CN114181909B - 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114181909B
CN114181909B CN202111410957.XA CN202111410957A CN114181909B CN 114181909 B CN114181909 B CN 114181909B CN 202111410957 A CN202111410957 A CN 202111410957A CN 114181909 B CN114181909 B CN 114181909B
Authority
CN
China
Prior art keywords
homocysteine
monoclonal antibody
hybridoma cell
test strip
hcy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111410957.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114181909A (zh
Inventor
吴峰
施学英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Zhenkang Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Zhenkang Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Zhenkang Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Zhenkang Technology Co ltd
Priority to CN202111410957.XA priority Critical patent/CN114181909B/zh
Publication of CN114181909A publication Critical patent/CN114181909A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114181909B publication Critical patent/CN114181909B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/304—Mood disorders, e.g. bipolar, depression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/321—Arterial hypertension
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒，杂交瘤细胞株C‑2B2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021274，保藏日为2021年9月29日。本发明提供的杂交瘤细胞株所分泌产生的单克隆抗体可用于制备同型半胱氨酸检测试剂，检测方法操作简单、灵敏度高、特异性强，可实现对同型半胱氨酸的快速检测。

Description

一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是蛋氨酸循环中的一种中间代谢产物，是一种含巯基的4碳α-氨基酸，来源于食物中的甲硫氨酸和半胱氨酸代谢产生的中间产物，其本身是一种小分子，不具有免疫原性，因此很难将其免疫动物制备抗体。人体血液中的同型半胱氨酸正常含量在5～15μM范围内，同型半胱氨酸代谢循环中酶功能的异常、叶酸缺乏等可导致血浆同型半胱氨酸水平异常升高，即为高同型半胱氨酸血症，高同型半胱氨酸血症与心血管疾病、高血压、脑卒中、慢性肾脏疾病、抑郁、阿尔茨海默症和糖尿病等的发生发展均有一定关联性，同型半胱氨酸水平越高，患病风险越高，因此同型半胱氨酸可作为这些疾病的独立危险指标或重要危险指标，也可用于人体健康风险评估，因此，同型半胱氨酸检测意义重大。
目前已经有较多同型半胱氨酸检测方法的报道，包括高效液相色谱法、循环酶法和免疫检测法等。高效液相色谱法准确性较高，常作为同型半胱氨酸检测的标准方法，但是高效液相色谱法仪器设备昂贵、操作步骤复杂、检测耗时长并且需要专业的操作人员，不利于临床及基层医院检测。循环酶法对试剂稳定性要求严格，涉及较多的试剂，操作步骤比较繁琐，不能满足基层检测需求。免疫检测方法由于操作简便，检测时间短，已有多种项目用于临床和基层检测，而同型半胱氨酸因为其抗原和抗体很难制备，没有工业化应用的抗原抗体原料提供，因此限制了同型半胱氨酸免疫检测试剂的开发和应用。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种杂交瘤细胞株C-2B2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021274，保藏日为2021年9月29日。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，所述单克隆抗体是由第一方面所述杂交瘤细胞株分泌产生。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种产品，所述产品包含第二方面所述单克隆抗体，或其抗原结合部分，所述产品用于如下用途中的至少一种：
(a)检测高半胱氨酸；
(b)检测待测样本中是否含有高半胱氨酸。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述杂交瘤细胞株，或第二方面所述单克隆抗体，或第三方面所述产品。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种试纸条，所述试纸条包含第二方面所述单克隆抗体，或第三方面所述产品。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种高半胱氨酸半抗原，所述高半胱氨酸半抗原包含至少一种多肽，每种所述多肽包含的高半胱氨酸数目≥5个。
根据第七方面，在一实施例中，提供一种高半胱氨酸完全抗原，包含第六方面所述高半胱氨酸半抗原。
根据第八方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第六方面所述高半胱氨酸半抗原，或第七方面所述高半胱氨酸完全抗原。
依据上述实施例的一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒，本发明提供的杂交瘤细胞株所分泌产生的单克隆抗体可用于制备同型半胱氨酸检测试剂，检测方法操作简单、灵敏度高、特异性强，可实现对同型半胱氨酸的快速检测。
附图说明
图1为实施例1中不同数目同型半胱氨酸完全抗原免疫结果。
图2为实施例1中不同载体偶联同型半胱氨酸完全抗原免疫结果。
图3为实施例3中的同型半胱氨酸单克隆抗体C-2B2 IC50检测曲线。
图4为实施例4与串联质谱测试结果相关性曲线图。
图5为试纸条的结构示意图。
附图标记说明：1、样品垫；2、荧光垫；3、缓释垫；4、包被膜；5、检测线；6、质控线；7、吸水垫。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
如本文所用，“室温”是指23±2℃。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种杂交瘤细胞株C-2B2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021274，保藏日为2021年9月29日。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，所述单克隆抗体是由第一方面所述杂交瘤细胞株分泌产生。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种产品，所述产品包含第二方面所述单克隆抗体，或其抗原结合部分，所述产品用于如下用途中的至少一种：
(a)检测高半胱氨酸；
(b)检测待测样本中是否含有高半胱氨酸。
“高半胱氨酸”亦称同型半胱氨酸、同半胱氨酸，化学式为C4H9NO2S，是一种氨基酸，具体为L-高半胱氨酸，CAS登录号：6027-13-0。
在一实施例中，所述产品可以作为试剂盒中的组分，与其他试剂组合，用于检测目标物。
在一实施例中，所述待测样本包括但不限于体液样本。
在一实施例中，所述体液样本包括但不限于血清、血浆、全血、尿液等等中的至少一种。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述杂交瘤细胞株，或第二方面所述单克隆抗体，或第三方面所述产品。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种试纸条，所述试纸条包含第二方面所述单克隆抗体，或第三方面所述产品。试纸条包括但不限于荧光试纸条、胶体金试纸条、量子点免疫层析试纸条。
在一实施例中，所述单克隆抗体包含荧光微球标记的单克隆抗体、胶体金标记的单克隆抗体、量子点标记的单克隆抗体中的至少一种。
在一实施例中，所述试纸条包括荧光试纸条。
在一实施例中，所述荧光试纸条包括荧光垫(亦称样品垫)，所述荧光垫包被有第四方面所述单克隆抗体。
在一实施例中，所述荧光试纸条还包括检测垫，所述检测垫上设有检测线(亦称测试线、T线)、质控线(亦称对照线、C线)，所述检测线上包被有高半胱氨酸抗原。
在一实施例中，所述质控线上包被有抗抗体。
在一实施例中，所述抗抗体包括但不限于羊抗鼠IgG抗体或者抗独立质控线抗体。
在一实施例中，所述检测垫的材质具体可为硝酸纤维素膜。
在一实施例中，荧光垫的材质具体可为聚酯纤维、玻璃纤维纸。
在一实施例中，微孔板的材质具体可为聚苯乙烯塑料。
在一实施例中，所述试纸条包括胶体金试纸条。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种高半胱氨酸半抗原，所述高半胱氨酸半抗原包含至少一种多肽，每种所述多肽包含的高半胱氨酸数目≥5个。
在一实施例中，每种所述多肽包含5～20个高半胱氨酸。每种多肽所包含的高半胱氨酸数目包括但不限于5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个等等。多肽少于5个氨基酸则没有免疫原性，如果多于20个氨基酸，则较难合成，合成时很容易交联。包含不同高半胱氨酸数目的高半胱氨酸半抗原的免疫原性无显著差异。
在一实施例中，所述高半胱氨酸半抗原包含至少两种多肽。
在一实施例中，所述高半胱氨酸半抗原包含三种多肽中的至少一种。
在一实施例中，所述高半胱氨酸半抗原包含三种多肽中的至少一种，所述三种多肽所含有的高半胱氨酸数目分别为6个、12个、18个。
在一实施例中，所述高半胱氨酸为L-高半胱氨酸。
根据第七方面，在一实施例中，提供一种高半胱氨酸完全抗原，包含第六方面所述高半胱氨酸半抗原。
在一实施例中，还包含偶联至所述半抗原的载体蛋白。
在一实施例中，所述载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等等中的至少一种。
根据第八方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第六方面所述高半胱氨酸半抗原，或第七方面所述高半胱氨酸完全抗原。
根据第九方面，在一实施例中，提供第一方面所述杂交瘤细胞株，或第二方面所述单克隆抗体，或第三方面所述产品在制备高半胱氨酸检测试剂盒、试纸条或装置中的用途。
在一实施例中，所述试剂盒包括酶联免疫(酶联免疫吸附测定，enzyme linkedimmunos orbent assay，简称ELISA)试剂盒。
灵敏性高且特异性高的抗体是抗原检测技术的开发和实施的关键。在一实施例中，本发明基于单克隆抗体技术获得了抗同型半胱氨酸的特异性抗体，并用其制备了同型半胱氨酸检测试纸条。采用本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂，操作简单、灵敏度高、特异性强，可实现对同型半胱氨酸的快速检测。
在一实施例中，本发明提供的单克隆抗体可用于免疫检测同型半胱氨酸，该检测方法是一种低成本、操作简单和快速的同型半胱氨酸免疫检测方法，可以满足临床对于低成本快速准确检测同型半胱氨酸的需求。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Balb/c小鼠：广东省医学实验动物中心，5周龄。
实施例1
同型半胱氨酸完全抗原制备及评价
同型半胱氨酸多肽由强耀公司(全称：上海强耀生物科技有限公司)合成，根据同型半胱氨酸氨基酸数目不同命名为H6(Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy)、H12(Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy)、H18(Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy-Hcy)，得到3种同型半胱氨酸多肽半抗原，同型半胱氨酸多肽分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，得到12种同型半胱氨酸多肽完全抗原。3种同型半胱氨酸多肽半抗原的免疫原性差异不大。
将同型半胱氨酸多肽完全抗原溶解至生理盐水中，配制成浓度1000μg/mL的同型半胱氨酸多肽完全抗原液，将同型半胱氨酸多肽完全抗原液与Quick Anti-body－Mouse3W佐剂等体积混合，然后小腿肌肉注射免疫2只Balb/c小鼠，注射液中同型半胱氨酸多肽完全抗原的浓度为500μg/mL，按照50μg/只小鼠免疫，H6的4种完全抗原各注射2只Balb/c小鼠，H12、H18的OVA完全抗原各注射2只Balb/c小鼠。第14天按同样方式加强免疫。第21天自小鼠尾部取血，分离血清后采用间接ELISA法检测，使用0.02M的PBS缓冲液将血清稀释1000倍后，分别检测对照组(对照组为PBS缓冲液)和加入浓度为10μg/mL的Hcy竞争组(使用0.02M PBS缓冲液配制的Hcy浓度为10μg/mL的溶液)，验证血清抗体是否能够识别Hcy，结果如图1和图2所示，不同同型半胱氨酸氨基酸数目抗原(H6、H12、H18)免疫血清与Hcy均有竞争反应，不同载体蛋白偶联同型半胱氨酸多肽免疫血清与Hcy均有竞争反应，表明所制备的同型半胱氨酸完全抗原能够用于免疫制备抗同型半胱氨酸抗体。图1、图2中，每组的左侧为对照组，右侧为Hcy竞争组。
实施例2
可分泌抗同型半胱氨酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的获得
将同型半胱氨酸完全抗原(OVA-H6)免疫小鼠在细胞融合前3天，用200μg同型半胱氨酸完全抗原进行脾脏加强免疫。
将Balb/c小鼠脾脏细胞与对数生长期的NS1骨髓瘤细胞(实验室保藏)按9：1的数量比例混合后，在50％的PEG1500(具体是0.5g PEG1500溶于0.5mL培养基，配制得到质量体积浓度为50％的培养液)作用下进行融合。融合后细胞于HAT半固体培养基培养8～10天，挑取细胞克隆到HT培养基筛选培养2天后，采用间接ELISA法检测细胞培养上清中的抗体特异性。将阳性细胞再用HT半固体培养基克隆1次，获得能稳定分泌抗体的单克隆细胞株，扩大培养后，用含10V/V％DMSO的胎牛血清(FBS)冻存(10mL DMSO加入90mL FBS制得)，细胞密度为106个/mL。采用体内诱生法制备腹水，腹水经Protein A亲和层析纯化得到纯化的抗体，于0.01mol/L磷酸盐缓冲液中透析后，用Nanodrop测定蛋白浓度。获得了多株单克隆细胞株，经过对抗体筛选实验，从单克隆细胞株中筛选到一株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，将其命名为杂交瘤细胞株C-2B2。
杂交瘤细胞株C-2B2，已于2021年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C2021274。杂交瘤细胞株C-2B2可分泌抗同型半胱氨酸的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株C-2B2分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体C-2B2。
实施例3
单克隆抗体C-2B2的制备、纯化以及效价
一、单克隆抗体C-2B2的制备
1、细胞培养
细胞培养基(7.4)的制备方法：向DMEM培养基中添加胎牛血清，胎牛血清的终浓度为15％(质量百分含量)。
将杂交瘤细胞株C-2B2置于细胞培养基中，37℃培养3～4天，细胞铺满瓶底后收集细胞，计数、离心。
2、腹水制备
Balb/c小鼠提前10天腹腔注射灭菌石蜡油(0.5mL/只)，腹腔注射杂交瘤细胞株C-2B2(1×106个细胞/只)，8～10天后采集腹水，采用Protein A亲和层析纯化，然后转移到透析袋中，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中进行透析，然后收集透析袋中的液体，得到单克隆抗体C-2B2，用Nanodrop测定蛋白浓度，-20℃保存。
二、效价检测(间接ELISA法)
1、取酶标板，加入包被液(100μL/孔)，4℃包被过夜。包被液：取同型半胱氨酸完全抗原(BSA-H6)，用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为10μg/mL，即为包被液。
2、完成步骤1后，取包被后的酶标板，用PBST溶液(pH为7.4)洗涤4次，然后加入封闭液(200μL/孔)，37℃孵育2小时。封闭液：含1g/100mL BSA的PBST溶液。
3、完成步骤2后，取封闭后的酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入抗体稀释液(100μL/孔)，37℃孵育1h。抗体稀释液：取单克隆抗体C-2B2，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到不同浓度的抗体稀释液。
4、完成步骤3后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入HRP标记二抗工作液，37℃孵育1h。按照HRP标记二抗工作液：HRP标记二抗＝1:4000的体积比混合，使得HRP标记二抗被稀释。HRP标记二抗：洛阳佰奥通实验材料中心，货号为C030205。
5、完成步骤4后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入TMB底物反应液显色10分钟，然后加入2M硫酸水溶液终止显色，然后用酶标仪测定450nm吸光值。
单克隆抗体C-2B2的效价为1：1000000。
三、IC50值检测
同型半胱氨酸完全抗原(OVA-H6)包被酶标板条，加入不同浓度同型半胱氨酸标准溶液(浓度：0、2.5、5、10、20、40、80μM/L)，加入HRP标记单克隆抗体C-2B2(1：3000稀释)，37℃反应1小时后，用PBST溶液洗涤4次，然后加入TMB底物反应液显色10分钟，然后加入2M硫酸溶液终止显色，然后用酶标仪测定450nm吸光值。结果见图3。单克隆抗体C-2B2的IC50为19μM/L。
实施例4
荧光快速检测试纸的制备
一、荧光微球标记抗体的制备
取10mg羧基修饰的荧光微球，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤并离心，然后用1mLpH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入EDC(使其在体系中的终浓度为5mM)和NHS(使其在体系中的终浓度为10mM)，室温避光反应半小时，得到活化后羧基修饰的荧光微球。活化后羧基修饰的荧光微球，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后加入单克隆抗体C-2B2(抗体含量为0.5mg)，在pH8.5、50mM的硼砂缓冲液中充分混匀，室温避光反应2小时(抗体和微球形成稳定的肽键共价结合从而得到偶联物)，然后加入BSA并使其在体系中的浓度为1g/100mL，以封闭剩余活性羧基位点，室温避光反应0.5小时，然后用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤、重悬，得到荧光微球标记的C-2B2抗体溶液(浓度为5mg/mL，以微球浓度计)，4℃保存。
二、荧光试纸条的制备
1、制备检测垫
采用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，将羊抗鼠IgG抗体配制为浓度1mg/mL的溶液，即为C溶液。采用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，将同型半胱氨酸完全抗原(BSA或OVA偶联)配制为浓度1mg/mL的溶液(以蛋白浓度计)，即为T溶液。羊抗鼠IgG抗体：洛阳佰奥通实验材料中心，货号为C020201。
取硝酸纤维素膜，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将C溶液喷至质控线(C线)位置，将T溶液喷至检测线(T线)位置，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时，得到检测垫。
2、制备样品垫、荧光垫、缓释垫
(1)取玻璃纤维纸，置于含0.2g/100mL Tween-20、1g/100mL BSA、2g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液中37℃浸泡半小时，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时。
(2)完成步骤(1)后，取所述玻璃纤维纸，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统喷涂荧光标记抗体溶液，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时，得到荧光垫。荧光标记抗体溶液的配制方法如下：取步骤一制备的荧光微球标记的C-2B2抗体溶液，用含0.2g/100mLTween-20、1g/100mL BSA、2g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释，使荧光微球标记的C-2B2抗体的浓度为0.5μg/mL(以蛋白浓度计)。
3、试纸条的组装
在10万级洁净和干燥的车间中进行试纸条的组装。
如图5所示，试纸条包括底板(又称为背衬)、样品垫1、荧光垫2、缓释垫3、检测垫和吸水纸7。沿样品流动方向，样品垫1、荧光垫2、缓释垫3、检测垫和吸水垫7依次固定于底板上(相邻垫之间略重叠)。检测垫上设有包被膜4，沿样品流动方向，检测垫上设有检测线5、质控线6。检测线5亦称T线，质控线6亦称C线。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为3.5mm。试纸条的总长度为6cm，其中荧光垫2的长度为2cm，检测垫的长度为2.5cm，吸水垫7的长度为2cm。C线靠近吸水垫7、远离荧光垫2。T线靠近荧光垫2、远离吸水垫7。
吸水垫7的材质为吸水纸。
底板仅起支撑作用，常规材质均可，本实施例具体为聚氯乙烯(PVC)。
三、试纸条的使用方法
将60μL待检样品垂直缓慢滴入荧光试纸条的加样端(荧光试纸条的加样端即荧光垫2中靠近游离端的部分)，室温水平放置10～15分钟，用荧光检测仪(型号：TH001)判读。
四、血清样本测试
取100份血清样本，分别采用串联质谱和实施例4制备的试纸条进行检测，测试结果见图4，R2为0.9947，相关性较好。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞株C-2B2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2021274，保藏日为2021年9月29日。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种产品，其特征在于，所述产品包含如权利要求2所述单克隆抗体，所述产品用于如下用途中的至少一种：
（a）检测高半胱氨酸；
（b）检测待测样本中是否含有高半胱氨酸。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述待测样本为体液样本；
所述体液样本为血清、血浆、全血、尿液中的至少一种。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述杂交瘤细胞株，或如权利要求2所述单克隆抗体，或如权利要求3或4所述产品。
6.一种试纸条，其特征在于，所述试纸条包含如权利要求2所述单克隆抗体，或如权利要求3或4所述产品。
7.如权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体包含荧光微球标记的单克隆抗体、胶体金标记的单克隆抗体、量子点标记的单克隆抗体中的至少一种。
8.如权利要求1所述杂交瘤细胞株，或权利要求2所述单克隆抗体，或权利要求3所述产品在制备高半胱氨酸检测试剂盒、试纸条或装置中的用途。
CN202111410957.XA 2021-11-25 2021-11-25 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒 Active CN114181909B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111410957.XA CN114181909B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111410957.XA CN114181909B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114181909A CN114181909A (zh) 2022-03-15
CN114181909B true CN114181909B (zh) 2023-06-06

Family

ID=80602557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111410957.XA Active CN114181909B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114181909B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478729A (en) * 1994-04-28 1995-12-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for homocysteine
JPH10114797A (ja) * 1996-10-09 1998-05-06 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒト血清アルブミン結合型ホモシステインの検出法
CN104479022A (zh) * 2014-10-23 2015-04-01 湖南天合生物技术有限公司 抗s-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶体金试纸、试剂盒及用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478729A (en) * 1994-04-28 1995-12-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for homocysteine
JPH10114797A (ja) * 1996-10-09 1998-05-06 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒト血清アルブミン結合型ホモシステインの検出法
CN104479022A (zh) * 2014-10-23 2015-04-01 湖南天合生物技术有限公司 抗s-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶体金试纸、试剂盒及用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体的制备及应用;勾宏娜;《中华检验医学杂志》;第28卷(第1期);92-95 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114181909A (zh) 2022-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK160108C (da) Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans
JPS5923251A (ja) 多価抗原の測定法及び測定試薬
BRPI0612666B1 (pt) anticorpo monoclonal, suporte sólido, composição, linhagem de células de hibridoma, imunoensaios e kits para sua detecção e quantificação
CN113391076A (zh) 一种25-羟基维生素d的免疫检测方法及其应用
Drijvers et al. The enzyme-linked immunosorbent assay: the application of ELISA in clinical research
US9435817B2 (en) Detection of synthetic cannabinoids
CN104931685B (zh) 一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法
CN114181909B (zh) 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒
EP3306319B1 (en) Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same
JP2023056523A (ja) 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途
AP156A (en) Agglutination assay.
CN112698027B (zh) 一种半抗原免疫层析检测试剂
CN111220802B (zh) 基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法
AU2003230509B2 (en) Sandwich assay and kit
EP2698383B1 (en) Detection of synthetic Cannabinoids
JP4663831B2 (ja) モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法
CN112142756A (zh) 黄曲霉毒素m1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用
CN105223362A (zh) 空肠弯曲菌酶联免疫检测试剂盒
JP7372196B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫測定方法及び免疫測定器具
KR940008091B1 (ko) 리간드의 면역학적 검출방법
CN116554313A (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白抗体、杂交瘤细胞株及应用、及检测试剂盒
Chang et al. Evaluation on the use of reactive dye-modified polylysine as the biomarker in immunochromatographic test application
CN116041495A (zh) 抗人呼吸道合胞病毒n蛋白抗体、杂交瘤细胞株、及应用、及检测试剂盒
CN118165939A (zh) 分泌抗腺病毒Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒
CN117448280A (zh) 分泌抗人偏肺病毒n蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant