臓−抗体−リガンドーエネルギー転位
受容体およびリガンド−抗体−標識を形成させる工程、
（ｄ）反応混合物にバイオルミネッセンス因子を加える
工程、（８３２本以上の波長での光を同時に測定して比
を求める工程、（ｆ）その比に基づいて定量すべきリガ
ンドの量ヲ決定する工程である。上記方法において、腔
腸動物由来発光タンパク質を代わりに用いた場合、腔腸
動物由来発光タンパク質から御］定可能な発光を誘発す
る能力のある化合物を腔腸動物由来発光タンパク質に結
合させ、バイオルミネッセンス因子の添加で２本の波長
の発光を住じさせる。上述の均−生物発光免疫定量法は
次のようにして、単一波長における測定だけの定量法に
改良できる。
すなわち、（１〕腔に動物由来ルシフェラーゼ系を用い
た場合、バイオルミネッセンス因子は腔腸動物由来ルシ
フェラーゼからの測定可能な発光を消失させることがで
きるものとする、および（２）腔賜動物由米発光タンパ
ク買糸を用いた場合、腔腸動物由来発光タンパク負から
の測定可能な発光音消失させることができる化合物を腔
腸動物由来発光タンパク質に結合させる。
た場合、バイオルミネッセンス因子は腔腸動物由来ルシ
フェラーゼからの測定可能な発光を消失させることがで
きるものとする、および（２）腔賜動物由米発光タンパ
ク買糸を用いた場合、腔腸動物由来発光タンパク負から
の測定可能な発光音消失させることができる化合物を腔
腸動物由来発光タンパク質に結合させる。
例 １
プロゲステロンーイクオリン抱合体の合成プログステロ
ン−１１α−ヘミスクシネート５岬を乾燥ジメチルホル
ムアミド１４０ノにとり、これにジシクロへキシルカル
ボジイミド２．４ｇｆおよびＮ−ヒトルキシスクシンイ
ミド４．０岬を加えた。反応混合物を室温で１２時間イ
ンキュベートし、ついで化成したジシクロヘキシル尿素
の結晶を遠心外１ｌＩｌｌＩによって除去した。
ン−１１α−ヘミスクシネート５岬を乾燥ジメチルホル
ムアミド１４０ノにとり、これにジシクロへキシルカル
ボジイミド２．４ｇｆおよびＮ−ヒトルキシスクシンイ
ミド４．０岬を加えた。反応混合物を室温で１２時間イ
ンキュベートし、ついで化成したジシクロヘキシル尿素
の結晶を遠心外１ｌＩｌｌＩによって除去した。
プロゲステロンの活性化エステルを含むこの溶液２μノ
を、＜５５ ｍＭザリン塩緩衝液（ｐｉ−１８，０）２
００ノに溶解したイクオリン１ｔＩＩｆＩに加えた。室
温で２０分インキュベーションしたのち、５ｍＭＦＩＤ
ＴＡ含有５ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉ８−Ｈ（Ｊ 緩衝液（ｐ
ｉ−１７，４）中５ｅｐｈａａ８Ｘ Ｇ −２５Ｋよっ
てゲルろ過を行い、プロゲステロンーイクオリン抱合体
を単離したロプロｒステロンーイクオリン抱合体は生物
発光性で、かつ同相抗プロｒステｐンエｇＧと反応する
能力により免疫学的に活性であった（例２参照）。
を、＜５５ ｍＭザリン塩緩衝液（ｐｉ−１８，０）２
００ノに溶解したイクオリン１ｔＩＩｆＩに加えた。室
温で２０分インキュベーションしたのち、５ｍＭＦＩＤ
ＴＡ含有５ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉ８−Ｈ（Ｊ 緩衝液（ｐ
ｉ−１７，４）中５ｅｐｈａａ８Ｘ Ｇ −２５Ｋよっ
てゲルろ過を行い、プロゲステロンーイクオリン抱合体
を単離したロプロｒステロンーイクオリン抱合体は生物
発光性で、かつ同相抗プロｒステｐンエｇＧと反応する
能力により免疫学的に活性であった（例２参照）。
この抱合体は一７０℃で４方力以上、４℃で２力月以上
安定であった。次の式（９）はプロｒステｐンーイクオ
リン抱合体の合成を示１′。
安定であった。次の式（９）はプロｒステｐンーイクオ
リン抱合体の合成を示１′。
例 ２
ゾロｒステロンーイクオリン抱合体（５０μｌ；１．７
Ｘ １０−１４モル、総ルミネッセンスカウント：”
、、５００ ）を緩衝液５０μｌおよびジアゾセルロー
スにカップリングした抗ゾロｒステロンエｇＧ （個相
抗体）の各種希釈液５０μｌと２時間インキュベートし
た。固相抗体に結合したゾロデステロンーイクオリン抱
合体を遠心分離によって分離し、その−Ｆ清１００μｌ
を嘔って生物発光活性を定量した。生物発光活性は光増
幅管の前でサンプル中に０．２ Ｍ ０ａＯ１２２０μ
ｌを注入し、生成した総光量を１５秒間測定することに
より定量した。
Ｘ １０−１４モル、総ルミネッセンスカウント：”
、、５００ ）を緩衝液５０μｌおよびジアゾセルロー
スにカップリングした抗ゾロｒステロンエｇＧ （個相
抗体）の各種希釈液５０μｌと２時間インキュベートし
た。固相抗体に結合したゾロデステロンーイクオリン抱
合体を遠心分離によって分離し、その−Ｆ清１００μｌ
を嘔って生物発光活性を定量した。生物発光活性は光増
幅管の前でサンプル中に０．２ Ｍ ０ａＯ１２２０μ
ｌを注入し、生成した総光量を１５秒間測定することに
より定量した。
第１図には、各種希釈度における同相抗体に結合したル
ミネッセンスのカウントをプロデステロンーイクオリン
抗体希釈曲線として示す。各点は６回の測定結果の平均
上標準偏差である。
ミネッセンスのカウントをプロデステロンーイクオリン
抗体希釈曲線として示す。各点は６回の測定結果の平均
上標準偏差である。
例 ６
ゾロデステロンＢＬＩＡ標準曲線
プロｒステロンーイクオリン抱合体（５０μｌ；１．７
ｘ １０−１４モル）に中間相抗体（抱合体の５０チ
が結合、例１１参照）の’ｙＡｏｏ希釈柄５０μｌと各
種濃度の標準プロプステロン溶液（１０ＭＭ〜１ ｎｍ
） ５０μｌを加えた。室温で２時間インキュベート
したのち、固相抗体に結合した抱合体の量を、例２に記
載したと同様にして定量した。
ｘ １０−１４モル）に中間相抗体（抱合体の５０チ
が結合、例１１参照）の’ｙＡｏｏ希釈柄５０μｌと各
種濃度の標準プロプステロン溶液（１０ＭＭ〜１ ｎｍ
） ５０μｌを加えた。室温で２時間インキュベート
したのち、固相抗体に結合した抱合体の量を、例２に記
載したと同様にして定量した。
第２図は、各種プロゲステロン濃度において同相抗体に
結合したルミネッセンスカウントを、プロｒステロンＢ
ＬＩＡ標準曲線として示す。各点は６回の測定結果の平
均標準偏差である。
結合したルミネッセンスカウントを、プロｒステロンＢ
ＬＩＡ標準曲線として示す。各点は６回の測定結果の平
均標準偏差である。
例 ４
１０ ｍＭ ＫＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７，５、反応緩衝液）２００μｊにイクオリン２０
０μｇを取り、これにＮ−スクシンイミジル−６−（２
−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＤＰＤ）３．１Ｘ
１０−５ ＩＩのエタノール２μｌ溶液を加えた。
ｐＨ７，５、反応緩衝液）２００μｊにイクオリン２０
０μｇを取り、これにＮ−スクシンイミジル−６−（２
−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＤＰＤ）３．１Ｘ
１０−５ ＩＩのエタノール２μｌ溶液を加えた。
６０分間室温でインキュベートしたのち、２−ぎリジル
ジスルフィド残基を含有するイクオリンを５ｅｐｈａｄ
θＫＧ−２５上デルろ過に１って単離した。
ジスルフィド残基を含有するイクオリンを５ｅｐｈａｄ
θＫＧ−２５上デルろ過に１って単離した。
同様に、ウサギエｇＧ１．５ｍｇを反応緩衝液５０μｌ
に収り、８ＤＰＤ ３．Ｉ Ｘ １０−５ｇと反応させ
、０．１５Ｍ Ｎａ０１含有１００ ｍＭ酢酸塩緩衝液
（ｐＨ５，０）中に単離した。次に、２−ピリジルジス
ルフィド基をジチオスレイトール（最終濃度５０ ｍＭ
）と室温で２０分反応させてチオール基に還元した。
に収り、８ＤＰＤ ３．Ｉ Ｘ １０−５ｇと反応させ
、０．１５Ｍ Ｎａ０１含有１００ ｍＭ酢酸塩緩衝液
（ｐＨ５，０）中に単離した。次に、２−ピリジルジス
ルフィド基をジチオスレイトール（最終濃度５０ ｍＭ
）と室温で２０分反応させてチオール基に還元した。
過剰の還元剤とピリジン−２−チオンをｒルろ過で除去
し、チオール含有ウサヤエｇＧを２−ぎりジルジスルフ
ィド基を含むイクオリンと混合した。室温で１２時間反
応させたのち、未反応イクオリンおよび他の副生成物を
Ａｍ１ｃｏｎ ＸＭ ５０膜を用いた限外ろ過により除
去した。ウサヤエｇＧ−イクオリン抱合体は、同相ヒツ
ジ抗−ウサヤエｇＧを用いた親和性クロマトグラフィー
によってさらに精製した。抱合体は生物発光性と、固相
抗体に対する結合能による免疫学的活性を示した。この
抱合体は一２０℃で保存すれば２力月間安定でめった。
し、チオール含有ウサヤエｇＧを２−ぎりジルジスルフ
ィド基を含むイクオリンと混合した。室温で１２時間反
応させたのち、未反応イクオリンおよび他の副生成物を
Ａｍ１ｃｏｎ ＸＭ ５０膜を用いた限外ろ過により除
去した。ウサヤエｇＧ−イクオリン抱合体は、同相ヒツ
ジ抗−ウサヤエｇＧを用いた親和性クロマトグラフィー
によってさらに精製した。抱合体は生物発光性と、固相
抗体に対する結合能による免疫学的活性を示した。この
抱合体は一２０℃で保存すれば２力月間安定でめった。
例 ５
親和性精製ウサギエｇＧ−イクオリン抱合体（総ルミネ
ッセンスカウント１，０００ ）の適当な希釈液５０μ
ｌを、シア・戸セルロースにカップリングしたヒツジ抗
−ウサギエｇＧの各種希釈液５０μｌおよび緩衝液５０
μｇとインキュベートした。２時間のインキュベーショ
ン後、同相抗体に結合したウサギエｇＧ−イクオリン抱
合体の量を、例２に記載したと同様にして定量した。
ッセンスカウント１，０００ ）の適当な希釈液５０μ
ｌを、シア・戸セルロースにカップリングしたヒツジ抗
−ウサギエｇＧの各種希釈液５０μｌおよび緩衝液５０
μｇとインキュベートした。２時間のインキュベーショ
ン後、同相抗体に結合したウサギエｇＧ−イクオリン抱
合体の量を、例２に記載したと同様にして定量した。
第６図は、各種抗体希釈液に対して結合したルミネッセ
ンスカウント（またはウサギエｇＧ−イクオリン抱合体
）をウサヤエｇＧ−イクオリン抱合体結合曲線として示
す。各点は６回の測定結果の平均上標準偏差である。
ンスカウント（またはウサギエｇＧ−イクオリン抱合体
）をウサヤエｇＧ−イクオリン抱合体結合曲線として示
す。各点は６回の測定結果の平均上標準偏差である。
例 ６
異項項二官能性試薬、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒ
ーロキシスクシンイミＰエステル（ＭＢＳ ）を、その
遊離アミン基を介して抗原とＲθｎ１ｌｌａルシフエラ
ーぜのスルフヒール基をカップリングさせるために用い
る。
ーロキシスクシンイミＰエステル（ＭＢＳ ）を、その
遊離アミン基を介して抗原とＲθｎ１ｌｌａルシフエラ
ーぜのスルフヒール基をカップリングさせるために用い
る。
ＭＢ８０．３２ ｈＫ／を含有するジオキサン（１５μ
ｌ）を、抗原ｉ ’ｎｇを含むリン酸塩緩衝１（ＰＩ−
１７，０）ｊ、５ｍ６に１７口える。この溶液を３０℃
に１時間保持し、ＭＢＳ反応抗原を５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ −’ｌ ５上で脱塩する。ついでＭＢＳ反応抗原を
Ｒｅｎ１ｌｌａルシフエラーゼｌ ｒｎｑと４ ’Ｏで
混合し、４℃で６時間インキュベートし、次にβ−メル
カプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）を加えて反
応を停止させた。非抱合抗原をＳθｐｈａｃｌｅｘ Ｇ
−７５上クロマトグラフイーによって標識抗原から除
去した。遊離標識と結合標識をこの操作で分離し、カラ
ム分画サンプルを収って、ルシフェリン（式Ｉ）を加え
、発生した光を曲１定することにより、容易にモニタリ
ングできる。
ｌ）を、抗原ｉ ’ｎｇを含むリン酸塩緩衝１（ＰＩ−
１７，０）ｊ、５ｍ６に１７口える。この溶液を３０℃
に１時間保持し、ＭＢＳ反応抗原を５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ −’ｌ ５上で脱塩する。ついでＭＢＳ反応抗原を
Ｒｅｎ１ｌｌａルシフエラーゼｌ ｒｎｑと４ ’Ｏで
混合し、４℃で６時間インキュベートし、次にβ−メル
カプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）を加えて反
応を停止させた。非抱合抗原をＳθｐｈａｃｌｅｘ Ｇ
−７５上クロマトグラフイーによって標識抗原から除
去した。遊離標識と結合標識をこの操作で分離し、カラ
ム分画サンプルを収って、ルシフェリン（式Ｉ）を加え
、発生した光を曲１定することにより、容易にモニタリ
ングできる。
例 ７
エネルギー転位を用いるホモＢＬＩＡ
ルシフェラーゼ標識抗原（例６参照）に、最大観察可能
エネルギー転位のほぼ５０％を与える量のＧＦＰ標識抗
体を加える。混合物はＴｒｉｓ−ＨＯｌ（ｐＨ７〜８）
のような低等性の緩衝液中に保持する。ルシフェリン（
式■）添加後、標識抗原とＧＦＰ標識抗体の間の相互作
用の結果としてのエネルギー転位により、４８０ ｎｍ
と５０９ ｎｍにおける発光の比の変ｍｂが起こる。両
発光の同時測定は２波長フオトメーターで行われる。発
光比すなわち４８０ ／ ５０９ ｎｍを６己録する。
エネルギー転位のほぼ５０％を与える量のＧＦＰ標識抗
体を加える。混合物はＴｒｉｓ−ＨＯｌ（ｐＨ７〜８）
のような低等性の緩衝液中に保持する。ルシフェリン（
式■）添加後、標識抗原とＧＦＰ標識抗体の間の相互作
用の結果としてのエネルギー転位により、４８０ ｎｍ
と５０９ ｎｍにおける発光の比の変ｍｂが起こる。両
発光の同時測定は２波長フオトメーターで行われる。発
光比すなわち４８０ ／ ５０９ ｎｍを６己録する。
反応混合物中の遊離抗原量が増加するに従い、エネルギ
ー転位の減少によって４８０ ／ ５９ Ｏｎｍ比は増
加する。
ー転位の減少によって４８０ ／ ５９ Ｏｎｍ比は増
加する。
例 ８
ルシフエラービ標識抗原およびＧＮＰ標識抗体の量は例
７の場合と同じである。条件も同じにする。
７の場合と同じである。条件も同じにする。
しかしながら、ルシフェリン（式Ｉ）の添加による発光
促進とエネルギー転位でなく、ルシフェリンの類縁体を
使用した。たとえば、発光は、式■においてＲ１−フェ
ニル、Ｒ３＝ベンジルであるルシフェリン類縁体で促進
した。エネルギー転位により、５０９ ｎｍに発光が認
められ、４８０ ｎｍにはほとんどまたは全くシグナル
がみられない。反応混合物中の遊離抗原量が増加するに
従い、エネルギー転位の低下により５０９ ｎｍの光強
度は減少する。この例では、均−ＢＬＩＡを実施するた
めに、牟−波長での測定しか必要でなかった。
促進とエネルギー転位でなく、ルシフェリンの類縁体を
使用した。たとえば、発光は、式■においてＲ１−フェ
ニル、Ｒ３＝ベンジルであるルシフェリン類縁体で促進
した。エネルギー転位により、５０９ ｎｍに発光が認
められ、４８０ ｎｍにはほとんどまたは全くシグナル
がみられない。反応混合物中の遊離抗原量が増加するに
従い、エネルギー転位の低下により５０９ ｎｍの光強
度は減少する。この例では、均−ＢＬＩＡを実施するた
めに、牟−波長での測定しか必要でなかった。
例 ９
アポ発光タンパク質−抗原抱合体の合成は、例１に概略
を述べた操作に従って行われる。結合アポ発光タンパク
質を次に、式４で要約された操作に従って、適当なルシ
フェリン類縁体の存在下に発光タンパク質標識抗原に変
換する。ＢＤＴＡ含有緩衝液中５ｅｐｈａｄθｘＧ−２
５でｒルろ過を行い、低分子１成分を除去する。たとえ
ば例８に示したようなルシフェリン類縁体をアポ発光タ
ンパク質の再チヤージ時に１吏えば、発行タンパク質標
識抗原にＯａ”＋を加える場合、はとんどまたは全く光
は観察されない。しかしながら、ＧＦＰ−標識抗体を加
えると、抗原−抗体複合体が形成されるので、５０９ｎ
＋ｎ４Ｃ発光がみられる。このような発光タンパク質標
識抗原は、Ｏａ２＋添加により５０９ ｎｍに最大観察
可能シゲナルの約５０％を与える量のＧＦＰ−標識抗体
を加える。反応混合物中の遊離抗原量が増加するほど、
５０９ｎｍにおける光強度はエネルギー転位の減少によ
り低下した。これは単一波長での測定による均−ＢＬＩ
へのもうひとつの例を提供するものである。
を述べた操作に従って行われる。結合アポ発光タンパク
質を次に、式４で要約された操作に従って、適当なルシ
フェリン類縁体の存在下に発光タンパク質標識抗原に変
換する。ＢＤＴＡ含有緩衝液中５ｅｐｈａｄθｘＧ−２
５でｒルろ過を行い、低分子１成分を除去する。たとえ
ば例８に示したようなルシフェリン類縁体をアポ発光タ
ンパク質の再チヤージ時に１吏えば、発行タンパク質標
識抗原にＯａ”＋を加える場合、はとんどまたは全く光
は観察されない。しかしながら、ＧＦＰ−標識抗体を加
えると、抗原−抗体複合体が形成されるので、５０９ｎ
＋ｎ４Ｃ発光がみられる。このような発光タンパク質標
識抗原は、Ｏａ２＋添加により５０９ ｎｍに最大観察
可能シゲナルの約５０％を与える量のＧＦＰ−標識抗体
を加える。反応混合物中の遊離抗原量が増加するほど、
５０９ｎｍにおける光強度はエネルギー転位の減少によ
り低下した。これは単一波長での測定による均−ＢＬＩ
へのもうひとつの例を提供するものである。
以上の例は、本発明の範囲内に含まれる特定の態様を例
示したものであって、本発明の範囲を限定するものでは
ない。本発明について、以−ヒ、特定の態様に関して述
べてきたが、本発明はそれらに限定されるものではない
。その変更、改変が、本発明の範囲から逸脱することな
く可能であることは、本技術分野における熟練者には自
明のとおりである。
示したものであって、本発明の範囲を限定するものでは
ない。本発明について、以−ヒ、特定の態様に関して述
べてきたが、本発明はそれらに限定されるものではない
。その変更、改変が、本発明の範囲から逸脱することな
く可能であることは、本技術分野における熟練者には自
明のとおりである。
第１図は、各蓄釈浴液において同相抗体に結合するルミ
ネッセンスカウントを示す、ゾロデステロンーイクオリ
ン抗体希釈曲線、第２図は各プロゲステロン濃度におい
て同相抗体に結合するルミネッセンスカウントを示すプ
ロプステロンＢＬＩＡ標準曲線、第６図は各抗体希釈度
で結合するルミネッセンスカウント（またはウサギエｇ
Ｇ−イクオリン抱合体）を示すウサギエｇＧ−イクオリ
ン抱合体結合曲線である。縦軸はいずれも結合ルミネッ
センスカウントを、横軸は第１図が固相抗ゾロｒステロ
ン希釈倍率、第２図がプロプステロン量（ピコモル）、
第６図が固相ヒツジ抗−ウサイエｇ（）希釈倍率である
。各点は６回の測定結果の平均である。
ネッセンスカウントを示す、ゾロデステロンーイクオリ
ン抗体希釈曲線、第２図は各プロゲステロン濃度におい
て同相抗体に結合するルミネッセンスカウントを示すプ
ロプステロンＢＬＩＡ標準曲線、第６図は各抗体希釈度
で結合するルミネッセンスカウント（またはウサギエｇ
Ｇ−イクオリン抱合体）を示すウサギエｇＧ−イクオリ
ン抱合体結合曲線である。縦軸はいずれも結合ルミネッ
センスカウントを、横軸は第１図が固相抗ゾロｒステロ
ン希釈倍率、第２図がプロプステロン量（ピコモル）、
第６図が固相ヒツジ抗−ウサイエｇ（）希釈倍率である
。各点は６回の測定結果の平均である。
Claims (20)
- （１）腔腸動物由来の発光タンパク質、ルシフエラーゼ
、アポ発光タンパク質、および光エネルギー転位受容体
よりなる群から選ばれるタンパク質にリガンドが共有結
合している、バイオルミネツセンス連結結合定量法にお
ける使用に適したタンパク質−リガンド抱合体。 - （２）リガンドは抗原または抗体である特許請求の範囲
第１項記載の抱合体。 - （３）リガンドはホルモンまたはホルモン受容体である
特許請求の範囲第１項記載の抱合体。 - （４）リガンドは核酸である特許請求の範囲第１項記載
の抱合体。 - （５）タンパク質はイクオリン、オベリン、ネミオプシ
ンもしくはベロビン、またはイクオリン、オベリン、ネ
ミオプシンもしくはベロビンから形成されるアポ発光タ
ンパク質である特許請求の範囲第１項記載の抱合体。 - （６）タンパク質は緑色螢光性タンパク質である特許請
求の範囲第１項記載の抱合体。 - （７）（ａ）ルシフエリンまたはルシフエリン様分子を
含む腔腸動物由来の発光タンパク質、ルシフエラーゼお
よびアポ発光タンパク質よりなる群から選ばれるタンパ
ク質標識で、かつ発光を生じる状態に活性化されうるタ
ンパク質標識に共有結合した第一のリガンドを準備し、
（ｂ）ルシフエリンまたはルシフエリン様分子からの光
エネルギーを受け取ることができる光エネルギー転位受
容体に共有結合し、タンパク質標識に結合した第一のリ
ガンドと複合体を形成した場合タンパク質標識の発光し
た光を修飾できる第二のリガンドを準備し、（ｃ）第一
のリガンドと第二のリガンドを接触させて第一のリガン
ドと第二のリガンドとの間に複合体を形成させ、（ｄ）
この被合体を発光促進試薬と、すなわち（ｉ）標識がル
シフエリンまたはルシフエリン様分子を含む発光タンパ
ク質の場合は複合体をカルシウムイオンと、（ｉｉ）標
識がルシフエラーゼである場合は複合体をルシフエリン
またはルシフエリン様分子と、また（ｉｉｉ）標識がア
ポ発光タンパク質である場合はアポ発光タンパク質をル
シフエリンまたはルシフエリン様分子と反応させて発光
タンパク質に変換したのち複合体をカルシウムイオンと
、接触させ、（ｅ）この複合体が発した光を検知するこ
とを特徴とする第一のリガンドと第二のリガンドとの間
の結合相互作用を検知する方法。 - （８）（ａ）ルシフエリンまたはルシフエリン様分子を
含む腔腸動物由来の発光タンパク質、ルシフエラーゼお
よびアポ発光タンパク質よりなる群から選ばれるタンパ
ク質標識で、かつ発光を生じる状態に活性化されうるタ
ンパク質標識に共有結合した第一のリガンドを準備し、
（ｂ）ルシフエリンまたはルシフエリン様分子からの光
エネルギーを受け取ることができる光エネルギー転位受
容体に共有結合し、タンパク質標識に結合した第一のリ
ガンドと被合体を形成した場合タンパク標識の発光した
光を修飾できるリガンドを準備し（ただし第一のリガン
ドまたは第二のリガンドのいずれかが検知すべきリガン
ドと同一である）、（ｃ）サンプルを、サンプル中の定
量すべきリガンドと同一でない第一のリガンドまたは第
二のリガンドの一方および第一のリガンドまたは第二の
リガンドの他方の既定量と接触させて、サンプル中の定
量すべきリガンドと同一でない方のリガンドとサンプル
中の定量すべきリガンドとの第一の複合体および第一の
リガンドまたは第二のリガンドの一方と第一のリガンド
と第二のリガンドとの第二の被合体を形成させ、（ｄ）
両被合体を発光促進試薬と、すなわち（ｉ）標識がルシ
フエリンまたはルシフエリン様分子を含む発光タンパク
質の場合は複合体をカルシウムイオンと、（ｉｉ）標識
がルシフエラーゼである場合は複合体をルシフエリンま
たはルシフエリン様分子と、また（ｉｉｉ）標識がアポ
発光タンパク質である場合はアポ発光タンパク質をルシ
フエリンまたはルシフエリン様分子と反応させて発光タ
ンパク質に変換したのち複合体をカルシウムイオンと、
接触させ、（ｅ）このルシフエリンまたはルシフエリン
様分子が発した光を検知することを特徴とする第一のリ
ガンドと第二のリガンドとの間の結合相互作用によつて
サンプル中のリガンドを検知する方法。 - （９）（ａ）反応混合物中で、第一のリガンドを、腔腸
動物由来の発光タンパク質、ルシフエラーゼおよびアポ
発光タンパク質よりなる群から選ばれるタンパク質標識
に共有結合した第二のリガンドと接触させて、第一のリ
ガンドと第二のリガンドの間に結合複合体を形成させ、
（ｂ）その複合体を反応混合物から分離し、（ｃ）その
複合体を発光促進試薬と、すなわち（ｉ）標識がルシフ
エリンまたはルシフエリン様分子を含む発光タンパク質
である場合は複合体をカルシウムイオンと、（ｉｉ）標
識がルシフエラーゼである場合は複合体をルシフエリン
またはルシフエリン様分子と、また（ｉｉｉ）標識がア
ポ発光タンパク質である場合はアポ発光タンパク質をル
シフエリンまたはルシフエリン様分子と反応させて発光
タンパク質に変換したのち複合体をカルシウムイオンと
、接触させて発光させ、（ｄ）その複合体が発した光を
検知することを特徴とする第一のリガンドと第二のリガ
ンドとの間の結合相互作用を検知する方法。 - （１０）（ａ）反応メジウム中で、第一のリガンドを、
検知すべきリガンドと同一であつて、しかも腔腸動物由
来発光タンパク質、ルシフエラーゼおよびアポ発光タン
パク質よりなる群から選ばれるタンパク質標識に共有結
合した第二のリガンドの既知量ならびにサンプルと接触
させて、第一のリガンドと第二のリガンドの間に第一の
複合体および第一のリガンドと検出すべきリガンドとの
間に第二の軸合体を形成させ、（ｂ）両複合体を発光促
進試薬と、すなわち（ｉ）標識がルシフエリンまたはル
シフエリン様分子を含む発光タンパク質である場合は複
合体をカルシウムイオンと、（ｉｉ）標識がルシフエラ
ーゼである場合は複合体をルシフエリンまたはルシフエ
リン様分子と、また（ｉｉｉ）標識がアポ発光タンパク
質である場合はアポ発光タンパク質をルシフエリンまた
はルシフエリン様分子と反応させて発光タンパク質に変
換したのち複合体をカルシウムイオンと、接触させて発
光させ、（ｄ）そのルシフエリンまたはルシフエリン様
分子が発した光を検知することを特徴とする第一のリガ
ンドと第二のリガンドとの間の結合相互作用によつてサ
ンプル中のリガンドを検知する方法。 - （１１）結合相互作用は抗原−抗体、ハプテン−抗体、
ホルモン−受容体、タンパク質−核酸または核酸−核酸
相互作用である特許請求の範囲第７項から第１０項まで
のいずれかに記載の方法。 - （１２）ルシフエリン様分子は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は芳香族基、異項環基、アルキル基およ
び水素よりなる群から選ばれ、Ｒ＿２は芳香族基、異項
環基、アルキル基および水素よりなる群から選ばれ、Ｒ
＿３は芳香族基、異項環基、アルキル基および水素より
なる群から選ばれる）で表される特許請求の範囲第７項
から第１１項までのいずれかに記載の方法。 - （１３）ルシフエリン分子は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はｐ−ヒドロキシフエニル基、Ｒ＿２は
ベンジル基、Ｒ＿３はｐ−ヒドロキシベンジル基である
）で表される特許請求の範囲第７項から第１０項までの
いずれかに記載の方法。 - （１４）発光タンパク質はイクオリン、オベリン、ネミ
オプシンまたはベロビンである特許請求の範囲第７項か
ら第１０項までのいずれかに記載の方法。 - （１５）第二のリガンドは、ルシフエリンまたはルシフ
エリン様分子からの光エネルギーを受け取ることができ
る光エネルギー転換受容体標識に共有結合している特許
請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載の方法
。 - （１６）光エネルギー転換受容体は、緑色螢光タンパク
質、フルオレセイン、フイコエリトリン、ローダミン、
ルシフアー黄色色素、または９，１０−ビスフエネチニ
ルアントラセンである特許請求の範囲第７項から第１０
項までのいずれかに記載の方法。 - （１７）腔腸動物由来の発光タンパク質、ルシフエラー
ゼ、アポ発光タンパク質および光エネルギー転換受容体
よりなる群から選ばれるタンパク質標識に共有結合した
第一のリガンドで構成される第一のタンパク質−リガン
ド抱合体の既定量を含有する第一の容器からなるバイオ
ルミネツセンス連結結合定量法を実施するのに適当なキ
ット。 - （１８）タンパク質は、イクオリン、オベリン、ネミオ
プシンもしくはベロビン、またはイクオリン、オベリン
、ネミオプシンもしくはベロビンから形成されるアポ発
光タンパク質である特許請求の範囲第１７項記載のキッ
ト。 - （１９）第一の容器は、タンパク質が発光タンパク質、
ルシフエラーゼまたはアポ発光タンパク質であるタンパ
ク質−リガンド抱合体を含み、さらに光エネルギー転位
受容体標識と共有結合した第二のリガンドからなる第二
のタンパク質−リガンド抱合体の既定量を含有する第二
の容器を組合わせ、第一リガンドと第二のリガンドは両
者間の結合相互作用が可能で結合複合体を形成する特許
請求の範囲第１７項記載のキット。 - （２０）光エネルギー転換受容体標識は緑色螢光タンパ
ク質である特許請求の範囲第１９項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54140583A | 1983-10-13 | 1983-10-13 | |
| US541405 | 1983-10-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6122254A true JPS6122254A (ja) | 1986-01-30 |
Family
ID=24159462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59214022A Pending JPS6122254A (ja) | 1983-10-13 | 1984-10-12 | バイオルミネツセンス連結結合定量法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0137515A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6122254A (ja) |
| AU (1) | AU590511B2 (ja) |
| CA (1) | CA1234756A (ja) |
| DK (1) | DK487784A (ja) |
| ES (2) | ES8607563A1 (ja) |
| FI (1) | FI844017L (ja) |
| NO (1) | NO164442C (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH04149199A (ja) * | 1990-10-11 | 1992-05-22 | Chisso Corp | 発光蛋白エクオリン標識抗体 |
| JPH08211058A (ja) * | 1994-10-28 | 1996-08-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | 競合免疫検定における使用のための生物発光標識ハプテン |
Families Citing this family (29)
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|---|---|---|---|---|
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| JP3293820B2 (ja) * | 1985-12-13 | 2002-06-17 | エンゾ− バイオケム インコ−ポレイテツド | 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
| GB8610426D0 (en) * | 1986-04-29 | 1986-06-04 | Leaback D H | Bound assay components |
| JPS62261942A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-14 | Chisso Corp | 金属の検出方法 |
| FR2617974B1 (fr) * | 1987-07-07 | 1992-11-13 | Stabiligen | Procede de dosage immunologique par bio- ou chimio- luminescence |
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