JPH0763759A

JPH0763759A - 免疫測定法

Info

Publication number: JPH0763759A
Application number: JP13271094A
Authority: JP
Inventors: Shinjiro Imai; 伸二郎今井; Hiroshi Sakai; 博坂井; Takeya Satou; 岳哉佐藤; Kazuyuki Sasaki; 一幸佐々木
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1993-06-16
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1995-03-10

Abstract

(57)【要約】【構成】担体表面にアフィニティーリガンド、特にプ
ロテインＡを介して精製した一次抗体または希釈した抗
血清中の一次抗体を固定化し、これによって測定すべき
抗原を固相上に捕捉し、さらにこの上に標識化された二
次抗体を反応させて抗原の量を定量する免疫測定法に関
する。【効果】本発明の方法により、従来の測定法では達成さ
れなかった検出及び測定の限界が向上され、一次抗体の
精製を不要にし、さらに使用する固定化抗体の消費量が
節減された、経済的で効率的な、しかも高感度に微量物
質を測定する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】微量成分の測定に有効な免疫測定法は基
礎研究、臨床等の様々な領域で活用されている。サンド
イッチ法としてよく知られる非競合型免疫測定系におい
ては固相に固定化した一次抗体によって測定すべき抗原
を固相上に捕捉し、これと適当なマーカー、例えば酵
素、放射性ヨードなどで標識した二次抗体を反応させる
ことによって固相に結合したマーカーの活性から測定す
べき抗原量を定量することができる。

【０００２】一次抗体の固定化にはポリスチレン等の合
成樹脂製マイクロタイタープレートに抗体溶液を加えプ
レートに抗体分子を物理的に吸着あるいは化学的に結合
せしめる方法が最も広く用いられている。このような方
法で固定化を計る場合、抗体分子は担体との分子間引力
あるいは共有結合によって担体表面に無秩序に吸着ある
いは結合すると考えられており、このため本来抗原との
特異的な結合に参画すべき抗体の可変領域が担体との結
合に消費されてしまう状態が、すなわち固定化された抗
体分子の抗原との結合部位の全てが有効に抗原との結合
に寄与し得ない事態が起こる。このことは固定化された
抗体の抗原との結合能すなわち力価が低下したことと事
実上同じことであり、当然所望の感度が達成されない原
因となる。

【０００３】さらには、サンドイッチ法を用いて微量成
分を測定する場合、一次抗体は通常精製して用いなけれ
ばならない。これは抗血清中にはアルブミン等イムノグ
ロブリン以外の蛋白質が大量に含まれており、これらが
イムノグロブリンの固定化に競合するためである。この
ために、測定の前に繁雑なイムノグロブリンの精製操作
も行わねばならず、また、入手が難しい貴重な抗血清の
場合では抗血清を多量に必要とすることがある。このよ
うに従来の固定化方法は必ずしも満足できるものではな
く一次抗体が歩留まり良く担体に固定化され、しかもそ
の抗原結合部位が効率良く抗原との結合反応の場に提供
されるシステムの開発が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】このような状況下に
あって本発明者らは前記従来技術の問題点に対する解決
策として使用する抗体の抗原との結合反応の効率を高め
る方法を種々検討した結果、従来の固定化方法では達成
されなかった経済的で効率的な、しかも高感度に微量物
質を測定する方法を発見し、更に検討を重ね本発明を完
成するに至った。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明は、担体表面に
アフィニティーリガンドを介して一次抗体を固定化し、
この固定化一次抗体上に測定すべき抗原を捕捉し、さら
にこれに標識化された二次抗体を反応させて抗原の量を
定量する免疫測定法に関する。これによって本発明は非
競合型免疫測定法に関して検出および測定の限界を向上
させ、さらに使用する固定化抗体の消費量を節減したい
という要望に充分に答え得るものである。

【０００６】また本発明によれば、一次抗体を精製Ｉｇ
Ｇのみならず、抗血清の状態で担体表面上のアフィニテ
ィーリガンドと反応させ固定化することも可能である。
このため、抗血清の状態で一次抗体を固定化し、繁雑な
イムノグロブリンの精製を行わずに測定に用いることが
可能となる。この場合精製時のロスも無くなるため貴重
な抗血清である場合抗血清の節約にもなる。さらには一
般的に精製イムノグロブリンと抗血清では安定性が抗血
清の方が良好であり、逐次精製する必要も無くなる、と
いう利点もある。

【０００７】本発明に使用される抗原は抗体が存在する
ものであればどの様なものでも使用できるが、例示する
と以下のようなものが挙げられる。ホルモン類。例えば
成長ホルモン、インスリン、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ
ＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）、プロラクチン、消化管ホルモン（グリ
センチンなど）等。成長因子。例えば神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子
（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インス
リン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
等。細菌毒素、及び細菌代謝産物並びにそれらの抗体。
細菌細胞膜成分。ウイルスカプシド成分。酵素。例えば
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、グルタミン酸−
オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（ＧＯＴ）、グルタミン
酸−ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＧＰＴ）、乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）、血液凝固因子、ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等。リポタンパク質。例えば超
低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、高密度リポタンパ
ク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）等。
受容体。例えばホルモン受容体としてインスリン受容
体、成長ホルモン受容体、ＥＧＦ受容体等。神経受容体
としてアセチルコリン受容体など。癌マーカー。例えば
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、フェリチン、ガン胎
児性抗原（ＣＥＡ）等。細胞表面抗原。例えば組織適応
性抗原、自己抗体、Ｃ−活性タンパク質等。その他生理
活性物質。例えばエンドセリン、ペプチド性酵素阻害物
質（膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ））、
アミラーゼインヒビター、α₂マクログロブリン等）、
補体（キャリアタンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質、ト
ランスフェリン等）等。

【０００８】本発明に使用されるアフィニティーリガン
ドは抗体のＦｃ領域に結合し得るものならばどのような
ものでも使用でき、例えばプロテインＡ、プロテインＧ
等を挙げることができる。本発明の実施態様においては
プロテインＡを用いることが好ましい。またイムノグロ
ブリンを精製するために使用されているアフィニティー
担体例えばプロテインＡ−セファロース（ファルマシア
社商標）や、ラジオイムノアッセイにおいて放射線エネ
ルギーの発光への変換効率を上昇させるためのシンチレ
ーターであるＳＰＡビーズ、例えばシンチレーション・
プロキシミティー・アッセイ・プロテインＡ試薬（アマ
シャム社商標）なども使用されうる。以下に本発明の実
施態様を示し、本発明をさらに詳しく説明する。

【０００９】プロテインＡをマイクロタイタープレート
やビーズ等に吸着あるいは結合させる。この製作に関し
ては特に限定すべき条件はないが、通常２〜１００μｇ
／mlの濃度のプロテインＡを０〜３７℃で１０分〜５０
時間接触させることによって達成される。緩衝液で未吸
着のプロテインＡを十分に洗浄除去し、さらに牛血清ア
ルブミン等の適当なブロッキング剤の溶液を添加するこ
とによって後続の工程で添加する抗原、あるいは二次抗
体の非特異的吸着を防止する。この操作は一般の免疫測
定で採用される方法に従えば良い。例えば牛血清アルブ
ミンを中性のリン酸バッファーに溶解した溶液を添加し
静置することにより行える。ブロッキング剤を洗浄除去
後、被検物質と特異的に結合する一次抗体（ＩｇＧ）ま
たはそれを含有する抗血清を加え、０〜３７℃で１０分
〜２０時間保温した後、緩衝液で十分に洗浄する。この
操作によって加えた抗体のＩｇＧはすでに固定化されて
いるプロテインＡによって効率よく捕捉され一次抗体の
固定化が完了する。

【００１０】一次抗体の固定化が完了後、被検物質を含
有する溶液を添加し、０〜３７℃で１０分〜５０時間保
温し被検物質を一次抗体に結合させ洗浄する。以後の操
作は一般に行われるサンドイッチ法による免疫測定の手
順に従えばよい。すなわち抗体のＦａｂ′をワサビ・ペ
ルオキシダーゼ等の酵素や放射性ヨード、ビオチン等の
マーカーで標識した被検物質に対する抗体を二次抗体と
して加え、固定化されるマーカーの活性を定法に従って
測定する。二次抗体を標識せず二次抗体に対する抗体を
適当なマーカーで標識した標識三次抗体で測定すること
も勿論可能である。

【００１１】本発明の方法により得られる効果の特筆す
べき点は、１）固定化された抗体分子は事実上全て抗原との結合
に直接関係のない定常領域がプロテインＡと結合するた
めに分子内の抗原認識部位が担体との結合に消費される
ことがないこと、２）抗体分子はプロテインＡと定量的に結合するため
固定化されたプロテインＡの量に見合った抗体量を添加
すればよく従来行われていたように過剰量の抗体を消費
する必要がないこと３）抗体分子はプロテインＡと特異的に結合するた
め、従来行われていた方法の様な非特異な固定化とは異
なり、精製しない抗体でも固定化が行え、繁雑な精製操
作を行わずに、しかも無駄に抗体を消費せずにすむこと
である。

【００１２】１）で実現される固定化の結果、一次抗体
はプロテインＡ分子の介在によって担体表面から一定の
空間を確保して結合できるため、抗原との結合反応にお
ける担体による立体障害が顕著に軽減される。このこと
は抗体の抗原に対する反応性を高める結果につながり感
度が上昇することになる。またプロテインＡと抗体との
特異的結合は、混在する血清中の蛋白質に著しく妨げら
れることは無いので、抗血清の状態で抗体はプロテイン
Ａと反応し得る。この様な原理に基づいて従来の方法で
は達成され得なかった測定限界の向上と固定化抗体の消
費量の削減と一次抗体の精製操作の除去という問題を解
決する優れた利点を有する免疫測定法が成立する。以下
に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明は下記実施例に限定されるものではない。

【００１３】

【実施例】実施例では以下に示す組成の溶液と試薬を使
用した。ＰＢＳ：１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７.２）、
０.１５Ｍ食塩ＰＢＳ・トウィーン：ＰＢＳ＋０.０５％トウィーン２
０ＥＩＡ−緩衝液：ＰＢＳ＋１０％ブロックエース（明治
乳業社商標）、０.０１５％トリトンＸ−３０５ＰＢＳ・ＢＳＡ：ＰＢＳ＋０.１％牛血清アルブミンブロッキング液：ＰＢＳ＋２５％ブロックエース発色液：オルソフェニレンジアミン（１mg／ml）を含む
クエン酸カリ緩衝液(０.１Ｍ，pH４.５）１０mlに使用
時に３０％過酸化水素液４μｌを添加する。

【００１４】実施例１プロテインＡ固定化プレートの作成プロテインＡ溶液（１０μｇ／ml、ＰＢＳに溶解）を９
６ウェルのヌンク・イムノプレート・マキシソープ（ヌ
ンク社商標）の各ウェルに５０μｌずつ分注し、４℃で
一夜放置しプロテインＡをイムノプレートに吸着せしめ
た。ウェル中のプロテインＡ溶液を捨てプレート・ウォ
ッシャー（バイオ・テック社製、型式ＥＬ４０３）を用
いＰＢＳでウェル内を３回洗浄した。ブロッキング液３
００μｌを加え４℃で１６時間保温後ＰＢＳでウェル内
を十分に洗浄しプロテインＡ固定化プレートの調製を完
了する。

【００１５】実施例２一次抗体の固定化プロテインＡ固定化プレートに抗エンドセリン（１５−
２１）ウサギＩｇＧ（株式会社免疫生物研究所製品）
（５μｇ／ml、ＥＩＡ緩衝液に溶解）を５０μｌを加
え、２５℃で２時間保温後ＰＢＳで３回洗浄し一次抗体
の固定化を完了した。なお、対照実験として一次抗体を
直接イムノプレートに固定化する従来の方法は以下のよ
うに実施した。抗エンドセリン抗体溶液（５μｇ／ml、
ＰＢＳに溶解）５０μｌを９６ウェルのイムノプレート
・マキシソープに加え４℃で１６時間保温した。ＰＢＳ
で３回洗浄することによって一次抗体の固定化を完了し
た。

【００１６】実施例３エンドセリン測定時の測定精度実施例２で作成した２種類の一次抗体固定化プレートの
各ウェルにエンドセリン−１を１〜３０pg／mlの濃度で
含有するＰＢＳ溶液１００μｌを加え２５℃で２時間振
盪下に保温した。ＰＢＳ・トウィーンで３回洗浄後、標
識二次抗体である抗エンドセリン−１ウサギＩｇＧ・Ｆ
ａｂ′・ＨＲＰ（株式会社免疫生物研究所製品）を０.
６μｇ／mlで含有するＥＩＡ緩衝液５０μｌを加え、２
５℃で２時間振盪下に保温した。ＰＢＳ・トウィーンで
５回洗浄後発色液１００μｌを加え２５℃で３０分間振
盪下に保温後、２規定の硫酸１００μｌを添加、プレー
ト・リーダー（モレキュラー・ディバイス社製、型式Ｍ
−Ｔｍａｘ）で吸光度（Ａ_490-650）を測定した。本発
明によって優れた定量性が達成されることが表１および
表２に示されている。すなわち、従来の測定方法に比べ
本測定法は抗原量に従った吸光度の差が大きく、またウ
ェル間の変動が小さいことが示された。この事はプロテ
インＡによる一次抗体の効率的利用と安定化を反映して
いると考えられる。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】

【００１９】実施例４血漿中のエンドセリン測定例ラットの血漿にエンドセリン−１を１０および３０pg／
mlの濃度になるように添加した。血漿が４％酢酸酸性と
なるように酢酸を加え、予め４％酢酸−８６％エタノー
ル混液、メタノール蒸留水の順で前処理したセップ・パ
ツクＣ₁₈カラム（日本ミリポア・リミティッド商標）に
付した。蒸留水でカラムを洗浄後４％酢酸−８６％エタ
ノール混液で溶出した。溶出物を減圧乾固後、ＥＩＡ緩
衝液に溶解し実施例３に従いエンドセリンの測定に供し
た。既知濃度のエンドセリン溶液による検量線から血漿
中のエンドセリン量を求めた。従来の方法に比べ本測定
法は添加エンドセリンをより正確に定量し、かつウェル
間の変動も小さい事が明白である（表３、表４）。この
事から本測定法は血漿由来の測定干渉因子の影響も軽減
し、臨床検査領域への応用にも極めて有効な事が示され
た。

【００２０】

【表３】

【００２１】

【表４】

【００２２】実施例５実施例１の方法に従い作成したプロテインＡ固定化プレ
ートに抗グリセンチン（４９−６９）ウサギＩｇＧ
（１、３、１０、３０、１００μｇ／ml、ＰＢＳ・ＢＳ
Ａに溶解）を５０μｌ加え、２５℃で２時間保温後ＰＢ
Ｓで３回洗浄し一次抗体を固定化した。また、対照実験
としての従来法では抗グリセンチン抗体をＰＢＳに各種
濃度に溶解した溶液５０μｌを９６ウェルのイムノプレ
ート・マキシソープに加え実施例２と同様に抗体を固定
化した。ここで使用した抗グリセンチン（４９−６９）
ウサギＩｇＧはグリセンチンのＮ末端より４９番目から
６９番目のアミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成
し、５０％ポリビニルピロリドンに吸着させフロイント
完全アジュバントと共にウサギに免疫した結果得られた
抗血清をＡｍｐｕｒｅ^TMＰＡキット（アマシャム社商
標）を用い精製し、調製した。このように種々の一次抗
体量を用いて作成した固定化プレートの各々のウェルに
グリセンチン溶液（１０、３０、１００、３００、１０
００pg／ml、ＰＢＳ・ＢＳＡに溶解）を１００μｌ加え
２５℃で３時間振盪下に保温した。ＰＢＳで５回洗浄
後、標識二次抗体である抗グリセンチン（１〜３２）ウ
サギＩｇＧ・Ｆａｂ′・ＨＲＰ溶液（２.２μｇ／ml、
ＰＢＳ・ＢＳＡに溶解）（「消化管ホルモン：消化管ホ
ルモン研究会編、医学図書出版、１９９２年」第１１
巻、ページ３５８〜３６３に記載の方法に従い作成）を
５０μｌ加え、２５℃で２時間振盪下に保温した。以後
実施例３に示した方法に従い吸光度を測定し、その結果
を図１および図２に示した。従来の方法に比べ本測定法
は抗原量に従った吸光度の差が大きく、低濃度の抗体溶
液を用いた場合にもその効果が顕著に現れている。すな
わち、従来の方法で１００μｇ／mlの一次抗体を使用し
ても達成され得なかった吸光度の変化が本法では僅か３
μｇ／mlで得られた。さらに抗原の検出限界は従来の方
法で１０pg前後であったのに対し本測定法では２pgに達
しており、感度は有意に上昇した。

【００２３】実施例６実施例１の方法に従い作成したプロテインＡ固定化プレ
ートに抗グリセンチン（４９−６９）抗血清（ＰＢＳ・
ＢＳＡで１００倍、１０００倍に希釈）を５０μｌ加
え、２５℃で２時間保温後ＰＢＳで３回洗浄し一次抗体
を固定化した。対照実験として上記抗血清（ＰＢＳで１
００倍、１０００倍に希釈）５０μｌを９６ウェルのイ
ムノプレート・マキシソープに加え４℃１６時間保温後
ＰＢＳで３回洗浄し固定化した。ここで使用した抗血清
は実施例５で一次抗体として使用した抗体を調製するの
に用いた抗血清である。このように作成した固定化プレ
ートの各々のウェルにグリセンチン溶液（１０、３０、
１００、３００、１０００pg／ml、ＰＢＳ・ＢＳＡに溶
解）を１００μｌ加え２５℃で３時間振盪下に保温し
た。ＰＢＳで５回洗浄後、実施例５で用いた標識二次抗
体である抗グリセンチン（１〜３２）ウサギＩｇＧ・Ｆ
ａｂ′・ＨＲＰ溶液（２.２μｇ／ml、ＰＢＳ・ＢＳＡ
に溶解）を５０μｌ加え２５℃で２時間振盪下に保温し
た。以後実施例３に示した方法に従い発色を行い吸光度
を測定し、その結果を図３に示した。本発明による方法
では一次抗体が血清の状態でも、抗原量に従った吸光度
の差が大きく、実用に十分な吸光度を示している。これ
に比較して対照実験である抗血清を直接固定化した場合
は抗原量に従った吸光度の差がほとんど現れず、全く測
定は不可能であることを示している。抗血清中のＩｇＧ
は通常ウサギでは１０mg／ml程度であるといわれ、また
実施例５で示したＩｇＧの精製量は血清１mlから５.５m
gのＩｇＧが得られている。本実験で用いた抗血清中の
ＩｇＧ濃度は正確には不明であるが、上記概算のＩｇＧ
濃度の１０mg／mlを適用した場合、抗血清の希釈率１０
００倍は１０μg／mlにあたり、希釈率１００倍は１０
０μg／mlにあたる。抗血清を用いた本実験の結果は図
１に示す実施例５の対照実験である精製ＩｇＧを直接固
定化する実験と比べ吸光度の変化は優位に高いことが示
される。また上記ＩｇＧの精製収量から換算すると抗血
清の希釈率１０００倍は５.５μg／mlにあたる。従来法
で一次抗体濃度１００μｇ／mlでの吸光度の変化とほぼ
同一な変化を示す本実験の一次抗体の希釈率は１０００
倍であるため、従来法と同定度の曲線を達成するために
必要な抗血清の量は１８分の１でよいことになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の方法により測定した抗原量と吸光度との
相関関係を示す図。

【図２】本発明の方法により一次抗体として精製した抗
血清を用いて測定した抗原量と吸光度との相関関係を示
す図。

【図３】本発明の方法により一次抗体として抗血清を用
いて測定した抗原量と吸光度との相関関係を示す図。

フロントページの続き (72)発明者佐々木一幸埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号日清製粉株式会社医薬研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】担体表面にアフィニティーリガンドを介
して一次抗体を固定化し、この固定化一次抗体上に測定
すべき抗原を捕捉し、さらにこれに標識化された二次抗
体を反応させて抗原の量を定量する免疫測定法。
【請求項２】アフィニティーリガンドがプロテインＡ
である請求項１に記載の方法。