JP2022528465A - 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

開示された内容は均一酵素免疫測定法のように、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物を検出するのに使用可能な対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合する抗体に関する。【選択図】 図１０

Description

本願は２０１９年４月３日に出願された米国仮出願番号６２／８２８，７６９号の出願日に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って優先権を主張するものであって、その開示内容は参照として本明細書に援用される。
本発明は、免疫アッセイ分野、特に対称性ジメチル化アルギニン分析物検出のための免疫アッセイに使用可能な対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合する抗体に関する。
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、イヌとネコによくみられる問題である。ＣＫＤの治療は不可能だが、該疾病を有する患者のための医療管理は可能である。その研究は可能な限り疾病経過初期に医療管理及びモニタリングを始めることを目標に、ＣＫＤの早期発見に焦点を合わせている。対称性ジメチルアルギニン（Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ）は、最近ネコとイヌにおいてＣＫＤの早期発見に有用な新たな腎排泄型バイオマーカーとして登場した。
非対称性ジメチルアルギニン（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ，ＡＤＭＡ；図２）及びモノメチルアルギニン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ，ＭＭＡまたはＮ－メチルアルギニン；図２）に加えて、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ；図１）は、ほぼすべての細胞内のアルギニン残基を含むタンパク質の翻訳後修飾（メチル化、ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）に由来する。タンパク質加水分解またはタンパク質ブレークダウン（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）後、該タンパク質残基は循環系に排出される。腎疾患、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、関節リウマチ及びその他疾病評価のためのマーカーとして、血清対称性ジメチルアルギニンの潜在的な使用が広く研究されてきた。
対称性ジメチルアルギニンは、主に腎排泄を通じて体内から除去される。クレアチニンと異なり、対称性ジメチルアルギニンは、除脂肪体重を含む腎外性要因の影響を受けない。対称性ジメチルアルギニンは、血漿タンパク質に部分的に結合している非対称性ジメチルアルギニンと異なり、タンパク質に結合しない。非対称性ジメチルアルギニンと糸球体濾過率（ＧＦＲ）間の相関関係はかなり弱いことが分かるが、これは糸球体濾過を阻害する非対称性ジメチルアルギニンのタンパク質結合分画が理由と考えられる。
対称性ジメチルアルギニンの血清濃度は、ヒトのＣＫＤ患者でも増加する。血清対称性ジメチルアルギニン濃度は、ＧＦＲと反比例することが分かった。
対称性ジメチルアルギニン及び対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンの循環代謝産物（図１）も確認され、これもまたＧＲＦとの相関関係が考えられる。対称性ジメチルアルギニンのアセチル化反応は、細胞外で生じて代謝産物を生成する。
対称性ジメチルアルギニンは、ほぼ独占的に腎臓によって除去されるため、ＧＦＲバイオマーカーの理想的な候補となる。したがって、対称性ジメチルアルギニンは、既に獣医学分野で広く用いられる腎臓機能の新たな内因性バイオマーカーである。
対称性ジメチルアルギニンを定量化するための酵素－結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、商業的に利用可能である。該方法は、対称性ジメチルアルギニンを定量化する前に対称性ジメチルアルギニンを含有する疑いがある試料にアシル化誘導体化試薬の添加を含む試料調製段階を含む。対称性ジメチルアルギニンは、アシル化試薬によって定量的にＮα－アシル－ＳＤＭＡにコンバートされる。ＥＬＩＳＡ製品に用いられた抗体は、対称性ジメチルアルギニンのＮα－アシル化形態のみに結合し、遊離対称性ジメチルアルギニンに結合しない。
ごく最近では、遊離対称性ジメチルアルギニンのみを検出するがＮα－アシル化対称性ジメチルアルギニンと交差反応しない抗体を用いる遊離対称性ジメチルアルギニンに対する競合免疫アッセイが開発された。競合免疫アッセイに用いられる抗体は、遊離対称性ジメチルアルギニンのみに特異的な抗体を産生する特定免疫原に対して開発される。対称性ジメチルアルギニンの酸性カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）の化学修飾に関連する誘導体であるハプテン（Ｈａｐｔｅｎｓ）が用いられる。抗体は、遊離対称性ジメチルアルギニン（すなわち、ポリペプチド鎖の一部でない対称性ジメチルアルギニン）を検出するのに用いられ、非対称性ジメチルアルギニン、Ｌ－アルギニン及びＮ－メチルアルギニンと交差反応性を全く、または実質的に示さない。
対称性ジメチルアルギニンの測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて行うことができる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技術は、依然として複雑であり、テスト開発及びオペレータに相当水準の専門知識が求められる。また、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイは完全自動化されておらず、結果が出るまでに相当な試料調製と時間が求められるため、血清クレアチニンに対する自動アッセイと比較すると処理時間が増大する。
対称性ジメチル化アルギニン分析物の検出を可能にするツールの開発が引き続き求められる。
本開示は、対称性ジメチル化アルギニン分析物の免疫アッセイ方法を提供する。特に、本開示は、シグナル生成免疫アッセイシステムにおける対称性ジメチルアルギニンの誘導体の用途に関する。本開示はまた、該分析物捕捉のための抗体を産生するのに用いられる対称性ジメチルアルギニンの免疫原の用途に関する。本明細書で用いられた用語「対称性ジメチル化アルギニン分析物」は、対称性ジメチルアルギニンに共通する抗体結合エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有する分析物を指す。対称性ジメチル化アルギニン分析物に含まれる分析物には、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン等の対称性Ｎα－アシル化－ジメチルアルギニン、及びＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチド等のＳＤＭＡ－ペプチド誘導体が含まれる。
一部の実施例において、本開示は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子上でアルキル化された対称性ジメチルアルギニンハプテンを提供する（図１）。特定の実施例において、該ハプテンは、対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的な抗体を産生するのに用いられる。
一部の実施例において、本開示は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子上でアシル化された対称性ジメチルアルギニン誘導体を提供する（図１）。特定の実施例において、該誘導体は、本明細書に記載された免疫アッセイに有用な結合体を生成するのに用いられる。
一部の実施例において、本開示は、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン等の対称性ジメチルアルギニン代謝産物に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供する（図１）。
一部の実施例において、本開示は、遊離対称性ジメチルアルギニン、及び対称性Ｎα－アセチル化－ジメチルアルギニンタンパク質に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供する（図１）。
一部の実施例において、抗体は、非対称性ジメチルアルギニン、Ｌ－アルギニン、及びＮ－メチルアルギニンのうち１以上に特異的に結合され得る（図２）。
一部の実施例において、本開示は、遊離対称性ジメチルアルギニン及びＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチド等のＳＤＭＡ－ペプチド誘導体に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供する（図３）。
一部の実施例において、本開示は、対称性ジメチルアルギニンから出発する対称性ジメチルアルギニンハプテン、免疫原及び結合体の合成方法を提供する。一部の実施例において、合成は、連結基を有する対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子を通じてタンパク質または標識（例えば、標識酵素）に結合することを含む。
本開示の一実施例の例は、下記化学式１の化合物である：
化学式１

Figure 2022528465000002
式中：
Ｒ１は－Ｙ－Ｚ；そして、
Ｙは連結基であり、Ｚは水素、ＯＨ、ＳＨ、Ｓ－アシル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、エポキシ、マレイミジル、ハロアセトアミド、カルボキシル、活性化されたカルボキシル、免疫原性担体、タンパク質及び標識から選択される。
本開示の実施形態は抗体を含む。一部の実施例において、本開示の抗体は、本開示の別途記載された化学式１の任意の化合物を含み、本開示の任意の化合物に特異的に結合する。
本開示の任意の抗体をコーディングする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸と発現ベクターを含む細胞も提供される。
また、本開示の抗体を作製する方法が提供される。該方法は、細胞が抗体を発現するのに適した条件下で本開示の細胞を培養することを含み、ここで抗体が産生される。
本開示の様態は、組成物をさらに含む。本開示の組成物は、本開示の任意の抗体、核酸、発現ベクター及び／または細胞を含み得る。
また、培地内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を測定する方法が提供される。特定の実施例において、該方法は少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物、及び本開示の抗体を含有する疑いがある試料を培地で組み合わせることを含む。該方法は、対称性ジメチル化アルギニン分析物及び抗体を含む複合体の存在または不在を決定する段階をさらに含み、ここで複合体の存在は、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在を示す。
本開示の様態は、キットをさらに含む。一部の実施例によれば、キットは、試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するのに用いられる。特定の実施例において、本開示のキットは、本開示の任意の抗体、及び試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するために抗体を用いるための指針を含む。該キットは、本開示の化学式１の任意の化合物をさらに含み得る。一部の実施例によれば、本開示のキットは、本開示の任意の化学式１の化合物、及び試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するためにその化合物を用いるための指針を含む。該キットは、本開示の任意の抗体をさらに含み得る。
本開示は、本出願の一部を形成する添付の図面と関連してなされる以下の詳細な説明からより完全に理解することができる。
図１は対称性ジメチルアルギニン及び対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンに対する化学的構造を示す。
図２は非対称性ジメチルアルギニン、モノメチルアルギニン及びアルギニンに対する化学的構造を示す。
図３はＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチドに対する化学的構造を示す。
図４（左側）は本発明の実施例に係る対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ窒素原子で修飾されたＳＤＭＡ－Ｍ（Ｎα－アルキル－ＳＤＭＡ）ハプテンを示す。
図４（右側）は本発明の実施例に係る対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ窒素原子で修飾されたＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ（Ｎα－アシル－ＳＤＭＡ）ハプテンを示す。
図５は本開示の実施例に係るＳＤＭＡ－Ｍ（Ｎα－アルキル－ＳＤＭＡ）ハプテンに対する反応式を示す。
図６は本開示の実施例に係るＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ（Ｎα－アシル－ＳＤＭＡ）ハプテンに対する反応式を示す。
図７は本開示の実施例に係るＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨに対する反応式を示す。
図８は本開示の実施例に係るＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ免疫原に対する反応式を示す。
図９は本開示の実施例に係るＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－ＢＳＡ免疫原に対する反応式を示す。
図１０は本開示の実施例に係る抗体スクリーニング技術を示す。
図１１は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２６４９４、モノクローナル抗体１Ｈ２／１Ｋ４、モノクローナル抗体３Ｈ１／３Ｋ３、及びモノクローナル抗体５Ｈ１／５Ｋ１を用いた対称性ジメチルアルギニンのキャリブレーション曲線のグラフを示す。
図１２は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２１３４２、モノクローナル抗体１Ｈ４／１Ｋ４、モノクローナル抗体８Ｈ１／８Ｋ３、及びモノクローナル抗体１８Ｈ１／１８Ｋ２を用いた対称性ジメチルアルギニンのキャリブレーション曲線のグラフを示す。
図１３は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２６４９４、モノクローナル抗体１Ｈ２／１Ｋ４、モノクローナル抗体３Ｈ１／３Ｋ３、モノクローナル抗体５Ｈ１／５Ｋ１を用いた対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンのキャリブレーション曲線のグラフを示す。
図１４は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２１３４２、モノクローナル抗体１Ｈ４／１Ｋ４、モノクローナル抗体８Ｈ１／８Ｋ３、及びモノクローナル抗体１８Ｈ１／１８Ｋ２を用いた対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンのキャリブレーション曲線のグラフを示す。
図１５は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２６４９４（下部右側）、モノクローナル抗体１Ｈ２／１Ｋ４（上部左側）、モノクローナル抗体３Ｈ１／３Ｋ３（上部右側）、モノクローナル抗体５Ｈ１／５Ｋ１（下部左側）を用いた対称性ジメチルアルギニンの少量添加回収率の実験グラフである。
図１６は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２１３４２（下部右側）、モノクローナル抗体１Ｈ４／１Ｋ４（上部左側）、モノクローナル抗体８Ｈ１／８Ｋ３（上部右側）及びモノクローナル抗体１８Ｈ１／１８Ｋ２（下部左側）を用いた対称性ジメチルアルギニンの少量添加回収率の実験グラフである。
図１７は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２６４９４（下部右側）、モノクローナル抗体１Ｈ２／１Ｋ４（上部左側）、モノクローナル抗体３Ｈ１／３Ｋ３（上部右側）、モノクローナル抗体５Ｈ１／５Ｋ１（下部左側）を用いた対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンの少量添加回収率の実験グラフである。
図１８は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２１３４２（下部右側）、モノクローナル抗体１Ｈ４／１Ｋ４（上部左側）、モノクローナル抗体８Ｈ１／８Ｋ３（上部右側）及びモノクローナル抗体１８Ｈ１／１８Ｋ２（下部左側）を用いた対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンの少量添加回収率の実験グラフである。
図１９は本開示の実施例に係るモノクローナル抗体３Ｈ１／３Ｋ３（左側）及びモノクローナル抗体８Ｈ１／８Ｋ３（右側）を用いたＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチドの少量添加回収率の実験グラフである。
図２０は本開示の実施例に係るウサギポリクローナル抗体＃２７４１０を用いたＳＤＭＡ及び対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンの少量添加回収率の実験グラフである。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は説明された特定の実施例に限定されないことは自明であり、変更され得ることを理解すべきである。また、本明細書で用いられた用語は、単に特定の実施例を説明するためのものであり、限定する意図はないことを理解すべきであり、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定される。
数値の範囲が提供される場合、それぞれの中間値は、該範囲の上限及び下限とその他明示された、または中間値の間であり、文脈上特記されない限り、下限単位の１０分の１までは本発明に含まれ得ると理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれることがあり、また本発明に含まれ、言及された範囲で具体的に排除した限定を受ける。明示された範囲が限定のうち一方または両方を含む場合、含まれた限定のうち一方または両方を排除した範囲も本発明に含まれる。
明確性のために、別途実施例の文脈で説明された本発明の特定の特徴は、単一の実施例の中で組み合わせて提供され得ると理解される。反対に、簡潔性のために、単一の実施例の文脈で説明された本発明の多様な特徴は、個々または任意の適切な下位の組み合わせで提供されることがある。本発明に属する実施例のすべての組み合わせは、本発明によって特定するように含まれ、それぞれのすべての組み合わせが個別的かつ明示的に開示されるように本明細書に開示され、該組み合わせは、例えば以下のような安定した化合物（すなわち、生物学的活性に対して調製、分離、特性化及びテストできる化合物）であると包括される。また、多様な実施例のすべての下位の組み合わせ及びその要素（例えば、該変数を説明する実施例に羅列された化学基の要素）も本発明によって具体的に含まれ、それぞれのすべての下位要素のように開示され、該組み合わせは、本明細書に個別的かつ明示的に開示される。
別途定義されない限り、本明細書で用いられたすべての技術及び化学用語は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたのと類似もしくは等価な任意の方法及び材料が本発明の実施または試験に用いられてもよいが、望ましい方法及び材料がここで説明される。本明細書に言及されたすべての刊行物は、その刊行物が引用された方法及び／または資料を開示して説明するために参照として本明細書に援用される。
本明細書及び添付の請求の範囲で用いられたように、単数の形態でも特記されない限り、複数の指示対象を含む。請求の範囲は任意の選択的要素を排除するように作成され得る。このように、該陳述は、請求の範囲のうち構成要素の引用または「否定的」限定の使用と関連して「のみ」、「単に」等の排他的用語の使用に対する先行根拠として用いることを意図する。
明確性のために、個別的な実施例の文脈で説明された本発明の特定の特徴が単一の実施例の中で組み合わせて提供され得ると理解される。反対に、簡潔性のために、単一の実施例の文脈で説明された本発明の多様な特徴は、個々または任意の適切な下位の組み合わせで提供されることがある。
ここで記載された刊行物は、本願の出願日前の開示のために提供されたものに過ぎない。本明細書内のいかなる内容も本発明が先行発明によって該公開よりも先行しないことの承認と解釈すべきではない。また、提供された発行日は、実際の発行日と異なる場合があるので、別途確認する必要があるだろう。
本開示の特定実施例の説明をより詳細に行う前に、いくつかの用語を定義する。
（定義）
分析物
測定する化合物または組成物、関心物質を指す。分析物は特異的結合対（ｓｂｐ）の構成要素が１価または多価の、一般的に抗原またはハプテンのリガンドでもよく、１以上の共通エピトープまたは決定因子部位を共有する単一化合物または複数の化合物である。
分析物を含有する疑いがある試料
合理的に分析物を含有する疑いがあるすべての試料は、本開示の方法によって分析し得る。該試料にはヒト、動物または人工試料を含み得る。試料は、アッセイを阻害しない、適切な培地で調製し得る。典型的に試料は限定されないが、尿、全血、血清、血漿、脳脊髄液または唾液等の水溶液または天然流体である。場合によっては、試料は血清である。
分析物の量測定
定量的、反定量的及び定性的方法及び分析物を決定する他のすべての方法は、分析物の量を測定する方法としてみなされる。例えば、分析物を含有する疑いがある試料内で単に分析物の有無のみを検出する方法も本発明の範囲に含まれるとみなされる。
本開示の範囲内で考慮される「分析物の量測定」という語句に対する同義語は限定されないが、分析物の検出、測定または決定；分析物の存在を検出、測定または決定する段階；分析物の量を検出もしくは決定する段階；及び分析物の濃度を検出、測定または決定する段階を含む。
特定結合対の構成要素
特異的な結合対（ｓｂｐ構成要素）の構成要素は、２つの異なる分子のうちの１個であり、表面または空洞に特定的に結合して他の分子の特定空間及び極性組織と相補的であると定義される領域を有する。特異的結合対の構成要素は、リガンド及び受容体（アンチリガンド）、ｓｂｐ構成要素及びｓｂｐパートナー等と称される。これらは一般的に抗原－抗体等の免疫学的対の構成要素である。
リガンド
受容体が自然に存在もしくは調製し得るすべての有機化合物を指す。例えば、本開示のある文脈において、分析物はリガンドであり、本開示はリガンドの分析物の量または濃度を決定するための方法を提供する。
受容体
受容体は、分子の特定空間及び極性組織を認識し得るすべての化合物または構成である。分子の該組織化された領域をエピトープまたは決定子部位という。例示的な自然発生受容体には抗体及び酵素が含まれる。
エピトープ
「エピトープ」は、免疫反応を誘導し得て、該反応によって産生された特定の抗体と結合し得る抗原表面上の分子領域であって、決定基、抗原決定基ともいう。ハプテン（対称性ジメチルアルギニン等）と関連して、ハプテンを免疫原性担体に結合させることで非－抗原性ハプテン分子に対する抗体が産生し得る。その後、ハプテンにより規定された「エピトープ」を認識する抗体が産生される。
連結基
連結基は、２個以上の下位構造を連結する構造の一部である。連結基は、下位構造間で伸びる原子の中断されていない１以上の鎖を有している。連結基の原子自体は、化学結合で連結される。連結基の原子数は、水素以外の原子をカウントして決定される。
結合体（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
結合体は、連結基を通じて一緒に結合されて単一構造を形成する２個以上の下位構造から構成された分子である。結合は、連結基を通じてサブユニットを連結してなされ得る。本開示の文脈において、結合体はハプテン、ｓｂｐ構成要素または分析物類似体に結合したグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）酵素、例えばＧ６ＰＤＨ突然変異酵素が用いられる結合体を含み得る（例えば、米国特許第６，４５５，２８８号、第６，０９０，５６７号及び第６，０３３，８９０号に記載された組換え体Ｇ６ＰＤＨ）。本開示の文脈において、Ｇ６ＰＤＨはＧ６ＰＤＨ酵素等の酵素、またはＧ６ＰＤＨ標識等の標識と呼ばれることがある。場合によっては、結合体は限定されないが、Ｇ６ＰＤＨ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素を含む標識（例えば、標識タンパク質）またはハプテン、ｓｂｐ構成要素または分析物類似体に結合した蛍光、発光または比色等の化学的標識を含み得る。
結合
結合は、２つのサブユニットが一緒に連結されて結合体を形成するすべての過程である。結合過程は、例えば本明細書に記載されたように、任意の数の段階で構成することができる。
ハプテン
ハプテンは、相応する抗体に特異的に結合し得るが、一般的にそれ自体が抗体調製のための免疫原として作用しない。ハプテンを認識する抗体は、免疫原性担体に連結されたハプテンから構成された化合物に対して調製し得る。
対称性ジメチル化アルギニン分析物
「対称性ジメチル化アルギニン分析物」は、対称性ジメチルアルギニンに共通する抗体－結合エピトープを有する分析物を指す。対称性ジメチル化アルギニン分析物に含まれる分析物には、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン等の、対称性Ｎα－アシル化－ジメチルアルギニン及びＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチド等のＳＤＭＡ－ペプチド誘導体が含まれる。
誘導体
用語「誘導体」は、１以上の化学反応によって親化合物から作られた化学的化合物または分子を指す。
類似体
「類似体」という用語は、他の化合物と類似する構造を有するが、特定の成分においては異なる化合物を指す。これは１以上の原子、官能基または下位構造で異なる場合があり、他の原子、グループまたは下位構造で置換される。
標識（Ｌａｂｅｌ）
「標識」、「検出器分子」、「リポーター」または「検出可能なマーカー」は、検出可能なシグナルを生成、もしくは生成するように誘導し得る任意の分子である。標識は分析物、免疫原、抗体または受容体等の他の分子、または、特にハプテンまたは抗体等の受容体に結合し得る分子にコンジュゲートすることができる。標識は、連結基によって直接または間接的に結合し得る。標識の非制限的例としては、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ）、酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ）、Ｇ６ＰＤＨ（例えば米国特許番号６，４５５，２８８、６，０９０，５６７、及び８９０３に記載された組換えＧ６ＰＤＨである突然変異Ｇ６ＰＤＨ）、酵素フラグメント、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、蛍光団（例えばローダミン、フルオレセインイソチオシアナートまたはＦＩＴＣ、またはＤｙｌｉｇｈｔ６４９）、染料、化学発光剤及び発光剤（例えば、ジオキセタン、ルシフェリン）、または増感剤を含む。
免疫原
用語「免疫原」は、有機体において免疫反応を誘導、産生または作製し得る物質を指す。
免疫原性担体
本明細書に用いられた「免疫原性担体」は、１以上の位置でハプテンと結合し得る一般的なタンパク質であって、該ハプテンと特異的に結合し得る抗体の産生を可能にする免疫原性物質である。免疫原性担体物質の例は、タンパク質、糖タンパク質、複合ポリアミノ－多糖類、粒子、及び外来と認識されて宿主からの免疫学的反応を誘導する核酸を含むが、これに限定されない。ポリアミノ－多糖類は、該調製に対して公知の任意の通常の手段を用いて多糖類から調製し得る。
タンパク質
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、任意の長さを有するアミノ酸の重合体的形態を指すため、本願では区別なく用いられる。別途具体的に示さない限り、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、遺伝的コーディングされた、もしくはコーディングされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾もしくは誘導体化アミノ酸、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチド、及び融合タンパク質を含み得る。
シグナル生成システム
「シグナル生成システム」は、分析物に対するアッセイに用いられ、１以上の構成要素を有することができ、少なくとも１個の構成要素は検出可能な標識（例えば、突然変異Ｇ６ＰＤＨ等のＧ６ＰＤＨ）である。シグナル生成システムは、試料内で分析物の存在または量と関連したシグナルを生成する。シグナル生成システムには、測定可能なシグナルを生成するのに必要なすべての試薬が含まれる。本開示の目的のために、典型的にはＧ６ＰＤＨまたは標識タンパク質（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）は、分析物と類似するｓｂｐ構成要素にコンジュゲートされる。
シグナル生成システムのその他の構成要素には、基質、改善剤、活性剤、化学発光化合物、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、シグナル生成物質の結合に必要な特異的結合物質、補酵素、酵素生成物と反応する物質、その他の酵素及び触媒等である。
シグナル生成システムは、例えば目視検査のように電磁気放射測定等の外部手段によって感知できるシグナルを提供する。場合によっては、シグナル生成システムは、発色基質及び酵素標識（例えば、突然変異Ｇ６ＰＤＨ酵素）を含み、ここで発色基質は、紫外線または可視光線領域の光を吸収する染料に酵素的にコンバートされる。
分離された
抗体と関連して用いられる場合、「分離された」とは、なんらかの自然状態から「人の手によって」改変されたことを意味する。すなわち、自然発生する場合であれば、本来の環境から改変もしくは除去されたこと、または両方である。例えば、生きている動物が自然状態で自然に存在する自然発生抗体は、「分離された」ものではないが、自然状態の共存物質から分離された同一の抗体は、本明細書で用いられる用語の通り「分離された」ものである。抗体は、天然発生組成物でない免疫アッセイ試薬等の組成物で発生することがあり、その中には本願で用いられる用語の意味内で分離された抗体が残っている。
交差－反応性
「交差－反応性」は、抗体の誘導に用いられなかった抗原と抗体の反応を意味する。「交差－反応性」は、標的分析物の公知の希釈液を用いて標準曲線を設定することで定量的免疫アッセイで決定され得る。その後、標準曲線を用いて類似する条件下定量された試料内で多様な既知量で存在する干渉物質の見かけ濃度を計算する。交差－反応性は見かけ濃度を実際濃度で割った値に１００をかけた値である。
キャリブレーション及び対照物質
「キャリブレーション及び対照物質」という語句は、既知量の分析物を含むすべての標準または参照物質を示す。分析物と該キャリブレーション物質を含有する疑いがある試料を類似する条件で定量する。分析物質の濃度は、未知の試料または既知濃度の分析物質を含む試料に対して得られた結果と標準物質に対して得られた結果を比較して計算する。これは一般的にキャリブレーション曲線を構成もしくは生成することで行われる。
感度
検出限界という意味、すなわち分析物がない時に得られるシグナルと区別できるシグナルを提供する最も少ない量の分析物という意味で用いられる。
少量添加回収率（Ｓｐｉｋｅ－Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）
「少量添加回収率」は、試料混合物に添加された（少量添加された）分析物の既知量と比較して試料混合物内の分析物（回収）の量を測定するアッセイを示す。分析物の量の測定は、濃度（ｎｇ／ｍＬ）または百分率（％）で表わされてもよい。
酵素活性の実質的変化
酵素が分析物に対するアッセイで標識として用いられる場合、分析物を検出するのに十分な酵素の活性変化。典型的には、酵素の活性は１０～１００％、例えば２０～９９％、または３０～９５％減少する。
阻害抗体
酵素に存在するエピトープと結合して酵素または酵素－リガンド結合体の活性を阻害し得る抗体。該抗体は、リガンドに結合して酵素－リガンド結合体の酵素活性を阻害し得る抗リガンド抗体と区別される。
調節
アッセイ実験において「調節」は、分析物－抗体結合部位のために競合する分析物を含有する疑いがある試料内で酵素及び分析物等の標識に結合したハプテンまたは分析物を指し、形成された酵素生成物の量を調節する（図１０参照）。
最大阻害
「最大阻害」は、過剰の抗体がアッセイに添加される場合、酵素に存在するエピトープ及び分析物の不在下で得られたシグナルに結合する場合に酵素、または酵素－リガンド結合体の活性を阻害し得る抗体を指す。
補助物質
多様な補助物質が本開示に係るアッセイで多く用いられる。例えば、緩衝液は、一般的にアッセイ培地に存在するだけでなく、アッセイ培地及びアッセイ成分に対する安定化剤も存在する。多くの場合、該添加剤に加え、アルブミンまたは界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合増強剤、例えばポリアルキレングリコール等の追加のタンパク質を含み得る。
（化合物、結合体及びその合成）
均一の酵素免疫アッセイは、酵素活性がｓｂｐパートナーの結合によって強く調節し得る酵素－ｓｂｐ構成要素結合体の可溶性に依存する。本開示は、均一免疫アッセイに有用なアッセイを行う酵素－ｓｂｐ構成要素結合体及び抗体を提供する。
特定の実施例において、タンパク質免疫原が合成されて対称性ジメチル化アルギニン分析物等の化合物に特異的な抗体を調製するのに用いられる。抗体は、分析物を含有する疑いがある試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物を検出する方法に用いられる標識結合体が調製されて前記方法に用いられてもよい。前述した１以上の対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在に対する試料の効果的なスクリーニングが実現され得る。
免疫原及び標識結合体は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子を通じてタンパク質または標識に連結された対称性ジメチルアルギニンの誘導体を含み得る。場合によっては、結合体は、本願において各々タンパク質結合体または標識結合体と呼ばれることがある。
本開示の化合物は、本開示に係る抗体を産生するのに有用な化合物を含む。また、本開示の化合物は、本明細書に記載された免疫アッセイに有用な結合体を含む。特定の実施例において、化合物は、下記化学式１の化合物を含む：

Figure 2022528465000003
式中：
Ｒ１は－Ｙ－Ｚ；
Ｙは連結基；そして、
Ｚは水素、ＯＨ、ＳＨ、Ｓ－アシル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、エポキシ、マレイミジル、ハロアセトアミド、カルボキシル、活性化されたカルボキシル、免疫原性担体、タンパク質及び標識から選択される。
一部の実施例において、Ｚはタンパク質である。例えば、タンパク質は、免疫原性担体である。免疫原性担体は、対称性ジメチルアルギニンハプテンにコンジュゲートされ得、これによりハプテンと特異的に結合し得る抗体の産生を可能にする。例えば、免疫原性担体は、ヘモシアニン、グロブリン、アルブミン及び多糖類から選択され得る。場合によっては、免疫原性担体は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。場合によっては、免疫原性担体は、スカシ貝ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）である。特定の実施例において、免疫原性担体は、１以上の官能基を含むように修飾されてもよい。修飾された免疫原性担体上の官能基は、化学式１の化合物で連結基に対する免疫原性担体の結合を容易にする反応性官能基である。
一部の実施例において、対称性ジメチルアルギニンハプテンは、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子上でアルキル化される（図１）。このように場合によっては、連結基は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子に結合した（すなわち、Ｒ１－窒素原子に結合した）アルキルまたは置換されたアルキル基を含む。特定の実施例において、該ハプテンは、対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的な抗体を産生するのに用いられる。
特定の実施例において、Ｚは標識である。標識は、検出可能なシグナルを生成、もしくは生成するように誘導され得る分子である。例えば、標識は、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼから選択されたような酵素である。一部の実施例において、標識は、グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である酵素である。場合によっては、Ｇ６ＰＤＨは、野生型形態に比べて１以上のアミノ酸残基置換を含む突然変異Ｇ６ＰＤＨである。例えば、突然変異Ｇ６ＰＤＨは、システイン置換、例えばＧ６ＰＤＨ酵素の各サブユニットでシステイン置換を含み得る。場合によっては、連結基がシステイン残基でＧ６ＰＤＨ酵素に結合し得る。特定の実施例において、標識は、１以上の官能基を含むように修飾されてもよい。修飾された標識上の官能基は、化学式１の化合物で連結基に対する標識の結合を容易にする反応性官能基である。
一部の実施例において、対称性ジメチルアルギニン誘導体は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子上でアシル化される（図１）。このように、場合によっては、連結基は対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子に結合した（すなわち、Ｒ１－窒素原子に結合した）アシルまたは置換されたアシル基を含む。特定の実施例において、該誘導体は、本明細書に記載された免疫アッセイに有用な結合体を生成するのに用いられる。
特定の実施例において、Ｚはタンパク質である。タンパク質は、例えば２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上等の任意の数の、ジペプチド、トリペプチド等のアミノ酸残基を含み得る。特定の実施例において、タンパク質は、１以上の官能基を含むように修飾されてもよい。修飾されたタンパク質上の官能基は、化学式１の化合物で連結基に対するタンパク質の結合を容易にする反応性官能基である。場合によっては、タンパク質はアシル化される。場合によっては、タンパク質がアルキル化される。
連結基は、約１ないし２５個の原子（水素原子は除く）を含んでもよく、２ないし１５個の原子（水素原子は除く）の鎖を含んでもよく、各々は炭素、酸素、硫黄、窒素、ハロゲン及びリンから独立して選択される。一部の実施例において、連結基は、１ないし１５個の炭素原子及び／または０ないし６個のヘテロ原子を含む。連結基の例は限定されないが、－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－ＮＨＣ（Ｏ）－、－Ｃ（０）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（０）（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎＮＨｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－、及び－（ＣＨ２）ｎ（ヘテロシクリル）Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（０）－であり、ｎは１ないし１０の整数であり、これらの酸塩を含む。特定の実施例において、連結基は、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－、例えば、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）－である。特定の実施例において、連結基は、－（ＣＨ２）ｎ（ヘテロシクリル）Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－、例えば－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）（２,５－ジオキソピロリジン－１－イル）Ｓ（ＣＨ２）Ｃ（Ｏ）－である。
連結基内のヘテロ原子の数は０ないし６、例えば約１ないし５、または２ないし５、または３ないし５の範囲でもよい。連結剤は、脂肪族または芳香族でもよい。ヘテロ原子が存在する場合、酸素は炭素、硫黄、窒素またはリンに結合されたヨウ素またはオキシとして存在してもよく；窒素は炭素、酸素、硫黄またはリンに結合されたニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在してもよく；硫黄は酸素と類似し得る。リンはホスホネート及びホスフェートモノまたはジエステル等の炭素、硫黄、酸素または窒素に結合し得る。連結基とコンジュゲートされる分子間に共有結合を形成する一般的な機能は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、ウレア、チオウレア、グアニジン、アゾ、チオエーテル及びカルボキシレート、スルフォネート、及びホスフェートエステル、アミド及びチオエステルである。
特定の実施例において、連結基が窒素及び硫黄類似体を含む非オキソカルボニル基を有する場合、ホスフェート基、アミノ基、ハロまたはトシルアルキル等のアルキル化剤、オキシ（ヒドロキシルまたは硫黄類似体、メルカプト）オキソカルボニル（例えば、アルデヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例えばビニルスルホン、またはα－、β－不飽和エステル、これら官能基はアミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロモアセチルに連結し得る。アミンとカルボキシル酸、またはその窒素誘導体、またはリン酸が連結される場合、アミド、アミジン及びホスホロアミドが形成され得る。メルカプタンと活性化されたオレフィンが連結される場合、チオエーテルが形成され得る。メルカプタンとアルキル化剤が連結された場合、チオエーテルが形成され得る。アルデヒドとアミンが還元条件で連結される場合、アルキルアミンが形成され得る。カルボキシル酸またはリン酸塩とアルコールが連結される場合、エステルが形成され得る。多様な連結基が、例えばＣａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９７０）２４５：３０５９に記載されている。
対称性ジメチルアルギニンに対するアッセイ法を開発するため、対称ジメチル化アルギニン分析物の化学構造が用いられる。例えば、非対称性ジメチルアルギニンは、グアニジン基の末端窒素原子のうち１個に追加された２個のメチル基を有する（図２参照）。モノメチルアルギニンは、末端窒素原子のうち１個に単一メチル基を有する（図２）。対称性ジメチルアルギニンは、２個のメチル基を有し、１個のメチル基はグアニジン基の末端窒素原子の各々に追加される（図１）。化学構造の特定対称メチル化は免疫原を調整し、それにより抗体を産生するために維持される。
本開示は、対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子の修飾による対称性ジメチルアルギニンハプテン及び免疫原の設計を提供する。本発明のハプテンＳＤＭＡ－Ｍ及びＳＤＭＡ－ＳＢＡＰが図４に示されている。対称性ジメチルアルギニンのアミン窒素における連結基の配置は、分析物が対称ジメチル化グアニジン基を共有するため、対称性ジメチルアルギニン分析物と特異的に反応する可能性がある抗体を提供する。したがって、本開示は、本願に記載された多様な類型の免疫アッセイに有用な対称性ジメチルアルギニン誘導体（すなわち、対称ジメチル化アルギニン分析物）及び免疫原を提供する（例えば、図１０参照）。
本開示に係る抗体及び結合体を生成するのに有用な化合物は、下記に記載された一般的な合成方法によって合成し得る。化学式１の化合物は、従来の方法によって調製し得る。下記の反応式は、単に方法の例を示すためのものであり、本開示を限定することを意味しない。
ａ）ハプテン
対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子に対するマレイミド官能基の結合は、反応式１に示した４－マレイミド－１－ブタナール（４）の使用を通じて達成されてもよく、その調製は実施例１に記載されている。対称性ジメチルアルギニンの窒素原子に対するアルキル化反応のために、ＡｃＯＨ及びＮａＢＨ３ＣＮを、ＭｅＯＨの４－マレイミド－１－ブタナール（４）及び対称性ジメチルアルギニンの溶液に添加し得る。生成された混合物を室温で３時間攪拌し得る。反応を水で冷却し、逆相クロマトグラフィーで精製してハプテンＳＤＭＡ－Ｍを得ることができる（図４）。
対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子に対する連結基の結合は、反応式２に示したＮ－ｔｅｒｔ－（ブトキシカルボニル）－β－アラニン（６）の使用を通じて達成されてもよく、Ｎ－ｔｅｒｔ－（ブトキシカルボニル）－β－アラニン（６）とジメチルアルギニンのアシル化も実施例２に記載されている。実施例２に記載された脱保護は、ＤＭＦのＮ－スクシンイミジルブロモアセテート（９）及びＤＩＰＥＡと反応してさらに作製される化合物（８）を提供し得る。溶媒は真空状態で除去し得る。粗生成物をＭｅＣＮ及び水に溶解させた後、逆相クロマトグラフィーで精製して生成物ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰを得ることができる（図４）。生成された生成物（ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ）は、チオール含有タンパク質に連結し得る。
連結基からｔ－Ｂｏｃ保護基を除去すると、化合物（８）を産生し得る。適切な保護基は、技術文献の特許及び記事で詳しく説明されている。例えば、「ＰｒｉｎＣｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ（１９８４））参照。該保護基の例は、非制限的な例であって、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アセトアミノメチル（Ａｃｍ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、１－アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、アルファ－ジメチル－３，５－ジメトキシベンザイルオキシカルボニル、ｏ－ニトロフェニルスルフェニル、２－シアノ－１，１－ジメチルエトキシカルボニル、ブロモベンジルオキシ、カルバミル、ホルミル等である。選択された特定の保護基は、遂行される反応の性質及び温度、ｐＨ等の反応条件によって異なり得る。
ｂ）免疫原
マレイミド機能化されたハプテン（例えば、ＳＤＭＡ－Ｍ）は、タンパク質にコンジュゲートし得る。Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用いたイプシロン－窒素のアシル化によるタンパク質リシン残基の活性化、次いでヒドロキシルアミンを用いたＳ－アセチル基の後続加水分解は、親核性スルフヒドリル基を生成する。スルフヒドリル活性化タンパク質とマレイミド誘導体化されたハプテンの結合は、マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応を通じて行われる。適当なタンパク質（免疫原性担体）は、スカシ貝ヘモシアニン、牛チログロブリン及びオボアルブミンを含むが、これに限定されない。
化合物ＳＤＭＡ－Ｍは、チオール含有タンパク質のチオール修飾のためのマレイミド機能を含む。対称性ジメチルアルギニンのα－アミノ基の窒素原子に連結基がある対称性ジメチルアルギニン免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨの合成は、図５に示されたように、ＳＤＭＡ－Ｍの合成から始まり、その作製は実施例１に開示される。Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテートとスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）からのアミンの反応は、保護されたスルフヒドリルを生成し得て、これは後続的にＳＤＭＡ－Ｍとの反応のためにヒドロキシルアミンによって脱保護し得る。リン酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ＝８．０）緩衝液でチオール修飾されたＫＬＨとＳＤＭＡ－Ｍの反応は、図８に示されたように、所望の免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨを生成し得る。免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨは、緩衝溶液があるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラム等のクロマトグラフィーで精製され得る。免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨの濃度は限定されないが、Ｐｉｅｒｃｅ（商品商標）Ｒａｐｉｄ Ｇｏｌｄ ＢＣＡタンパク質アッセイキット等のタンパク質アッセイを用いて測定され得る。免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨは、抗体産生のためのウサギの免疫化に使用され得る。
ｃ）酵素結合体
ブロモアセトアミド機能があるハプテンＳＤＭＡ－ＳＢＡＰは、チオール基を含むタンパク質との反応に使用され得る。Ｇ６ＰＤＨを含むシステインに対するＳＤＭＡ－ＳＢＡＰの結合は、図７に示されており、その調製は実施例２に記載されている。
ハプテンＳＤＭＡ－Ｍを用いて免疫原を調製し得る。ハプテンＳＤＭＡ－ＳＢＡＰを用いてＧ６ＰＤＨ結合体を調製し得る。免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨは、抗体誘導に使用され得る。特定の実施例において、酵素基盤アッセイ形式において、産生された抗体は、対称性ジメチル化アルギニン分析物と一緒に良好な調節を示し得る。一部の実施例において、免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨを用いて抗体を成功的に産生し得て、これは該抗体が以下に記載された酵素－基盤対称性ジメチルアルギニン免疫アッセイの潜在的用途を有する表示を提供し得る。
抗体及びその調製
本開示の実施態様は、対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的に結合する抗体を含む。場合によっては、その抗体は、非対称性ジメチルアルギニン、Ｌ－アルギニン及びＮ－メチルアルギニンのうち１以上に特異的に結合する。一部の実施例において、本開示の抗体は、本明細書の別途記載されたいずれかの化学式１の化合物をはじめとする本開示の任意の化合物に特異的に結合する。
用語「抗体」（「免疫グロブリン」と区別なく用いられる）は、抗体が抗体または任意のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等）の抗体、または免疫グロブリンであるポリクローナル（例えばウサギポリクローナル）及びモノクローナル抗体製剤、全抗体（例えば、四量体から構成された抗体は、次に重鎖及び軽鎖ポリペプチドの２個の二量体で構成される）；単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；限定されないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ´）２、（ＳＣＦＶ´）２を含む、化合物に対する特異的結合を維持する抗体のフラグメント（例えば、全または単鎖抗体のフラグメント）、及び二重体；キメラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体；及び抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合の部分を含む融合タンパク質を包括する。一部の実施例において、抗体はＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２またはＦａｂ´から選択される。抗体は、特異的結合対の構成要素、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対の構成要素）等の他の部分にさらにコンジュゲートされてもよい。
免疫グロブリンポリペプチドは、カッパ及びラムダ軽鎖及びアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖、または他種の等価物を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（通常約２５ｋＤａまたは約２１４個のアミノ酸）は、ＮＦ２－末端に約１１０個のアミノ酸の可変領域及びＣＯＯＨ－末端にカッパまたはラムダ不変領域を含む。全長免疫グロブリン「重鎖」（約１５０ｋＤａまたは約４４６個のアミノ酸）は、類似して可変領域（約１１６個のアミノ酸）及び前述した重鎖不変領域のうち１個、例えばガンマ（約３３０個のアミノ酸）を含む。
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３個の超可変領域が中断された「フレームワーク」領域（ＦＲ）で構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が定義されている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,」Ｅ．Ｒａｂａｔ ｅｔ ａｌ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,（１９９１及びＬｅｆｒａｎＣ ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ，国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（商標登録）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００５，３３，Ｄ５９３－Ｄ５９７））。ＩＭＧＴシステムがどのように公式化され、他のシステムとどのように比較されるかを含むＩＭＧＴシステムに対する詳しい説明は、ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／ＩＭＧＴｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓＴａｂｌｅ．ｈｔｍｌのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにて提供される。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で相対的に保存される。構成軽鎖及び重鎖の結合されたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲの位置を指定してアラインする役割をする。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに対する結合に関与する。本開示によって提供されるすべてのＣＤＲ及びフレームワークは、別途表示されない限り、前記ＩＭＧＴによって定義される。
したがって、「抗体」は、例えば免疫グロブリン遺伝子、または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって遺伝的にエンコードし得る１以上のポリペプチドを有するタンパク質を含む。認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー不変領域遺伝子だけでなく、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、これは次に免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを各々定義する。
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むものとして知られている。各四量体は、２個の同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は１個の「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１個の「重鎖」（約５０－７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ－末端は、抗原認識に主に関与する約１００ないし１１０個、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、各々これらの軽鎖及び重鎖を指す。
抗体は、完全なグロブリンだけでなく、遺伝的にコーディングされたり、多様なペプチダーゼで消化によって生成され得る、よく特徴付けられた多数のフラグメントを含む。したがって、例えば、ペブシンは、ヒンジ領域の二硫化結合下で抗体を分解してＦ（ａｂ）´２、自主的に二硫化結合によってＶＨ－ＣＨＩに連結された軽鎖であるＦａｂの二量体を生成する。Ｆ（ａｂ）´２は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域で二硫化結合を破壊することで（Ｆａｂ´）２二量体をＦａｂ´単量体にコンバートさせてもよい。Ｆａｂ´単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントに対するより詳細な説明は、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）参照）。多様な抗体フラグメントが完全な抗体の消化の観点で定義されるが、通常の知識を有する者であれば、該Ｆａｂ´フラグメントが化学的または組換えＤＮＡ方法論を利用して新たに合成され得ることが理解される。したがって、本明細書に用いられた用語である抗体は限定されないが、Ｆａｂ´２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ及び二重体を含む組換えＤＮＡ方法論を利用して新たに合成されたり、全抗体の修飾によって作製された抗体フラグメントを含む。特定の実施例において、本開示の抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦａｂ´から選択される。
抗体について言及する際、「特異的に結合」、「特異的な」、「免疫反応性」及び「免疫反応性」、及び「抗原結合特異性」という語句は、抗原の不均一集団の存在下で抗原の存在を決定するために、抗原またはそのフラグメントに対して非常に優先的な抗原との結合反応を意味する。したがって、指定された免疫アッセイ条件下で、特異的な抗体は、特定抗原に結合して試料に存在する他の抗原には相当量結合しない。該条件下において、抗原に対する特異的結合は、特定抗原に対する特異性のために選択された抗体を必要とし得る。例えば、抗体は、化合物に特異的に結合することができ、試料に存在する他の分子に比較するほどの結合を示さない。
一部の実施例において、本開示の抗体は、親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍ単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）で化合物に結合もしくは会合する場合、化合物に、例えば１０５Ｍ－１以上で「特異的に結合する」。特定の実施例において、抗体は、約１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、１０１２Ｍ－１、または１０１３Ｍ－１以上であるＫａと一緒に化合物に結合する。「高親和性」結合は、少なくとも１０７Ｍ－１以上、少なくとも１０８Ｍ－１以上、少なくとも１０９Ｍ－１以上、少なくとも１０１０Ｍ－１以上、少なくとも１０１１Ｍ－１以上、少なくとも１０１２Ｍ－１以上、少なくとも１０１３Ｍ－１以上のＫａと一緒に結合することを意味する。もしくは、親和度は、Ｍ単位（例えば、１０－５Ｍないし１０－１３Ｍ以下）との特定の結合相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）で定義されてもよい。一部の実施例において、特異的結合は、抗体が約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、または約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ以下のＫＤで化合物に結合することを意味する。化合物に対する抗体の結合親和性は、従来技術、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素－結合免疫吸着体アッセイ）、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器、製造業者が説明した一般の手順を使用）を用いることで、放射線免疫アッセイ等によって容易に決定され得る。
化合物に対する結合のために、第１抗体が第２抗体と「競合」するか否かは当業界で公知の競合的結合アッセイを用いて容易に決定され得る。競合抗体は、例えば抗体競合アッセイを通じて確認してもよい。例えば、第１抗体試料は、固体支持体に結合し得る。その次に、該第１抗体と競合し得る疑いがある第２抗体の試料が追加される。２つの抗体のうち１個が標識される。標識抗体と非標識抗体が化合物の分離された個別部位に結合する場合、標識抗体は疑いがある競合抗体の存在に関係なく、同一の水準で結合されるであろう。しかし、相互作用部位が同一もしくは重複する場合、非標識抗体が競合して化合物に結合標識抗体の量が低くなるだろう。非標識抗体が過度に存在すると、標識抗体が結合する場合はほぼない。
本開示の目的のために、競合抗体は、化合物に対する抗体の結合を約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上減少するものである。該競合アッセイを行うための手順の細部事項は当業界でよく知られており、例えば、文献Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，５６７－５６９，１９８８，ＩＳＢＮ０－８７９６９－３１４－２に記載されている。該アッセイは、精製された抗体を用いて定量的に作製し得る。標準曲線は、１個の抗体自体を滴定して設定され得るが、すなわち、同一の抗体が標識とコンペティターの両方に用いられる。プレートに対する標識抗体の結合を阻害する非標識競合抗体のキャパシティーが滴定されてもよい。結果をプロットし、所望する結合阻害の程度を達成するのに必要な濃度を比較してもよい。
一部の実施例によれば、本開示の抗体は、化学式１の化合物に対する結合に対して以下を含む抗体と競合する：
アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１
アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＳＮＶＥＮＡ（配列番号８）を含むＶＬＣＤＲ３
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド。
特定の実施例において、該抗体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８に提示された６個のＣＤＲを含む。
一部の実施例によれば、抗体は：配列番号１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び配列番号５に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む。
一部の実施例によれば、本開示の抗体は、化学式１の化合物に対する結合に対して以下を含む抗体と競合する：
アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１
アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＴＮＶＥＮＡ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ３
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド。
特定の実施例において、該抗体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、及び配列番号１０に提示された６個のＣＤＲを含む。
一部の実施例によれば、抗体は：配列番号１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び配列番号９に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む。
一部の実施例によれば、本開示の抗体は、化学式１の化合物に対する結合に対して以下を含む抗体と競合する：
アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１
アミノ酸配列ＣＩＧＴＤＴ（配列番号１３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＲＳＳＳＴＧＹＹＮＬ（配列番号１４）を含むＶＨＣＤＲ３
を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
アミノ酸配列ＱＳＩＲＳＹ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号１７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＨＤＹＹＴＦＴＤＮＤ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ３
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド。
特定の実施例において、該抗体は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８に提示された６個のＣＤＲを含む。
一部の実施例によれば、抗体は：配列番号１１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び配列番号１５に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む。
一部の実施例によれば、本開示の抗体は、化学式１の化合物に対する結合に対して以下を含む抗体と競合する：
アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１
アミノ酸配列ＣＩＧＶＧＳＲＧＳ（配列番号２０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＲＳＳＴＴＧＹＹＩＬ（配列番号２１）を含むＶＨＣＤＲ３
を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
アミノ酸配列ＥＳＩＹＳＹ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＫＡＳ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＱＮＹＹＴＦＴＥＮＤ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド。
特定の実施例において、該抗体は、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に提示された６個のＣＤＲを含む。
一部の実施例によれば、抗体は：配列番号１９に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び配列番号２２に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む。
一部の実施例によれば、本開示の抗体は、化学式１の化合物に対する結合に対して以下を含む抗体と競合する：
アミノ酸配列ＧＦＳＦＷＲ（配列番号２７）を含むＶＨＣＤＲ１
アミノ酸配列ＣＩＤＧＧＮＴＮＲ（配列番号２８）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＲＶＲＬＧＮＮＤＹＩＤＬ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ３
を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＱＱＧＹＮＷＤＬＤＧＡ（配列番号３１）を含むＶＬＣＤＲ３
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド。
特定の実施例において、該抗体は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号６、配列番号７、及び配列番号３１に提示された６個のＣＤＲを含む。
一部の実施例によれば、抗体は：配列番号２６に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び配列番号３０に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む。
可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、及びＣＤＲのアミノ酸配列は、下記表１に提供される。
表１－ＶＨ、ＶＬ、及びＣＤＲアミノ酸配列

Figure 2022528465000004
Figure 2022528465000005
Figure 2022528465000006
特定の実施例において、本開示の抗体は、対称性ジメチルアルギニンの代謝産物にさらに特異的に結合する。関心代謝産物として限定されないが、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）が含まれる。一部の実施例によれば、本開示の抗体は、ＳＤＭＡに対するその反応性の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超または５０％超のＡｃ－ＳＤＭＡ反応性を有する。
本開示の実施形態は、核酸をさらに含む。特定の実施例において、本開示の核酸は限定されないが、表１に記載された抗体のうちいずれかのＣＤＲを含むＶＨ及び／またはＶＬを含み、本開示の任意の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を暗号化する。本開示の例示的な抗体をコーディングするヌクレオチド配列を有する核酸の例は、下記表２に提供される。
表２－ヌクレオチド配列

Figure 2022528465000007

Figure 2022528465000008
また、本開示の任意の核酸を含む発現ベクターが提供される。発現ベクターは、例えば、宿主細胞で本開示の抗体のＶＨ及び／またはＶＬを発現させるための用途を見出す。本開示の抗体のＶＨ及び／またはＶＬをコーディングする天然または合成核酸の発現は、典型的にＶＨ及び／またはＶＬをコーディングする核酸をプロモーター（構成的または誘導性である）に作動可能に連結して発現ベクターに構築物を統合することで達成される。ベクターは、原核生物、真核生物または両方で複製及び統合に適している。典型的なクローニングベクターは、ＶＨ及び／またはＶＬをコーディングする核酸の発現調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含む。ベクターは、選択的に少なくとも１個の独立的なターミネーター配列、真核生物及び原核生物の両方でカセットの複製を許容する配列、すなわちシャトルベクター、及び原核生物及び真核生物システムの両方に対する選択マーカーを含む一般発現カセットを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）を参照する。クローニングされた核酸の高水準の発現を得るために、一般的に転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構成することが一般的である。
したがって、本開示の実施形態は、細胞、例えば組換え宿主細胞をさらに含む。特定の実施例において、本開示の任意の核酸及び／または、発現ベクターを含む細胞が提供される。一部の実施例によれば、本開示の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをエンコードする第１核酸、及び抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをエンコードする第２核酸を含む細胞が提供される。特定の実施例において、第１核酸を含む第１発現ベクター、及び第２核酸を含む第２発現ベクターを含む細胞が提供される。本開示の細胞は、当業界で公知の方法、例えば、電気穿孔、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、マイクロ注入等を通じて本開示の１以上の核酸及び／または発現ベクターを宿主細胞に導入することで産生され得る。
また、本開示の抗体を作製する方法が提供される。特定の実施例において、該方法は、細胞が抗体を発現するのに適した条件下で本開示の細胞（例えば、組換え宿主細胞）を培養することを含み、ここで抗体が産生される。抗体が発現するように細胞を培養するための適当な条件は多様である。該条件は、適切な温度（例えば、３７℃等の３２℃－４２℃）及びｐＨ（例えば、ｐＨ７．４等のｐＨ７．０－７．７）で適切な百分率のＣＯ２、例えば５％等の３％ないし１０％を有する環境で、適切な培地（例えば、細胞培養プレートまたはそのウェル）、適当な容器（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２等の細胞培養培地）で細胞を培養することを含み得る。
また、化学式１に提示された新たな免疫原のうちいずれかに特異的に結合するポリクローナル抗体を調製する方法が提供される。抗体を含む免疫血清は、化学式１で提示された適切な免疫原でウサギ及びヒツジ等の動物の免疫化を含んで提示された適切な待機期間を経て免疫された動物の血液から抗血清を収得する確立された技術によって得られる。レビューは、Ｐａｒｋｅｒ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．，１９７６），Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７：１ ２４（１９７５）；Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２：７２６ ７３２（１９７６）；ａｎｄ Ｐｌａｙｆａｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．３０：２４ ３１（１９７４）にある。免疫化の手順は、当業界で確立されており、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，２０００）により編集された「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」２版、及びそれに引用された参考文献をはじめとする多数の論文及び刊行物に説明されている。必要な抗体精製の程度は、所望の応用プログラムによって異なる。様々な目的のために精製は不要である。
採取された血清は、対称性ジメチルアルギニンタンパク質結合体またはＥＬＩＳＡ形式または均一酵素免疫アッセイ形式の他の対称性ジメチルアルギニン結合体を用いて対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的に結合する抗体の存在に対してテストすることができる。該技術は、一般的に本明細書に説明された対称性ジメチル化アルギニン分析物に対するポリクローナル抗体を作製し、その有用性を評価するのに適用し得る。産生された特定の抗体は、対称性ジメチルアルギニンの検出または決定（選択的定量化を含む）のための免疫アッセイ用試薬として有用である。
モノクローナル抗体、特に化学式１の免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を調製するために、下記の手順が用いられるモノクローナル抗体は、文献Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２６５：４９５ ４９７，１９７５における従来技術によって作製し得る。モノクローナル抗体技術のレビューは、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｅｄ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９７８），Ｎａｔｕｒｅ２６６：４９５（１９７７），ＳｃｉｅｎＣｅ ２０８：６９２（１９８０）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ７３（パートＢ）：３ ４６（１９８１）にある。適切な免疫原製剤の試料をウサギまたはマウス等の動物に注入し、十分な時間をおいた後、動物を犠牲にして脾臓細胞を得た。もしくは、非免疫化動物の脾臓細胞は、試験管内で免疫原に感作し得る。所望の免疫グロブリンに対する塩基配列を暗号化する脾臓細胞染色体は、一般的に非イオン性洗剤、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で脾臓細胞を骨髄種細胞株と融合することで圧縮し得る。融合されたハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）を含む産生された細胞は、ＨＡＴ－培地等の選択的培地で成長するようになり、生存する不死化細胞は、制限希釈条件を用いて該培地で成長する。細胞を適切な容器、例えばマイクロタイターウェルで成長させ、上澄液を所望の特異性を有するモノクローナル抗体に対してスクリーニングする。細胞を受容する哺乳動物宿主の腹腔内にハイブリドーマ細胞を注入し、腹水液を摂取する等、モノクローナル抗体の収率を向上させるための多様な技術が存在する。腹水液内でモノクローナル抗体の量が不充分な場合、宿主の血液から抗体を採取してもよい。もしくは、所望の抗体を産生する細胞は、中空糸細胞培養装置またはスピナーフラスコ装置で成長することができ、どちらも当業界で周知である。他のタンパク質及びその他の汚染物質からモノクローナル抗体の分離及び精製のための多様な通常の方法が存在する（前記Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ参照）。
下記手順を利用して、組換えモノクローナル抗体、特に化学式１の免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を調製し得る。単一Ｂ－細胞スクリーニング、クローニング及び発現を行った。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をウサギの全血から分離して同日付で培養し、単一Ｂ細胞を４０×９６ウェルプレートにプレーティングした。４０×９６ウェルプレートをＢ細胞培養培地で７日間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションした後、上澄液をＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＢＳＡ抗原に対する間接ＥＬＩＳＡでスクリーニングして抗原陽性ウェルを決定した。抗原－陽性ウェルは、ＲＮＡ溶解緩衝液に保存して－８０℃で保管した。ｍＲＮＡは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号６１０１２）によって選択されたＢ細胞ウェル（ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＢＳＡ抗原陽性ウェル）から分離された。ｃＤＮＡを合成して２回のＰＣＲを行ってクローニング用抗体可変領域ｃＤＮＡを調製した。ウサギＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖可変領域ｃＤＮＡを各々ウサギ重鎖及び軽鎖不変領域を有する哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。発現構成物をＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入させ、ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＢＳＡ抗原に対する間接ＥＬＩＳＡによってアッセイされた細胞培養上澄液を分析した。上澄液から抗体精製のための従来のアプローチ法によって抗体を精製した。一般的に、抗体はクロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥクロマトグラフィー、ＡＢｘクロマトグラフィー等の公知技術によって精製し得る。抗体は様々な技術のうち任意のものを用いてスクリーニングすることができ、例えば図１０に示された均一酵素免疫アッセイ形式を用いて結合阻害、曲線の大きさ及び交差反応性等の特性を考慮してスクリーニングしてもよい。
選択された陽性ウサギモノクローナル抗体に対して、ＤＮＡシーケンシングを行った。ウサギＩｇＧ重鎖配列は約１２００ｂｐであり、５´末端でシーケンシングして信頼できる全長可変配列を得ることができる。ウサギカッパ軽鎖は約７００ｂｐであり、５´方向におけるシーケンシングから信頼できる全長可変配列を得ることができる。すべての重鎖及びカッパ鎖可変領域配列が翻訳された。例示的な抗体のＶＨ及びＶＬの産生されたアミノ酸配列は、前記表１に提供される。
組成物
本開示はまた組成物を提供する。一部の実施例によれば、本開示の組成物は、本開示の任意の化合物、抗体、核酸、発現ベクター及び／または細胞を含む。
特定の実施形態において、本開示の組成物は、液体培地に存在する本開示の任意の化合物、抗体、核酸、発現ベクター及び／または細胞を含む。液体培地は水、緩衝溶液等の水性液体培地である。塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチルエチル）ピペラジン－Ｎ´－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、可溶化剤、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０等の非イオン性洗剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤等の１以上の添加剤が該組成物に存在し得る。
特定の実施例において、本開示の組成物は、本願に記載された任意の均一酵素免疫アッセイを含む本開示の任意の免疫アッセイを行う試薬として用いられる。例えば、本開示の任意の化学式１の化合物、本開示の任意の抗体、または両方を含む組成物が該免疫アッセイを行うために用いられる。一部の実現例によれば、試薬は、例えば安定性、便宜性等を増加させるために凍結乾燥された形態で提供される。１個だけ例を挙げると、本開示の化学式１の化合物のうち任意のもの、本開示の任意の抗体、または両方を含む組成物は、米国特許第５，４１３，７３２号に記載されており、その開示内容はあらゆる目的のために全体が参照として本明細書に援用される。要約すると、該球形状体は、例えば、試薬の均一溶液を形成することで調製することができ；溶液の均一な液滴測定（例えば、２ないし５０μＬ）；均一な測定液滴を無攪拌の極低温液体（例えば、液体窒素）に分配して液滴を凍結させる段階；極低温液体から凍結した粒子を収集する段階；及び凍結した粒子を凍結乾燥させて複数の凍結乾燥された試薬球体を形成する段階を含む。
免疫アッセイ
本開示の様態は、本開示の任意の化学式１の化合物及び／または本開示の任意の抗体を用いる方法をさらに含む。特定の実施例において、該化合物及び／または抗体は、培地、例えば関心生物学的試料を含む培地で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物を検出（量の決定を含む）するために用いられる。例えば、一部の実施例によれば、培地で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定する方法が提供され、該方法は培地で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料、及び本開示の任意の抗体の結合を含む。該方法は対称性ジメチル化アルギニン分析物及び抗体を含む複合体の存在または不在を決定する段階をさらに含み、ここで複合体の存在は、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在を示す。特定の実施例において、培地は本開示の任意の化学式１の化合物をさらに含む。例えば、培地は対称性ジメチルアルギニンの部分及び検出可能な標識（例えば、Ｇ６ＰＤＨ等の酵素）を有する対称性ジメチルアルギニン結合体をさらに含み得る。
少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料は、任意の関心試料である。特定の実施例において、試料は全血、血清、血漿、尿、痰、精液、唾液、眼球水晶体液、脳液、脊髄液、羊水、組織培養培地等及びこれらの希釈液を含む。
本開示は、分析物を含有する疑いがある試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在または不在を評価するための免疫アッセイ方法を提供する。本開示の免疫アッセイは、多様な形式を挙げることができる。免疫アッセイは、分離免疫アッセイ（不均一免疫アッセイとしても知られている）、または均一免疫アッセイである。また、免疫アッセイは、定性的か定量的である。本開示のアッセイは、サンドイッチ及び競合アッセイの両方を含む。免疫アッセイは、免疫沈殿を含む特定のアッセイのようにサンドイッチや競合アッセイでない他の類型のアッセイを実現してもよい。特定の実施例において、免疫アッセイは均一免疫アッセイであり、ここでアッセイ試薬及び試料は、均一アッセイ混合物を形成するために一緒に混合される。
特定の実施例において、免疫アッセイは、生物学的な流体試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物のアッセイに用いられる均一酵素免疫アッセイシステムである。場合によっては、免疫アッセイは、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物と抗体結合部位に対して標識されたＮα－アシル化－ＳＤＭＡ及び／またはＮα－アルキル化－ＳＤＭＡ間の競合を基盤とする。一部の実施例において、標識は酵素等のタンパク質である。例えば、標識は分光光度計で活性を測定できる酵素である。一つの非限定的な例において、本開示のアッセイは、抗体結合部位に対して酵素グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）で標識されたＮα－アシル化－ＳＤＭＡ及び／またはＮα－アルキル化－ＳＤＭＡを用いる。特定の実施例において、酵素活性は抗体に結合する場合に減少し、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度を酵素活性の観点から測定することができる。場合によっては、活性酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨにコンバートして分光光度計で測定される吸光度変化を招く。場合によっては、内因性血清Ｇ６ＰＤＨは、補酵素ＮＡＤ＋がアッセイに用いられたバクテリア（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）酵素とだけ機能するため、免疫アッセイを阻害しない。
一般的に、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在（または不在）を検出するための本開示の免疫アッセイは、反応混合物に、（ｉ）対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料、及び（ｉｉ）対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的に結合する抗体と試料に存在し得る対称性ジメチル化アルギニン分析物との間に複合体を形成する抗体を添加することで行うことができる。該方法は、また複合体の存在または不在を検出することを含む。複合体の存在（または不在）は、試料における対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在（または不在）を示すことがある。さらに、形成された複合体の量は、試料に存在する対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度を決定するために評価することができる（例えば、試料を得た対象から対称性ジメチル化アルギニン分析物の血清または組織濃度の評価を提供するために）。複合体の存在及び／または量は、直接的（例えば、複合体で結合抗体を検出することで）または間接的（例えば、対称性ジメチルアルギニン酵素結合体が抗体に結合されていない場合、対称性ジメチルアルギニン酵素結合体で酵素の活性を評価することで、反応混合物で対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体が試料から対称性ジメチル化アルギニン分析物によって結合されたことを示す検出可能なシグナルが生成される）（例えば、図１０参照）。
一般的に、本開示の免疫アッセイは、培地（例えば、アッセイ培地またはアッセイ反応混合物）で、試料内で分析物と抗体との間に安定した複合体の形成を許容する条件下に、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体と試料が組み合わさることを伴う。
アッセイは溶液で行われたり、固体（不溶性）支持体（例えば、ポリスチレン、ニトロセルロースまたはビーズ）を用いてもよく、任意の従来の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２．に記載）を用いる。該方法にはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＩＲＭＡ（免疫放射線アッセイ）及びＲＩＡ（放射性免疫アッセイ）が含まれる。特定の実施例において、アッセイは溶液で行われ、例えば、アッセイは固体支持体に結合されたり、結合アッセイ試薬なしで行われる。
アッセイが溶液で行われる場合、テスト試料（及び選択的に対照群試料）は、分析物及び親和性試薬複合体を形成するのに十分な期間で、非対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体と一緒にインキュベーションしてもよい。前述したように、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体は、検出可能な標識、例えば放射性核種、蛍光物質または酵素を含み得る。次に、試料を処理して過剰の、未反応の対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体から対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体複合体を分離する（例えば、二次抗体（例えば、抗－免疫グロブリン抗血清）を添加し、遠心分離して二次複合体を沈殿することで、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標登録）、またはプラスチックウェル等の固体基質に固定された二次非標識抗体等の親和性表面に結合することで）。対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合された対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体の検出は、多様な方法で達成することができる。必要であれば、検出可能な標識に対する基質を試料に追加してもよい。
アッセイが固体支持体を用いる場合、支持体は、支持体表面に結合された対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体（または結合体）を有することができる。アッセイ試薬の結合は、試料（または競合的結合アッセイ等の試料から対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合されず、反応混合物に存在し得る抗体）が抗体に対する特異的結合を通じて固体支持体に対する安定的な、耐水性結合を容易にする。不溶性支持体は、抗体または適当な対称性ジメチルアルギニン結合体を結合することができ、可溶性物質から分離することができ、あるいは試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の全体検出方法と両立可能な任意の組成物である。
該支持体の表面は、固体か多孔性でもよく、任意の適切な形状を有してもよい。対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体、または対称的にジメチルアルギニン結合体が結合された適当な不溶性支持体の例は、ビーズ、例えば磁気ビーズ、膜及びマイクロタイタープレートを含む。これらはガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロースで構成することができる。
アッセイ試薬は、本明細書に開示された対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体だけでなく、選択的に検出可能に標識し得る二次抗体を含み得る。支持体にアッセイ試薬を結合した後、支持体が遮断剤で処理されてアッセイ試薬によって占められていない領域で支持体に結合される。適切な遮断剤は、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の非干渉タンパク質を含む。もしくは、Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ４０、ＴＸ１００等の非干渉濃度の洗剤が用いられる。該遮断処理は、非特異的結合を減少させ得る。
本開示のアッセイは、定性的及び定量的アッセイを共に含む。一般的な定量的方法は、分析物を予め決定された量の試薬抗体と混合し、検査される試料に対して予想範囲内の既知量の分析物を含む従来の試料を用いて決定された関係を使用し、本来の試料の分析物の量と形成された複合体の量を関連付けることを含む。定性的アッセイでは分析物が含まれるか、もしくは含まれないと考えられる試料によって設定された閾値水準よりも高いか低い十分な複合体を用いてアッセイ結果を設定し得る。別途明示されない限り、本開示で「測定」または「決定する」行為は、定性的及び定量的決定を共に含む。
本明細書に記載されたアッセイにおいて、単独または組み合わせて用いられる免疫アッセイ試薬は限定されないが、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体、対称性ジメチルアルギニン結合体及び対称性ジメチル化アルギニン分析物（例えば、競合的結合アッセイにおける対照群として）を含む。免疫アッセイ試薬は、緩衝水溶液で提供され得る。該溶液には表面活性添加剤、有機溶媒、消泡剤、緩衝剤、界面活性剤及び抗菌剤等の追加の成分を含み得る。表面活性添加剤は、溶液で疏水性または溶解度が低い化合物を維持し、溶液の構成要素を安定化するために導入し得る。例としては、β－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の増量剤；Ｔｗｅｅｎ－２０，ＰｌｕｒａｆａｃＡ３８，ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，Ｐｌｕｒｏｎｉｃ２５Ｒ２，ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び炭水化物等の消泡剤及び界面活性剤を含む。有機溶媒の例は、メタノール及びその他のアルコールを含み得る。多様な緩衝液を用いて保管中の溶液のｐＨを維持してもよい。例示的な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等を含む。抗菌剤はまた、免疫アッセイ試薬の保存寿命を延ばす。
アッセイで試薬として用いられる対称性ジメチルアルギニン結合体及び／または対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体は、固体支持体に結合して不溶化することができる。これは、微粒子または、例えば、浮遊状態で維持できるが遠心分離または精密濾過等の物理化学的手段で除去できる高分子量担体に対する試薬が入っている培地の壁である。場合によっては、結合が１以上の共有結合を通じてなされる。結合は共有的である必要はないが、少なくともアッセイの手順の一部であり得る分離技術（洗浄を含む）に耐えられるほどの十分な強度及び／または永久性を有してなければならない。場合によっては、固体支持体は、対称性ジメチルアルギニン結合体及び／または対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体の固体支持体への結合を容易にする反応性基を含むように官能化していてもよい。使用され得る反応性基の非制限的な例は、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－ＳＨ等を含む。一部の実施例において、対称性ジメチルアルギニン結合体及び／または対称ジメチル化アルギニン分析物抗体は、タンパク質担体にコンジュゲートされることができ、タンパク質担体は、固体支持体にコンジュゲートされることができ、したがって、対称性ジメチルアルギニン結合体及び／または対称ジメチル化アルギニンを固体支持体に間接的に結合させることができる。特定の微粒子物質にはアガロース、ポリスチレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ラテックス粒子、磁性粒子及び固定赤血球が含まれるが、これに限定されない。商業的に利用可能なマトリックスの例には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標登録）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｏｒｏｓ（商標登録）樹脂（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ａｃｔｉｇｅｌ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商品商標）樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ＩｎＣ．）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ（商品商標）（Ｄｙｎａｌ ＩｎＣ．）が含まれるが、これに限定されない。特定の実施例において、固体支持体の選択は、安定性、容量、カップリングされた抗体の接近性、流速（または、反応混合物で樹脂を分散させるキャパシティー）、及び分離容易性のうち１以上に依存してもよい。
前述したように、対称性ジメチル化アルギニン分析物の検出のための免疫アッセイは多様な形式がある。一般的に、免疫アッセイは、培地（例えば、反応混合物またはアッセイ混合物）内で試料（すなわち、対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料）と一緒に１以上の免疫アッセイ試薬（例えば、少なくとも１個の非対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体）を混合することを含む。「反応混合物」または「アッセイ混合物」は、一般的に本開示に例示された対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料、及び１以上の免疫アッセイ試薬の組み合わせを指し、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在または不在の検出を容易にし、検出は定性的または定量的である。免疫アッセイ試薬（ら）が溶液内にあるか、支持体（例えば、ビーズ等の基質）に固定され得るが、反応混合物は一般的に水溶液である。反応混合物は、免疫アッセイと両立できる他の成分、例えば緩衝液、試薬等を含み得る。
免疫アッセイは、一般的に様々な方法の１個に分類される。例えば、免疫アッセイは、使用された検出方法により分類されることができ、例えば、酵素免疫アッセイ、放射線免疫アッセイ、蛍光偏光免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイ、濁度アッセイ等である。また、他の分類方法は、使用されたアッセイの手順、すなわち競合アッセイ形式、サンドイッチ類型アッセイ形式及び沈殿または凝集原理を基盤とするアッセイによる。場合によっては、洗浄段階が手順に含まれるか（いわゆる、不均一アッセイ）、または、反応及び検出が洗浄段階なしで行われるか（いわゆる、均一アッセイ）によって追加区別なされる。特定のアッセイは、下で詳しく説明されている。
免疫アッセイは、不均一的もしくは均一的と記載され得る。本明細書で用いられた「均一免疫アッセイ」は、複合体が未反応の反応成分から分離せず、その代わり複合体の存在が反応物のうち少なくとも１個が複合体内に編入された結果として獲得もしくは喪失する特性によって検出される分析法を意味する。均一アッセイには互いに異なる試薬に対する蛍光色及び蛍光色消光対；他の試薬の酵素及び酵素阻害剤対；他の試薬の発色団及び発色団修飾子対；及びラテックス凝集アッセイを含むシステムが含まれる。
特定の均一アッセイは、対称メチルアルギニンが活性酵素に結合された定量的均一酵素免疫アッセイである。一部の実施例において、対称メチルアルギニン結合体に対する対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体の結合が結合体の酵素活性に定性的または定量的方法で影響を及ぼすように結合が配列される。対称性ジメチル化アルギニン分析物を含む試料を抗体と予め混合すると、抗体が対称性ジメチル化アルギニン分析物と複合体を形成して酵素結合体に結合することを阻害し得る。このように、結合体における酵素の活性は、試料に存在する対称性ジメチル化アルギニン分析物の量と関与し得る。
Ｇ６ＰＤＨは、該アッセイに有用な特定の酵素である。一部の実施例において、Ｇ６ＰＤＨは、１以上のリジン残基が欠失または置換、もしくは１以上のシステイン残基が導入された天然発生Ｇ６ＰＤＨの変異体である。例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｇ６ＰＤＨは、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を利用することでＤ－グルコノ－デルタ－ラクトン－６－ホスフェートの酸化に対して触媒作用をする二量体酵素である。ＮＡＤ＋を用いる該特性は、該酵素をＮＡＤＰ＋のみを効果的に用いるヒトＧ６ＰＤＨと区別され、例えば、ヒト由来試料のようにヒトＧ６ＰＤＨの存在下で、Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ－特異的Ｇ６ＰＤＨ活性を測定できるようにする。Ｇ６ＰＤＨを選択する２つの特定のバクテリアの属は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＺｙｍｏｍｏｎａｓである。これらのうち、Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ及びＺ．ｍｏｂｉｌｉｓが関心対象であり、Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ及びＬ．ｌａｃｔｉｓが具体的な例である。均一アッセイシステムのまた他の例は、クローニングされた酵素ドナー免疫アッセイである。
チオール反応性基を有する対称性ジメチルアルギニン誘導体は、前述したように調製することができ、グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）突然変異酵素と反応してそれぞれの酵素結合体を形成され得る（例えば、図７参照）。突然変異酵素は、米国特許第６，０９０，５６７号及び第６，０３３、８９０号に記載された手順によって取得することができ、これらの開示内容は本明細書に参照として援用される。
一部の実施例において、免疫アッセイは対称性ジメチルアルギニンの部分及び検出可能な標識を有する対称性ジメチルアルギニン結合体を試料に添加することをさらに含む。試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在または不在は、検出可能な標識を検出することで検出し得る。検出可能な標識は、酵素を含んでもよく、検出は酵素の活性を分析することで行うことができる。特定の実施例において、酵素はＧ６ＰＤＨ等の脱水素酵素である。
発光酸素チャネリングアッセイ（ＬＯＣＩ）は、分析物に対するビオチン化抗体がストレプトアビジンがコーティングされたドナービーズに結合し、分析物に対する第２抗体がＬＯＣＩ受容体ビーズに直接コンジュゲートされる化学発光均一免疫アッセイである。アッセイ物質が存在する場合、２つのビーズが近接するようになる。６８０ｎｍでドナービーズの励起はＬＯＣＩ受容体ビーズで一連の化学反応を誘発する一重項酸素分子を生成して６１５ｎｍで検出可能な光放出ピークを生成する（Ｕｌｌｍａｎ，ＥＦ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２，１５１８－１５２６）。
分離基盤または「不均一」アッセイで対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体と分析物の複合体検出には、形成された複合体が未反応分析物、未反応抗体または両方から物理的に分離する過程が含まれる。
不均一免疫アッセイにおいては、抗体と対称性ジメチル化アルギニン分析物の複合体は、まず流体上で形成された後、固相試薬によって捕捉されるか、ゲル濾過または沈殿のように改変された物理的または化学的特性を基盤に分離され得る。もしくは、試薬のうち１個は他の試薬と接触する前に固相に結合し得て、次いで未反応試薬がない固相を洗浄することで複合体を回収し得る。分離－基盤アッセイは、典型的には複合体の検出または定量を容易にするために標識された誘導体または標識抗体の使用を含む。適当な標識には１２５Ｉ等の放射性同位元素、ペルオキシダーゼ及びｂ－ガラクトシダーゼ等の酵素、及びフルオレセインイソチオシアネート等の蛍光標識が含まれる。分離段階は未反応標識試薬で複雑な形態で存在する標識試薬を除去することを含む。複合体の標識量は直接測定するか、未反応で残された量で類推し得る。
本開示のアッセイは、サンドイッチ及び競合アッセイを共に含む。サンドイッチアッセイは、典型的には測定される分析物が複合体の分離に究極的に用いられる第１抗体等の一つの試薬と、分離された複合体のマーカーとして用いられる第２抗体等の他の試薬との間に挟まれている複合体の形成を含む。競合アッセイは、測定される分析物が抗体等の他の試薬に結合されるように分析物の誘導体と競合するシステムを含む。ＥＭＩＴ（商標登録）を用いた競合アッセイの例は、米国特許第３，８１７，８３７号に説明されている。
現在開示された具現例の化合物及び方法はまた、ラテラルフロークロマトグラフィー（ｌａｔｅｒ ｆｌｏｗ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）技術でこれら物質の使用を含む。ラテラルフロークロマトグラフィーは、対称性ジメチル化アルギニン分析物に対して、非同位元素シグナル生成部分等の検出装置を含むメンブレインストリップを含む。次に、患者の試料をメンブレインストリップに適用し得る。試料は検出装置と相互作用して結果を生成し得る。結果は試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の不在、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在及び／または試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度を含んで様々なものを表わすことができる。
特定の実施例は、ラテラルフロークロマトグラフィーの使用を通じて、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在または不在を定性的に決定する方法を提供する。特定の実施例において、定性的ラテラルフロー装置の基本設計は、次のとおりである：１）試料パッドは試料が適用される場所である。試料パッドは緩衝剤または塩等の化学物質で処理され、これは再溶解される場合に結合体、テスト及び対照試薬との反応のために試料の化学的性質を最適化する。２）コンジュゲートリリースパッドは、一般的に抗体コロイド性金結合体等の結合体試薬で処理されたポリエステルまたはガラスファイバー材料である。コンジュゲートパッドを処理する一般的な工程は、含浸後に乾燥して用いることである。使用中にテストに追加された液体試料は、結合体を再溶解してメンブレインに流れる。３）メンブレイン基板は、一般的にニトロセルロースまたは抗体捕捉成分が固定された類似する物質で作製される。４）ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）パッドは、血漿と全血を分離しなければならない検査に用いられる。含浸過程は、一般的に試料を調節して細胞分離を促進するための試薬としてこのパッドを処理するのに用いられる。５）吸収パッドは、装置を通じて流れる流体を収集するための保存場所の役割をする。６）上部層とメンブレインシステムは、構造部材の役割をする接着材料があるプラスチック支持台に積層される。
特定の実施例は、ラテラルフロークロマトグラフィーの使用を通じて試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在を定性的に決定する方法を提供する。該実施例において、メンブレインストリップは、対称性ジメチル化アルギニン分析物に特異的な抗体を有するコンジュゲートリリースパッドである試料パッドを含む。該抗体は、コロイド性金粒子等の非－同位元素シグナル生成部分にコンジュゲートし得る。ラテラルフロークロマトグラフィー環境で有用な他の検出部分としては染料、着色ラテックス粒子、蛍光標識ラテックス粒子、非同位元素シグナル生成部分等が含まれる。場合によっては、メンブレインストリップは捕捉ラインをさらに含み、ここで対称性ジメチル化アルギニン分析物抗原または対称的にジメチルアルギニン結合体がストリップに固定される。一部の実施例において、該固定は任意に連結基を通じてメンブレインストリップに対する共有結合を通じてなされる。他の実施例において、固定化はメンブレインストリップに対する非共有結合を通じてなされる。また他の実施例において、捕捉ラインで固定された対称性ジメチル化アルギニン分析物は、ＢＳＡ等の免疫原性担体等の反応性パートナーに結合する。
患者からの試料を試料パッドに適用すると、コンジュゲートリリースパッドの抗体と結合して溶液を形成することができる。この溶液は、膜を横断する毛細管の作用によってクロマトグラフィー的に移動し得る。対称性ジメチル化アルギニン分析物が試料に存在する場合、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体複合体が形成されてもよく、これは毛細管作用によって膜を横断して移動する。溶液が捕捉ラインに到達すると、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体複合体が抗体の制限された結合部位に対して移動しない対称性ジメチル化アルギニン分析物と競合し得る。対称性ジメチル化アルギニン分析物質の十分な濃度が試料に存在する場合、制限された抗体結合部位を充填し得る。特定の場合に、これは捕獲ラインで着色抗体－非移動の対称性ジメチル化アルギニン分析物複合体の形成を阻害するようになる。したがって、捕捉ラインに色がないことは、試料内に対称性ジメチル化アルギニンアッセイ物質が存在することを示す。
試料に対称性ジメチル化アルギニン分析物がない場合、溶液がメンブレインストリップの捕捉ラインに到達すると、着色抗体－非移動の対称性ジメチル化アルギニン分析物複合体が形成され得る。場合によっては、捕獲ラインにこの複合体が形成されることは、試料に対称性ジメチル化アルギニン分析物がない証拠である。
特定の実施例は、ラテラルフロークロマトグラフィーの使用を通じて、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を定量的に決定する方法を提供する。この技術は、米国特許第４，３９１，９０４号；第４，４３５，５０４号；第４，９５９，３２４号；第５，２６４，１８０号；第５，３４０，５３９号；及び第５，４１６，０００号に記載されており、その開示内容は参照として本明細書に援用される。一部の実施例において、抗体は、メンブレインストリップの全長に対して固定され得る。一般的に、メンブレインストリップが紙で作製される場合、抗体はメンブレインストリップに共有結合され得る。メンブレインストリップがニトロセルロースで作製された場合、抗体は、例えば疏水性及び静電気相互作用を通じてメンブレインストリップに非共有的に結合し得る。メンブレインストリップは、検出器部分に結合した対称性ジメチル化アルギニン分析物を含むコンジュゲートリリースパッドを含み得る。特定の実施例において、検出器部分はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素である。
特定の実施例において、患者からの試料は、コンジュゲートリリースパッドで対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子と結合して溶液を形成できるメンブレインストリップに適用される。この溶液は、膜を横断する毛細管作用によってクロマトグラフィー的に移動し得る。対称性ジメチル化アルギニン分析物が試料に存在する場合、試料対称性ジメチル化アルギニン分析物と対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子は共に抗体の制限された数の結合部位に対して競合する。対称性ジメチル化アルギニン分析物質の十分な濃度が試料に存在する場合、制限された抗体結合部位を充填し得る。場合によっては、対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子がメンブレインストリップで継続して移動するようにする。メンブレインストリップで対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子の移動距離が短いほど試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度が低くなり、その反対の場合も同様である。対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子が酵素を含む場合、対称性ジメチル化アルギニン分析物／検出器分子の移動長さは、酵素基質をメンブレインストリップに適用して感知することができる。酵素反応生成物の検出は、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度を決定するために利用してもよい。特定の実施例において、修飾されたＮ,Ｎ－ジメチルアニリン等の酵素の発色基質は、メンブレインストリップに固定され、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾンは、膜に受動的に適用され、発色反応の視角化のための別途試薬の必要性を軽減する。
蛍光分極アッセイ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎＣｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＰＩＡ）技術は競合的結合を基盤とする。ＦＰＩＡ技術は、例えば米国特許第４，５９３，０８９号、第４，４９２，７６２号、第４，６６８，６４０号及び第４，７５１，１９０号に記載されており、これらの開示内容は本明細書に参照として援用される。
ＦＰＩＡ技術は、対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在を識別するのに用いることができ、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を定量化するアッセイに使用され得る。部分的に、溶液内で分子の回転特性は、分極の程度が分子の大きさに正比例するようにする。したがって、分子の大きさが大きくなるほど偏光も増加し得る。すなわち、溶液内で小さく早く回転する蛍光標識、またはその他の発光標識された対称ジメチル化アルギニン分析物を励起するために線形偏光を用いると、放出光が大きく脱分極し得る。蛍光標識された対称性ジメチル化アルギニン分析物が抗体と相互作用したり抗体に結合すると、回転が遅くなり放出光が高度に偏光し得る。場合によっては、抗体が複合体の大きさを有意かつ測定可能に増大させるためである。また、試料内で非標識対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を増加させると、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体による蛍光標識された対称性ジメチル化アルギニン分析物の結合が減少して試料内で放出される光の偏光が減少し得る。試料内で非標識対称性ジメチル化アルギニン分析物の濃度と極性間の定量的関係は、既知濃度の対称性ジメチル化アルギニン分析物でキャリブレーションの偏光値を測定して設定し得る。したがって、ＦＰＩＡは、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在と濃度を識別するのに使用され得る。
免疫濁度アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）と呼ばれる均一微粒子免疫アッセイ技術は、溶液内で粒子と化合物の凝集を基盤とする。粒子及び／または化合物が凝集すると、粒子の大きさが増大して溶液の濁度が増加し得る。したがって、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体は、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在及び選択的に量を評価するために微粒子と一緒に使用され得る。均一微粒子免疫アッセイは、免疫アッセイが血液、血液溶血液、血清、血漿、組織及び／またはその他の試料に対して行われるので有用である。均一微粒子免疫アッセイは、対称性ジメチル化アルギニン分析物を用いて行われ、微粒子にローディングしたり、対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体を微粒子にローディングして行うように構成することができる。均一微粒子免疫アッセイまたは免疫濁度アッセイは、試料内で物質の凝集を測定するのに用いられる。免疫濁度アッセイ技術は、例えば米国特許第５，５７１，７２８号、第４，８４７，２０９号、第６，５１４，７７０号、及び第６，２４８，５９７号に記載されており、これらの開示内容は本明細書に参照として援用される。該アッセイには光減衰、ネフェロメトリックまたは濁度測定方法が含まれる。
セディア法（「ＣＥＤＩＡ（商標登録）」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合し得る抗体に結合するために、Ｅ．ｃｏｌｉからβ－Ｄ－ガラクトシドガラクトヒドロラーゼまたはβ－ガラクトシダーゼ（「β－ｇａｌ」）等の非活性遺伝子操作酵素ドナー（「ＥＤ」）フラグメントを含む対称性ジメチルアルギニン結合体と生物学的試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の競合を基盤とする。対称性ジメチル化アルギニン分析物が試料に存在する場合、抗体に結合してＥＤ－誘導体結合体のＥＤ部分を自由に残し、反応混合物でβ－Ｄ－ガラクトシドガラクトヒドロラーゼまたはβ－ｇａｌの酵素活性を回復して酵素受容体（「ＥＡ」）フラグメントと結合し得るようにする。ＥＤとＥＡを含む活性酵素は、適切な基質に露出した時に定量可能な反応生成物を生成し得る。基質の例は、活性酵素によってガラクトース及びＣＰＲで分割できるクロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（「ＣＰＲＧ」）であり、ここでＣＰＲは、波長が約５７０ｎｍでの吸光度で測定される。対称性ジメチル化アルギニン分析物が試料に存在しない場合、抗体がＥＤ－誘導体結合体に結合してＥＤフラグメントとＥＡフラグメントの結合を阻害し、酵素活性の回復を阻害し得る。反応生成物の量と結果的な吸光度変化は、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の量に比例する。
化学発光微粒子免疫アッセイ（「ＣＭＩＡ」）技術を用いる競合アッセイは、対称性ジメチル化アルギニン分析物が試料に存在するか否かの評価にも使用され得る。多様な類型のＣＭＩＡ技術を用いて試料内で分析物の存在及び／または量が決定され得る。ＣＭＩＡ分析は、対称性ジメチル化アルギニン分析物に結合し得る対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体の使用を含み、これは濾過、沈殿及び／またはその他の手段による分離に適当な粒子または磁性粒子等の粒子に結合される。また、適切な化学発光の部分に連結された対称性ジメチルアルギニンまたは誘導体を含み得るトレーサーを用いて粒子上の対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体の制限された量に対して患者試料の遊離対称ジメチル化アルギニン分析物と競合し得る。試料、トレーサー及び抗体粒子が相互作用して日常的な洗浄段階で結合されていないトレーサーが除去された後、抗体粒子に結合されたトレーサーの量は化学発光によって測定することができ、ここで化学発光は相対光単位（ＲＵＬＥ）で表される。化学発光の量は患者の試料にある遊離アッセイ物の量と反比例し、濃度は既知分析物の値を用いて標準曲線を構成して決定される。
一部の実施例によれば、生物学的流体（例えば、全血、血清、血漿、尿、痰、精液、唾液、水晶体液、脳液、脊髄液、羊水、組織培養培地等、及びこれらの希釈液を含む）内のＳＤＭＡのアッセイのための均一酵素免疫アッセイが提供される。アッセイは、生物学的流体に存在するＳＤＭＡと抗体結合部位に対する酵素（例えば、グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ））で標識されたＮα－アシル化－ＳＤＭＡまたはＮα－アルキル化－ＳＤＭＡ間の競合を基盤とする。抗体に結合すると酵素活性が減少するので、生体液内のＳＤＭＡ濃度を酵素活性で測定することができる。例えば、活性Ｇ６ＰＤＨはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨにコンバートして分光光度計で測定できる吸光度変化を招く。補酵素ＮＡＤ＋は、バクテリア酵素とのみ作用するため、内因性血清Ｇ６ＰＤＨが干渉しないようにバクテリア（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）酵素がアッセイに用いられる。
特定の実施例において、本明細書に記載された任意の均一酵素免疫アッセイをはじめとする本開示の免疫アッセイで、１以上の試薬が凍結乾燥された形態で提供される。１つだけ例を挙げると、本開示の化学式１の化合物のうち任意のもの、本開示の任意の抗体、または両方を含む組成物は、その開示内容があらゆる目的のために全体が参照として本明細書に含まれる米国特許第５，４１３，７３２号に記載されたように、凍結乾燥された試薬球体（または「ビーズ」）の形態で提供され得る。簡単に、該球形状体は、例えば試薬の均一溶液を形成することで作製され得て；溶液の均一な液滴測定（例えば、２ないし５０μＬ）；均一な測定液滴を無攪拌の極低温液体（例えば、液体窒素）に分配して液滴を凍結させる段階；極低温液体から凍結した液滴を収集する段階；及び凍結した液滴を凍結乾燥させて複数の凍結乾燥された試薬球体を形成する段階を含む。
例えば、１以上の試薬が凍結乾燥された形態で提供される実施例を含む一部の実施例によれば、マイクロ流体ローター（または「ディスク」）を含む遠心分析器が本開示の免疫アッセイに用いられる。例えば、本開示の免疫アッセイは、血漿または血清を、１以上の試薬（例えば、前記記載された）及び血漿または血清を複数の個別試験ウェルに分配する段階を含む。全血を血漿に分離するのに必要なチャンバー及び通路は、正確に測定された量の血液及び／または希釈剤を分離チャンバーに伝達する計量チャンバーから放射状外側に位置する。分離チャンバーは、放射状に外側に向かう細胞トラップを含む。ローターを回転させると全血の細胞成分が細胞トラップで隔離される。次に分離血漿は、多数のテストウェルまたはキュベットに伝達される。前述した分離及び分注段階は、一般的に回転する回転子によって生成された遠心力の結果として発生する。前記説明したローターと組み合わせて前述した凍結乾燥された試薬球体は、血漿または希釈血漿を定量するのに特に適している。また、尿、痰、精液、唾液、水晶体液、脳液、脊髄液、羊水、組織培養培地等の多様なその他の生物学的流体と食品及び産業用化学物質等に有用である。マイクロ流体ローターを含む該遠心分析器に関する細部事項は、例えば、米国特許番号第５，０６１，３８１号、第５，１７３，１９３号；第５，１２２，２８４号及び第５，１８６，８４４号に開示され、これらの内容はあらゆる目的のために全体的に本明細書に援用される。
一部の実施例において、免疫アッセイは、ローター内の第１及び第２チャンバー間に予め測定された体積の液体（例えば、全血、血清または血漿等の生物学的試料）を伝達するためのサイフォン（ｓｉｐｈｏｎｓ）を含むマイクロ流体ローターを含む遠心分析器を用いる。サイフォンは、第１チャンバーで流体の半径方向の最も内側地点の半径方向内側にあるエルボを含み得る。ローターが回転するにつれ、流体がエルボを通過して流れない。一度ローターが止まると、毛細管がエルボのすぐ周辺で流体を引き込んでサイフォンを「プライム（ｐｒｉｍｅ）」する。ローターが再始動すると、遠心力は計量チャンバーの流体レベルがサイフォンの出口と同一半径の距離にあるまで計量チャンバーの残りの流体を受容チャンバーに引き入れる。サイフォンは、第１チャンバー上のサイフォンの入口が第２チャンバー上のサイフォン出口の半径方向外側にあるように設計してもよい。サイフォンの入口と出口の位置は特定の長所を提供する。例えば、サイフォンの入口は、流体が第２チャンバーに移送された後、常に第１チャンバーにある流体のメニスカスの最終位置の半径方向外側に位置してもよい。したがって、メニスカスが最小化されるため、異なる流体で異なる形のメニスカスと関連した測定の不正確度が最小化される。また、当業者に自明なように、サイフォン内の流体の列は安定化するがローターが摂動されると容易に破損するため、すべてのサイフォンは反安定的である。流体の列（ｔｒａｉｎ）が断絶すると、遠心力によってサイフォンに含まれる流体が放射状の最も外側の地点に流れるようになる。前のサイフォンでは、この地点がサイフォン排出口である。したがって、計量されていない体積の流体を受容チャンバーに伝達する可能性がある。本明細書に説明されたサイフォンでは、サイフォンの放射状の最も外側の地点はサイフォン入口になる。この設計では、流体の列が切れると、流体が第１チャンバーに再び流れるため、計量されなかった量の流体を伝達する問題を避けることができる。本発明の任意の方法／免疫アッセイに使用され得る予め測定された体積の液体を伝達するためのサイフォンを含む遠心ローターを含む分析器に関する追加の細部事項は、米国特許第７，９９８，４１１号に記載されており、あらゆる目的のためにその内容全体は参照として本明細書に援用される。
本明細書に記載された対称性ジメチルアルギニン誘導体、結合体、抗体、免疫原及び／または、その他の結合体は、酵素または蛍光及び／または均一免疫アッセイを含むが、これに限定されない急速ラテラルフローアッセイ、及び抗体アレイ及び未開発の形式を含む多様な検出システムを用いる多数の他の不均一免疫アッセイにも適している。
対称性ジメチルアルギニン誘導体、結合体、抗体及び免疫原を活用する多様な免疫診断アッセイが本明細書に記載されているが、該アッセイはまた変更され得る。このように、該免疫アッセイを行うための段階、または作用の多様な変更は、本明細書に記載された実施例の範囲内で行うことができる。アッセイの形式と関連した追加情報は、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｄａｔｅ：３１ｓｔ Ｊａｎｕａｒｙ２０１３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＳｃｉｅｎＣｅ）に説明されている。
キット
本開示の実施形態は、キットをさらに含む。一部の実施例において、キットは試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するのに用いられる。該キットは、本開示の任意の化学式１の化合物、本開示の任意の抗体、または両方を含み得る。
特定の実施例において、試料内で１以上の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するためのキットであって、該キットは本開示の任意の抗体を含み、及び抗体を用いて試料内で１以上の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するための指針を提供する。一部の実施例によれば、抗体は対称性ジメチルアルギニンの代謝物（非制限的な例として、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）を含む）に特異的に結合し、キットは対称性ジメチルアルギニン代謝物の量を決定するための指針をさらに含み得る。特定の実施例において、本開示の抗体を含むキットは本開示の任意の化学式１の化合物をさらに含む。一部の実施例において、化合物はＺが標識、例えば酵素、例えばグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である。
また、試料内で１以上の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を測定するためのキットが提供され、このキットは、本開示の任意の化学式１の化合物を含み、試料内で１以上の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するために化合物を用いるための指針が提供される。特定の実施形態において、化合物はＺが標識であること、例えば酵素、例えば、グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である。該キットは本開示の任意の抗体をさらに含み得る。一部の実施例によれば、抗体は、対称性ジメチルアルギニンの代謝物（非制限的な例は、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）を含む）に特異的に結合し、キットは対称性ジメチルアルギニン代謝物の量を決定するための指針をさらに含み得る。
一部の実施例によれば、本開示のキットは、例えば対称性ジメチルアルギニン及びこれの類似体、対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン等の、試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の測定のためのアッセイを適切に行うのに有用である。キットは：（ａ）対称性ジメチルアルギニン及び本明細書に記載された化学式１の化合物（例えば、対称性ジメチルアルギニン結合体）に特異的に結合するように産生された抗体；及び（ｂ）試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するための指針を含み得る。一部の実施例において、キットはまた、化学式１の化合物の結合体を含み、ここで結合体は、標識（例えば、検出可能な標識、例えばＧ６ＰＤＨ）を含む。場合によっては、キットはまた、分析物を決定するための補助試薬を含む。キットの抗体は本願に記載された化学式１の化合物に対して産生された抗体である。
免疫アッセイの多様性を向上させるために、キット試薬は試薬の比率が方法及びアッセイの実質的な最適化を提供するように、液体または凍結乾燥された形態で同一もしくは別途の容器に包装された組み合わせで提供され得る。特定の実施例において、キットは本開示の抗体、本開示の化合物または両方を含み、その開示内容はあらゆる目的のために全体が本明細書に参照として援用される米国特許第５，４１３，７３２号に記載された凍結乾燥された試薬球形状体として提供される。キットに提供された試薬は、各々別途の容器にあるか、多様な試薬が、例えば試薬の交差反応性及び安定性に応じて１以上の容器に組み合わされてもよい。一部の実施例において、本願に記載された化学式１の化合物（例えば、対称性ジメチルアルギニン結合体）は、凍結乾燥された形態で存在する。一部の実施例において、抗体は凍結乾燥された形態で存在する。例えば、化学式１の化合物は、第１凍結乾燥された組成物（１以上の賦形剤、緩衝剤、安定化剤等をさらに含み得る）で存在し得て、抗体は第２凍結乾燥された組成物（これはさらに酵素基質及び１以上の賦形剤、緩衝剤、安定剤等）で存在し得る。第１凍結乾燥された組成物及び第２凍結乾燥された組成物は、例えば１回の使用のための包装または容器等の単一のキットで提供され得る。
キットは、補助酵素基質等の補助試薬等のアッセイを行うために別途包装された他の試薬をさらに含み得る。キットにある多様な試薬の相対的な量は方法／免疫アッセイ（例えば、均一酵素免疫アッセイ）を行う時に発生する反応を実質的に最適化し、さらにアッセイの感度を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するために広範囲で変更され得る。適切な状況において、キットにある１以上の試薬は、本発明に関する方法またはアッセイを行うために適切な濃度を有する試薬を提供するように一般的に賦形剤を含む凍結乾燥された乾燥粉末で提供され得る。キットは前述した通り本発明に係る方法の指針書をさらに含み得る。
キットの特定の例示的な実施例の説明は「及び／または」という語句を使用し、これはキットが言及された各項目を含む、もしくは含まない可能性があることを意味する。この語句は簡潔化するために用いられる。一般的に、免疫アッセイキットは分析物の免疫原に対する１以上の抗体、例えば対称性ジメチルアルギニン、及び該分析物、例えば対称性ジメチルアルギニン誘導体の酵素結合体に該当する１以上の酵素結合体（例えば、標識結合体）を含む。
特定の実施例において、分析物対称性ジメチルアルギニン及び／または対称性ジメチルアルギニンの代謝産物に対するアッセイのためのキットが提供される。キットは包装された組み合わせで次を含み得る：（ｉ）化学式１の化合物に対して産生された抗体；及び（ｉｉ）分析物の誘導体の結合体。本開示のまた他の実施例は、パッケージされた組み合わせとして、以下を含む対称性ジメチルアルギニン及び／または対称性ジメチルアルギニンの代謝物アッセイ用キットが提供される：（ｉ）分析物の誘導体に対して産生された抗体；及び（ｉｉ）分析物のハプテンの結合体（ここで、ハプテンは化学式１の化合物である）。
本開示の化合物、方法及びキットは、免疫アッセイによる対称性ジメチルアルギニンの日常的なモニタリングに用いられる。特定の実施例において、該免疫アッセイは、早い処理時間で従来の実験室の装備に適する容易な自動化テストを提供する。本願に記載されたように、該免疫アッセイを提供するために対称ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体が産生される。誘導体及び免疫原は、相応する抗体を通じて対称性ジメチルアルギニンに対する特異的反応性を付与するように設計された。
キットに含まれる指針は、適切な記録媒体に記録してもよい。例えば、指針は、紙またはプラスチック等の基材に印刷してもよい。このように指針は、パッケージ挿入物としてキットに、キットの容器またはその構成要素のラベルに存在し得る（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングと関連した）等が含まれる。他の実施例において、指針は適切なコンピュータで読み取り可能な保存媒体、例えば携帯用フラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、フロッピー等に存在する電子的保存データファイルで存在する。また他の実施例において、実際の指針はキットに存在しないが、遠隔ソースから指針を得るための手段、例えばインターネットを通じて提供される。この実施例の例は、指針を視聴可能及び／または指針をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指針と同様に、指針を得るための手段は適切な基板に記録される。
実施例
下記実施例は、本発明を調製して用いる方法に対する完全な開示及び説明を通常の知識を有する者に提供するために提示されるものであり、本発明者らがそれらの発明とみなす範囲を制限しようとするものではない。下記の実験はすべて、または行われた唯一の実験であることを示すためのものである。用いられた数字（例えば、量、温度等）と関連して正確性を担保するために努力したが、一部実験の誤差及び偏差が考慮されなければならない。別途明示されない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、圧力は大気圧またはその付近である。「平均」は算術平均を意味する。標準略語、例えばｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下；等である。
化合物、結合体及び免疫原と関連して、次の略語が用いられる。ＤＣＭはジクロロメタン；ＤＭＦはＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＥＤＴＡはエチレンジアミンテトラアセト酸；ＫＬＨはスカシ貝ヘモシアニン；ＳＡＴＡはＮ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート；ＴＦＡはトリフルオロアセト酸；ＥＤＣＩは１－エチル－３（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド；ＮＨＳはＮ－ヒドロキシスクシンイミド；ＤＴＴはジチオエリトリトール；Ｇ６ＰＤＨはグルコース－６－リン酸脱水素酵素；ＥｔＯＡｃはエチルアセテート；ＢＳＡは牛血清アルブミン；ＤＭＯはＤｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン；ＭｅＣｎはアセトニトリル；ＥＡはエチルアセテート；ｔ－Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル保護基；ＴＬＣは薄層クロマトグラフィー；ＭｅＯＨはメタノール；ＡｃＯＨはアセト酸；ＰＢＳＴはＴｗｅｅｎ－２０が含まれたリン酸塩緩衝食塩水；ＴＭＢは３,３´，５,５´－テトラメチルベンジジン；ＰＢＭＣは末梢血液単核細胞である。
一般合成の手順
開示された化合物の合成に有用な一般的な既知の化学的合成反応式及び条件を提供する様々な一般の参考文献を利用することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ´ｓ ＡｄｖａｎＣｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎＣｅ，２００１；またはＶｏｇｅｌ，Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩｎＣｌｕｄｅ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８）。
本明細書に記載された化合物は、クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、分取薄層クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む当業界で公知の任意の精製プロトコルによって精製することができる。イオン性樹脂だけでなく、順相及び逆相を含む任意の適当な固定相を使用することができる。特定の実施例において、開示された化合物はシリカゲル及び／またはアルミナクロマトグラフィーを通じて精製される。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｌ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ及びＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９７９；及びＴｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｄ Ｅ．Ｓｔａｈｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９を参照する。
対象化合物の調製工程のうち任意の関連分子で敏感性または反応性基を保護することが必要及び／または望ましい場合もある。これはＪＦＷ ＭｃＯｍｉｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９７３，ＴＷ Ｇｒｅｅｎｅ、及びＰＧＭ Ｗｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９９９，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；Ｖｏｌｕｍｅ ３（Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８１，ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ」，Ｈｏｕｂｅｎ－Ｗｅｙｌ，４版，Ｖｏｌ．１５／１，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｄ１９７４，Ｈ．－Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ ａｎｄ Ｈ．Ｊｅｓｃｈｅｉｔ，」Ａｍｉｎｏｓａｕｒｅｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎｅ」，Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ Ｂｅａｃｈ，ａｎｄ Ｂａｓｅｌ１９８２、及び／またはｉｎ Ｊｏｃｈｅｎ Ｌｅｈｍａｎｎ、」Ｃｈｅｍｉｅ ｄｅｒ Ｋｏｈｌｅｎｈｙｄｒａｔｅ：Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｅ」，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ１９７４等の従来の作業書に開示された従来の保護基の手段によって達成することができる。保護基は当業界で公知の方法を用いて適切な後続段階で除去してもよい。
対象化合物は、商業的に入手可能な出発物質及び／または通常の合成方法によって調製された出発物質を用いて多様な異なる合成経路を通じて合成することができる。本願に開示された化合物を合成するために使用され得る合成経路の多様な例は、下記反応式に記載されている。
実施例１
ＳＤＭＡ－Ｍハプテンの調製

１段階
Figure 2022528465000009
飽和ＮａＨＣＯ３（１２ｍＬ）のうち（１）（５３４ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に温度を０℃に維持しながら（２）（９３０ｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を少量添加した。添加完了時、生成された溶液を０℃で１．５時間攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、すべての出発物質が標的物質にコンバートしたことを示した。攪拌された反応混合物を室温に昇温してＥｔＯＡｃで抽出した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／エチルアセテート＝１／１、ｖ／ｖで溶離）で精製して（３）（０．９１ｇ、９１％収率）を透明なオイルとして得た。構造は、１ＨＮＭＲにて確認した。
２段階
Figure 2022528465000010
ＤＣＭ（４０ｍＬ）内で（３）（０．９ｇ、５．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ酸化試薬（４．５ｇ、１０．６ｍｍｏｌ、２．０当量）及びＮａＨＣＯ３の混合物を２５℃で３時間攪拌した。ＴＬＣは大部分の出発物質が標的物質にトランスフォームしたことを示した。反応混合物を濾過して生成された余液を真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／エチルアセテート＝１／１、ｖ／ｖ）で精製して０３３０－０４（０．３５ｇ、４０％収率）を透明なオイルとして得た。製品（４）は、空気に対して極度に敏感であり、次の段階に直ちに使用された。構造は、ＬＣ－ＭＳにて確認された。
３段階
Figure 2022528465000011
ＭｅＯＨのうち（４）（６６８ｍｇ、４ｍｍｏｌ、２．０当量）及び対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）（４０４ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＡｃＯＨ（２００μＬ）及びＮａＢＨ３ＣＮ（１５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．２当量）が添加された。生成された混合物を室温で３時間攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、大部分の出発物質が標的物質にトランスフォームしたことを示した。反応を水で冷却し、直ちにＢｉｏｔａｇｅ逆相クロマトグラフィーで精製して透明なオイルとしてＳＤＭＡ－Ｍ（３２６ｍｇ、ＴＦＡ塩として３５％収率）を得た。構造は、１ＨＮＭＲにて確認した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２０）：δ６．８１（ｓ、２Ｈ）、３．９７（Ｍ、１Ｈ）、３．５１（ｍ、２Ｈ）、３．２１（ｍ、２Ｈ）、３．０８（ｍ、２Ｈ）、２．７８（ｓ、６Ｈ）、１．９８（ｍ、２Ｈ）、１．６４（ｍ、６Ｈ）。（図５参照）。
実施例２
ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰハプテンの調製

１段階
Figure 2022528465000012
ＤＭＦ（１８ｍＬ）のうち（５）（１．４ｇ、７．２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１ｇ、８．７ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＥＤＣＩ（２．７８ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。生成された混合物を室温で１２時間攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、すべての出発物質が標的物質にトランスフォームしたことを示した。溶液をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）に注いでＥＡ（１００ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ２Ｏ及び飽和食塩水で洗浄した。有機溶媒を減圧下で除去し、真空で乾燥して所望の生成物（６）を得た（２．０ｇ、９５．２％収率）。構造は、１ＨＮＭＲにて確認した。
２段階
Figure 2022528465000013
ＤＭＦ（５ｍＬ）のうち対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に（６）（６３０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応混合物を６０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、すべての出発物質が標的物質にトランスフォームしたことを示した。溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＭｅＣＮ及び水（７．５ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）に溶解させた後、Ｂｉｏｔａｇｅ逆相クロマトグラフィー（従来方法）を用いて精製して純粋な生成物（７）（６５０ｍｇ、ＴＦＡの塩、６６．７％収率）を透明なオイルとして用いる。構造は、１ＨＮＭＲにて確認した。
３段階
Figure 2022528465000014
ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）のうち（７）（６５０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温（ＲＴ）で３０分攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、すべての出発物質が標的物質（８）にトランスフォームしたことを示した。溶媒を減圧下で除去し、真空で乾燥して所望の生成物を定量的収率（ＴＦＡ塩として）で得た。構造は、ＬＣ－ＭＳにて確認された。
４段階
Figure 2022528465000015
（８）（２５８ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ－スクシンイミジルブロモアセテート（９）（２０５ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（０．３ｍＬ、１．７４ｍｍｏｌ、２．０当量）の混合物ＤＭＦ（２ｍＬ）を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ－ＭＳは、すべての出発物質が標的物質にトランスフォームしたことを示した。溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＭｅＣＮ及び水（３．５ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）に溶解させた後、Ｂｉｏｔａｇｅ逆相クロマトグラフィー（従来方法）で精製して純粋な生成物ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ（１７５ｍｇ、ＴＦＡの塩、３９．６％収率）を透明なオイルとして収得した。構造は、１ＨＮＭＲにて確認された。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２０）δ４．３６－４．３２（ｍ、１Ｈ）、３．８３（ｓ、２Ｈ）、３．４５（ｔ、Ｊ＝６．４、２Ｈ）、３．１８－３．１５（ｍ、２Ｈ）、２．７６（ｓ、６Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝６．４、２Ｈ）、１．８７－１．７４（ｍ、１Ｈ）、１．７３－１．５８（ｍ、３Ｈ）。反応式を図６に示した。
実施例３
ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ免疫原の調製
Ｈａｐｔｅｎ ＳＤＭＡ－Ｍは、チオール基がＫＬＨに化学的に導入されたＫＬＨにコンジュゲートされた。Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテートを保護されたスルフヒドリルを添加したＫＬＨの一次アミンと反応させた。ヒドロキシルアミンで保護されたスルフヒドリルの脱保護で所望のチオール化されたＳＨ－ＫＬＨを産生した（図８）。ハプテンＳＤＭＡ－ＭとＳＨ－ＫＬＨの結合は、免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨを産生した（図８参照）。
ａ）ＳＨ－ＫＬＨの調製
凍結乾燥されたＫＬＨ（２０ｍｇ）を脱イオン水で再構成し、１Ｍ炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を用いてｐＨを８．６に調整した。Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテートの溶液を調製し（４．６７ｍｇを９２μＬのＤＭＦに２２０ｍＭの濃度で溶解）、ＫＬＨ溶液に４時間かけてゆっくり添加した。Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテートを添加しながら反応混合物を室温で攪拌した後、さらに１６時間、低温室（４℃）で攪拌した。
架橋に用いるためのスルフヒドリルを生成するための脱アシル化は、２００μＬの脱アセチル化溶液（１２．５ｍＭ、ＮａＨ２Ｐ０４－Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液のうち０．７Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７）を添加して行われた。内容物を混合し、反応物を室温で２時間インキュベーションして生成物ＳＨ－ＫＬＨを生成した（図８参照）。この反応の最後にＥＤＴＡを１ｍＭの濃度で添加した。
ｂ）ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ免疫原の調製
前記ＳＨ－ＫＬＨ溶液にジチオトレイトール溶液を総１ｍＭ濃度で添加して二硫化結合形成を最小化した。１Ｍ炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を用いてｐＨを７．２に調整した。ＳＨ－ＫＬＨ溶液に、ＤＭＦ（０．２ｍＬ、ＤＭＦに溶解された９．６ｍｇ）に溶解されたマレイミド誘導体ハプテンＳＤＭＡ－Ｍ１４６μｌを４ないし５時間かけてゆっくり添加した。反応を４℃で夜通し継続した。混合物を２－８℃で４リットルのＮａＨ２Ｐ０４－Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液１２．５ｍＭ、ｐＨ７．０のうち１０，０００ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標登録）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて透析によって精製した。この手順は、免疫原ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨを産出した（図８参照）。
実施例４
ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨ結合体の調製
実施例２に記載されたように調製されたハプテンＳＤＭＡ－ＳＢＡＰは、突然変異Ｇ６ＰＤＨ（米国特許第６，４５５，２８８号、第６，０９０，５６７号、第６，０３３，８９０号参照）等のシステイン基を含むタンパク質、または化学反応によって実施例３に記載されたようにＧ６ＰＤＨにチオール－基の導入のために設計される。
ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰハプテン（７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２１ｍＬ）に溶解させた。溶液を室温で３０分攪拌した。このＳＤＭＡ－ＳＢＡＰソリューションは、次のように使用された。
ジチオトレイトール溶液を２ｍＭ濃度で突然変異Ｇ６ＰＤＨに添加してジスルフィド結合でスルフヒドリル基に連結されたシステインチオール基を還元させた。生成された酵素溶液（０．９ｍｇ、１．５ｍＬ）を１Ｍ炭酸塩重炭酸塩緩衝液でｐＨ７．２に調整し、約３４０倍モル過剰（０．０７ｍＬ）のＳＤＭＡ－ＳＢＡＰハプテンと混合した。反応混合物を４℃で１６時間緩く攪拌されるようにした。過剰のＳＤＭＡ－ＳＢＡＰハプテンは、１２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰ０４緩衝液（ｐＨ７．０）のうちＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０カラムに反応混合物を通過させて酵素－ハプテン結合体から分離された。酵素－ハプテン結合体を含むカラム分画を２８０ｎｍにて吸光度を測定することでプーリングして結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを得た（図７参照）。
Ｈａｐｔｅｎ ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰは前述したものと類似する結合手順を用いてＢＳＡとコンジュゲートした。ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－ＢＳＡ結合体（図９）を用いて実施例６に記載されたように間接ＥＬＩＳＡによってＢ－細胞及びモノクローナル抗体をスクリーニングした。
実施例５
ＳＤＭＡに対するポリクローナル抗体の調製
完全フロイントアジュバントで乳化させた、実施例３で調製したＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ免疫原２００μｇ／ウサギを２４匹のメスのニュージーランドホワイトウサギに皮下注射して免疫化させた。ウサギは不完全フロイントアジュバントで乳化された同一の免疫原の１００μｇ／ウサギで初期注射後、４週ごとにブーストされた。初期免疫化１３４日後、各ウサギのポリクローナル抗体を含む出血を中耳動脈で採取した。ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ抗体を含むこれらの出血からの抗血清は、酵素結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨの最大抗体阻害及び実施例７及び８に記載された対称性ジメチルアルギニン存在下における調節を測定することで均一アッセイ形式（図１０）で評価した。
これらの実験でウサギ２１３４２及び２６４９４を選択してＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨ免疫原で免疫化されたウサギから複製のためのＢ－細胞の供給源としてＰＢＭＣを分離した（実施例６）。ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＫＬＨで免疫化された２４匹のウサギポリクローナル抗血清の初期スクリーニング結果は、下記表１の通りである。
表１
Figure 2022528465000016
実施例６
ウサギモノクローナル抗体の調製
ウサギ組換えモノクローナル抗体は、免疫化されたウサギの天然抗体レパートリーを効率的に試料化するための単一Ｂ－細胞スクリーニング方法を用いて調製された。この技術は、一般的に本願に記載された対称性ジメチルアルギニンに対するモノクローナル抗体を産生するのに適用することができる。
免疫された動物＃２１３４２及び＃２６４９４のウサギ末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ´ｓ）をＢ－細胞の供給源として用いた。従来の密度勾配遠心分離法を用いて各ウサギの約４０ｍＬ全血からＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣをＰＢＳに希釈し、理論的にウェル当たり単一細胞を同日４０個の９６ウェルプレートに分配して培養した。
各ウェルから生成された上澄液をＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－ＢＳＡ抗原に対する間接ＥＬＩＳＡによって試験した（図９）。４０個の９６－ウェルマイクロタイタープレートを０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５で０．ｌμｇ／ウェルＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－ＢＳＡでコーティングし、４℃で夜通し保管した。プレートを空けた後、室温で１時間振盪しながらＰＢＳＴのうち３％脱脂粉乳で遮断した。遮断溶液を除去した後、プレートをＰＢＳＴですすいだ。２５μＬのＰＢＳＴを各ウェルに添加した後、すべてのウェルに２５μＬの細胞上澄液を添加し、インキュベーターで３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、総洗浄時間は３０分だった。その後、ＰＢＳＴに１００μＬ／ウェル二次抗体１：１０，０００（ｖ／ｖ）ヤギ抗－ウサギＩｇＧＦｃ－ＨＲＰ結合体を添加し、プレートを一定の振盪下、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、総洗浄時間は３０分だった。ＴＭＢ基質を５０ｕＬ／ウェルでプレートに添加した。暗所で５分間インキュベーションして発色するようにした後、５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を中断させた。４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーを通じて発色を読み取り、データをアッセイのためにコンピュータに転送した。ＳＤＭＡ－Ｍ－ＳＨ－ＢＳＡ結合体に結合された上層液（ウェルで生成された色）は陽性とみなされた。総３２個の細胞がクローニング及び発現のために選択された。
抗原－特異的抗体がある各ＥＬＩＳＡウェルに対して、該ＰＢＭＣ培養ウェルでｍＲＮＡを分離し、ウサギ遺伝子、ＩｇＨ及びＩｇＫの可変領域からｃＤＮＡを別途合成するために分割した。増幅のための２回のＰＣＲ後、ｃＤＮＡを各々重鎖不変ＩｇＧ領域または軽鎖不変ＩｇＫ領域を有する別途の哺乳動物発現ベクターにシームレスにリゲートさせた。
ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換して正確な発現構成体を選択し、培養してプラスミドを分離した。発現構築物をＨＥＫ２９３細胞内で共形質感染させた。形質感染された細胞を２日間培養して組換え抗体を分泌した。組換え的に発現された抗体の抗原結合特性は、前記記載のようにＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＢＳＡ抗原に対する間接ＥＬＩＡによって評価した。選択されたクローンは、実施例７及び８に記載されたように、均一酵素免疫アッセイ形式で評価のためにさらに使用された。選択されたウサギモノクローナル抗体に対してＤＮＡシーケンシングを行い、従来のコードで翻訳してすべての重鎖及びカッパ鎖可変領域配列に対するタンパク質配列データを提供した。以下の表は、モノクローナル抗体を産生する開発段階を要約したものである。
表２
Figure 2022528465000017
実施例７
ＳＤＭＡ標準及びキャリブレーションプロトコルの調製
対称性ジメチルアルギニンジ（ｐ－ヒドロキシアゾベンゼン－ｐ´－スルフォネート）塩（Ｓｉｇｍａ）をＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）に溶解させ、合成マトリックスで４μｇ／ｍｌストック溶液のＳＤＭＡの最終濃度に希釈した。ＳＤＭＡストック溶液を０、１５、５０、１００、１５０、２００μｇ／ｄＬの水準を達成するために、合成マトリックスの分注に移した。合成マトリックスは、ＨＥＰＥＳ（６．５ｍＭ、ｐＨ６．７）及びＥＤＴＡ（０．２５ｍＭ）、界面活性剤、消泡剤及び保存剤で緩衝されたタンパク質性溶液から構成された。標準は、ＬＣ／ＭＳによって検証された（図１７参照）。
６点キャリブレーション曲線を用いて試料内で対称性ジメチル化アルギニンを定量化した。各キャリブレーターレベルを二重測定してＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＵ４８０自動化臨床化学分析器（実施例７及び８参照）でキャリブレーション曲線を生成した。
Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）キャリブレーターは、前述したものと類似する方法で調製された。Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニンは、ＳＹＮｔｈｅｓｉｓ ｍｅｄ ｃｈｅｍ（オーストラリア）により合成された。
実施例８
試薬及びアッセイ
対称性ジメチルアルギニン抗体及び酵素結合体は、本開示によって試料内で対称ジメチル化アルギニン分析物を検出するために均一アッセイ形式で有利に用いられる抗体は、結合体阻害、結合体調節、キャリブレーション、交差反応性及び少量添加回収率等の公知の方法によって評価してもよい。該目的のために、抗体（ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、またはウサギ＃２７４２０、またはクローニングされた抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または、５Ｈ１／５Ｋ１）は、抗体希釈剤に添加して抗体試薬を調製する。抗体試薬は前述のように、調製された抗体、緩衝剤、塩、安定化剤、保存剤、ＮＡＤ＋及びグルコース－６－ホスフェートを含む。酵素結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを結合体希釈剤に添加して酵素結合体試薬を調製する。酵素結合体試薬は、結合体、緩衝剤、安定剤、塩及び防腐剤を含む。
均一酵素免疫アッセイ形式で抗体及び酵素結合体を評価するのに有用な臨床化学分析器は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＵ４８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）である。Ｂｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０は医療実験室で尿、脳脊髄液、口腔額、血漿及び血清等の生物学的流体標本を処理するのに用いられる自動化された生化学分光光度計分析器である。分析器は一定温度の維持、試料のピペッティング、試薬の混合、吸光度の測定、反応時間の正確な測定が可能である。
均一酵素免疫アッセイは、前述のように、すぐに使用できる液体の２種類の試薬アッセイを用いて行われる。一般的に、２～１５μＬの対称性ジメチル化アルギニン分析物含有試料を７５～１５０μＬの抗体試薬と一緒に培養した後、５０～１００μＬ酵素結合体試薬を添加する。
アッセイは、生物学的流体内のＳＤＭＡ分析に用いられる均一酵素免疫アッセイ技術である。分析は検体のＳＤＭＡと抗体結合部位に対する酵素グルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）で標識されたＮα－アシル化－ＳＤＭＡ、またはＮα－アルキル化－ＳＤＭＡ間の競合を基盤とする。抗体に結合すると酵素活性が減少するので、試料内で薬品濃度を酵素活性で測定することができる。活性酵素はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨにコンバートして３４０ｎｍにて分光光度計で測定される吸光度変化を招く。内因性血清Ｇ６ＰＤＨは、補酵素ＮＡＤ＋がアッセイに用いられたバクテリア（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）酵素とのみ機能するので干渉しない。３４０ｎｍにて吸光度の変化は分光光度計で測定することができ、酵素結合体の活性と比例し、これは次に分析物濃度と関連する（図１０参照）。
実施例９
対称性ジメチルアルギニン分析物を用いた抗体及びキャリブレーション
対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体及び酵素結合体（ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨ）を均一アッセイ形式で用いて実施例７に記載された対称性ジメチルアルギニン標準を用いてキャリブレーション曲線を生成した。抗体試薬は、実施例８に記載されたように調製した。対称ジメチル化アルギニン分析物ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及びクローニングされた抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または５Ｈ１／５Ｋ１を用いて調製された。酵素結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを用いて結合体試薬を調製した。実施例７及び８に記載されたようにＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０臨床化学分析器で６－ポイントキャリブレーション曲線を生成した。典型的なキャリブレーション曲線は下記の表に、用量－反応曲線は図１１及び図１２に示した。本実験は、ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及びクローニングされた単一クローン抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または５Ｈ１／５Ｋ等が用量－反応関係を示す対称性ジメチルアルギニンに対する反応に結合する抗体を有することを立証した。
表３
Figure 2022528465000018
実施例１０
Ｎα－Ａｃｅｔｙｌ－Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｅを用いた抗体及びキャリブレーション
対称性ジメチル化アルギニン分析物抗体及び酵素結合体（ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨ）を均一アッセイ形式で用いて実施例７に記載されたＮα－アセチル－対称性ジメチルアルギニンを用いて調製された標準を用いてキャリブレーション曲線を生成した。抗体試薬を記載されたように調製した。実施例８において、対称ジメチル化アルギニン分析物ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及びクローニングされた抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｈ１／５、または酵素結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを用いて結合体試薬を調製した。実施例８に記載されたようにＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０臨床化学分析器で６－ポイントキャリブレーション曲線を生成した。典型的なキャリブレーション曲線は下記表に、用量－反応曲線は図１３及び図１４に示した。本実験は、ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及びクローニングされたモノクローナル抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または５Ｈ１／５Ｋ等が用量－反応関係を示すＮα対称性ジメチルアルギニンに対する反応に結合する抗体を有することを立証した。
表４
Figure 2022528465000019
実施例１１
少量添加回収率
既知量の対称性メチル化アルギニン分析用ストック溶液（４ｐｇ／ｍＬ）を実施例７に記載されたように合成マトリックスに添加（スパイク）して０、１５、５０、１００、１５０、２００ｐｇ／ｄＬの濃度を達成した。これらの試料は、実施例８に記載されたようにＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０上の少量添加回収率（リカバリー）を確認するために均一酵素免疫アッセイによって３重で定量化された。試料は、６－ポイントキャリブレーション曲線を生成するのに別途調製された標準セットを用いて定量化された。テスト中の試料内で定量化される分析物等の分析物を用いて調製された標準を用いてキャリブレーション曲線を生成した。酵素結合体試薬は、結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを含み、抗体試薬は、ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及び抗体クローン１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または５Ｈ１／５Ｋ１であった。少量添加回収率の実験で回収された対称性メチル化アルギニン分析物濃度を公知の濃度と比較してプロットした（図１５～１８）。本実験は、ポリクローナル抗体ウサギ＃２１３４２、ウサギ＃２６４９４、ウサギ＃２７４２０及びクローニングされた抗体１Ｈ４／１Ｋ４、８Ｈ１／８Ｋ３、１８Ｈ１／１８Ｋ２、１Ｈ２／１Ｋ４、３Ｈ１／３Ｋ３または５Ｈ１／５Ｋ１が対称性ジメチルアルギニン及びＮα－アセチル－ＳＤＭＡに対する抗体反応を有することを立証した。
他の実験で、上記と同一試料を均一酵素免疫測定法（実施例８参照）及びＬＣ－ＭＳ－ＭＳによって二重で定量化した。内部標準の重水素化非対称性ジメチルアルギニンをＬＣ－ＭＳ－ＭＳ方法に用いた。抗体試薬のクローン３Ｈ１／３Ｋ３と酵素結合体試薬の酵素結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを用いて均一酵素免疫アッセイを調製した。結果は均一酵素免疫アッセイがＬＣ－ＭＳ－ＭＳと一致するＳＤＭＡ水準を定量化することを示す。
他の実験で公知の量のＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチドを実施例８に記載されたようにＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０で少量添加された試料の濃度（回収率）を確認するために均一酵素免疫アッセイで分析した。これを用いて調製された標準を用いてキャリブレーション曲線を生成した。分析物はテスト中の試料内で定量化される分析物である。酵素結合体試薬は、結合体ＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨを含み、抗体試薬は抗体クローン８Ｈ１／８Ｋ３または３Ｈ１／３Ｋ３を含んで調製された。添加－回収実験で回収されたＳＤＭＡ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチド分析物濃度を既知濃度と比較してプロットした（図１９）。
実施例１２
対称性ジメチルアルギニン及びＮα－アセチル－対称性ジメチルアルギニン分析物を用いた抗体及びキャリブレーション
ウサギ＃２７４１０及びＳＤＭＡ－ＳＢＡＰ－ＳＨ－Ｇ６ＰＤＨからのポリクローナル抗体を用いて試薬を調製し、実施例８に記載されたように対称ジメチル化アルギニン及びＮα－Ａｃ－ＳＤＭＡ分析物を検出するために均一アッセイ形式で用いた。ＳＤＭＡ及びＮα－Ａｃ－ＳＤＭＡ試料を実施例７に記載されたように調製し、ＳＤＭＡを用いて調製された標準から生成されたキャリブレーション曲線から定量化した。ウサギ＃２７４１０のポリクローナル抗体を用いて実施例１１に記載されたように少量添加回収率の実験を行った。図２０はウサギ＃２７４１０のポリクローナル抗体がＳＤＭＡ及びＮα－Ａｃ－ＳＤＭＡの両方で実質的に結合することを示す。ウサギ＃２７４１０のポリクローナル抗体に対する最大阻害（％）及び調節（％）は上の表１にある。
前述の内容は、単に本開示の実施例の原理を例示したものに過ぎない。通常の知識を有する者は、本明細書で明白に説明もしくは未図示の実施例の原理を実現してその思想及び範囲内に含まれる多様な配列を考案することができることを理解しなければならない。また、本明細書に引用されたすべての実施例及び条件付きの語句等は、主に読む手にとって実施例の原理及び本発明が技術発展に寄与する概念を理解しやすくするためのものであり、このような具体的に引用された実施例及び条件に制限されることなく解釈されなければならない。さらに、本開示の原理、様態、及び実施例だけでなく、その特定の例を引用する本願のすべての陳述は、その構造的及び機能的等価物のすべてを含む。また、該等価物は、現時点で既知の等価物と将来開発される等価物、すなわち構造を問わず同一の機能を果たす開発されたすべての要素をすべて含む。

Claims (79)

  1. 化学式１の化合物：

    Figure 2022528465000020

    式中：
    Ｒ１は－Ｙ－Ｚ；
    Ｙは連結基；そして、
    Ｚは水素、ＯＨ、ＳＨ、Ｓ－アシル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、エポキシ、マレイミジル、ハロアセトアミド、カルボキシル、活性化されたカルボキシル、免疫原性担体、タンパク質、標識及び固体支持体から構成された群から選択される。
  2. 連結基が１ないし１５個の炭素原子及び／または０ないし６個のヘテロ原子を含む、請求項１に記載の化合物。
  3. 連結基は－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）－、－Ｃ（０）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（０）（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎＮＨｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ－、－ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ（ヘテロシクリル）Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（０）－から構成された群及びこれらの酸塩から選択され、ｎは１ないし１０の整数である、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｚがタンパク質である、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
  5. タンパク質がヘモシアニン、グロブリン及びアルブミンから構成された群から選択された免疫原性担体である、請求項４に記載の化合物。
  6. 免疫原性担体が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）である、請求項５に記載の化合物。
  7. Ｚが免疫原性担体であり、免疫原性担体は多糖類である、請求項１に記載の化合物。
  8. Ｚが標識である、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
  9. 標識が酵素である、請求項８に記載の化合物。
  10. 酵素がアルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
  11. 酵素がグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である、請求項９に記載の化合物。
  12. 連結基が窒素原子に結合したアシルまたは置換されたアシル基を含む、請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物。
  13. 連結基が窒素原子に結合したアルキルまたは置換されたアルキル基を含む、請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物。
  14. 請求項１ないし１３のいずれかに記載の化学式１の化合物に特異的に結合する抗体。
  15. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１
    アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＳＮＶＥＮＡ（配列番号８）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む抗体と前記化合物に対する結合に対して競合する、請求項１４に記載の抗体。
  16. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＳＮＶＥＮＡ（配列番号８）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記抗体は：
    配列番号１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    配列番号５に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含む、請求項１５または１６に記載の抗体。
  18. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１
    アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＴＮＶＥＮＡ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む抗体と前記化合物に対する結合に対して競合する、請求項１４に記載の抗体。
  19. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＤＩＫＴＧＤＲ（配列番号３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＹＶＳＧＮＤＨＹＤＬ（配列番号４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＬＧＹＴＹＴＮＶＥＮＡ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項１８に記載の抗体。
  20. 配列番号１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    配列番号９に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項１８または１９に記載の抗体。
  21. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＧＴＤＴ（配列番号１３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＳＳＳＴＧＹＹＮＬ（配列番号１４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＲＳＹ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号１７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＨＤＹＹＴＦＴＤＮＤ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む抗体と前記化合物に対する結合に対して競合する、請求項１４に記載の抗体。
  22. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＧＴＤＴ（配列番号１３）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＳＳＳＴＧＹＹＮＬ（配列番号１４）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＲＳＹ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号１７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＨＤＹＹＴＦＴＤＮＤ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項２１に記載の抗体。
  23. 前記抗体は：
    配列番号１１に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    配列番号１５に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項２１または２２に記載の抗体。
  24. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＧＶＧＳＲＧＳ（配列番号２０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＳＳＴＴＧＹＹＩＬ（配列番号２１）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＥＳＩＹＳＹ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＫＡＳ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＮＹＹＴＦＴＥＮＤ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む抗体と前記化合物に対する結合に対して競合する、請求項１４に記載の抗体。
  25. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＴＫ（配列番号１２）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＧＶＧＳＲＧＳ（配列番号２０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＳＳＴＴＧＹＹＩＬ（配列番号２１）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＥＳＩＹＳＹ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＫＡＳ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＮＹＹＴＦＴＥＮＤ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド
    を含む、請求項２４に記載の抗体。
  26. 前記抗体は：
    配列番号１９に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    配列番号２２に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項２４または２５に記載の抗体。
  27. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＷＲ（配列番号２７）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＤＧＧＮＴＮＲ（配列番号２８）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＲＬＧＮＮＤＹＩＤＬ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＱＧＹＮＷＤＬＤＧＡ（配列番号３１）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む抗体と前記化合物に対する結合に対して競合する、請求項１４に記載の抗体。
  28. 前記抗体は：
    アミノ酸配列ＧＦＳＦＷＲ（配列番号２７）を含むＶＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＣＩＤＧＧＮＴＮＲ（配列番号２８）を含むＶＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＲＶＲＬＧＮＮＤＹＩＤＬ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号６）を含むＶＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号７）を含むＶＬＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＱＱＧＹＮＷＤＬＤＧＡ（配列番号３１）を含むＶＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項２７に記載の抗体。
  29. 前記抗体は：
    配列番号２６に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド；及び
    配列番号３０に提示されたアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド；
    を含む、請求項２７または２８に記載の抗体。
  30. 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１４ないし２９のいずれかに記載の抗体。
  31. 前記抗体はウサギモノクローナル抗体である、請求項３０に記載の抗体。
  32. 前記抗体は：ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦａｂ´から構成された群から選択される、請求項１４ないし３１のいずれかに記載の抗体。
  33. 前記抗体がＩｇＧである、請求項１４ないし３２のいずれかに記載の抗体。
  34. 前記抗体がＩｇＧ１である、請求項３３に記載の抗体。
  35. 前記抗体がＦａｂである、請求項１４ないし３１のいずれかに記載の抗体。
  36. 前記抗体が単鎖抗体である、請求項１４ないし３１のいずれかに記載の抗体。
  37. 前記抗体がｓｃＦｖである、請求項３６に記載の抗体。
  38. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１４ないし２９のいずれかに記載の抗体。
  39. 前記抗体がウサギポリクローナル抗体である、請求項３８に記載の抗体。
  40. 前記抗体が対称性ジメチルアルギニンの代謝産物にさらに特異的に結合する、請求項１４ないし３９のいずれかに記載の抗体。
  41. 前記代謝産物は対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）である、請求項４０に記載の抗体。
  42. 請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、または両方を暗号化する、核酸。
  43. 請求項４２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  44. 請求項４２に記載の核酸、または、請求項４３に記載の発現ベクターを含む、細胞。
  45. 請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドを暗号化する第１核酸；及び
    前記抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを暗号化する第２核酸；
    を含む細胞。
  46. 前記第１核酸を含む第１発現ベクター；及び
    前記第２核酸を含む第２発現ベクター；
    を含む、請求項４５に記載の細胞。
  47. 請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体を作製する方法であって、
    細胞が前記抗体を発現するのに適した条件下で、請求項４４ないし４６のいずれかに記載の細胞を培養する段階を含み、前記抗体が生産される方法。
  48. 請求項１ないし１３のいずれかに記載の化学式１の化合物；または
    請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体；または
    請求項４２に記載の核酸；または
    請求項４３に記載の発現ベクター；または
    請求項４４ないし４６のいずれかに記載の細胞；または
    これらの任意の組み合わせ；
    を含む組成物。
  49. 前記組成物が液体培地に存在する、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記組成物は凍結乾燥された形態で存在する、請求項４８に記載の組成物。
  51. 培地内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を測定する方法であって：
    培地内で
    少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物を含有する疑いがある試料、及び
    請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体
    を結合する段階；及び
    対称性ジメチル化アルギニン分析物及び前記抗体を含む複合体の存在または不在を決定する段階；
    を含み、
    前記複合体の存在は試料内で対称性ジメチル化アルギニン分析物の存在を示す、方法。
  52. 前記培地が請求項１ないし１３のいずれかに記載の化学式１の化合物をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. Ｚが標識である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記標識は酵素である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記酵素が：アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼから構成された群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記酵素がグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記決定する段階が前記化合物の酵素反応生成物の存在を検出することを含む、請求項５４ないし５６のいずれかに記載の方法。
  58. 試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を測定するためのキットであって：
    請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体；及び
    試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するために前記抗体を用いるための指針；
    を含むキット。
  59. 前記抗体が対称性ジメチルアルギニンの代謝産物に特異的に結合する、請求項５８に記載のキット。
  60. 前記対称性ジメチルアルギニンの代謝産物の量を決定するための指針をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
  61. 前記代謝産物が対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）である、請求項５９または６０に記載のキット。
  62. 前記抗体が凍結乾燥された形態で存在する、請求項５８に記載のキット。
  63. 請求項１ないし１３のいずれかに記載の化学式１の化合物をさらに含む、請求項５８ないし６２のいずれかに記載のキット。
  64. Ｚが標識である、請求項６３に記載のキット。
  65. 前記標識は酵素である、請求項６４に記載のキット。
  66. 酵素が：アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼから構成された群から選択される、請求項６５に記載のキット。
  67. 前記酵素がグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である、請求項６５に記載のキット。
  68. 前記化合物が凍結乾燥された形態で存在する、請求項６３ないし６７のいずれかに記載のキット。
  69. 試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を測定するためのキットであって：
    請求項１ないし１３のいずれかに記載の化学式１の化合物；及び
    前記試料内で少なくとも１個の対称性ジメチル化アルギニン分析物の量を決定するために前記化合物を用いるための指針
    を含む、キット。
  70. Ｚが標識である、請求項６９に記載のキット。
  71. 前記標識が酵素である、請求項７０に記載のキット。
  72. 前記酵素が：アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼから構成された群から選択される、請求項７１に記載のキット。
  73. 前記酵素がグルコース－６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）である、請求項７１に記載のキット。
  74. 前記化合物が凍結乾燥された形態で存在する、請求項６９ないし７３のいずれかに記載のキット。
  75. 請求項１４ないし４１のいずれかに記載の抗体をさらに含む、請求項６９ないし７４のいずれかに記載のキット。
  76. 前記抗体が対称性ジメチルアルギニンの代謝産物に特異的に結合する、請求項７５に記載のキット。
  77. 前記対称性ジメチルアルギニンの代謝産物の量を決定するための指針をさらに含む、請求項７６に記載のキット。
  78. 前記代謝産物が対称性Ｎα－アセチル－ジメチルアルギニン（Ａｃ－ＳＤＭＡ）である、請求項７６または７７に記載のキット。
  79. 前記抗体が凍結乾燥された形態で存在する、請求項７５ないし７８のいずれかに記載のキット。
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