WO2011064981A1 - 免疫測定方法 - Google Patents

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WO2011064981A1
WO2011064981A1 PCT/JP2010/006831 JP2010006831W WO2011064981A1 WO 2011064981 A1 WO2011064981 A1 WO 2011064981A1 JP 2010006831 W JP2010006831 W JP 2010006831W WO 2011064981 A1 WO2011064981 A1 WO 2011064981A1
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WO
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antibody
immunoglobulin
solution
protein
complex
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PCT/JP2010/006831
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English (en)
French (fr)
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純子 若井
明仁 亀井
仁 村岡
Original Assignee
パナソニック株式会社
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Filing date
Publication date
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Priority to US13/222,599 priority patent/US8343776B2/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
    • G01N2333/765—Serum albumin, e.g. HSA

Definitions

  • the present invention relates to a method for dissociating immunoglobulin G, which is bound to the surface of a substrate using protein A, from the surface.
  • Protein A is a protein constituting 5% of cell wall components of Staphylococcus aureus and is abbreviated as “SpA”. Protein A has a high affinity for immunoglobulin G. Protein A is sandwiched between the surface of the substrate and the immunoglobulin G, and immobilizes the immunoglobulin G on the surface of the substrate.
  • the third to fourth lines on the lower right side of page 3 of Patent Document 1 disclose that immunoglobulin G binds to protein A, but that immunoglobulin G dissociates from protein A by lowering the pH. ing.
  • the target substance contained in the biological sample can be detected or quantified using the dissociation due to the decrease in pH.
  • a decrease in pH can lead to undesirable denaturation of the biological sample.
  • the number of steps can be increased to lower the pH.
  • the present inventors have provided human serum on the surface to which an immunoglobulin IgG antibody consisting of an anti-human albumin monoclonal antibody (2F13F11G11) produced from the production cell line of accession number FERM BP-10458 is bound via protein A. It has been found that when a biological sample containing albumin is supplied, the immunoglobulin IgG antibody dissociates from protein A even if the biological sample has a pH of 6 or higher, preferably 7.4 or higher.
  • the present invention provides a method for dissociating an immunoglobulin G (IgG) antibody bound to the surface of a substrate via protein A from the surface.
  • This method comprises the following steps: (A) preparing a substrate having a surface to which an immunoglobulin G antibody is bound via protein A; and (B) a solution containing human serum albumin on the surface.
  • the immunoglobulin G antibody is an anti-human albumin monoclonal antibody (2F13F11G11) produced from the production cell line of accession number FERM BP- 10459, and the solution has a pH of 6 or more and 8.9 or less.
  • protein A is a protein also referred to as “SpA”. This protein was found in cell wall components of Staphylococcus aureus. One skilled in the art can obtain natural or synthetic protein A from commercial sources.
  • a complex of the immunoglobulin G antibody and the human serum albumin can be formed by an antigen-antibody reaction.
  • a “complex” refers to a group of molecules in which two or more molecules are linked through interaction and behave like a single molecule as a whole.
  • a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule can interact and bind to form a group of molecules that behave like a single molecule.
  • the immunoglobulin G antibodies described above interact and bind to human serum albumin molecules to form a group of molecules that behave like a single molecule.
  • interaction refers to two substances (molecules) and a force (eg, intermolecular force (van der Waals) between one substance and the other. Force), hydrogen bond, hydrophobic interaction, etc.).
  • a force eg, intermolecular force (van der Waals) between one substance and the other. Force
  • hydrogen bond e.g., hydrogen bond
  • hydrophobic interaction e.g., hydrogen bond
  • hydrophobic interaction e.g, hydrogen bond, hydrophobic interaction, etc.
  • binding means a physical or chemical interaction between two proteins or compounds or related proteins or compounds, or a combination thereof. To do. This bond includes an ionic bond, a nonionic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, a hydrophobic interaction, and the like.
  • a physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates.
  • the immunoglobulin G antibody when the complex is formed, can be dissociated from the surface described above.
  • the complex existing at the time of the dissociation does not necessarily exist stably. Even if the bond is broken, a necessary measurement system can be constructed in the subsequent steps.
  • the solution may contain the immunoglobulin G antibody dissociated from the surface.
  • the solution may contain the complex.
  • the pH is 7.4 or more and 8.9 or less.
  • the solution can be a buffer. More preferably, the pH is 7.4 or more and 8.9 or less.
  • the present invention relates to a substance to be measured contained in a solution using the above-described method for dissociating an immunoglobulin G (IgG) antibody bound to the surface of a substrate via protein A from the surface.
  • IgG immunoglobulin G
  • the immunoglobulin G antibody bound to the surface of the substrate via protein A is modified with an appropriate label.
  • the immunoglobulin G antibody interacts with a substance to be measured (human serum albumin) present in the solution and dissociates from protein A.
  • the dissociated immunoglobulin G antibody is mixed with the solution, and the presence or absence of the labeled substance bound to the immunoglobulin G antibody or the amount of the labeled substance is detected in the solution to be measured. Realize detection and quantification of the presence or absence of substances.
  • the present invention provides an apparatus for performing an immunoassay method using a method for dissociating an immunoglobulin G antibody bound to the surface of the substrate via protein A from the surface. .
  • An apparatus for carrying out an immunoassay method includes, for example, an antibody that specifically binds to a substance to be measured modified with at least a label (production of accession number FERM BP- 10459 An immunoglobulin G antibody produced by a cell line), a binding agent (protein A) that specifically binds to the antibody, and a carrier (for example, a substrate).
  • the immunoassay method performed on the device includes the following steps: (1) providing a substance to be measured for the antibody immobilized on the carrier via the binding agent; (2) forming a complex of the antibody and the substance to be measured by an antigen-antibody reaction; (3) a step of dissociating from the carrier by releasing the binding of the antibody to the binding agent when the antibody and the substance to be measured form a complex; (4) A step of measuring the amount of the labeled body of the dissociated antibody.
  • the step of measuring the amount of the labeled body of the dissociated antibody described above can be realized by any technique as long as it uses a chemical property or physical property of the labeled body to quantify the labeled body. May be.
  • the present invention has achieved the construction of an immunoassay system that uses only one type of antibody that specifically binds to an antigen and is characterized by a simple process.
  • an immunoassay method and apparatus capable of measuring a substance to be measured comprising not only a high molecular antigen but also a low molecular antigen.
  • the pH of many biological samples is neutral. Therefore, the biological sample can be used as a solution without the step of lowering the pH. Therefore, in the present invention, adverse effects on the biological sample due to a decrease in pH can be avoided.
  • FIG. 1 is a basic configuration diagram of an immunoassay method in the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a measurement flow of the immunoassay method in the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an application example of the immunoassay method of the present invention to immunochromatography.
  • 4 is a sensor graph measured in Example 1.
  • FIG. 5 is a sensor graph measured in Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the salt concentration and the dissociation rate in Example 2.
  • FIG. 7 is a sensor graph showing the relationship between buffer type and pH and dissociation rate in Example 2.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between buffer type and pH and dissociation rate in Example 2.
  • FIG. 9 is a sensor graph measured in Comparative Example 2.
  • FIG. 10 is a sensor graph measured in Comparative Example 2.
  • FIG. 11 is a sensor graph measured in Comparative Example 2.
  • FIG. 1 shows a basic configuration diagram of the immunoassay method in the first embodiment.
  • the antibody 102 is an antibody that specifically binds to the substance to be measured.
  • the label 103 is a label that binds to the antibody 102.
  • the antibody 102 is immobilized on the carrier 11 via a binding agent 104.
  • the antibody 102 binds to the binding agent 104 to form an antibody-binding agent complex 105.
  • the antibody-binding agent complex 105 includes an antibody 102 and a binding agent 104 bound to a binding agent binding site 111 of the antibody 102.
  • the carrier 11 is not particularly limited as long as the binder 104 can be immobilized.
  • Specific examples of the carrier 11 include glass and a resin substrate having a metal film on the surface.
  • the antibody 102 has a property of dissociating from the binding agent 104 bound through the binding agent binding site 111 when the substance to be measured binds to the antibody 102.
  • Specific antibodies 102 include IgG antibodies.
  • a more specific antibody 102 is an anti-human albumin monoclonal antibody (2F13F11G11) produced from the production cell line of accession number FERM BP-10458.
  • the substance to be measured (for example, indicated by 101 in FIG. 2 described later) is human serum albumin (hSA).
  • Antibody 102 ie the anti-human albumin monoclonal antibody described above, can interact and bind to hSA when supplied with hSA.
  • the binding agent 104 has a property of dissociating the antibody 102 when a substance to be measured is bound to the antibody 102 bound to the binding agent 104.
  • Specific examples of the binding agent include protein A.
  • the labeled body 103 is a substance that can be used for optically or electrochemically measuring the abundance of the antibody 102.
  • Specific examples of the labeled substance 103 include enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, fluorescent dyes, luminescent dyes such as ruthenium complexes, luminol, and electrochemically active substances such as ferrocene.
  • enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, fluorescent dyes, luminescent dyes such as ruthenium complexes, luminol, and electrochemically active substances such as ferrocene.
  • FIG. 2 shows a measurement flow of the immunoassay method in the first embodiment.
  • the method includes the following steps (1) to (4).
  • step (1) a solution containing the substance 101 to be measured is supplied to the carrier 11 having the antibody-binder complex 105.
  • the pH of the solution is 6 or more and 8.9 or less.
  • the pH is preferably 7.4 or more and 8.9 or less.
  • step (2) the substance to be measured 101 and the antibody 102 form a complex by an antigen-antibody reaction.
  • step (3) when the substance to be measured 101 and the antibody 102 form a complex, the antibody 102 is dissociated from the binder 104.
  • the substance 101 to be measured is human serum albumin (hSA).
  • hSA human serum albumin
  • antibody 102 immunoglobulin antibody IgG does not dissociate from binding agent 104 when bovine serum albumin (BSA) is used instead of hSA.
  • step (4) the amount of the dissociated antibody 102 is calculated by measuring the amount of the labeled body 103 of the dissociated antibody 102. Thereby, the substance 101 to be measured contained in the solution is quantified. Instead, in step (4), by detecting the labeled body 103 of the dissociated antibody 102, it can be detected whether or not the substance to be measured 101 is contained in the solution.
  • FIG. 3 shows an example in which the immunoassay method of Embodiment 1 is applied to the immunochromatography measurement kit.
  • This immunochromatographic measurement kit is used when a substance (mobile phase) containing a specimen passes through the surface or inside of a specific substance (referred to as a stationary phase or carrier) and the labeled antibody. It is possible to confirm the existence of the substance to be measured by utilizing the process of interaction with.
  • the immunochromatographic specimen provides a stationary phase as well as an attached structure.
  • the immunochromatographic test piece is made of a material having a property (for example, structure or physical property) that causes capillary action.
  • the immunochromatographic test strip is a nitrocellulose membrane that is a porous carrier.
  • the protein can be easily immobilized to this nitrocellulose membrane.
  • the strength of the nitrocellulose membrane is low. Therefore, the nitrocellulose membrane is used in a form attached to a polytetrafluoroethylene substrate (hereinafter referred to as PTFE substrate).
  • PTFE substrate polytetrafluoroethylene substrate
  • substrate is marketed.
  • a porous carrier made of a nitrocellulose membrane 113 (for example, 1 cm wide ⁇ 6 cm long, 200 ⁇ m thick) is made of PTFE substrate 112 (for example, 1 cm wide ⁇ 10 cm long, thick using spray paste). 3 mm).
  • the nitrocellulose membrane 113 has a sample liquid introduction part 114 made of glass fiber filter paper at one end in the length direction.
  • the nitrocellulose membrane 113 has a water absorbing portion 115 made of a glass fiber water absorbing pad at the other end in the length direction.
  • the immunochromatographic test piece 111 may not have a water absorption part.
  • the immunochromatographic test piece has such a length that it is not completely infiltrated by the sample solution introduced as the mobile phase.
  • the immunochromatographic test piece 111 has a label immobilization part and a judgment part in order in the path along which the mobile phase moves along the length direction of the nitrocellulose membrane 113.
  • the antibody 102 labeled with the label 103 is immobilized on the nitrocellulose membrane 113 via the binder 104 to form the above-described label immobilization part.
  • the antibody 102 is an IgG antibody that can specifically bind to the substance 101 to be measured.
  • this antibody 102 is an IgG antibody (that is, an anti-human albumin monoclonal antibody (2F13F11G11)) produced from the production cell line of accession number FERM BP- 10459 when the substance to be measured 101 is human serum albumin. is there.
  • the label 103 can be an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, for example. Various methods for binding such an enzyme to antibody 102 have been established.
  • the glutaraldehyde method, the periodic acid method, and the maleimide method are known as labeling methods for horseradish peroxidase.
  • Peroxidase Labeling Kit-SH both Dojin Chemical Co., Ltd.
  • labeling kit typified that can be labeled in SH group Peroxidase Labeling Kit -NH 2
  • antibodies can be labeled NH 2 group of antibodies can be utilized.
  • the commercially available kit can easily label an enzyme with an antibody.
  • the binder 104 is protein A.
  • the second antibody 116 is immobilized on the nitrocellulose membrane 113 to form the determination unit described above.
  • the second antibody 116 an anti-human IgG antibody obtained by immunizing an animal with the whole IgG antibody (2F13F11G11) molecule or Fc portion can be used.
  • the second antibody 116 is an antibody obtained by immunization with the Fc portion of the human IgG antibody. The antibody thus obtained does not interfere with the binding between the antibody 102 and the substance to be measured.
  • the binder 104 and the second antibody 116 are immobilized on the nitrocellulose membrane 113 as follows.
  • the substrate 112 is dried at 40 ° C. for about 2 hours.
  • the nitrocellulose membrane 113 is subjected to a blocking treatment with a substance that does not participate in the antigen-antibody reaction.
  • the blocking treatment prevents the antibody 102 from binding nonspecifically on the nitrocellulose membrane 113 without using the binding agent 104.
  • the components contained in the specimen are prevented from binding onto the nitrocellulose membrane 113 during measurement.
  • the blocking process is performed as follows, for example.
  • the nitrocellulose membrane 113 is immersed in a PBS buffer solution containing 1% by weight of casein for about 15 minutes, and casein is bound onto the nitrocellulose membrane 113.
  • the blocking-treated nitrocellulose membrane 113 is washed by shaking in a container holding a PBS buffer for about 15 minutes to remove excess casein.
  • the washed nitrocellulose membrane 113 is dried again at 40 ° C. for about 2 hours.
  • 100 ⁇ l of PBS buffer solution in which 1 mg / ml antibody 102 having the label 103 is dissolved is applied to the label immobilization part using a dispenser.
  • the antibody 102 having the label 103 is allowed to stand at room temperature for about 1 hour, and is bound to the binding agent 104.
  • the container holding the PBS buffer is washed by shaking for about 15 minutes.
  • the antibody 102 that has excessively deposited without binding to the binding agent 104 is removed.
  • the nitrocellulose membrane 113 is dried at 40 ° C. for about 2 hours. Thereby, the label immobilization part and the determination part can be formed on the nitrocellulose membrane 113.
  • test reaction solution is a reaction solution used for identifying the abundance of the label 103.
  • This test reaction solution can be prepared as follows.
  • test reaction liquid is composed of the following liquid A and liquid B.
  • Solution A provides the substrate necessary for the enzyme reaction, while solution B provides the H 2 O 2 required for the enzyme reaction.
  • an HBS buffer solution (0.05 M Hepes-Na, 0.15 M NaCl, pH 7.5) having a concentration of 0.5 mg / ml in which 3,3′-diaminobenzidine is dissolved (solution A) ).
  • the liquid A is stored in the dark.
  • an HBS buffer solution containing 0.15% H 2 O 2 is prepared (B solution).
  • a liquid and B liquid are mixed in the case of use, and the reaction liquid for a test is obtained.
  • the sample solution is dropped into the sample solution introducing portion made of the glass fiber filter paper 114.
  • the sample solution moves through the nitrocellulose membrane 113 by capillarity and reaches the label immobilization part composed of the complex of the binder 104 and the antibody 102.
  • the substance to be measured binds to the antibody 102 modified with the label 103.
  • a complex of the substance to be measured and the antibody 102 is formed, and the formed complex is dissociated from the binder 104 immobilized on the nitrocellulose membrane 113.
  • the flow of the sample solution moving through the nitrocellulose membrane 113 by capillary action moves the complex to the determination unit.
  • the complex binds to the second antibody 116.
  • the antibody 102 is not the second one. Of the antibody 116.
  • the antibody 102 is modified with the label 103, it can be a determination target in the determination unit, as in the above-described complex.
  • Molecules that have not been combined in the determination unit and the extra sample solution further move on the nitrocellulose membrane 113 due to capillary action and are absorbed by the water absorption unit 115.
  • a solution containing the substrate and a solution containing H 2 O 2 (A liquid configured as described above) And a liquid mixture of B liquid).
  • the dropping position is between the determination unit and the label immobilization unit, and the dropping is performed from the upstream side close to the determination unit. After a predetermined time has elapsed since the liquid mixture of the liquid A and the liquid B was dropped, the coloring of the determination unit is determined visually or by an instrument.
  • Embodiment 1 It is easy to apply the immunoassay method of Embodiment 1 to chemiluminescence and electrochemiluminescence, as is the case with immunochromatography.
  • Example 1 Hereinafter, specific examples of the immunoassay method of the present invention will be shown.
  • SPR apparatus surface plasmon resonance apparatus
  • a Biacore 3000 system (hereinafter referred to as Biacore) manufactured by Biacore was used as a measuring apparatus.
  • This measuring apparatus is an analyzing apparatus capable of detecting an interaction between biomolecules without using a label based on the surface plasmon resonance phenomenon.
  • a sample solution containing molecules that act on the immobilized molecules is used for the measurement. Liquid is fed to the chip surface.
  • the measuring device detects a small amount of mass change caused by the binding / dissociation between molecules occurring on the surface of the measuring chip as a surface plasmon resonance signal, monitors the signal over time, Record the result as a sensorgram.
  • Biacore CM5 (hereinafter referred to as a sensor chip) was used as a measurement chip.
  • This sensor chip has carboxymethyl dextran on the gold film surface on the glass plate.
  • an appropriate reagent eg, N-hydroxysuccinimide (NHS)
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Human albumin (hereinafter referred to as hSA) was used as a substance to be measured.
  • the human albumin used was human albumin manufactured by SIGMA.
  • the antibody used in this measurement example was an anti-human albumin monoclonal antibody (hereinafter referred to as 2F13F11G11) produced from the production cell line of accession number FERM BP- 10459.
  • Protein A (Lot # D33524) manufactured by CALBIOCHEM was used.
  • the binder (protein A) was immobilized on the sensor chip by the amino coupling described above.
  • This immobilization was performed according to the immobilization method provided by Biacore.
  • protein A diluted with an acetate buffer having a predetermined pH was used. It is necessary to determine the pH of the acetic acid solution so that a sufficient amount of protein A is immobilized. Therefore, solutions were prepared in which 20 ng / ml protein A was dissolved in 10 mM acetate buffer solutions of pH 4, pH 5 and pH 6, respectively. The prepared solutions having different pHs were sequentially flowed into one of the four flow cells provided in Biacore at a flow rate of 10 ⁇ l / min. Based on the sensorgram obtained for each prepared solution, the pH at which a sufficient amount of protein A was immobilized was determined.
  • a buffer solution in which 2F13F11G11 was dissolved was flowed at a flow rate of 10 ⁇ l to all four flow cells at a flow rate of 20 ⁇ l / min to bind to protein A immobilized on the sensor chip.
  • the concentration of 2F13F11G11 dissolved in the buffer solution was 200 nM.
  • the binding amount to protein A was approximately 5 ng / mm 2 .
  • 2F13F11G11 was allowed to flow into the flow cell, and then only the buffer solution was allowed to flow into the flow cell.
  • a PBS buffer solution pH 7.4 containing 0.05% Tween 20 was used as the buffer solution.
  • FIG. 4 shows a sensorgram obtained as a result of the measurement.
  • FIG. 4 also shows the results of Comparative Example 1 below.
  • the immunoassay method of the present invention can be realized by using an antibody that specifically reacts with a substance to be measured and dissociates from protein A by the reaction used in the above experiment.
  • FIG. 9 shows a sensorgram obtained as a result of the measurement using the 11-4B antibody.
  • FIG. 10 shows a sensorgram obtained as a result of the measurement using the 42-DA3 antibody.
  • FIG. 11 shows a sensorgram obtained as a result of the measurement using the 13-3B antibody.
  • 2F13F11G11 and hSA allows the dissociation of immunoglobulin G antibody from said protein A at pH 8.9 or less, preferably at pH 7.4 or more and 8.9 or less.
  • Example 2 Next, an example of measurement using an SPR device will be described under conditions suitable for the immunoassay method of the present invention.
  • Example 2 since a measurement system similar to Example 1 was used, differences in the used measurement system will be mainly described.
  • Biacore 3000 system (hereinafter referred to as Biacore) manufactured by Biacore was used.
  • the same substances as in Example 1 were used as the substance to be measured, the antibody, and the binder.
  • CM5 manufactured by Biacore (hereinafter referred to as a sensor chip) was used as a measurement chip.
  • Protein A which is a binder, was immobilized on the above-described sensor chip by amino coupling. The amount of protein A immobilized was about 6 ng / mm 2 .
  • a sensorgram was obtained under the condition that protein A was not immobilized on the flow cell.
  • PBS buffer solution pH 7.4 containing 0.005% Tween 20 having various NaCl concentrations was prepared.
  • the concentration of NaCl was 0 g / l, 4 g / l, 8 g / l, 12 g / l or 24 g / l.
  • 2F13F11G11 was dissolved in each of the obtained PBS buffers. This series of 2F13F11G11 solutions was allowed to flow through all four flow cells at a flow rate of 20 ⁇ l / min at a flow rate of 40 ⁇ l to bind to protein A immobilized on the sensor chip. At this time, the concentration of bound 2F13F11G11 was 1 ⁇ M.
  • 2F13F11G11 was allowed to flow into the flow cell, and then only the buffer solution was allowed to flow into the flow cell.
  • a buffer solution in which hSA as a substance to be measured was dissolved was flowed into the flow cell to cause a binding reaction with 2F13F11G11.
  • the flow rate at this time was 20 ⁇ l / min.
  • the flow rate was 40 ⁇ l.
  • the concentration was 1 ⁇ M.
  • FIG. 5 shows a sensorgram obtained by measurement. This sensorgram shows a result of subtracting a blank value in which protein A is not immobilized from each measured value.
  • a large change was observed in the change in the binding amount between protein A and 2F13F11G11 depending on the NaCl concentration.
  • the NaCl concentration was 0 g / l
  • an increase in response was observed even when a buffer solution was flowed, which is considered to be a condition in which a nonspecific reaction is likely to occur. This condition was considered unsuitable for the measurement of the substance to be measured.
  • the buffer containing 4 g / l or more of NaCl the following observation results were obtained.
  • Buffers with lower salt concentrations tended to have a greater amount of 2F13F11G11 binding. Furthermore, the buffer solution having a lower salt concentration had a larger amount of the complex of hSA and 2F13F11G11 dissociated from protein A when hSA was introduced.
  • FIG. 6 shows the relationship between the NaCl concentration and the amount of dissociation.
  • the dissociation rate in the graph shown in FIG. 6 is the ratio of the Biacore response decreased by adding hSA, expressed as%, with the Biacore response immediately before adding hSA after flowing 2F13F11G11 into the flow cell being 100%. is there.
  • the dissociation rate increased when a buffer containing 4 g / l or 8 g / l NaCl was used.
  • PBS buffer pH 7.4 containing 0.005% Tween 20 having a NaCl concentration of 8 g / l
  • PBS buffer pH 8.9 containing 0.005% Tween 20 having a NaCl concentration of 8 g / l
  • 8 g A Gly buffer solution (pH 8.9) containing 0.005% Tween 20 having a NaCl concentration of / l was prepared. 2F13F11G11 was dissolved in each of the prepared buffers.
  • the obtained 2F13F11G11 solution was allowed to flow through all four flow cells under the conditions of a flow rate of 20 ⁇ l / min and a flow rate of 40 ⁇ l to bind to protein A immobilized on the sensor chip.
  • the concentration of 2F13F11G11 dissolved in the buffer was 1 ⁇ M.
  • 2F13F11G11 was allowed to flow into the flow cell, and then only the buffer solution was allowed to flow into the flow cell.
  • a buffer solution in which hSA as a substance to be measured was dissolved was flowed into the flow cell to cause a binding reaction with 2F13F11G11.
  • the flow rate at this time was 20 ⁇ l / min.
  • the flow rate was 40 ⁇ l.
  • the concentration was 1 ⁇ M.
  • FIG. 7 shows sensorgrams obtained for each buffer solution.
  • FIG. 8 shows the dissociation rate with hSA addition calculated based on the results shown in FIG. Referring to FIG. 7, it can be seen that although there is a difference in the binding amount of 2F13F11G11 depending on the pH and the buffer type, the difference in the dissociation rate due to the difference in the pH of the buffer and the buffer type is small with reference to FIG. The That is, the above measurement system can be used even when at least either a PBS buffer solution or a Gly buffer solution is used. In addition, the above results showed that the measurement system can be used in the pH range between pH 7.4 and pH 8.9.
  • an immunoassay system can be constituted by one type of antibody that specifically binds to an antigen.
  • an immunoassay system can be constituted by one type of antibody that specifically binds to an antigen.

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Abstract

２種類以上の抗体を必要とせず免疫測定系の構築にかかる労力を低減し、さらに高分子抗原のみならずハプテン等の低分子抗原への応用を可能にする、免疫測定方法を提供する。基板の表面にプロテインＡを介して結合している免疫グロブリンＧ抗体を、上記表面から解離させる方法であって、上記方法は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）、すなわち、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株により産生された免疫グロブリンＧ抗体がプロテインＡを介して結合している表面を有する基板を提供する工程（Ａ）、およびヒト血清アルブミンを含有し、６以上８．９以下のｐＨ、好ましくは７．４以上８．９以下のｐＨを有する溶液を上記表面に提供し、上記免疫グロブリンＧ抗体を上記プロテインＡから解離させる工程（Ｂ）を含む、方法。

Description

免疫測定方法
　本発明は、プロテインＡを用いて基板の表面に結合している免疫グロブリンＧを、前記表面から解離させる方法に関する。
　プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分の５％を構成するタンパク質であり、「ＳｐＡ」と略記される。プロテインＡは、免疫グロブリンＧに対して高い親和性を有する。プロテインＡは基板の表面および当該免疫グロブリンＧの間に挟まれ、当該基板の表面上に免疫グロブリンＧを固定する。特許文献１の第３頁右下第３行目～第４行目は、免疫グロブリンＧはプロテインＡに結合するが、ｐＨを低下させることによって免疫グロブリンＧはプロテインＡから解離することを開示している。このｐＨの低下による解離を利用して、生体試料に含有される標的物質が検出または定量され得る。
特開平０２－０７３１５８号公報
　ｐＨの低下は、生体試料の好ましくない変性をもたらし得る。ｐＨを低下させるために、工程数が増加し得る。
　本発明者らは、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）からなる免疫グロブリンＩｇＧ抗体がプロテインＡを介して結合している表面に、ヒト血清アルブミンを含有する生体試料が供給されると、当該生体試料のｐＨが６以上、好ましくは７．４以上であっても、当該免疫グロブリンＩｇＧ抗体がプロテインＡから解離するという知見を見出した。
　本発明は、基板の表面にプロテインＡを介して結合している免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を上記表面から解離させる方法を、提供する。この方法は、以下の工程、すなわち、（Ａ）免疫グロブリンＧ抗体がプロテインＡを介して結合している表面を有する基板を用意する工程、および（Ｂ）ヒト血清アルブミンを含有する溶液を上記表面に提供し、上記免疫グロブリンＧ抗体を上記プロテインＡから解離させる工程を具備する。ここで、免疫グロブリンＧ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）であり、前記溶液は６以上８．９以下のｐＨを有する。
　本明細書で使用される場合、用語「プロテインＡ」は、「ＳｐＡ」とも称されるタンパク質である。このタンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分で発見された。当業者は、市販供給元より、天然または合成のプロテインＡを入手することができる。
　一実施形態において、上記工程（Ｂ）では、抗原抗体反応によって、上記免疫グロブリンＧ抗体と上記ヒト血清アルブミンとの複合体が形成され得る。
　本明細書で使用される場合、「複合体」とは、２つ以上の分子が相互作用を介して結合し、その全体で１つの分子のように挙動する状態となった一群の分子をいう。例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの複数個の分子が相互作用し結合し、１つの分子のように挙動する状態となった一群の分子を形成し得る。本明細書において上述した例では、上述の免疫グロブリンＧ抗体が、ヒト血清アルブミン分子と相互作用して結合し、１つの分子のように挙動する状態となった一群の分子を形成する。
　本明細書において使用される場合、用語「相互作用」とは、２つの物質（の分子）についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
　本明細書中で使用される場合、用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。この結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
　他の実施形態において、上記複合体が形成された際に、上記免疫グロブリンＧ抗体が上述した表面から解離し得る。
　なお、上述の免疫グロブリンＧ抗体が、上述の表面から解離した後、その解離の際に存在していた複合体が、必ずしも安定に存在している必要はなく、解離とともに、その複合体間の結合が解けた場合であっても、後続の工程において適宜必要な測定系が構築され得る。
　別の実施形態において、上記工程（Ｂ）の後、上記溶液は、上記表面から解離した上記免疫グロブリンＧ抗体を含有し得る。
　さらに別の実施形態において、上記工程（Ｂ）の後、上記溶液は、上記複合体を含有し得る。
　さらに別の実施形態において、上記ｐＨは、７．４以上８．９以下である。
　さらに別の実施形態において、上記溶液は、緩衝液であり得る。より好ましくは、上記ｐＨは、７．４以上８．９以下である。
　別の態様において、本発明は、基板の表面にプロテインＡを介して結合している免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を上記表面から解離させる上述の方法を利用して、溶液に含まれる被測定物質を定量する方法、または、その溶液が被測定物質を含有するかどうかを決定する方法を提供し得る。ここで、基板の表面にプロテインＡを介して結合された免疫グロブリンＧ抗体は、適当な標識体によって修飾されている。そして、免疫グロブリンＧ抗体は、その溶液中に存在する被測定物質（ヒト血清アルブミン）と相互作用し、プロテインＡから解離する。解離した免疫グロブリンＧ抗体が、当該溶液に混合され、その免疫グロブリンＧ抗体に結合している標識体の存在の有無、またはその標識体の量を当該容液中で検出することで、被測定物質の存在の有無の検出、およびその定量を実現する。
　別の態様において、本発明は、上述の基板の表面にプロテインＡを介して結合している免疫グロブリンＧ抗体を上記表面から解離させる方法を利用して、免疫測定方法を実施する装置を提供する。
　本発明の一実施形態に係る免疫測定方法を実行するための装置は、例えば、少なくとも標識体により修飾された被測定物質に対して特異的に結合する抗体（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株により産生された免疫グロブリンＧ抗体）と、上記抗体と特異的に結合する結合剤（プロテインＡ）と、担体（例えば、基板）とを備える。
　当該装置に行われる免疫測定方法は、次のような工程、すなわち、
（１）上記担体上に上記結合剤を介して固定化された上記抗体に対し、被測定物質を提供する工程と、
（２）抗原抗体反応により、上記抗体と上記被測定物質との複合体を形成する工程と、
（３）上記抗体と上記被測定物質とが複合体を形成した際に、上記抗体が上記結合剤との結合を解消することで、上記担体上から解離する工程、
（４）解離した上記抗体の上記標識体の量を計測する工程
を含む。
　上述の解離した前記抗体の前記標識体の量を計測する工程は、標識体の化学的性質または物理的性質を利用することで、標識体を定量する手法であれば、いずれの手法で実現されてもよい。
　本発明は、抗原に対して特異結合する１種類の抗体だけを用い、かつ簡単な工程を特徴とする免疫測定系の構築を達成した。これにより、高分子の抗原だけでなく低分子の抗原からなる被測定物質を測定可能な免疫測定の方法及び装置の提供が可能となる。
　多くの生体試料のｐＨは中性である。従って、ｐＨを低下させる工程なしに、生体試料は溶液として用いられ得る。従って、本発明では、ｐＨの低下による生体試料への悪影響が回避され得る。
図１は、本発明における免疫測定方法の基本構成図である。 図２は、本発明における免疫測定方法の測定フローを示す図である。 図３は、本発明における免疫測定方法のイムノクロマトへの応用例を示す図である。 図４は、実施例１において測定されたセンサーグラフである。 図５は、実施例２において測定されたセンサーグラフである。 図６は、実施例２における塩濃度を解離率の関係を示すグラフである。 図７は、実施例２における緩衝液種類およびｐＨと解離率の関係を示すセンサーグラフである。 図８は、実施例２における緩衝液種類およびｐＨと解離率の関係を示すグラフである。 図９は、比較例２において測定されたセンサーグラフである。 図１０は、比較例２において測定されたセンサーグラフである。 図１１は、比較例２において測定されたセンサーグラフである。
　図面を参照しながら、以下、本発明の例示的な実施の形態を説明する。
　（実施の形態１）
　図１は、実施の形態１における免疫測定方法の基本構成図を示す。抗体１０２は、被測定物質に特異的に結合する抗体である。標識体１０３は、抗体１０２に結合する標識体である。図１（ａ）に示されるように、抗体１０２は、結合剤１０４を介して担体１１上に固定化されている。図１（ｂ）に示されるように、抗体１０２が結合剤１０４に結合し、抗体－結合剤複合体１０５を形成する。この抗体－結合剤複合体１０５は、抗体１０２と、その抗体１０２の結合剤結合部位１１１に結合した結合剤１０４とを有する。
　担体１１は、結合剤１０４を固定化できれば特に限定されない。具体的な担体１１としては、例えば、ガラスおよび表面に金属膜を有する樹脂基板が挙げられる。
　抗体１０２は、被測定物質が抗体１０２に結合することによって結合剤結合部位１１１を介して結合している結合剤１０４から解離する性質を有する。具体的な抗体１０２としては、ＩｇＧ抗体が挙げられる。より具体的な抗体１０２は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）である。このとき、被測定物質（例えば、後述する図２においては、１０１で示される）は、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）である。抗体１０２、すなわち、上述の抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体は、ｈＳＡが供給されると、ｈＳＡと相互作用し、結合し得る。
　結合剤１０４は、その結合剤１０４に結合している抗体１０２に対して被測定物質が結合した際に当該抗体１０２を解離させる性質を有する。具体的な結合剤としては、例えば、プロテインＡが挙げられる。
　標識体１０３は、抗体１０２の存在量を光学的にまたは電気化学的に計測するために用いられ得る物質である。具体的な標識体１０３としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼなどの酵素、蛍光色素、ルテニウム錯体、ルミノールなどの発光色素、フェロセンなどの電気化学活性物質などが挙げられるが、これらに限定されない。
　以下、本発明の免疫測定方法の一例を説明する。
　図２は、実施の形態１における免疫測定の方法の測定フローを示す。当該方法は、以下の工程（１）から（４）までを含む。
　工程（１）において、抗体－結合剤複合体１０５を有する担体１１に、被測定物質１０１を含む溶液が供給される。溶液のｐＨは６以上８．９以下である。当該ｐＨは７．４以上８．９以下であることが好ましい。
　工程（２）において、抗原抗体反応によって被測定物質１０１および抗体１０２が複合体を形成する。
　工程（３）において、被測定物質１０１および抗体１０２が複合体を形成した際に、抗体１０２が結合剤１０４から解離する。上述のように、被測定物質１０１は、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）である。後述の例示的な実施例においても明らかになるが、ｈＳＡの代わりに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた場合には、抗体１０２（免疫グロブリン抗体ＩｇＧ）は、結合剤１０４から解離しない。
　工程（４）において、解離した抗体１０２が有する標識体１０３の量を測定することによって、解離した抗体１０２の量を算出する。これにより、当該溶液に含まれる被測定物質１０１を定量する。これに代えて、工程（４）において、解離した抗体１０２が有する標識体１０３を検出することによって、当該溶液に被測定物質１０１が含まれているかどうかが検出され得る。
　抗原を含む試料を抗体－結合剤複合体に反応させ、抗原が抗体に結合すれば、抗体が結合剤から解離するという原理が、簡便な免疫測定を可能とする。さらに、標識体１０３の検出は、用いる標識体の性質に合わせて選択することができるため、実施の形態１の免疫測定の方法を従来の免疫測定方法へ応用することは容易である。
　（イムノクロマト測定キットの例）
　イムノクロマト試験片および試験用反応液からなるイムノクロマト測定キットに上述の免疫測定法を利用した例を、以下に説明する。図３は、実施の形態１の免疫測定の方法を、当該イムノクロマト測定キットに応用した例を示す。このイムノクロマト測定キットは、特定の物質の表面あるいは内部（固定相または担体と呼ばれる）を、検体を含む物質（移動相）が通過する際に、当該検体中の抗原（被測定物質）と標識抗体とが相互作用する過程を利用して、その被測定物質の存在を確認することを実現する。
　イムノクロマト試験片は、固定相ならびに付属する構造体を提供する。イムノクロマト試験片は、毛細管現象を生じる性質（例えば、構造または物性）を有する材料により作製される。好ましくは、このイムノクロマト試験片は、多孔性担体であるニトロセルロースメンブレンである。タンパク質は、このニトロセルロースメンブンレンに対して容易に固定化され得る。また、ニトロセルロースメンブレンの強度は低い。したがって、ニトロセルロースメンブレンは、ポリテトラフルオロエチレン基板（以下、ＰＴＦＥ基板）に貼り付けられた形態で使用される。また、ＰＴＦＥ基板によって裏打ちされた形態のニトロセルロースメンブレンが、市販されている。
　図３の例において、ニトロセルロースメンブレン１１３（例えば、幅１ｃｍ×長さ６ｃｍ、厚さ２００μｍ）からなる多孔性担体が、スプレー糊を用いてＰＴＦＥ基板１１２（例えば、幅１ｃｍ×長さ１０ｃｍ、厚さ３ｍｍ）に貼り付けられる。ニトロセルロースメンブレン１１３は、その長さ方向の一端に、ガラス繊維濾紙からなる試料液導入部１１４を有している。他方、ニトロセルロースメンブレン１１３は、その長さ方向の他端に、ガラス繊維性の吸水性パッドからなる吸水部１１５を有している。
　イムノクロマト試験片１１１は、吸水部を有さなくてもよい。当該イムノクロマト試験片は、移動相として導入される試料液によって完全に浸潤しない程度の長さを有する。
　本例において、イムノクロマト試験片１１１は、ニトロセルロースメンブレン１１３の長さ方向に沿って移動相が移動する経路において、順に、標識固定化部、および判定部を有している。
　本例において、標識１０３で標識された抗体１０２が、結合剤１０４を介してニトロセルロースメンブレン１１３に固定化され、上述の標識固定化部を形成する。
　抗体１０２は、被測定物質１０１に対して特異的に結合可能なＩｇＧ抗体である。好ましくは、この抗体１０２は、被測定物質１０１がヒト血清アルブミンである場合、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生されるＩｇＧ抗体（すなわち、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１））である。
　標識体１０３は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼのような酵素であり得る。このような酵素を抗体１０２に結合させる種々の方法が、確立されている。
　例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの標識方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法が知られている。
　抗体のＮＨ２基に標識できるＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　－ＮＨ２、および抗体のＳＨ基に標識できるＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ（共に同仁化学製）に代表される市販の標識用キットが、利用され得る。
　当該市販のキットは、抗体へ酵素を標識することを容易にし得る。
　好ましくは、結合剤１０４は、プロテインＡである。
　第２の抗体１１６が、ニトロセルロースメンブレン１１３に固定化されて、上述の判定部を形成する。
　第２の抗体１１６は、動物を、ＩｇＧ抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）分子の全体またはＦｃ部分で免疫することによって得られた抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。好ましくは、第２の抗体１１６は、当該ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分で免疫して得られた抗体である。このようにして得られた抗体は、抗体１０２および被測定物質の結合を妨げない。
　結合剤１０４および第２の抗体１１６は、以下のようにしてニトロセルロースメンブレン１１３上に固定化される。
　ニトロセルロースメンブレン１１３の長さ方向の一端から２ｃｍ離れた場所に、ディスペンサーを用いて、１ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ（結合剤１０４）を溶解した１００μｌのＰＢＳ緩衝液（８ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ　ＫＣｌ，１．１５ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，０．２ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）を塗布する。
　ニトロセルロースメンブレン１１３の長さ方向の他端から２ｃｍ離れた場所に、ディス
ペンサーを用いて、第２の抗体１１６を溶解した１００μｌのＰＢＳ緩衝液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を塗布する。
　その後、４０℃で約２時間、基板１１２は乾燥される。
　好ましくは、結合剤１０４および第２の抗体１１６をニトロセルロースメンブレン１１３上に固定化した後、ニトロセルロースメンブレン１１３は、抗原抗体反応に関与しない物質でブロッキング処理される。ブロッキング処理により、抗体１０２が結合剤１０４を介さずにニトロセルロースメンブレン１１３上に非特異的に結合することが防止される。さらに、検体中に含まれる成分が測定時にニトロセルロースメンブレン１１３上へ結合することが防止される。ブロッキング処理は、例えば、以下のように行われる。ニトロセルロースメンブレン１１３を１重量％のカゼインを含むＰＢＳ緩衝液中に１５分間程度浸漬し、ニトロセルロースメンブレン１１３上へカゼインを結合させる。
　ブロッキング処理されたニトロセルロースメンブレン１１３は、ＰＢＳ緩衝液を保持する容器中で約１５分間、振とうによって洗浄され、余分なカゼインが除去される。洗浄されたニトロセルロースメンブレン１１３は、再度４０℃で約２時間程度乾燥される。その後、ディスペンサーを用いて標識体１０３を有する１ｍｇ／ｍｌの抗体１０２を溶解した１００μｌのＰＢＳ緩衝液を標識固定化部に塗布する。約１時間、室温で静置され、標識体１０３を有する抗体１０２が結合剤１０４に結合される。
　静置後、ＰＢＳ緩衝液を保持する容器を約１５分間振とうすることにより洗浄する。これにより、結合剤１０４との結合を生じず余分に沈着した抗体１０２が除去される。洗浄後、ニトロセルロースメンブレン１１３を４０℃で約２時間乾燥する。これにより、ニトロセルロースメンブレン１１３上に標識固定化部および判定部が形成され得る。
　以上の手順を経て、イムノクロマト試験片１１１が完成される。
　試験用反応液は、標識体１０３の存在量を同定するために使用される反応液である。この試験用反応液は、次のようにして調製され得る。
　西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼのような酵素を標識体１０３として用いる場合、試験用反応液は、次のようなＡ液およびＢ液から構成される。Ａ液は、酵素反応に必要な基質を提供し、他方、Ｂ液は、酵素反応に必要なＨ２Ｏ２を提供する。
　基質として、例えば、３，３’－ジアミノベンジジンを溶解した０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＨＢＳ緩衝液（０．０５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ－Ｎａ，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を調製する（Ａ液）。好ましくは、Ａ液は、遮光保存される。
　酵素反応に必要なＨ２Ｏ２を供給するために、０．１５％　Ｈ２Ｏ２を含むＨＢＳ緩衝液を調製する（Ｂ液）。Ａ液およびＢ液が、使用の際に混合され、試験用反応液が得られる。
　次に、得られたイムノクロマト試験片および試験用反応液からなるイムノクロマト測定キットの使用方法を説明する。
　ガラス繊維濾紙１１４からなる試料液導入部に試料液を滴下する。試料液はニトロセルロースメンブレン１１３を毛細管現象によって移動し、結合剤１０４と抗体１０２との複合体からなる標識固定化部に到達する。
　試料液中に被測定物質が存在する場合には、被測定物質が、標識体１０３で修飾された抗体１０２に結合する。被測定物質と抗体１０２との複合体が形成され、この形成された複合体は、ニトロセルロースメンブレン１１３に固定化された結合剤１０４から解離する。毛細管現象によってニトロセルロースメンブレン１１３を移動する試料液の流れが、当該複合体を、判定部に移動させる。当該複合体は、判定部に到達すると、第２の抗体１１６に結合する。なお、仮に、被測定物質と抗体１０２から形成された上述の複合体が、ニトロセルロースメンブレン１１３を移動する間に、被測定物質と抗体１０２とに分離しても、この抗体１０２は、第２の抗体１１６に結合し得る。このとき、抗体１０２は、標識体１０３により修飾されているから、上述の形成された複合体と同様に、判定部における判定対象となり得る。
　判定部で結合されなかった分子、ならびに余分な試料液は毛細管現象により、ニトロセルロースメンブレン１１３上を更に移動し、吸水部１１５で吸収される。
　試料液が吸水部１１５に到達し、かつ試料液導入部に滴下した試料液が無くなったことが確認された後、基質を溶解した溶液とＨ２Ｏ２を含む溶液（上記で構成したＡ液とＢ液との混合液）を滴下する。この滴下する位置は、判定部と標識固定化部との間であり、滴下は、判定部に近い上流側から行う。Ａ液とＢ液との混合液を滴下して一定時間が経過した後、判定部の着色を目視、あるいは機器によって判定する。
　実施の形態１の免疫測定の方法を化学発光および電気化学発光に応用することは、イムノクロマト法への応用と同様に、容易である。
　（実施例１）
　以下、本発明の免疫測定方法の具体例を示す。本実施例では、表面プラズモン共鳴装置（以下、ＳＰＲ装置）を用いた測定を行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ社製のＢｉａｃｏｒｅ３０００システム（以下、Ｂｉａｃｏｒｅと記す）を測定装置として使用した。この測定装置は、表面プラズモン共鳴現象を測定原理として、生体分子間の相互作用を標識なしで検出することが可能な分析装置である。Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定対象である分子の間の相互作用を測定するためには、測定対象分子の一方を測定用チップに固定化し、固定した分子に作用する分子を含む試料液を当該測定用チップ表面に送液する。このとき、この測定装置は、測定用チップの表面で起こる分子間の結合・解離に帰因する微量の質量変化を表面プラズモン共鳴シグナルとして検出し、当該シグナルを経時的にモニタして、そのモニタした結果をセンサーグラムとして記録する。
　本実施例では、Ｂｉａｃｏｒｅ社製のＣＭ５（以下、センサーチップと記す）を測定チップとして用いた。このセンサーチップは、ガラス板上の金膜表面にカルボキシメチルデキストランを有している。試料がセンサーチップに固定化される際、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基は適切な試薬（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ））で活性化され、次いで、固定化される試料がそこに導入される。当該デキストランが有するカルボキシル基と、当該試料が有するアミノ基との間のカップリング（アミノカップリング）により、センサーチップに対する結合剤の固定化が可能となる。
　評価に用いた被測定物質、抗体および結合剤を以下に示す。ヒトアルブミン（以下、ｈＳＡと記す）を、被測定物質として、用いた。使用したヒトアルブミンは、ＳＩＧＭＡ社製のヒトアルブミンであった。本測定例で使用した抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（以下、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と記す）であった。結合剤として、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製のプロテインＡ（Ｌｏｔ＃Ｄ３３５２４）を使用した。
　次に、抗原（すなわち、被測定物質）の存在／不在に伴う、抗体と結合剤との結合量変化を測定した測定手順を示す。
　まず、結合剤（プロテインＡ）を、前述のアミノカップリングによりセンサーチップ上に固定化した。この固定化は、Ｂｉａｃｏｒｅ提供の固定化方法に従い行った。固定化に際し、所定のｐＨの酢酸緩衝液により希釈されたプロテインＡを使用した。十分な量のプロテインＡが固定化されるための当該酢酸溶液のｐＨを決定する必要がある。そこで、ｐＨ４、ｐＨ５およびｐＨ６の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液に、２０ｎｇ／ｍｌのプロテインＡを溶解した溶液を各々準備した。この異なるｐＨを有する調製した溶液を、Ｂｉａｃｏｒｅが備える４つのフローセルのいずれかに、順次、流速１０μｌ／分で流した。それぞれの調製した溶液について得られたセンサーグラムに基づき、十分な量のプロテインＡが固定化されるｐＨを決定した。
　本実験では、センサーチップ上への固定化量が最も多かったｐＨ４の条件を採用した。上記ｐＨ４の条件下で、プロテインＡをセンサーチップ上に約５ｎｇ／ｍｍ２固定化した。また、ブランク値を測定するために、フローセルにプロテインＡを固定化しない条件でセンサーグラムを得た。
　次に、抗原の存在／不在に伴う、抗体とプロテインＡとの結合量変化を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて測定した。
　まず、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１を溶解させた緩衝溶液を、流速２０μｌ／ｍｉｎにて流量１０μｌを全４つのフローセルへ流し、センサーチップ上に固定化されたプロテインＡと結合させた。この際、緩衝液に溶解した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の濃度は、２００ｎＭであった。また、プロテインＡへの結合量は、およそ５ｎｇ／ｍｍ２であった。ここでは、プロテインＡと結合した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１以外の物質の影響を排除するため、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１をフローセルに流入させた後、緩衝溶液のみをフローセルに流入させた。本実験において、緩衝溶液として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
　次に、被測定物質であるｈＳＡを溶解させた緩衝溶液をフローセルへ流入させ、２Ｆ１　３Ｆ１１Ｇ１１と結合反応させた。このときの流速は２０μｌ／ｍｉｎ、流量は６０μｌであった。使用したｈＳＡの濃度は、４μＭ、２μＭ、５００ｎＭおよび０ｎＭであった。図４は、測定の結果得られたセンサーグラムを示す。図４は、以下の比較例１の結果も示す。
　（比較例１）
　ｈＳＡと２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１との特異性を測定するため、ｈＳＡの代わりに２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と反応しないウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）を用いて同様の実験（ｐＨ：７．４）を実施した。
　図４から理解されるように、ｈＳＡを流入したときレスポンスの低下が観測された。他方、このようなレスポンスの低下は、ＢＳＡを流入した直後には観測されなかった。このことは、ｈＳＡと２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の特異的な結合反応により、プロテインＡからｈＳＡと２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１との複合体がｐＨ：７．４下でも解離していることが示された。
　上記の実験に用いた、被測定物質と特異的に反応しその反応によりプロテインＡから解離する抗体を用いることにより、本発明の免疫測定方法が実現可能であることが示された。
　（比較例２）
　２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１に代えて、１１－４Ｂ抗体、４２－ＤＡ３抗体、および１３－３Ｂ抗体が用いられ、実施例１と同様に実験（ｐＨ：７．４）が実施された。
１１－４Ｂ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－７９３７号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体であった。
４２－ＤＡ３抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１０６３７号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体であった。
１３－３Ｂ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－７９３８号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体であった。
図９は、１１－４Ｂ抗体が用いられた測定の結果得られたセンサーグラムを示す。
図１０は、４２－ＤＡ３抗体が用いられた測定の結果得られたセンサーグラムを示す。
図１１は、１３－３Ｂ抗体が用いられた測定の結果得られたセンサーグラムを示す。
図９～図１１から理解されるように、ｈＳＡまたはＢＳＡを流入しても、レスポンスの低下は観測されなかった。従って、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１およびｈＳＡの組合せのみが、ｐＨ６上８．９以下での、好ましくはｐＨ７．４以上８．９以下での、免疫グロブリンＧ抗体の前記プロテインＡからの解離を可能にする。
　（実施例２）
　次に、本発明の免疫測定方法に適した条件について、ＳＰＲ装置での測定例を示す。
　実施例２では、実施例１と類似の測定系を使用したため、使用した測定系における相違点を中心に説明する。
　測定装置としてＢｉａｃｏｒｅ社製のＢｉａｃｏｒｅ３０００システム（以下、Ｂｉａｃｏｒｅと記す）を用いた。また、被測定物質、抗体、結合剤は、実施例１と同じものを用いた。Ｂｉａｃｏｒｅ社製のＣＭ５（以下、センサーチップと記す）を、測定チップとして使用した。アミノカップリングによって、結合剤であるプロテインＡを上述のセンサーチップに固定化した。プロテインＡの固定化量は、約６ｎｇ／ｍｍ２であった。また、ブランク値を測定するために、フローセルにプロテインＡを固定化しない条件でセンサーグラムを得た。
　次に、種々のＮａＣｌ濃度を有する０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。ＮａＣｌの濃度は、０ｇ／ｌ、４ｇ／ｌ、８ｇ／ｌ、１２ｇ／ｌまたは２４ｇ／ｌとした。得られたＰＢＳ緩衝液の各々に、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１を溶解した。この一連の２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１溶液を、流速２０μｌ／ｍｉｎにて流量４０μｌの条件で、全４つのフローセルへ流し、センサーチップ上に固定化されたプロテインＡと結合させた。この際、結合した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の濃度は１μＭであった。
　さらに、プロテインＡと結合した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１以外の物質の影響を排除するため、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１をフローセルに流入させた後、緩衝溶液のみをフローセルに流入させた。次に、被測定物質であるｈＳＡを溶解させた緩衝溶液をフローセルへ流入させ、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と結合反応させた。このときの流速は２０μｌ／ｍｉｎであった。また、流量は４０μｌであった。濃度は、１μＭであった。これら操作を、先述の５種の緩衝液のそれぞれを用いて行った。
　図５は、測定により得られたセンサーグラムを示す。このセンサーグラムは、プロテインＡを固定化していないブランク値を、それぞれの測定値から差し引いた結果を示す。５種の緩衝液において、ＮａＣｌ濃度に依存して、プロテインＡと２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１との結合量変化に大きな変化が観測された。ＮａＣｌ濃度が０ｇ／ｌであったとき、緩衝液を流した場合にもレスポンスの上昇が見られており、非特異的な反応が起こりやすい条件であると考えられる。この条件は、被測定物質の測定には適さないと考えられた。４ｇ／ｌ以上のＮａＣｌを含む緩衝液では、次のような観測結果が得られた。低い塩濃度を有する緩衝液ほど、大きな２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の結合量を有する傾向があった。さらに、低い塩濃度を有する緩衝液ほど、ｈＳＡを流入した際に、ｈＳＡと２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１との複合体がプロテインＡから解離する量が大きかった。
　図６は、ＮａＣｌ濃度と解離量の関係を示す。図６に示されるグラフ内の解離率は、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１をフローセルに流入させた後、ｈＳＡを添加する直前のＢｉａｃｏｒｅレスポンスを１００％とし、ｈＳＡ添加により減少したＢｉａｃｏｒｅレスポンスの割合を％で示したものである。但し、ＮａＣｌ濃度が０ｇ／ｌであるとき、解離が観測できなかったため、その場合のデータは、示していない。図６から理解されるように、４ｇ／ｌまたは８ｇ／ｌのＮａＣｌを含む緩衝液を用いた場合、解離率が高くなった。
　これらの結果は、プロテインＡから解離する抗体を用いた免疫測定法は、４ｇ／ｌから８ｇ／ｌのＮａＣｌを含む緩衝液を用いることでより感度よく実現できることを示す。
　次に、本発明の免疫測定方法に適した条件としての緩衝液ｐＨと緩衝液種について検討した結果を示す。利用した測定系は、先のＳＰＲ装置による測定と同様のものだった。
　８ｇ／ｌのＮａＣｌ濃度を有する０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、８ｇ／ｌのＮａＣｌ濃度を有する０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．９）、および８ｇ／ｌのＮａＣｌ濃度を有する０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＧｌｙ緩衝液（ｐＨ８．９）を調製した。この調製された緩衝液の各々に、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１を溶解させた。
　得られた２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１溶液を、流速２０μｌ／ｍｉｎかつ流量４０μｌの条件で４つ全てのフローセルに流し、センサーチップ上に固定化されたプロテインＡと結合させた。この際、緩衝液に溶解した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の濃度は１μＭであった。さらに、プロテインＡと結合した２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１以外の物質の影響を排除するため、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１をフローセルに流入させた後、緩衝溶液のみをフローセルに流入させた。次に、被測定物質であるｈＳＡを溶解させた緩衝溶液をフローセルへ流入させ、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と結合反応させた。このときの流速は２０μｌ／ｍｉｎであった。流量は４０μｌで実施した。また、濃度は、１μＭであった。
　図７は、各緩衝液について得られたセンサーグラムを示す。図８は、図７に示される結果に基づき算出したｈＳＡ添加に伴う解離率を示す。図７を参照すると、ｐＨと緩衝液種によって２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１の結合量に違いが見られるものの、図８を参照すると、緩衝液のｐＨおよび緩衝液種類の違いによる解離率の違いは小さいことが理解される。すなわち、上述の測定系は、少なくともＰＢＳ緩衝液またはＧｌｙ緩衝液のいずれを用いた場合でも、利用することが可能である。また、上述の結果から、当該測定系は、ｐＨ７．４からｐＨ８．９までの間でｐＨ範囲においても使用可能であることが示された。
　以上、本発明を詳細に説明してきたが、前述の説明はあらゆる点において本発明の例示にすぎず、その範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲を逸脱することなく種々の改良や変形を行うことができることは言うまでもない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。また、当業者は、本発明の具体的な実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて均等な範囲を実施することができることが理解される。また、本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　本発明は、例えば、抗原に対して特異結合する１種類の抗体により免疫測定系を構成することができる。これにより、免疫測定系の構築の労力を低減でき、また、抗原とそれに対して特異結合する２種類の抗体により、サンドイッチ様の結合体を生じさせる必要がないため、ハプテンのような低分子化合物抗原においても適用することができると考えられる。
１１　　担体
１０１　被測定物質
１０２　抗体
１０３　標識体
１０４　結合剤
１０５　抗体－結合剤複合体
１１１　イムノクロマト試験片
１１２　ＰＴＦＥ基板
１１３　ニトロセルロースメンブレン
１１４　ガラス繊維濾紙
１１５　吸水性パッド
１１６　第２の抗体

 

Claims (24)

  1. 　基板の表面にプロテインＡを介して結合している免疫グロブリンＧ抗体を、前記表面から解離させる方法であって、
    　前記方法は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を具備する：
    　プロテインＡを介して免疫グロブリンＧ抗体が結合している表面を有する基板を用意する工程（Ａ）、および
    　ヒト血清アルブミンを含有する溶液を前記表面に提供し、前記免疫グロブリンＧ抗体を前記プロテインＡから解離させる工程（Ｂ）
    を含み、
    　ここで、前記免疫グロブリンＧ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）であり、
    　前記溶液は６以上８．９以下のｐＨを有する。
  2. 　前記工程（Ｂ）において、抗原抗体反応によって、前記免疫グロブリンＧ抗体と前記ヒト血清アルブミンとの複合体が形成される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記複合体が形成された際に、前記免疫グロブリンＧ抗体が前記表面から解離する、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記表面から解離した前記免疫グロブリンＧ抗体を含有している、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記複合体を含有している、請求項２に記載の方法。
  6. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記溶液は、緩衝液である、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項７に記載の方法。
  9. 　溶液に含まれるヒト血清アルブミンを定量する方法であって、以下の工程（Ａ）～工程（Ｃ）を具備する：
    　プロテインＡを介して免疫グロブリンＧ抗体が結合している表面を有する基板を用意する工程（Ａ）、
    　ここで、前記免疫グロブリンＧ抗体は、標識体によって修飾されており、
    　前記免疫グロブリンＧ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）であり、
    　ヒト血清アルブミンを含有する溶液を前記表面に提供し、前記免疫グロブリンＧ抗体を前記プロテインＡから解離させて前記溶液に混合する工程（Ｂ）、ここで
    　前記溶液は６以上８．９以下のｐＨを有し、および
    　前記溶液に混合された前記免疫グロブリンＧ抗体を修飾する前記標識体を定量し、前記溶液に含有される前記ヒト血清アルブミンを定量する工程（Ｃ）。
  10. 　前記工程（Ｂ）において、抗原抗体反応によって、前記免疫グロブリンＧ抗体と前記ヒト血清アルブミンとの複合体が形成される、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記複合体が形成された際に、前記免疫グロブリンＧ抗体が前記表面から解離する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記表面から解離した前記免疫グロブリンＧ抗体を含有している、請求項９に記載の方法。
  13. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記複合体を含有している、請求項１０に記載の方法。
  14. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項９に記載の方法。
  15. 　前記溶液は、緩衝液である、請求項９に記載の方法。
  16. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　溶液がヒト血清アルブミンを含有するかどうかを決定する方法であって、以下の工程（Ａ）～工程（Ｄ）を具備する：
    　プロテインＡを介して免疫グロブリンＧ抗体が結合している表面を有する基板を用意する工程（Ａ）、
    　ここで、前記免疫グロブリンＧ抗体は、標識体によって修飾されており、
    　前記免疫グロブリンＧ抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１）であり、
    　ヒト血清アルブミンを含有する可能性がある溶液を前記表面に提供し、前記免疫グロブリンＧ抗体を前記プロテインＡから解離させて前記溶液に混合する工程（Ｂ）、ここで、
    　前記溶液は６以上８．９以下のｐＨを有し、
    　前記溶液に混合された前記免疫グロブリンＧ抗体を修飾する前記標識体を検出する工程（Ｃ）、および
    　前記工程（Ｃ）において前記標識体が検出されれば、前記溶液が前記ヒト血清アルブミンを含有していることを決定する工程（Ｄ）。
  18. 　前記工程（Ｂ）において、抗原抗体反応によって、前記免疫グロブリンＧ抗体と前記ヒト血清アルブミンとの複合体が形成される、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記複合体が形成された際に、前記免疫グロブリンＧ抗体が前記表面から解離する、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記表面から解離した前記免疫グロブリンＧ抗体を含有している、請求項１７に記載の方法。
  21. 　前記工程（Ｂ）の後、前記溶液が前記複合体を含有している、請求項１８に記載の方法。
  22. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項１７に記載の方法。
  23. 　前記溶液は、緩衝液である、請求項１７に記載の方法。
  24. 　前記ｐＨは、７．４以上８．９以下である、請求項２３に記載の方法。
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