JPH04149199A - 発光蛋白エクオリン標識抗体 - Google Patents
発光蛋白エクオリン標識抗体Info
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- JPH04149199A JPH04149199A JP27303490A JP27303490A JPH04149199A JP H04149199 A JPH04149199 A JP H04149199A JP 27303490 A JP27303490 A JP 27303490A JP 27303490 A JP27303490 A JP 27303490A JP H04149199 A JPH04149199 A JP H04149199A
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［技術の分野〕
本発明は、特異的結合能を有する物質と結合したエクオ
リン活性を有する蛋白質、該蛋白質と該蛋白質の基質と
なり得る発光体との複合体及びそれらの調製法、及び該
発光体を用いた標的物の検出法に関する。
リン活性を有する蛋白質、該蛋白質と該蛋白質の基質と
なり得る発光体との複合体及びそれらの調製法、及び該
発光体を用いた標的物の検出法に関する。
［従来の技術とその問題点コ
エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハーバ−島
近郊に生息する発光クラゲより分離されたカルシウム受
容発光蛋白質である。
近郊に生息する発光クラゲより分離されたカルシウム受
容発光蛋白質である。
エクオリン１分子に２分子（或は３分子）のＣ８２１イ
オンが結合することによりエクオリン分子中に含まれる
活性化状態にあるセレンテラジンが酸化され、光とＣｏ
２を放出する。この発光には、Ｃ８２４イオンが不可欠
なことより、エクオリンを用いて０８２′を特異的に定
量検出することが可能である。 Ｃｓ”イオンの検出限
界は１０−”Ｍ程度であり、非常にＥ度がよいことが特
徴である。
オンが結合することによりエクオリン分子中に含まれる
活性化状態にあるセレンテラジンが酸化され、光とＣｏ
２を放出する。この発光には、Ｃ８２４イオンが不可欠
なことより、エクオリンを用いて０８２′を特異的に定
量検出することが可能である。 Ｃｓ”イオンの検出限
界は１０−”Ｍ程度であり、非常にＥ度がよいことが特
徴である。
しかしながら、エクオリンの天然からの分離は発光クラ
ゲ１０トンから２００＋ａｇ程度にすぎず、生産五は十
分でなく、一定量の供給が保証されていない。
ゲ１０トンから２００＋ａｇ程度にすぎず、生産五は十
分でなく、一定量の供給が保証されていない。
本発明者らは組換えＤＮＡの手法を用いて、発光クラゲ
よりアポエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、その
１次構造を決定した（特開昭６１−１３５．５８６）。
よりアポエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、その
１次構造を決定した（特開昭６１−１３５．５８６）。
次いで、このｃＤＮＡを用いて大腸菌を宿主とし、その
菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に成功した
（特開昭６２−１９６，０３１） 、さらに陰イオン交
換クロマトグラフィー法によるアポエクオリンの精製法
も確立した（特開平１−１３２Ｊ９７）。
菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に成功した
（特開昭６２−１９６，０３１） 、さらに陰イオン交
換クロマトグラフィー法によるアポエクオリンの精製法
も確立した（特開平１−１３２Ｊ９７）。
また、酵素免疫測定法に利用すべく、化学結合法及び物
理吸着法によるエクオリン活性を有する蛋白質の固定化
法を確立しく特願平１−２９】、４８Ｂ。
理吸着法によるエクオリン活性を有する蛋白質の固定化
法を確立しく特願平１−２９】、４８Ｂ。
特願平１−２９１．４Ｎ）、化学修飾エクオリンの調製
に成功した（特願平１−３０９．４７８）。
に成功した（特願平１−３０９．４７８）。
さらに、エクオリン活性を有する蛋白質を特異的結合能
を有する蛋白質を介して標的物に結合廿しめることによ
り、標的物を特異的に発光で検出することができる。こ
こで、特異的結合とは抗原抗体反応、酵素反応、レセプ
ターへの特異的結合、核酸と蛋白質の特異的結合等を利
用した結合である。そして、特異的結合能を有する蛋白
質と結合したエクオリン活性を有する蛋白質は、上述し
た機能から詮断薬等の検査薬として有用であることが予
測される。
を有する蛋白質を介して標的物に結合廿しめることによ
り、標的物を特異的に発光で検出することができる。こ
こで、特異的結合とは抗原抗体反応、酵素反応、レセプ
ターへの特異的結合、核酸と蛋白質の特異的結合等を利
用した結合である。そして、特異的結合能を有する蛋白
質と結合したエクオリン活性を有する蛋白質は、上述し
た機能から詮断薬等の検査薬として有用であることが予
測される。
本発明者らは上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果
、特異的結合能を有する蛋白質と結合したエクオリン活
性を有する蛋白質とその調製法、該蛋白質と該蛋白質の
基質となり得る発光体との複合体、および特異的結合能
を有する蛋白質と結合したエクオリン活性を有する蛋白
質を用いた新しい検出法を開発することができた。
、特異的結合能を有する蛋白質と結合したエクオリン活
性を有する蛋白質とその調製法、該蛋白質と該蛋白質の
基質となり得る発光体との複合体、および特異的結合能
を有する蛋白質と結合したエクオリン活性を有する蛋白
質を用いた新しい検出法を開発することができた。
以上の説明から明らかなように、本発明の目的はエクオ
リン活性を保持した特異的結合能を有する蛋白質と結合
した蛋白質とその応用物または応用方性を提供すること
である。
リン活性を保持した特異的結合能を有する蛋白質と結合
した蛋白質とその応用物または応用方性を提供すること
である。
［問題点を解決するための手段］
本発明は、下記 （１）〜（１０）の構成を有する。
（１）エクオリン活性を有する蛋白質に特異的結合能を
有する物質を結合手段を用いて共有結合させることを特
徴とするエクオリン活性を有する蛋白質の調製法。
有する物質を結合手段を用いて共有結合させることを特
徴とするエクオリン活性を有する蛋白質の調製法。
（２）前記第 （１）項に記載の調製法により調製され
てなる特異的結合能を有する物質と結合したエクオリン
活性を有する蛋白質。
てなる特異的結合能を有する物質と結合したエクオリン
活性を有する蛋白質。
（３）前記第 （２）項に記載の蛋白質と該蛋白質の基
質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質と
該発光体との複合体。
質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質と
該発光体との複合体。
（４）結合方法として、架橋剤を用いることを特徴とす
る前記第（１）項に記載の方法。
る前記第（１）項に記載の方法。
（５）前記第 （４）項に記載の調製法により調製され
てなる特異的結合能を有する物質と結合したエクオリン
活性を有する蛋白ｐｘ。
てなる特異的結合能を有する物質と結合したエクオリン
活性を有する蛋白ｐｘ。
（６）前記第 （５）項に記載の蛋白質と該蛋白質の基
質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質と
該発光体との複合体。
質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質と
該発光体との複合体。
（７）特異的結合能を有する物質とエクオリン活性を有
する蛋白質を結合手段を用いて結合させ、かくして得ら
れた結合物を標的物質に結合させることを特徴とする標
的物質の検出法。
する蛋白質を結合手段を用いて結合させ、かくして得ら
れた結合物を標的物質に結合させることを特徴とする標
的物質の検出法。
（８）結合物がエクオリン活性及び抗体結合能を有する
物質である前記第 （））項に記載の検出法。
物質である前記第 （））項に記載の検出法。
（９）特異的結合能を有する物質が、酵素、抗体、プロ
テインＡ、プロテインＧ 、 ＤＮＡ 、 ＲＮＡ 。
テインＡ、プロテインＧ 、 ＤＮＡ 、 ＲＮＡ 。
ＤＮＡ結合蛋白質もしくはレセプターである前記第 （
１）項もしくは第 （７）項に記載の調製法もしくは検
出法。
１）項もしくは第 （７）項に記載の調製法もしくは検
出法。
（１０）標的物質が５基質、補酵素、補欠分子族、抗原
、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモンもしくはトランスミ
ツターである前記第（ア）項に記載の検出法。
、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモンもしくはトランスミ
ツターである前記第（ア）項に記載の検出法。
本発明の構成につき以下に詳述する。
ここでエクオリン活性を有する蛋白質とは、アポエクオ
リン蛋白質の他、種々の機能五白買とアポエクオリンと
の融合蛋白質または種々の物質により修飾を受けた修飾
アポエクオリン等の蛋白質であってエクオリン活性を有
するものを言う。
リン蛋白質の他、種々の機能五白買とアポエクオリンと
の融合蛋白質または種々の物質により修飾を受けた修飾
アポエクオリン等の蛋白質であってエクオリン活性を有
するものを言う。
本発明は、特異的結合能を有する物質とエクオリン活性
を有する蛋白質の結合物とその調製法及び該結合物を用
いた標的物質の検出法に係わるものであり、例えば後述
の実施例に示す方法で実施することができる。
を有する蛋白質の結合物とその調製法及び該結合物を用
いた標的物質の検出法に係わるものであり、例えば後述
の実施例に示す方法で実施することができる。
本発明を添付図面によって説明すると、第１図は標識用
マレイミド−エクオリン調製工程図（フローシート）を
示す０例えばエクオリン９．７９ｍｇを含むリン酸ソー
ダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐ）１６．０１）．０００μｌに
、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドｏ、ｕｍｇ１
５μＡ Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えた後、３
０℃で、３０分間インキュベートする。
マレイミド−エクオリン調製工程図（フローシート）を
示す０例えばエクオリン９．７９ｍｇを含むリン酸ソー
ダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐ）１６．０１）．０００μｌに
、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドｏ、ｕｍｇ１
５μＡ Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えた後、３
０℃で、３０分間インキュベートする。
その後、セファデックスＧ−５０（１、Ｏｘ４０ｃｍ）
のカラムで溶媒としてリン酸ソーダ緩衝液（［１，ＩＭ
、ｐＨ６−０）を用いて、ゲル濾過を行い、標識用マレ
イミド−エクオリンビークを分取する８次いで、ミクロ
コンセントレータ−・セントリコン−１０を用いて、標
識用マレイミド−エクオリン画分を濃縮する。
のカラムで溶媒としてリン酸ソーダ緩衝液（［１，ＩＭ
、ｐＨ６−０）を用いて、ゲル濾過を行い、標識用マレ
イミド−エクオリンビークを分取する８次いで、ミクロ
コンセントレータ−・セントリコン−１０を用いて、標
識用マレイミド−エクオリン画分を濃縮する。
以上の操作により、標識用マレイミド−エクオリンが得
られる。
られる。
第２図は還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギエｇ（ｉ調製
工程図（フローシート）を示す０例久ば抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギＩｇＧ ［１，Ｈｓｇを含むリン酸ソーダＨ
ａ液ｆＯ，１Ｍ、ｐｌ＋６．ｏ） ９００μＡに、Ｏ，
１Ｍ２−メルカプトエチルアミンを含む５ａｌｌ ＥＤ
Ｔ＾／リン酸ソーダｉｉ？ｆｉ液（（１，ＩＭ、ｐＨ６
、ｏ） １００μｍを加え、３７０Ｃ’ｔ−９０分間イ
ンキュベーションする。
工程図（フローシート）を示す０例久ば抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギＩｇＧ ［１，Ｈｓｇを含むリン酸ソーダＨ
ａ液ｆＯ，１Ｍ、ｐｌ＋６．ｏ） ９００μＡに、Ｏ，
１Ｍ２−メルカプトエチルアミンを含む５ａｌｌ ＥＤ
Ｔ＾／リン酸ソーダｉｉ？ｆｉ液（（１，ＩＭ、ｐＨ６
、ｏ） １００μｍを加え、３７０Ｃ’ｔ−９０分間イ
ンキュベーションする。
その後セファデックスＧ−５０（１，Ｄｘ ４０ｃｍ）
のカラムで溶媒として５ｍＭ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
Ｍ衝液（０，１Ｍ、ｐｈ６．０）を用いて、ゲル濾過を
行い、還元型読ヒト下ＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分
取した１以上の操作により、還元型読ヒト下ＮＦ−〇・
ウサギＩｇＧが得られる。
のカラムで溶媒として５ｍＭ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
Ｍ衝液（０，１Ｍ、ｐｈ６．０）を用いて、ゲル濾過を
行い、還元型読ヒト下ＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分
取した１以上の操作により、還元型読ヒト下ＮＦ−〇・
ウサギＩｇＧが得られる。
第３図はエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体
調製工程図（フローシート）を示す０例えば第２図の工
程で得られる還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧ
１〜ｌｏｍｇを含む５０１Ｍ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
緩衝液（０，＋Ｍ、ｐＨ６，０）２．０１）Ａと第１図
の工程で得られる標識用マレイミド−エクオリン１０Ｂ
を含むリン酸ソーダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，０）
ｆｉｎを混合し、４℃で２２２時間インキュページンす
る。
調製工程図（フローシート）を示す０例えば第２図の工
程で得られる還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧ
１〜ｌｏｍｇを含む５０１Ｍ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
緩衝液（０，＋Ｍ、ｐＨ６，０）２．０１）Ａと第１図
の工程で得られる標識用マレイミド−エクオリン１０Ｂ
を含むリン酸ソーダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，０）
ｆｉｎを混合し、４℃で２２２時間インキュページンす
る。
その後、セファデックスＧ−５０（１，０ｘ４０ｃ■）
のカラムでＷＩ媒としてリン酸ソーダＭｉ？Ｉｌ液（０
，１Ｍ、ｐＨ８，５）を用いて、ゲル濾過を行い、エク
オリンｍｌ抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分取
する６以上の操作により、エクオリンｒＩＩＩ識抗ヒト
ＴＮＦ−α・ウサギ抗体が得られる。
のカラムでＷＩ媒としてリン酸ソーダＭｉ？Ｉｌ液（０
，１Ｍ、ｐＨ８，５）を用いて、ゲル濾過を行い、エク
オリンｍｌ抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分取
する６以上の操作により、エクオリンｒＩＩＩ識抗ヒト
ＴＮＦ−α・ウサギ抗体が得られる。
第４・５図はエクオリン１ｌｌｌＩ識抗ヒトＴＮＦ−α
・ウサギ抗体を用いたヒトγＮＦ−αの定量工程図（フ
ローシート）及びその結果を示す０例えばルミフォトメ
ーター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のポリス
チレンキュベツト（外径１０ｘ８５ｍ１））に１００μ
ｍの抗ヒトＴＮＦ−α抗体溶液を入れ、バラフィルムで
ポリスチレンキュベツトの上端をカバーした後、４℃で
７２時間インキ一ユベー卜する。
・ウサギ抗体を用いたヒトγＮＦ−αの定量工程図（フ
ローシート）及びその結果を示す０例えばルミフォトメ
ーター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のポリス
チレンキュベツト（外径１０ｘ８５ｍ１））に１００μ
ｍの抗ヒトＴＮＦ−α抗体溶液を入れ、バラフィルムで
ポリスチレンキュベツトの上端をカバーした後、４℃で
７２時間インキ一ユベー卜する。
抗ヒト丁ＮＦ−〇抗体溶液を除去した後、３００μｍの
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒをボリスチｌ／ンキュ
ベット中に入れ、再度パラフィルムでカバーして３７℃
で２時間インキュベーションし、抗ヒト丁ＮＦ−α抗体
をポリスチレンキュベツトの内壁に固定化する。
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒをボリスチｌ／ンキュ
ベット中に入れ、再度パラフィルムでカバーして３７℃
で２時間インキュベーションし、抗ヒト丁ＮＦ−α抗体
をポリスチレンキュベツトの内壁に固定化する。
次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを除去し、４ｒ
ＪＯｕＪ−のＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチ
レンキュベツトの内壁を３回洗浄した後、全てのポリス
チレンキュベツト中に５０μｍのＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔを入れ、さらに各種濃度のヒトＴＮＦ−α溶液
を５０μｍずつ加えた後、バラフィルムでカバーシ３７
℃で２時間インキュベーションする。このとき使用した
ヒトＴＮＦ−α溶液の濃度は、２０，４０，１５０，２
６７．３８３，５００．δ６７．８３３１、ＯＯＯｐｇ
／ ｍａｌとする。
ＪＯｕＪ−のＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチ
レンキュベツトの内壁を３回洗浄した後、全てのポリス
チレンキュベツト中に５０μｍのＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔを入れ、さらに各種濃度のヒトＴＮＦ−α溶液
を５０μｍずつ加えた後、バラフィルムでカバーシ３７
℃で２時間インキュベーションする。このとき使用した
ヒトＴＮＦ−α溶液の濃度は、２０，４０，１５０，２
６７．３８３，５００．δ６７．８３３１、ＯＯＯｐｇ
／ ｍａｌとする。
ヒトＴＮＦ−α溶液を除去し、４００μｍのＩ！ｆａｓ
ｈｉｎｇＢυｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの内壁
を３回洗浄した後、１００ μｍのエクオリン標識抗ヒ
トＴＮＦ−α・ウサギ抗体溶液を全てのポリスチレンキ
ュベツトに入れ、バラフィルムでカバーした後、３７℃
で２時間インキュベーションする。
ｈｉｎｇＢυｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの内壁
を３回洗浄した後、１００ μｍのエクオリン標識抗ヒ
トＴＮＦ−α・ウサギ抗体溶液を全てのポリスチレンキ
ュベツトに入れ、バラフィルムでカバーした後、３７℃
で２時間インキュベーションする。
この後、余剰のエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−〇・ウサ
ギ抗体を除去するために、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ
−α・ウサギ抗体溶液を除去した後、４００ｕｆＬのＷ
ａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツト
の内壁を３回洗浄する。
ギ抗体を除去するために、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ
−α・ウサギ抗体溶液を除去した後、４００ｕｆＬのＷ
ａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツト
の内壁を３回洗浄する。
続いて、２−メルカプトエタノール１μｋ。
２μｇ／ ｍＡセレンテラジン１μｊ２．２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１．００ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ緩衝液＋ｏμｘ及び蒸留水８８μぶをポリスチレ
ンキュベツト中に入れ、バラフィルムでカバーした後、
４℃で２０時間インキュベーションし、ルミフォトメー
ター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）を用いて、
エクオリン活性を測定する。
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１．００ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ緩衝液＋ｏμｘ及び蒸留水８８μぶをポリスチレ
ンキュベツト中に入れ、バラフィルムでカバーした後、
４℃で２０時間インキュベーションし、ルミフォトメー
ター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）を用いて、
エクオリン活性を測定する。
これにより、ヒトＴＮＦ−α溶液中のヒトＴＮＦ−α量
を求める。この結果を示したものが、第５図である。エ
フオリ標識抗体はエクオリン活性・抗体活性共に有して
おり、かつ、エクオリン標識抗体が酵素免疫測定法に応
用され得ることが確認された。
を求める。この結果を示したものが、第５図である。エ
フオリ標識抗体はエクオリン活性・抗体活性共に有して
おり、かつ、エクオリン標識抗体が酵素免疫測定法に応
用され得ることが確認された。
［発明の効果コ
本発明の方法によれば、特異的結合能を有する物質とエ
クオリン活性を有する蛋白買を結合させることができる
０本発明の特異的結合能を有する物質と結合したエクオ
リン活性を有する蛋白賀並びにその調製法の有用性は、
当業者に自明である。該結合物質の持つ特異的結合能と
発光能を利用することにより、超微量の種々の物質の検
出法に応用することができる。
クオリン活性を有する蛋白買を結合させることができる
０本発明の特異的結合能を有する物質と結合したエクオ
リン活性を有する蛋白賀並びにその調製法の有用性は、
当業者に自明である。該結合物質の持つ特異的結合能と
発光能を利用することにより、超微量の種々の物質の検
出法に応用することができる。
［実施例］
実施例１
［標識用マレイミド−エクオリンの調製］エクオリン０
．７９ｗｇを含むリン酸ソーダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐｌ
＋８．０） １．０００μＡに、Ｎ、Ｎ−ｏ−フェニレ
ンジマレイミド０．１９ｍｇ７５μｆ、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドを加えた後、３０℃で、３０分間インキ
ュベートした。
．７９ｗｇを含むリン酸ソーダ緩衝液（０，１Ｍ、ｐｌ
＋８．０） １．０００μＡに、Ｎ、Ｎ−ｏ−フェニレ
ンジマレイミド０．１９ｍｇ７５μｆ、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドを加えた後、３０℃で、３０分間インキ
ュベートした。
このときに用いたアポエクオリンは、以下の方法により
調製した０組換えＤＮＡの手法により製造したアポエク
オリン（特開昭８３−１０２，５９５）を、陰イオン交
換クロマトグラフィー法により４Ａ現しく特願昭６２−
２９１，５４０）さらに逆相）ＩＰＬＣにより精製した
。
調製した０組換えＤＮＡの手法により製造したアポエク
オリン（特開昭８３−１０２，５９５）を、陰イオン交
換クロマトグラフィー法により４Ａ現しく特願昭６２−
２９１，５４０）さらに逆相）ＩＰＬＣにより精製した
。
逆相ＨＰＬＣは、コスモシル１ＯＣ４−３００（１０ｘ
１５０ｍｍ）のカラムに、溶媒系として水／アセトニト
リル（共に０１％トリフルオロ酢酸を含む）系を用い、
グラジェントは２０〜８０％で行い、アポエクオリンビ
ークを分取した。このアポエクオリン画分を凍結乾燥し
てアポエクオリンを調製し、−２０℃で保存したものを
使用した。
１５０ｍｍ）のカラムに、溶媒系として水／アセトニト
リル（共に０１％トリフルオロ酢酸を含む）系を用い、
グラジェントは２０〜８０％で行い、アポエクオリンビ
ークを分取した。このアポエクオリン画分を凍結乾燥し
てアポエクオリンを調製し、−２０℃で保存したものを
使用した。
その後、セファデックスＧ−５０（１，Ｏｘ４０ｃｍ）
のカラムで溶媒としてリン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ、
ｐ［、Ｏ）を用いて、ゲル濾過を行い、標識用マレイミ
ド−エクオリンビークを分取した０次いで、ミクロコン
セントレータ−セントリコン１０を用いて、標識用マレ
イミド−エクオリンを画分を濃縮した０以上の操作によ
り、ｌ１）１）ｍ用マレイミド−エクオリンが得られた
。
のカラムで溶媒としてリン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ、
ｐ［、Ｏ）を用いて、ゲル濾過を行い、標識用マレイミ
ド−エクオリンビークを分取した０次いで、ミクロコン
セントレータ−セントリコン１０を用いて、標識用マレ
イミド−エクオリンを画分を濃縮した０以上の操作によ
り、ｌ１）１）ｍ用マレイミド−エクオリンが得られた
。
実施例２
［還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧの調製］抗ヒ
トＴＮＦ−α・ウサギｉｇＧ ０．９９ｍｇを含むリン
酸ソーダｉＪＩ衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，ｏ） ９００
μｋに、０．１Ｍ ２−＋ｏｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌ
ａａｊｎｅを含む５Ｉｌ１Ｍ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
緩衝ｉ （０，１Ｍ、ｐＨ８，０） １００μｍを加え
、３７℃で９０分間インキュベーションした。
トＴＮＦ−α・ウサギｉｇＧ ０．９９ｍｇを含むリン
酸ソーダｉＪＩ衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，ｏ） ９００
μｋに、０．１Ｍ ２−＋ｏｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌ
ａａｊｎｅを含む５Ｉｌ１Ｍ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ
緩衝ｉ （０，１Ｍ、ｐＨ８，０） １００μｍを加え
、３７℃で９０分間インキュベーションした。
その後、セファデックスＧ−５０（１，Ｏｘ ４０ｃｍ
）のカラムで溶媒として５ｍＭ ＥＤＴＡ／リン酸ソー
ダ緩衝液ｆＯ，１Ｍ、ｐｌ＋６．０＋を用いて、ゲル濾
過を行い、還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピーク
を分取した０以上の操作により、還元型抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギＩｇＧが得られた。
）のカラムで溶媒として５ｍＭ ＥＤＴＡ／リン酸ソー
ダ緩衝液ｆＯ，１Ｍ、ｐｌ＋６．０＋を用いて、ゲル濾
過を行い、還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピーク
を分取した０以上の操作により、還元型抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギＩｇＧが得られた。
実施例３
［エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体の調製
］ 実施例１及び２で得られた標識用マレイミド−エクオリ
ンと還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧを用いて、
エクオリンＩＩｌｌＩｍ抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体
を調製した。
］ 実施例１及び２で得られた標識用マレイミド−エクオリ
ンと還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧを用いて、
エクオリンＩＩｌｌＩｍ抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体
を調製した。
還元型抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギＩｇＧ１〜１０ｍｇを
含む５ｍＭ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ
、ｐＨ６，０） ２．ＯｍＡと標識用マレイミド−エク
オリン１０＋ｎｇを含むリン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ
、ｐ）１６．０） ｌ＋ｅＪＩを混合し、４℃で２２時
間インキユベーシーンした。
含む５ｍＭ ＥＤＴ＾／リン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ
、ｐＨ６，０） ２．ＯｍＡと標識用マレイミド−エク
オリン１０＋ｎｇを含むリン酸ソーダ緩衝液（０，ＩＭ
、ｐ）１６．０） ｌ＋ｅＪＩを混合し、４℃で２２時
間インキユベーシーンした。
その後、セファデックスＧ−５０（１，Ｏｘ ４０ｃｍ
）のカラムで溶媒としてリン酸ソーダＵＳ液ｆＯ，ＩＭ
、ｐＨ６，５）を用いて、ゲル濾過を行い、エクオリン
標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分取した０
以上の操作により、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・
ウサギ抗体が得られた。
）のカラムで溶媒としてリン酸ソーダＵＳ液ｆＯ，ＩＭ
、ｐＨ６，５）を用いて、ゲル濾過を行い、エクオリン
標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体ピークを分取した０
以上の操作により、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・
ウサギ抗体が得られた。
実施例４
［エクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・ウサギ抗体を用い
たヒトＴＮＦ−αの定量］ エクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・ウサギ抗体を用いた
ヒトＴＮＦ−ａの定量には、１８０ ＫＩＮＥ ＴＮＦ
丁ｅｓｔＨ１ｔ（Ｔ Ｃｅ１ｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、
Ｉｎｃ、）を利用した。
たヒトＴＮＦ−αの定量］ エクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・ウサギ抗体を用いた
ヒトＴＮＦ−ａの定量には、１８０ ＫＩＮＥ ＴＮＦ
丁ｅｓｔＨ１ｔ（Ｔ Ｃｅ１ｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、
Ｉｎｃ、）を利用した。
ルミフォトメーター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス
社）のポリスチレンキュベツト（外径１０ｘ ６５■）
に １００μにの抗ヒトＴＮＦ−α抗体溶液を入れ、バ
ラフィルムムでポリスチレンキュベツトの上端をカバー
した後、４℃で７２時間インキュベートした。
社）のポリスチレンキュベツト（外径１０ｘ ６５■）
に １００μにの抗ヒトＴＮＦ−α抗体溶液を入れ、バ
ラフィルムムでポリスチレンキュベツトの上端をカバー
した後、４℃で７２時間インキュベートした。
抗ヒト丁ＮＦ−α抗体溶液を除去した後、 ３００μｍ
のブロック用緩衝液をポリスチレンキュベツト中に入れ
、再度バラフィルムでカバーして３７℃で２時間インキ
ュベーションし、抗ヒトＴＮＦ−α抗体をポリスチレン
キュベツトの内壁に固定化した。
のブロック用緩衝液をポリスチレンキュベツト中に入れ
、再度バラフィルムでカバーして３７℃で２時間インキ
ュベーションし、抗ヒトＴＮＦ−α抗体をポリスチレン
キュベツトの内壁に固定化した。
次ぎに、ブロック用＆Ｉ？１ＩＦｉ、を除去し、 ４０
０μ４２の洗浄用緩衝液でポリスチレンキュベツトの内
壁を３回洗浄した後、全てのポリスチレンキュベツト中
に５０μぶのＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔを入れ、さ
らに各種濃度のヒトＴＮＦ−α溶液を５０μＬずつ加え
た後、バラフィルムでカバーシ３７℃で２時間インキュ
ベーションした。
０μ４２の洗浄用緩衝液でポリスチレンキュベツトの内
壁を３回洗浄した後、全てのポリスチレンキュベツト中
に５０μぶのＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔを入れ、さ
らに各種濃度のヒトＴＮＦ−α溶液を５０μＬずつ加え
た後、バラフィルムでカバーシ３７℃で２時間インキュ
ベーションした。
ヒトＴＮＦ−α溶液を除去し、 ４００μＪ２のＷａｓ
ｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの内壁
を３回洗浄した後、 １００μｍのエクオリン標識抗ヒ
トＴＮＦ−α・ウサギ抗体溶液を全てのポリスチレンキ
ュベツトに入れ、バラフィルムでカバーした後、３７℃
で２時間インキュベーションした。
ｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの内壁
を３回洗浄した後、 １００μｍのエクオリン標識抗ヒ
トＴＮＦ−α・ウサギ抗体溶液を全てのポリスチレンキ
ュベツトに入れ、バラフィルムでカバーした後、３７℃
で２時間インキュベーションした。
この後、余剰のエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサ
ギ抗体を除去するために、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ
−α・ウサギ抗体溶液を除去した後、４００μｌのＷａ
ｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの
内壁を３回洗浄した。
ギ抗体を除去するために、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ
−α・ウサギ抗体溶液を除去した後、４００μｌのＷａ
ｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでポリスチレンキュベツトの
内壁を３回洗浄した。
続いて、２−メルカプトエタノール１μＡ１２μｇ ／
ｉｆセレンテラジン１μ４１．２００ｍＭ Ｔｒｊｓ−
ＨＣｌｆｐＨ７，６）、ｌｏｏ＋＋＋Ｍ ＥＤＴＡ緩衝
液１０μｋ及び蒸留水８８μぶをポリスチレンキュベツ
ト中に入れ、バラフィルムでカバーした後、４℃で２０
時間インキニベーションし、ルミフォトメーター（ＴＤ
−４０００，ラボサイエンス社）を用いて、エクオリン
活性を測定した。
ｉｆセレンテラジン１μ４１．２００ｍＭ Ｔｒｊｓ−
ＨＣｌｆｐＨ７，６）、ｌｏｏ＋＋＋Ｍ ＥＤＴＡ緩衝
液１０μｋ及び蒸留水８８μぶをポリスチレンキュベツ
ト中に入れ、バラフィルムでカバーした後、４℃で２０
時間インキニベーションし、ルミフォトメーター（ＴＤ
−４０００，ラボサイエンス社）を用いて、エクオリン
活性を測定した。
これにより、ヒトＴＮＦ−α溶液中のヒト丁ＮＦ−α量
を求めた。この結果を示したものが第５図である。同図
から明らかなようにエクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・
ウサビ抗体は明らかにエクオリン活性を有しており、ま
た、ヒトＴＮＦ−α量に比例して発光量が増大すること
より、エクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・ウサギ抗体は
抗体活性も有していることが確認された。
を求めた。この結果を示したものが第５図である。同図
から明らかなようにエクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・
ウサビ抗体は明らかにエクオリン活性を有しており、ま
た、ヒトＴＮＦ−α量に比例して発光量が増大すること
より、エクオリン標識抗ヒト丁ＮＦ−α・ウサギ抗体は
抗体活性も有していることが確認された。
以上の結果を総合すると、標識用マレイミド−エクオリ
ン及びエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体は
エクオリン活性を有しており、また、還元型抗ヒトＴＮ
Ｆ−αウサギＩｇＧ及びエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギ抗体は抗体活性を有していることが確認され
た。
ン及びエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体は
エクオリン活性を有しており、また、還元型抗ヒトＴＮ
Ｆ−αウサギＩｇＧ及びエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−
α・ウサギ抗体は抗体活性を有していることが確認され
た。
そして、このエクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ
抗体を使用することによって、微量のヒトＴＮＦ−αを
発光を用いて定量することが可能となった。
抗体を使用することによって、微量のヒトＴＮＦ−αを
発光を用いて定量することが可能となった。
さらに、抗ヒトＴＮＦ−α抗体の代わりに種々の酵素、
抗体、プロティンＡ、プロティンＧ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
ＤＮＡ結合蛋白質もしくはレセプターを使用することで
、あらゆる種類の微量の基質、補酵素、補欠分子族、抗
原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモンもしくはトランス
ミツターを発光により検出、定量することが可能となる
ことは容易に予測される。
抗体、プロティンＡ、プロティンＧ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
ＤＮＡ結合蛋白質もしくはレセプターを使用することで
、あらゆる種類の微量の基質、補酵素、補欠分子族、抗
原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモンもしくはトランス
ミツターを発光により検出、定量することが可能となる
ことは容易に予測される。
また、エクオリン標識抗ヒトＴＮＦ−α・ウサギ抗体が
エクオリン活性を有することより、エクオリンの代わり
に修飾エクオリンや固定化エクオリンを用いることが可
能なことは、当業者にとって自明である。
エクオリン活性を有することより、エクオリンの代わり
に修飾エクオリンや固定化エクオリンを用いることが可
能なことは、当業者にとって自明である。
以上、本発明により特異的結合能を有する物質とエクオ
リン活性を有する蛋白質の結合物とその調製法及び該結
合物を用いた揮的物の検出法が提供された。
リン活性を有する蛋白質の結合物とその調製法及び該結
合物を用いた揮的物の検出法が提供された。
第１〜３図は、本発明品を調製する方法を説明するため
の工程図（フローシート）であり、第４・５区は本発明
に係る結合と揮的物の結合を示すための工程図ならびに
結合物のエフ第１ノン活性と抗体活性の関係を示す図で
ある。 以上
の工程図（フローシート）であり、第４・５区は本発明
に係る結合と揮的物の結合を示すための工程図ならびに
結合物のエフ第１ノン活性と抗体活性の関係を示す図で
ある。 以上
Claims (10)
- （１）エクオリン活性を有する蛋白質に特異的結合能を
有する物質を結合手段を用いて共有結合させることを特
徴とするエクオリン活性を有する蛋白質の調製法。 - （２）特許請求の範囲第（１）項に記載の調製法により
調製されてなる特異的結合能を有する物質と結合したエ
クオリン活性を有する蛋白質。 - （３）特許請求の範囲第（２）項に記載の蛋白質と該蛋
白質の基質となり得る発光体とを結合させて得られる該
蛋白質と該発光体との複合体。 - （４）結合方法として、架橋剤を用いることを特徴とす
る特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。 - （５）特許請求の範囲第（４）項に記載の調製法により
調製されてなる特異的結合能を有する物質と結合したエ
クオリン活性を有する蛋白質。 - （６）特許請求の範囲第（５）項に記載の蛋白質と該蛋
白質の基質となり得る発光体とを結合させて得られる該
蛋白質と該発光体との複合体。 - （７）特異的結合能を有する物質とエクオリン活性を有
する蛋白質を結合手段を用いて結合させ、かくして得ら
れた結合物を標的物質に結合させることを特徴とする標
的物質の検出法。 - （８）結合物がエクオリン活性及び抗体結合能を有する
物質である特許請求の範囲第（７）項に記載の検出法。 - （９）特異的結合能を有する物質が、酵素、抗体、プロ
テインＡ、プロテインＧ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ結合
蛋白質もしくはレセプターである特許請求の範囲第（１
）項もしくは第（７）項に記載の調製法もしくは検出法
。 - （１０）標的物質が、基質、補酵素、補欠分子族、抗原
、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモンもしくはトランスミ
ッターである特許請求の範囲第（７）項に記載の検出法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27303490A JPH04149199A (ja) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | 発光蛋白エクオリン標識抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27303490A JPH04149199A (ja) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | 発光蛋白エクオリン標識抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04149199A true JPH04149199A (ja) | 1992-05-22 |
Family
ID=17522250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27303490A Pending JPH04149199A (ja) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | 発光蛋白エクオリン標識抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04149199A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6122254A (ja) * | 1983-10-13 | 1986-01-30 | ユニバ−シテイ オブ ジヨ−ジア リサ−チ フアウンデ−シヨン，インコ−ポレ−テツド | バイオルミネツセンス連結結合定量法 |
-
1990
- 1990-10-11 JP JP27303490A patent/JPH04149199A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6122254A (ja) * | 1983-10-13 | 1986-01-30 | ユニバ−シテイ オブ ジヨ−ジア リサ−チ フアウンデ−シヨン，インコ−ポレ−テツド | バイオルミネツセンス連結結合定量法 |
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