KR20230006059A - 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

개시된 내용은 동종 효소 면역검정법과 같이, 시료 내에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 검출하는데 사용할 수 있는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합하는 항체에 관한 것이다.

Description

대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대한 항체 및 그의 용도 {ANTIBODIES TO SYMMETRICALLY DIMETHYLATED ARGININE ANAL YTES AND USE THEREOF}
본원은 2019년 4월 3일에 출원된 미국 임시출원 번호 62/828,769호의 출원일에 대한 35 U.S.C.§119(e)에 관한 우선권을 주장하는 것으로서, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 결합된다.
본 발명은 면역검정 분야, 특히 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 검출을 위한 면역검정에 사용될 수 있는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합하는 항체에 관한 것이다.
만성 신장 질환(CKD)은 개와 고양이에게 흔한 문제이다. CKD를 치료할 수 있는 없지만 이 질병을 가진 환자를 위한 의료 관리는 가능하다. 그 연구는 가능한한 질병 경과의 초기에 의료 관리 및 모니터링을 시작하는 것을 목표로 CKD의 조기 발견에 초점을 맞추고 있다. 대칭 디메틸아르기닌(Symmetric dimethylarginine)은 최근에 고양이와 개에 있어서 CKD의 조기 발견에 도움이 될 수 있는 새로운 신장 배설 바이오마커로 등장하였다.
비대칭 디메틸아르기닌(asymmetric dimethylarginine, ADMA; 도 2) 및 모노메틸아르기닌(monomethylarginine, MMA, 또는 N-메틸아르기닌; 도 2)에 부가하여 대칭 디메틸아르기닌(SDMA; 도 1)은 거의 모든 세포 내의 아르기닌 잔류물을 포함하는 단백질의 번역후 변형(메틸화, methylation)으로부터 유래한다. 단백질 가수분해, 또는 단백질 브레이크다운(breakdown) 후에 이러한 단백질 잔류물은 순환계로 배출된다. 신장 질환, 심혈관 건강, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 류머티즘 관절염 및 기타 질병의 평가를 위한 마커로서, 혈청 대칭 디메틸아르기닌의 잠재적인 사용이 광범위하게 연구되어 왔다.
대칭 디메틸아르기닌은 주로 신장 배설을 통하여 체내에서 제거된다. 크레아티닌과 달리 대칭 디메틸아르기닌은 무지방 신체 질량을 포함한 비신장 요인의 영향을 받지 않는다. 대칭 디메틸아르기닌은, 혈장 단백질에 부분적으로 결합되어 있는 비대칭 디메틸아르기닌과 달리, 단백질에 결합하지 않는다. 비대칭 디메틸아르기닌과 사구체 여과율(GFR) 사이의 상관관계는 훨씬 약한 것으로 나타나는데, 이는 사구체 여과를 방해하는 비대칭 디메틸아르기닌의 단백질 결합 분획 때문인 것으로 보인다.
대칭 디메틸아르기닌의 혈청 농도는 인간의 CKD 환자에서도 증가한다. 혈청 대칭 디메틸아르기닌 농도는 GFR과 반비례하는 것으로 나타났다.
대칭 디메틸아르기닌 및 대칭형 Nα-아세틸-디메틸아르기닌의 순환 대사산물(도 1) 역시 확인되었으며 이 또한 GRF와 상관관계가 있을 수 있다. 대칭 디메틸아르기닌의 아세틸화 반응은 세포 밖에서 발생하여 대사산물을 생성한다.
대칭 디메틸아르기닌은 거의 독점적으로 신장에 의하여 제거되기 때문에, 이는 GFR 바이오마커의 이상적인 후보로 만든다. 따라서 대칭 디메틸아르기닌은 이미 수의학 분야에서 널리 사용되는 신장 기능의 새로운 내인성 바이오마커이다.
대칭 디메틸아르기닌을 정량화하기 위한 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)은 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 방법들은 대칭 디메틸아르기닌을 정량화하기 전에 대칭 디메틸아르기닌을 함유하는 것으로 의심되는 시료에 아실화 유도체화 시약의 첨가를 포함하는 시료 준비 단계를 포함한다. 대칭 디메틸아르기닌은 아실화 시약에 의해 정량적으로 Nα-아실-SDMA로 전환된다. ELISA 제품에 사용된 항체는 대칭 디메틸아르기닌의 Nα-아실화 형태에만 결합하고 유리 대칭 디메틸아르기닌에는 결합하지 않는다.
보다 최근에는, 유리 대칭 디메틸아르기닌만 검출하지만 Nα-아실화 대칭 디메틸아르기닌과 교차 반응하지 않는 항체를 사용하는 유리 대칭 디메틸아르기닌에 대한 경쟁 면역검정이 개발되었다. 경쟁 면역검정에 사용되는 항체는 유리 대칭 디메틸아르기닌에만 특이적인 항체를 생성하는 특정 면역원에 대해 개발된다. 대칭 디메틸아르기닌의 산성 카르복실기(-COOH)의 화학적 변형에 관련하는 유도체인 합텐(Haptens)이 사용된다. 항체는, 유리 대칭 디메틸아르기닌(즉, 폴리펩티드 사슬의 일부가 아닌 대칭 디메틸아르기닌)을 검출하는데 사용되고 비대칭 디메틸아르기닌, L-아르기닌 및 N-메틸아르기닌과 교차 반응성을 전혀 또는 실질적으로 나타내지 않는다.
대칭 디메틸아르기닌의 측정은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 수행할 수도 있다. LC-MS/MS 기술은 여전히 복잡하며 테스트 개발 및 운영에 상당한 수준의 전문 지식이 필요하다. 또한, LC-MS/MS 검정은 완전히 자동화되지 않았으며 결과가 생성되기까지 상당한 시료 준비와 시간이 필요하므로, 혈청 크레아티닌에 대한 자동 검정과 비교할 때 처리 시간이 늘어나게 된다.
대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 검출을 가능하게 하는 도구를 개발하는 것에 대한 지속적인 필요가 있다.
본 개시내용은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 면역검정 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 신호 생성 면역검정 시스템에서 대칭 디메틸아르기닌의 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이러한 분석물의 포획을 위한 항체를 생성하는데 사용되는 대칭 디메틸아르기닌의 면역원의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물"은 대칭 디메틸아르기닌에 공통적인 항체 결합 에피토프(epitope)를 갖는 분석물을 지칭한다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 포함된 분석물에는 대칭 디메틸아르기닌(SDMA), 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌과 같은 대칭 Nα-아실화-디메틸아르기닌, 및 SDMA-Gly-Gly 디펩티드와 같은 SDMA-펩티드 유도체가 포함된다.
일부 실시예에서, 본 개시내용은 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자 상에 알킬화된 대칭 디메틸아르기닌 합텐을 제공한다(도 1). 특정 실시예에서, 이러한 합텐은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적인 항체를 생산하는 데 사용된다.
일부 실시예에서, 본 개시내용은 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자 상에서 아실화된 대칭 디메틸아르기닌 유도체를 제공한다(도 1). 특정 실시예에서, 이러한 유도체들은 본 명세서에 기술된 면역검정에 유용한 결합체를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시예에서, 본 개시내용은 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌과 같은 대칭 디메틸아르기닌 대사산물에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제공한다(도 1).
일부 실시예에서, 본 개시내용은 유리 대칭 디메틸아르기닌, 및 대칭 Nα-아세틸화-디메틸아르기닌 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제공한다(도 1).
일부 실시예에서, 항체는 비대칭 디메틸아르기닌, L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌 중 하나 이상에 특이적으로 결합할 수 있다(도 2).
일부 실시예에서, 본 개시내용은 유리 대칭 디메틸아르기닌 및 SDMA-Gly-Gly 디펩티드와 같은 SDMA-펩티드 유도체에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제공한다(도 3).
일부 실시예에서, 본 개시내용은 대칭 디메틸아르기닌으로부터 출발하는 대칭 디메틸아르기닌 합텐, 면역원 및 결합체의 합성 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 합성은 연결기를 갖는 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자를 통해 단백질 또는 표지(예를 들어, 표지 효소)에 결합하는 것을 포함한다.
본 개시의 일 실시예의 예는 하기 화학식 1의 화합물이다:
화학식 1
Figure pat00001
여기에서:
R1은 -Y-Z; 또한
Y는 연결기이고 Z는 수소, OH, SH, S-아실, O-알킬, 할로겐, NH2, 에폭시, 말레이미딜, 할로아세트아미드, 카르복실, 활성화된 카르복실, 면역원성 담체, 단백질 및 표지로부터 선택된다.
본 개시내용의 실시형태는 항체들을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 개시내용의 항체는 본 개시내용 다른 곳에 기재된 화학식 1의 임의의 화합물을 포함하여, 본 개시내용의 임의의 화합물에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용의 임의의 항체를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산과 발현 벡터를 포함하는 세포가 또한 제공된다.
또한, 본 개시내용의 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포가 항체를 발현하는데 적합한 조건하에 본 개시내용의 세포를 배양하는 것을 포함하고, 여기에서 항체가 생성된다.
본 개시내용의 양태는 조성물을 더 포함한다. 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 임의의 항체, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 세포를 포함할 수 있다.
또한 배지 내에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 측정하는 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 이러한 방법은 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 및 본 개시내용의 항체를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 배지에서 조합하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 및 항체를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복합체의 존재는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재를 나타낸다.
본 개시내용의 양태는 키트를 추가로 포함한다. 일부 실시예에 따르면, 키트는 시료에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하는데 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 키트는 본 개시내용의 임의의 항체, 및 시료에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위해 항체를 사용하기 위한 지침을 포함한다. 이러한 키트는 본 개시내용의 화학식 1의 임의의 화합물을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 키트는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물, 및 시료에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위해 그 화합물을 사용하기 위한 지침을 포함한다. 이러한 키트는 본 개시내용의 임의의 항체를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 본 출원의 일부를 형성하는 첨부된 도면과 관련하여 취해진 이하의 상세한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 수 있다:
도 1은 대칭 디메틸아르기닌 및 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌에 대한 화학적 구조를 보여준다.
도 2는 비대칭 디메틸아르기닌, 모노메틸아르기닌 및 아르기닌에 대한 화학적 구조를 나타낸다.
도 3은 SDMA-Gly-Gly 디펩티드에 대한 화학적 구조를 보여준다.
도 4(좌측)는 본 발명의 실시예에 따른 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노 질소 원자에 변형된 SDMA-M(Nα-알킬-SDMA) 합텐을 나타낸다. 도 4(우측)는 본 발명의 실시예에 따른 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노 질소 원자에 변형된 SDMA-SBAP(Nα-아실-SDMA) 합텐을 나타낸다.
도 5는 본 개시내용의 실시예에 따른 SDMA-M(Nα-알킬-SDMA) 합텐에 대한 반응식을 나타낸다.
도 6은 본 개시내용의 실시예에 따른, SDMA-SBAP(Nα-아실-SDMA) 합텐에 대한 반응식을 도시한다.
도 7은 본 개시내용의 실시예에 따른, SDMA-M-SH-G6PDH에 대한 반응식을 나타낸다.
도 8은 본 개시내용의 실시예에 따른, SDMA-M-SH-KLH 면역원에 대한 반응식을 나타낸다.
도 9는 본 개시내용의 실시예에 따른, SDMA-SBAP-SH-BSA 면역원에 대한 반응식을 나타낸다.
도 10은 본 개시내용의 실시예에 따른, 항체 스크리닝 기술을 나타낸다.
도 11은 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #26494, 모노클로날 항체 1H2/1K4, 모노클로날 항체 3H1/3K3, 및 모노클로날 항체 5H1/5K1을 사용한 대칭 디메틸아르기닌 보정 곡선의 그래프를 나타낸다.
도 12는 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #21342, 모노클로날 항체 1H4/1K4, 모노클로날 항체 8H1/8K3, 및 모노클로날 항체 18H1/18K2를 사용한 대칭 디메틸아르기닌 보정 곡선의 그래프를 나타낸다.
도 13은 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #26494, 모노클로날 항체 1H2/1K4, 모노클로날 항체 3H1/3K3, 모노클로날 항체 5H1/5K1을 사용한 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌 보정 곡선의 그래프를 나타낸다.
도 14는 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #21342, 모노클로날 항체 1H4/1K4, 모노클로날 항체 8H1/8K3, 및 모노클로날 항체 18H1/18K2를 사용한 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌 보정 곡선의 그래프를 나타낸다.
도 15는 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #26494(도 15d), 모노클로날항체 1H2/1K4(도 15a), 모노클로날 항체 3H1/3K3(도 15b), 모노클로날항체 5H1/5K1(도 15c)을 이용한 대칭 디메틸아르기닌의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
도 16은 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #21342(도 16d), 모노클로날 항체 1H4/1K4(도 16a), 모노클로날 항체 8H1/8K3(도 16b) 및 모노클로날 항체 18H1/18K2(도 16c)를 사용한 대칭 디메틸아르기닌의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
도 17은 본 개시의 실시예들에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #26494(도 17d), 모노클로날 항체 1H2/1K4(도 17a), 모노클로날 항체 3H1/3K3(도 17b), 모노클로날 항체 5H1/5K1(도 17c)를 사용한 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
도 18은 본 개시의 실시예들에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #21342(도 18d), 모노클로날 항체 1H4/1K4(도 18a), 모노클로날 항체 8H1/8K3(도 18b) 및 모노클로날 항체 18H1/18K2(도 18c)을 사용한 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
도 19는 본 개시내용의 실시예에 따른, 모노클로날 항체 3H1/3K3 (도 19a) 및 모노클로날 항체 8H1/8K3(도 19b)를 사용한 SDMA-Gly-Gly 디펩티드의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
도 20은 본 개시내용의 실시예에 따른, 토끼 폴리클로날 항체 #27410을 사용한 SDMA 및 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌의 소량 첨가 회수율 실험 그래프이다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 물론 설명된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 하며, 이는 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 것이기 때문이다.
수치들의 범위가 제공되는 경우, 각 중간값은, 해당 범위의 상한 및 하한과 기타 명시된 또는 중간값 사이에서, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지는, 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
명확성을 위해, 별도의 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정 특징은 단일 실시예에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 속하는 실시예들의 모든 조합은 본 발명에 의해 특정하게 포함되며, 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것과 같이 본 명세서에 개시되며, 그러한 조합은 예를 들어 다음과 같은 안정적인 화합물(즉, 생물학적 활성에 대해 제조, 분리, 특성화 및 테스트할 수 있는 화합물)인 것으로 포괄된다. 또한, 다양한 실시예의 모든 하위 조합 및 그 요소(예를 들어, 그러한 변수를 설명하는 실시예에 나열된 화학기의 요소)도 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 각각의 모든 하위 요소인 것처럼 여기에 개시되고, 그러한 조합은 본 명세서에 개별적으로 또한 명시적으로 개시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수는 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위해 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태라도 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이처럼, 이러한 진술은 청구 범위 중의 구성요소의 인용 또는 "부정적" 한정의 사용과 관련하여 "순전히", "오로지" 등의 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거로 사용하는 것을 의도한 것이다.
명확성을 위해, 개별적인 실시예들의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정한 특징들이 단일 실시예에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다.
여기에 논의된 간행물은 본원의 출원일 이전의 개시를 위해서만 제공된 것이다. 본 명세서 내의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공개보다 선행되지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로 별도로 확인해야 할 수도 있다.
본 개시의 특정 실시예의 설명을 더 진행하기 전에, 다수의 용어가 정의될 것이다.
정의
분석물
측정할 화합물 또는 조성물, 관심 물질. 분석물은 특이적 결합쌍(sbp)의 구성요소가며 1가 또는 다가의, 일반적으로 항원 또는 합텐인 리간드일 수 있으며, 하나 이상의 공통 에피토프 또는 결정인자 부위를 공유하는 단일 화합물 또는 복수의 화합물이다.
분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료
분석물을 함유하는 것으로 합리적으로 의심되는 모든 시료는 본 개시내용의 방법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 시료에는 인간, 동물 또는 인공 시료가 포함될 수 있다.
시료는 검정을 방해하지 않는 어떠한 편리한 배지에서도 준비될 수 있다. 일반적으로 시료는 한정하는 것은 아니지만, 소변, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액 또는 타액과 같은 수용액 또는 천연 유체이다. 어떤 경우에 시료는 혈청이다.
분석물의 양 측정
정량적, 반정량적 및 정성적 방법 및 분석물을 결정하는 다른 모든 방법은 분석물의 양을 측정하는 방법으로 간주된다. 예를 들어, 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료에서 단순히 분석물의 유무만 검출하는 방법도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다.
본 개시내용의 범위 내에서 고려되는 "분석물의 양 측정"이라는 문구에 대한 동의어는, 한정하는 것은 아니지만, 분석물의 검출, 측정 또는 결정; 분석물의 존재를 검출, 측정 또는 결정하는 단계; 분석물의 양을 검출하거나 결정하는 단계; 및 분석물의 농도를 검출, 측정 또는 결정하는 단계를 포함한다.
특정 바인딩 쌍의 구성요소
특이적인 결합쌍(sbp 구성요소)의 구성요소는 두 개의 상이한 분자 중 하나이며, 표면 또는 공동에 특정적으로 결합하여 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직과 상보적인 것으로 정의되는 영역을 갖는다. 특이적 결합쌍의 구성요소는 리간드 및 수용체(안티리간드), sbp 구성요소 및 sbp 파트너 등으로 지칭된다. 이들은 일반적으로 항원-항체와 같은 면역학적 쌍의 구성요소이다.
리간드
수용체가 자연적으로 존재하거나 준비될 수 있는 모든 유기 화합물. 예를 들어, 본 개시내용의 한 맥락에서, 분석물은 리간드이고 본 개시내용은 리간드인 분석물의 양 또는 농도를 결정하기 위한 방법을 제공한다.
수용체
수용체는 분자의 특정 공간 및 극성 조직을 인식할 수 있는 모든 화합물 또는 구성이다. 분자의 이러한 조직화된 영역을 에피토프 또는 결정자 부위라고 한다. 예시적인 자연 발생 수용체에는 항체 및 효소가 포함된다.
에피토프
"에피토프"는 면역 반응을 유도할 수 있고 그러한 반응에 의해 생성된 특정 항체와 결합할 수 있는 항원 표면 상의 분자 영역으로서, 결정기, 항원 결정기라고도 한다. 합텐(대칭 디메틸아르기닌과 같은)과 관련하여, 합텐을 면역원성 담체에 결합시킴으로써 비-항원성 합텐 분자에 대한 항체가 생성될 수 있다. 그 후 합텐에 의해 규정된 "에피토프"를 인식하는 항체가 생성된다.
연결기
연결기는 두 개 이상의 하위 구조를 연결하는 구조의 일부이다. 연결기는 하위 구조 사이에서 연장되는 원자의 중단되지 않은 하나 이상의 사슬을 가지고 있다. 연결기의 원자 자체는 화학 결합으로 연결된다. 연결기의 원자 수는 수소 이외의 원자를 세어 결정된다.
결합체(Conjugate)
결합체는 연결기를 통해 함께 결합되어 단일 구조를 형성하는 둘 이상의 하위 구조로 구성된 분자이다. 결합은 연결기를 통해 소단위체를 연결함으로써 이루어질 수 있다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 결합체는 합텐, sbp 구성요소 또는 분석물 유사체에 부착된 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH) 효소, 예를 들어 G6PDH 돌연변이 효소가 사용되는 결합체를 포함할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,455,288호, 제6,090,567호 및 제6,033,890호에 기재된 바와 같은 재조합체 G6PDH). 본 개시내용의 맥락 내에서, G6PDH는 G6PDH 효소와 같은 효소, 또는 G6PDH 표지와 같은 표지로 지칭될 수 있다. 어떤 경우에, 결합체는 한정하는 것은 아니지만, G6PDH, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 및 양고추냉이(horse radish) 과산화효소를 포함하는 표지(예를 들어, 표지 단백질), 또는 합텐, sbp 구성요소 또는 분석물 유사체에 부착된 형광, 발광 또는 비색과 같은 화학적 표지를 포함할 수 있다.
결합
결합은 두 개의 소단위가 함께 연결되어 결합체를 형성하는 모든 과정이다. 결합과정은 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 임의의 수의 단계로 구성될 수 있다.
합텐
합텐은 상응하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있지만 일반적으로 그 자체가 항체 제조를 위한 면역원으로 작용하지는 않는다. 합텐을 인식하는 항체는 면역원성 담체에 연결된 합텐으로 구성된 화합물에 대해 제조할 수 있다.
대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물
"대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물"은 대칭 디메틸아르기닌에 공통적인 항체-결합 에피토프를 갖는 분석물을 지칭한다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 포함된 분석물에는 대칭 디메틸아르기닌(SDMA), 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌과 같은, 대칭 Nα-아실화-디메틸아르기닌 및 SDMA-Gly-Gly 디펩티드와 같은 SDMA-펩티드 유도체가 포함된다.
유도체
용어 "유도체"는 하나 이상의 화학 반응에 의해 모 화합물로부터 만들어진 화학적 화합물 또는 분자를 지칭한다.
유사체
"유사체"라는 용어는 다른 화합물과 유사한 구조를 가지나 특정 성분에 있어서는 다른 화합물을 말한다. 그것은 하나 이상의 원자, 작용기 또는 하위 구조에서 다를 수 있으며 다른 원자, 그룹 또는 하위 구조로 대체된다.
표지 (Label)
"표지", "검출기 분자", "리포터" 또는 "검출 가능한 마커"는 검출 가능한 신호를 생성하거나 생성하도록 유도될 수 있는 임의의 분자이다. 표지는 분석물, 면역원, 항체, 또는 수용체와 같은 다른 분자 또는 특히 합텐 또는 항체와 같은 수용체에 결합할 수 있는 분자에 결합될 수 있다. 표지는 연결기에 의해 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 표지의 비제한적 예로서는 방사성 동위원소(예를 들면 125I), 효소(예를 들면, β-갈락토시다제, 페록시다아제), G6PDH(예를 들어 미국 특허 번호 6,455,288, 6,090,567, 및 8903에 기재된 바와 같은 재조합 G6PDH인 돌연변이 G6PDH), 효소 단편, 효소 기질, 효소 억제제, 조효소, 촉매, 형광단(예를 들면 로다민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC, 또는 Dylight 649), 염료, 화학발광제 및 발광제(예를 들면, 디옥세탄, 루시페린), 또는 증감제를 포함한다.
면역원
용어 "면역원"은 유기체에서 면역 반응을 유도, 생성 또는 생성할 수 있는 물질을 지칭한다.
면역원성 담체
본 명세서에 사용된 "면역원성 담체"는 하나 이상의 위치에서 합텐과 결합할 수 있는, 일반적으로 단백질로서, 이러한 합텐과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생산을 가능하게 하는 면역원성 물질이다. 면역원성 담체 물질의 예는 단백질, 당단백질, 복합 폴리아미노-다당류, 입자, 및 외래로 인식되어 숙주로부터의 면역학적 반응을 유도하는 핵산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 폴리아미노-다당류는 이러한 제조에 대해 공지된 임의의 통상적인 수단을 사용하여 다당류로부터 제조될 수 있다.
단백질
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 임의의 길이의 아미노산의 중합체적 형태를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 유전적으로 코딩되거나 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드, 및 융합 단백질을 포함할 수 있다.
신호 생성 시스템
"신호 생성 시스템"은 분석물에 대한 검정에 사용되며 하나 이상의 구성요소를 가질 수 있으며, 적어도 하나의 구성요소는 검출 가능한 표지(예를 들어, 돌연변이 G6PDH와 같은 G6PDH)이다. 신호 생성 시스템은 시료 내 분석물의 존재 또는 양과 관련된 신호를 생성한다. 신호 생성 시스템에는 측정가능한 신호를 생성하는 데 필요한 모든 시약이 포함된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적으로, G6PDH 또는 표지 단백질(예를 들어, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 양고추냉이 페록시다아제)은 분석물과 유사한 sbp 구성요소에 결합된다.
신호 생성 시스템의 다른 구성 요소에는 기질, 개선제, 활성제, 화학발광 화합물, 보조인자, 억제제, 스캐빈저, 금속 이온, 신호 생성 물질의 결합에 필요한 특이적 결합 물질, 조효소, 효소 생성물과 반응하는 물질, 기타 효소 및 촉매 등을 들 수 있다.
신호 생성 시스템은 예를 들어 육안 검사와 같은 전자기 복사의 측정과 같은 외부 수단에 의해 감지할 수 있는 신호를 제공한다. 일부 예에서, 신호 생성 시스템은 발색 기질 및 효소 표지(예를 들면, 돌연변이 G6PDH 효소)를 포함하며, 여기서 발색 기질은 자외선 또는 가시광선 영역의 빛을 흡수하는 염료로 효소적으로 전환된다.
분리된
항체와 관련하여 사용될 때 "분리된"이라는 것은 어떠한 자연 상태에서 "사람의 손에 의해" 변경된 것을 의미한다. 즉, 자연에서 발생하는 경우라면, 원래의 환경에서 변경되거나 제거되었거나 또는 양자 모두이다. 예를 들어, 살아있는 동물이 자연 상태로 자연적으로 존재하는 자연 발생 항체는 "분리된" 것은 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 항체는 본 명세서에서 사용되는 용어대로 "분리된" 것이다. 항체는 천연 발생 조성물이 아닌 면역검정 시약과 같은 조성물에서 발생할 수 있으며, 그 안에는 본원에서 사용되는 용어의 의미 내에서 분리된 항체가 남아 있다.
교차-반응성
"교차-반응성"은 항체를 유도하는데 사용되지 않은 항원과 항체의 반응을 의미한다. "교차-반응성"은 표적 분석물의 공지의 희석액을 사용하여 표준 곡선을 설정함으로써 정량적 면역검정에서 결정할 수 있다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 유사한 조건에서 검정된 시료에서 다양한 알려진 양으로 존재하는 간섭 물질의 겉보기 농도를 계산한다. 교차-반응성은 겉보기 농도를 실제 농도로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
교정 및 대조 물질
"교정 및 대조 물질"이라는 문구는 알려진 양의 분석물을 포함하는 모든 표준 또는 참조 물질을 나타낸다. 분석물과 해당 보정 물질을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 유사한 조건에서 검정한다. 분석물질의 농도는 미지의 시료 또는 알려진 농도의 분석물질을 포함하는 시료에 대해 얻은 결과와 표준물질에 대해 얻은 결과를 비교하여 계산한다. 이것은 일반적으로 보정 곡선을 구성하거나 생성함으로써 수행된다.
감도
검출 한계라는 의미, 즉 분석물이 없을 때 얻어지는 신호와 구별할 수 있는 신호를 제공하는 가장 적은 양의 분석물이라는 의미로 사용된다.
소량첨가 회수율(Spike-Recovery)
"소량첨가 회수율"은 시료 혼합물에 첨가된(소량 첨가된) 분석물의 알려진 양과 비교하여 시료 혼합물 내의 분석물(회수)의 양을 측정하는 검정을 나타낸다. 분석물의 양을 측정하는 것은 농도(ng/mL) 또는 백분율(%)로 표현될 수 있다.
효소 활성의 실질적인 변화
효소가 분석물에 대한 검정에서 표지로 사용될 때 분석물의 검출을 허용하기에 충분한 효소의 활성 변화. 전형적으로 효소의 활성은 10~100%, 예를 들어 20 ~ 99% 또는 30 ~ 95% 감소한다.
*억제 항체
효소에 존재하는 에피토프와 결합하여 효소 또는 효소-리간드 결합체의 활성을 억제할 수 있는 항체. 이러한 항체는 리간드에 결합하여 효소-리간드 결합체의 효소 활성을 억제할 수 있는 항-리간드 항체와 구별된다.
조절
검정 실험에서 "조절"은 분석물-항체 결합 부위를 놓고 경쟁하는 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료에서 효소 및 분석물과 같은 표지에 부착된 합텐 또는 분석물을 지칭하며, 형성된 효소 생성물의 양을 조절한다(도 10 참조).
최대 억제
"최대 억제"는 과량의 항체가 검정에 첨가될 때 효소에 존재하는 에피토프 및 분석물의 부재 하에 얻은 신호에 결합할 때 효소 또는 효소-리간드 결합체의 활성을 억제할 수 있는 항체를 지칭한다.
보조 재료
다양한 보조 물질이 본 개시내용에 따른 검정에서 자주 사용될 것이다. 예를 들어, 완충액은 일반적으로 검정 배지에 존재할 뿐만 아니라 검정 배지 및 검정 성분에 대한 안정화제도 존재한다. 흔히, 이러한 첨가제에 더하여, 알부민 또는 계면활성제, 특히 비이온성 계면활성제, 결합 증강제, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 등과 같은 추가 단백질이 포함될 수 있다.
화합물, 결합체 및 이의 합성
동종의 효소 면역검정은, 효소 활성이 sbp 파트너의 결합에 따라 강하게 조절될 수 있는 효소-sbp 구성요소 결합체의 가용성에 의존한다. 본 개시내용은 동종 면역검정에 유용한 검정을 수행하는 효소-sbp 구성요소 결합체 및 항체를 제공한다.
특정 실시예에서, 단백질 면역원이 합성되고 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 같은 화합물에 특이적인 항체를 제조하는 데 사용된다. 항체는 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 검출하는 방법에 사용될 수 있다. 표지 결합체가 제조되고 상기 방법에 사용될 수 있다. 위에서 언급한 하나 이상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재에 대한 시료의 효과적인 스크리닝이 실현될 수 있다.
면역원 및 표지 결합체는 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자를 통해 단백질 또는 표지에 연결된 대칭 디메틸아르기닌의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 결합체는 본원에서 각각 단백질 결합체 또는 표지 결합체로 지칭될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 본 개시내용에 따른 항체를 생성하는데 유용한 화합물을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 화합물은 본 명세서에 기재된 면역검정에 유용한 결합체를 포함한다. 특정 실시예에서, 화합물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함한다:
Figure pat00002
여기에서:
R1은 -Y-Z;
Y는 연결기; 또한
Z는 수소, OH, SH, S-아실, O-알킬, 할로겐, NH2, 에폭시, 말레이미딜, 할로아세트아미드, 카르복실, 활성화된 카르복실, 면역원성 담체, 단백질 및 표지로부터 선택된다.
일부 실시예에서, Z는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 면역원성 담체일 수 있다. 면역원성 담체는 대칭 디메틸아르기닌 합텐에 결합될 수 있으며, 이로써 합텐과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생산을 가능하게 한다. 예를 들어, 면역원성 담체는 헤모시아닌, 글로불린, 알부민 및 다당류로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 면역원성 담체는 소 혈청 알부민(BSA)이다. 일부 경우에, 면역원성 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin: KLH)이다. 특정 실시예에서, 면역원성 담체는 하나 이상의 작용기를 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 면역원성 담체상의 작용기는 화학식 1의 화합물에서 연결기에 대한 면역원성 담체의 부착을 용이하게 하는 반응성 작용기일 수 있다.
일부 실시예에서, 대칭 디메틸아르기닌 합텐은 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자 상에서 알킬화된다(도 1). 이와 같이, 일부 경우에, 연결기는 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자에 부착된(즉, R1 -질소 원자에 부착된) 알킬 또는 치환된 알킬기를 포함한다. 특정 실시예에서, 이러한 합텐은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적인 항체를 생산하는 데 사용된다.
특정 실시예에서, Z는 표지이다. 표지는 검출 가능한 신호를 생성하거나 생성하도록 유도될 수 있는 분자이다. 예를 들어, 표지는 알칼리성 포스파타제,β-갈락토시다제 및 양고추냉이 페록시다아제로부터 선택된 효소와 같은 효소일 수 있다. 일부 실시예에서, 표지는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)인 효소이다. 일부 경우에, G6PDH는 야생형 형태에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 돌연변이 G6PDH이다. 예를 들어, 돌연변이 G6PDH는 시스테인 치환, 예를 들어 G6PDH 효소의 각 서브유닛에서 시스테인 치환을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 연결기가 시스테인 잔기에서 G6PDH 효소에 부착될 수 있다. 특정 실시예에서, 표지는 하나 이상의 작용기를 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 표지 상의 작용기는 화학식 1의 화합물에서 연결기에 대한 표지의 부착을 용이하게 하는 반응성 작용기일 수 있다.
일부 실시예에서, 대칭 디메틸아르기닌 유도체는 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자 상에서 아실화된다(도 1). 이와 같이, 일부 경우에, 연결 기는 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자에 부착된(즉, R1 -질소 원자에 부착된) 아실 또는 치환된 아실 기를 포함한다. 특정 실시예에서, 이러한 유도체는 본 명세서에 기재된 면역검정에 유용한 결합체를 생성하는 데 사용된다.
특정 실시예에서, Z는 단백질이다. 단백질은 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 또는 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 등과 같은 임의의 수의, 디펩티드, 트리펩티드와 같은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 단백질은 하나 이상의 작용기를 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 단백질 상의 작용기는 화학식 1의 화합물에서 연결기에 대한 단백질의 부착을 용이하게 하는 반응성 작용기일 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 아실화된다. 어떤 경우에는 단백질이 알킬화된다.
연결기는 약 1 내지 25개의 원자(수소 원자 제외)를 포함할 수 있고 2 내지 15개의 원자(수소 원자 제외)의 사슬을 포함할 수 있으며, 각각은 탄소, 산소, 황, 질소, 할로겐 및 인으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 연결기는 1 내지 15개의 탄소 원자 및/또는 0 내지 6개의 헤테로원자를 포함한다. 연결기의 예는, 한정되는 것은 아니지만, -(CH2)nC(O)-, -C(O)(CH2)n-, -C(O)(CH2)n-NHC(O)-, -C(0)(CH2)nNHC(0)(CH2)n-, -(CH2)nSCH2C(O)-, -(CH2)nC(O)NH(CH2)n-, -(CH2)nNHC(O)-, -(CH2)nNHc(O)(CH2)n-, NH(CH2)nC(O)-, -(CH2)n-, 및 -(CH2)n(헤테로사이클릴)S(CH2)nC(0)-이고, n은 1 내지 10의 정수이며, 이들의 산염을 포함한다. 특정 실시예에서, 연결기는 -C(O)(CH2)nNHC(O)(CH2)n-, 예를 들어, -C(O)(CH2CH2)NHC(O)(CH2)-이다. 특정 실시예에서, 연결기는 -(CH2)n(헤테로시클릴)S(CH2)nC(O)-, 예를 들어 -(CH2CH2CH2CH2)(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)S(CH2)C(O)- 이다.
연결기 내의 헤테로원자의 수는 0 내지 6, 예를 들어 약 1 내지 5, 또는 2 내지 5, 또는 3 내지 5의 범위일 수 있다. 연결제는 지방족 또는 방향족일 수 있다. 헤테로원자가 존재할 때, 산소는 탄소, 황, 질소 또는 인에 결합된 옥소 또는 옥시로 존재할 수 있으며; 질소는 탄소, 산소, 황 또는 인에 결합된 니트로, 니트로소 또는 아미노로 존재할 수 있으며; 황은 산소와 유사할 수 있다. 인은 포스포네이트 및 포스페이트 모노 또는 디-에스테르와 같은 탄소, 황, 산소 또는 질소에 결합될 수 있다. 연결기과 결합될 분자 사이에 공유 결합을 형성하는 일반적인 기능은 알킬아민, 아미딘, 티오아미드, 에테르, 우레아, 티오우레아, 구아니딘, 아조, 티오에테르 및 카르복실레이트, 술포네이트, 및 포스페이트 에스테르, 아미드 및 티오에스테르이다.
특정 실시예에서, 연결기가 질소 및 황 유사체를 포함하는 비 옥소카르보닐기를 갖는 경우, 포스페이트기, 아미노기, 할로 또는 토실알킬과 같은 알킬화제, 옥시(히드록실 또는 황 유사체, 머캅토)옥소카르보닐(예를 들어, 알데하이드 또는 케톤), 또는 활성 올레핀, 예를 들어 비닐 설폰 또는 α-,β-불포화 에스테르, 이들 관능기는 아민기, 카르복실기, 활성 올레핀, 알킬화제, 예를 들어 브로모아세틸에 연결될 수 있다. 아민과 카르복실산 또는 그 질소 유도체 또는 인산이 연결되면 아미드, 아미딘 및 포스포르아미드가 형성될 수 있다. 메르캅탄과 활성화된 올레핀이 연결되면 티오에테르가 형성될 수 있다. 메르캅탄과 알킬화제가 연결된 경우 티오에테르가 형성될 수 있다. 알데히드와 아민이 환원 조건에서 연결되면 알킬아민이 형성될 수 있다. 카르복실산 또는 인산염과 알코올이 연결되면 에스테르가 형성될 수 있다. 다양한 연결기가, 예를 들어 Cautrecasas, J. Biol. Chem (1970) 245:3059에 기술되어 있다.
대칭 디메틸아르기닌에 대한 검정법을 개발하기 위해 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물의 화학 구조가 사용된다. 예를 들어, 비대칭 디메틸아르기닌은 구아니듐기의 말단 질소 원자 중 하나에 추가된 2개의 메틸기를 갖는다(도 2 참조). 모노메틸 아르기닌은 말단 질소 원자 중 하나에 단일 메틸기를 갖는다(도 2). 대칭 디메틸아르기닌은 2개의 메틸기를 가지며, 하나의 메틸 기는 구아니딘기의 말단 질소 원자 각각에 추가된다(도 1). 화학 구조의 특정 대칭 메틸화는 면역원을 준비하고 그에 따라 항체를 생성하기 위해 유지된다.
본 개시내용은 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자의 변형에 의한 대칭 디메틸아르기닌 합텐 및 면역원의 설계를 제공한다. 본 발명의 합텐 SDMA-M 및 SDMA-SBAP가 도 4에 도시되어 있다. 대칭 디메틸 아르기닌의 아민 질소에서의 연결기의 배치는 분석물이 대칭 디메틸화 구아니딘기를 공유하기 때문에 대칭 디메틸 아르기닌 분석물과 특이적으로 반응할 수 있는 항체를 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 다양한 유형의 면역검정에 유용한 대칭 디메틸아르기닌 유도체(즉, 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물) 및 면역원을 제공한다(예를 들어, 도 10 참조).
본 개시내용에 따른 항체 및 결합체를 생성하는데 유용한 화합물은 하기 기재된 일반적인 합성 방법에 따라 합성될 수 있다. 화학식 1의 화합물은 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기 반응식은 단지 방법의 예를 나타내기 위한 것이며 본 개시내용을 제한하는 것을 의미하지 않는다.
가) 합텐
대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자에 대한 말레이미드 작용기의 부착은 계획 1에 나타낸 4-말레이미도-1-부탄알(4)의 사용을 통해 달성될 수 있으며, 이의 제조는 실시예 1에 기술되어 있다. 대칭 디메틸아르기닌의 질소 원자에 대한 알킬화 반응을 위하여, AcOH 및 NaBH3CN이, MeOH에서 4-말레이미도-1-부탄알(4) 및 대칭 디메틸아르기닌의 용액에 첨가될 수 있다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반할 수 있다. 반응을 물로 냉각되고 역상 크로마토그래피로 정제하여 합텐 SDMA-M을 수득할 수 있다(도 4).
대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자에 대한 연결기의 부착은 반응식 2에 나타낸 N-tert-(부톡시카르보닐)-β-알라닌(6)의 사용을 통해 달성될 수 있으며, N-tert-(부톡시카르보닐)-β-알라닌(6)과 디메틸아르기닌의 아실화 또한 실시예 2에 기술되어 있다. 실시예 2에 기술된 바와 같은 탈보호는 DMF에서 N-숙시니미딜 브로모아세테이트(9) 및 DIPEA와 반응하여 추가로 만들어지는 화합물(8)을 제공할 수 있다. 용매는 진공 상태에서 제거할 수 있다. 조 생성물을 MeCN 및 물에 용해시킨 다음 역상 크로마토그래피로 정제하여 생성물 SDMA-SBAP를 수득할 수 있다(도 4). 생성된 생성물(SDMA-SBAP)은 티올 함유 단백질에 연결될 수 있다.
연결기로부터 t-Boc 보호기를 제거하면 화합물(8)을 생성할 수 있다. 적절한 보호기는 기술 문헌의 특허 및 기사에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, "Principles of Peptide Synthesis"(M. Bodanszky, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo(1984)) 참조. 이러한 보호기의 예는 비제한적인 예로서 t-부톡시카르보닐(t-Boc), 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 아세트아미노메틸(Acm), 트리페닐 메틸(Trt), 벤질옥시카르보닐, 비페닐이소프로필옥시카르보닐, 1-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 알파-디메틸-3,5-디메톡시벤자일옥시카르보닐, o-니트로페닐술페닐, 2-시아노-1,1-디멘틸에톡시카르보닐, 브로모벤질옥시, 카르바밀, 포르밀 등이다. 선택된 특정 보호기는 수행될 반응의 성질 및 온도, pH 등과 같은 반응의 조건에 따라 달라질 수 있다.
b) 면역원
말레이미드 기능화된 합텐(예를 들면, SDMA-M)은 단백질에 결합될 수 있다. N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)를 사용한 엡실론-질소의 아실화에 의한 단백질 리신 잔기의 활성화, 이어서 히드록실아민을 사용한 S-아세틸기의 후속 가수분해는 친핵성 설프히드릴기를 생성한다. 설프히드릴 활성화 단백질과 말레이미드 유도체화된 합텐의 결합은 마이클(Michael) 부가 반응을 통해 진행된다. 적합한 단백질(면역원성 담체)은 키홀 림펫 헤모시아닌, 소 티로글로불린 및 오브알부민을 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
화합물 SDMA-M은 티올 함유 단백질의 티올 변형을 위한 말레이미드 기능을 포함한다. 대칭 디메틸아르기닌의 α-아미노기의 질소 원자에 연결기가 있는 대칭 디메틸아르기닌 면역원 SDMA-M-SH-KLH의 합성은 도 5에 도시된 바와 같이 SDMA-M의 합성으로 시작되며, 그의 제조는 실시예 1에 개시된다. N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트와 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)으로부터의 아민의 반응은 보호된 설프히드릴을 생성할 수 있으며, 이는 후속적으로 SDMA-M과의 반응을 위해 하이드록실아민에 의해 탈보호될 수 있다. 인산나트륨(0.1M, pH=8.0) 완충액에서 티올 변형된 KLH와 SDMA-M의 반응은 도 8에 도시된 바와 같이 원하는 면역원 SDMA-M-SH-KLH를 생성할 수 있다. 면역원 SDMA-M-SH-KLH는 완충 용액이 있는 Sephadex G-25 컬럼과 같은 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 면역원 SDMA-M-SH-KLH의 농도는, 한정하는 것은 아니지만, Pierce™ Rapid Gold BCA 단백질 검정키트와 같은 단백질 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 면역원 SDMA-M-SH-KLH는 항체 생산을 위한 토끼의 면역화에 사용될 수 있다.
c) 효소 결합체
브로모아세트아미드 기능이 있는 합텐 SDMA-SBAP는 티올기를 포함하는 단백질과의 반응에 사용할 수 있다. G6PDH를 함유하는 시스테인에 대한 SDMA-SBAP의 결합은 도 7에 도시되어 있으며, 그의 제조는 실시예 2에 기술되어 있다.
합텐 SDMA-M을 사용하여 면역원을 제조할 수 있다. 합텐 SDMA-SBAP를 사용하여 G6PDH 결합체를 제조할 수 있다. 면역원 SDMA-M-SH-KLH는 항체 유도에 사용할 수 있다. 특정 실시예에서, 효소 기반 검정형식에서, 생성된 항체는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 함께 양호한 조절을 나타낼 수 있다. 일부 실시예에서, 면역원 SDMA-M-SH-KLH를 사용하여 항체를 성공적으로 생성할 수 있으며, 이는 이러한 항체가 이하에 기재된 바와 같은 효소-기반 대칭 디메틸아르기닌 면역검정에서 잠재적 용도를 갖는 표시를 제공할 수 있다.
항체 및 이의 제조
본 개시내용의 실시태양은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 경우에, 그 항체는 비대칭 디메틸아르기닌, L-아르기닌 및 N-메틸아르기닌 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다. 일부 실시예에서, 본 개시내용의 항체는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 어떤 화학식 1의 화합물을 비롯한 본 개시내용의 임의의 화합물에 특이적으로 결합한다.
용어 "항체"("면역글로불린"과 상호교환적으로도 사용됨)는, 항체가 항체 또는 임의의 아이소타이프(isotype)(예를 들면, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgE, IgD, IgA, IgM 등)의 항체 또는 면역글로불린일 수 있는 폴리클로날 (예를 들면 토끼 폴리클로날) 및 모노클로날 항체 제제, 전체 항체(예를 들어, 사량체로 구성된 항체는 차례로 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 2개의 이량체로 구됨); 단쇄 항체(예를 들면, scFv); 한정하는 것은 아니지만, 단쇄 Fv(scFv), Fab, (Fab')2, (SCFV')2를 포함하는, 화합물에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편(예를 들어, 전체 또는 단쇄 항체의 단편), 및 이중체; 키메라 항체; 모노클로날 항체, 인간 항체; 및 항체 및 비항체 단백질의 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 일부 실시예에서, 항체는 IgG, Fv, 단쇄 항체, scFv, Fab, F(ab')2, 또는 Fab'로부터 선택된다. 항체는 특이적 결합쌍의 구성요소, 예를 들어 비오틴(비오틴-아비딘 특이적 결합쌍의 구성요소) 등과 같은 다른 모이어티에 추가로 결합될 수 있다.
면역글로불린 폴리펩티드는 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마(IgGi, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄 또는 다른 종의 등가물을 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(보통 약 25kDa 또는 약 214개의 아미노산)는 NF2-말단에 약 110개 아미노산의 가변 영역 및 COOH-말단에 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 150kDa 또는 약 446개 아미노산)는 유사하게 가변 영역(약 116개 아미노산) 및 전술한 중쇄 불변 영역 중 하나, 예를 들어 감마(약 330개 아미노산)를 포함한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 하는 3개의 초가변 영역이 중단된 "프레임워크" 영역(FR)으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되었다("Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Rabat et al, US Department of Health and Human Services, (1991 및 Lefranc et al. IMGT, 국제 ImMunoGeneTics information system. Nucl.Acids Res., 2005, 33, D593-D597)). IMGT 시스템이 어떻게 공식화되고 다른 시스템과 어떻게 비교되는지를 포함한 IMGT 시스템에 대한 자세한 설명은 imgt.cines.fr/textes/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTnumberingsTable.html의 World Wide Web에서 제공된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 CDR의 위치를 지정하고 정렬하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 본 개시내용에 의해 제공되는 모든 CDR 및 프레임워크는 달리 표시되지 않는 한 상기 IMGT에 따라 정의된다.
따라서 "항체"는 예를 들어 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 유전적으로 인코딩될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 갖는 단백질을 포함한다. 인식된 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.
전형적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70kD)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)라는 용어는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.
항체는 온전한 면역글로불린뿐만 아니라 유전적으로 코딩되거나 다양한 펩티다아제로 소화에 의해 생성될 수 있는 잘 특성화된 다수의 단편을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해하여 F(ab)'2, 자체적으로 이황화 결합에 의해 VH-CHI에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에 환원되어 힌지 영역에서 이황화 결합을 파괴함으로써 (Fab')2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(다른 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명은 Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) 참조). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화의 관점에서 정의되지만, 통상의 지식을 가진 자라면 그러한 Fab' 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 새롭게 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 항체는, 한정하는 것은 아니지만, Fab'2, IgG, IgM, IgA, scFv, dAb, 나노바디, 유니바디 및 이중체를 포함하는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 새롭게 합성되거나 전체 항체의 변형에 의하여 제조된 항체 단편들을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 항체는 IgG, Fv, 단쇄 항체, scFv, Fab, F(ab')2, 및 Fab'로부터 선택된다.
항체를 언급할 때 "특이적으로 결합", "특이적인", "면역반응성" 및 "면역반응성", 및 "항원 결합 특이성"이라는 문구는, 항원의 이종 집단의 존재 하에 항원의 존재를 결정하기 위해, 항원 또는 그의 단편에 대해 매우 우선적인 항원과의 결합 반응을 의미한다. 따라서 지정된 면역검정 조건 하에서, 특이적인 항체는 특정 항원에 결합하고 시료에 존재하는 다른 항원에는 상당양으로 결합하지는 않는다. 이러한 조건하에서 항원에 대한 특이적 결합은 특정 항원에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 항체는 화합물에 특이적으로 결합할 수 있으며 시료에 존재하는 다른 분자에 비교할 만한 결합을 나타내지 않다.
일부 실시예에서, 본 개시내용의 항체는 친화성 또는 Ka(즉, 1/M 단위를 가지는 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 화합물에 결합하거나 연합하는 경우 화합물에, 예를 들어 105 M-1 이상으로 "특이적으로 결합한다". 특정 실시예에서, 항체는 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1 이상인 Ka 와 함께 화합물에 결합한다. "고친화성" 결합은 적어도 107 M-1 이상, 적어도 108 M-1 이상, 적어도 109 M-1 이상, 적어도 1010 M-1 이상, 적어도 1011 M-1 이상, 적어도 1012 M-1 이상, 적어도 1013 M-1 이상의 Ka와 함께 결합하는 것을 의미한다. 대안적으로, 친화도는 M 단위(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M 이하)와의 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(KD)로 정의될 수 있다. 일부 실시예에서, 특이적 결합은 항체가 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M 이하 KD로 화합물에 결합함을 의미한다. 화합물에 대한 항체의 결합 친화성은, 종래의 기술, 예를 들면, 경쟁 ELISA (효소-결합된 면역흡착체 검정), 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(예를 들면, BIAcore 2000 기기, 제조업체가 설명한 일반 절차를 사용)을 사용함으로써; 방사선면역검정 등에 의해; 용이하게 결정될 수 있다.
화합물에 대한 결합을 위하여 제1 항체가 제2 항체와 "경쟁"하는지의 여부는 당업계에 공지된 경쟁적 결합 검정을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 경쟁 항체는 예를 들어 항체 경쟁 검정을 통해 확인될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 항체의 시료는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 그런 다음 이러한 첫 번째 항체와 경쟁할 수 있다고 의심되는 두 번째 항체의 시료가 추가된다. 두 항체 중 하나가 표지된다. 표지된 항체와 표지되지 않은 항체가 화합물의 분리된 개별 부위에 결합하는 경우, 표지된 항체는 의심되는 경쟁 항체의 존재 여부에 관계없이 동일한 수준으로 결합할 것이다. 그러나 상호작용 부위가 동일하거나 중복되는 경우, 표지되지 않은 항체가 경쟁하여 화합물에 결합된 표지된 항체의 양이 낮아질 것이다. 표지되지 않은 항체가 과도하게 존재하면 표지된 항체가 결합하는 경우는 거의 없다.
본 개시내용의 목적을 위해, 경쟁 항체는 화합물에 대한 항체의 결합을 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상 감소하는 것 들이다. 이러한 경쟁 검정을 수행하기 위한 절차의 세부사항은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, 567-569, 1988, ISBN 0-87969-314-2에서 찾을 수 있다. 이러한 검정은 정제된 항체를 사용하여 정량적으로 만들 수 있다. 표준 곡선은 자체에 대해 하나의 항체를 적정하여 설정할 수 있는데, 즉, 동일한 항체가 표지와 경쟁자 모두에 사용된다. 플레이트에 대한 표지된 항체의 결합을 억제하는 표지되지 않은 경쟁 항체의 능력이 적정될 수 있다. 결과를 플롯할 수 있고 원하는 정도의 결합 억제를 달성하는 데 필요한 농도를 비교할 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 화학식 1의 화합물에 대한 결합에 대해서 다음을 포함하는 항체와 경쟁한다:
아미노산 서열 GFSLSSY (서열번호 2)를 포함하는 VH CDR1
아미노산 서열 DIKTGDR(서열번호 3)을 포함하는 VH CDR2, 및
아미노산 서열 ARVYVSGNDHYDL(서열번호 4)을 포함하는 VH CDR3
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및
아미노산 서열 QSISNY(서열번호 6)를 포함하는 VL CDR1,
아미노산 서열 RAS(서열번호 7)를 포함하는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 QLGYTYSNVENA(서열번호 8)을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드.
특정 실시예에서, 이러한 항체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8에 제시된 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 항체는: 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 화학식 1의 화합물에 대한 결합에 대해서 다음을 포함하는 항체와 경쟁한다:
아미노산 서열 GFSLSSY (서열번호 2)를 포함하는 VH CDR1
아미노산 서열 DIKTGDR(서열번호 3)을 포함하는 VH CDR2, 및
아미노산 서열 ARVYVSGNDHYDL(서열번호 4)을 포함하는 VH CDR3
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및
아미노산 서열 QSISNY(서열번호 6)를 포함하는 VL CDR1,
아미노산 서열 RAS(서열번호 7)를 포함하는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 QLGYTYTNVENA(서열번호 10)을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드.
특정 실시예에서, 이러한 항체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 10에 제시된 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 항체는: 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 화학식 1의 화합물에 대한 결합에 대해서 다음을 포함하는 항체와 경쟁한다:
아미노산 서열 GFSFSSTK(서열번호 12)를 포함하는 VH CDR1
아미노산 서열 CIGTDT(서열번호 13)을 포함하는 VH CDR2, 및
아미노산 서열 ARSSSTGYYNL(서열번호 14)을 포함하는 VH CDR3
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및
아미노산 서열 QSIRSY(서열번호 16)를 포함하는 VL CDR1,
아미노산 서열 YAS(서열번호 17)를 포함하는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 HDYYTFTDND(서열번호 18)을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드.
특정 실시예에서, 이러한 항체는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18에 제시된 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 항체는: 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 화학식 1의 화합물에 대한 결합에 대해서 다음을 포함하는 항체와 경쟁한다:
아미노산 서열 GFSFSSTK(서열번호 12)를 포함하는 VH CDR1
아미노산 서열 CIGVGSRGS(서열번호 20)을 포함하는 VH CDR2, 및
아미노산 서열 ARSSTTGYYIL(서열번호 21)을 포함하는 VH CDR3
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및
아미노산 서열 ESIYSY(서열번호 23)를 포함하는 VL CDR1,
아미노산 서열 KAS(서열번호 24)를 포함하는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 QNYYTFTEND(서열번호 25)을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드.
특정 실시예에서, 이러한 항체는 서열번호 12, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25에 제시된 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 항체는: 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 화학식 1의 화합물에 대한 결합에 대해서 다음을 포함하는 항체와 경쟁한다:
아미노산 서열 GFSFWR(서열번호 27)를 포함하는 VH CDR1
아미노산 서열 CIDGGNTNR(서열번호 28)을 포함하는 VH CDR2, 및
아미노산 서열 ARVRLGNNDYIDL(서열번호 29)을 포함하는 VH CDR3
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및
아미노산 서열 QSISNY(서열번호 6)를 포함하는 VL CDR1,
아미노산 서열 RAS(서열번호 7)를 포함하는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 QQGYNWDLDGA(서열번호 31)을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드.
특정 실시예에서, 이러한 항체는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 31에 제시된 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 항체는: 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드; 및 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 포함한다.
가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 및 CDR의 아미노산 서열은 하기 표 1에 제공된다.
표 1 - V H , V L , 및 CDR 아미노산 서열
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
특정 실시예에서, 본 개시내용의 항체는 대칭 디메틸아르기닌의 대사 산물에 추가로 특이적으로 결합한다. 관심 대사 산물로서, 한정하는 것은 아니지만, 대칭형 Nα-아세틸-디메틸아르기닌(Ac-SDMA)이 포함된다. 일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체는 SDMA에 대한 그의 반응성의 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 또는 50% 초과의 Ac-SDMA 반응성을 갖는다.
본 개시내용의 실시형태는 핵산을 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 핵산은, 한정하는 것은 아니지만, 표 1에 기재된 항체 중 어느 것의 CDR을 포함하는 VH 및/또는 VL 을 포함하여, 본 개시내용의 임의의 항체의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드, 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드, 또는 양자 모두를 암호화한다. 본 개시내용의 예시적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 예는 하기 표 2에 제공된다.
표 2 - 뉴클레오티드 서열
Figure pat00006
Figure pat00007
또한, 본 개시내용의 임의의 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 발현 벡터는, 예를 들어 숙주 세포에서 본 개시내용의 항체의 VH 및/또는 VL을 발현시키기 위한 용도를 찾는다. 본 개시내용의 항체의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 VH 및/또는 VL을 코딩하는 핵산을 프로모터(구성적 또는 유도성임)에 작동가능하게 연결하고 발현 벡터에 구축물을 통합으로써 달성된다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 양자 모두에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 VH 및/또는 VL을 코딩하는 핵산의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 벡터는 선택적으로 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열, 진핵생물 및 원핵생물 양자 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 즉 셔틀 벡터, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 모두에 대한 선택 마커를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함한다. Sambrook et al(1989) 참조한다. 복제된 핵산의 높은 수준의 발현을 얻기 위하여 일반적으로 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사/번역 종결자를 함유하는 발현 플라스미드를 구성하는 것이 일반적이다.
따라서, 본 개시내용의 실시형태는 세포, 예를 들어 재조합 숙주 세포를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 임의의 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 항체의 가변 중쇄(VH) 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, 및 항체의 가변 경쇄(VL) 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 세포가 제공된다. 특정 실시예에서, 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 본 개시내용의 세포는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 미세주입 등을 통해 본 개시내용의 하나 이상의 핵산 및/또는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 생성될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 이러한 방법은 세포가 항체를 발현하는데 적합한 조건 하에 본 개시내용의 세포 (예를 들어, 재조합 숙주 세포)를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 항체가 생성된다. 항체가 발현되도록 세포를 배양하기 위한 적합한 조건은 다양할 수 있다. 이러한 조건은, 적절한 온도(예를 들어, 37℃와 같은 32℃ - 42℃) 및 pH(예를 들어, pH 7.4와 같은 pH 7.0 - 7.7)에서 적절한 백분율의 CO2, 예를 들면 5%와 같은 3% 내지 10%를 갖는 환경에서, 적절한 용기(예를 들면, 세포 배양 플레이트 또는 그의 웰), 적합한 배지(예를 들면, DMEM, RPMI, MEM, IMDM, DMEM/F-12, 등과 같은 세포 배양 배지)에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 화학식 1에 제시된 새로운 면역원 중 어느 것에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 항체를 함유하는 면역 혈청은, 화학식 1에서 제시된 적절한 면역원으로 토끼 및 양과 같은 동물의 면역화를 포함하고 제시된 적절한 대기 기간 후에 면역된 동물의 혈액으로부터 항혈청을 수득하는 잘 확립된 기술에 의해 얻어진다. 리뷰는 Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall(Englewood Cliffs, N.J., U.S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1 24(1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22:726 732(1976); and Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30:24 31(1974). 면역화 절차는 당업계에 잘 확립되어 있으며 David Wild(Nature Publishing Group, 2000)에 의해 편집된 "The Immunoassay Handbook", 2판 및 그에 인용된 참고 문헌을 비롯한 수많은 논문 및 간행물에 설명되어 있다. 필요한 항체 정제의 정도는 원하는 응용 프로그램에 따라 다르다. 많은 목적상, 정제는 필요하지 않다.
수확된 혈청은 대칭 디메틸아르기닌 단백질 결합체 또는 ELISA 형식 또는 동종 효소 면역검정 형식의 다른 대칭 디메틸아르기닌 결합체를 사용하여 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 테스트할 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 본 명세서에 설명된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대한 폴리클로날 항체를 생성하고 그 유용성을 평가하는 데 적용할 수 있다. 제조된 특정 항체는 대칭 디메틸아르기닌의 검출 또는 결정(선택적으로 정량화 포함)을 위한 면역검정용 시약으로 유용하다.
모노클로날 항체, 특히 화학식 1의 면역원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하기 위해 하기 절차가 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 Kohler and Milstein, Nature 265:495 497, 1975 에서의 표준 기술에 따라 생성될 수 있다. 모노클로날 항체 기술의 리뷰는 Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag(New York 1978), Nature 266: 495(1977), Science 208: 692(1980) 및 Methods of Enzymology 73(파트 B): 3 46(1981)에서 찾아볼 수 있다. 적절한 면역원 제제의 시료를 토끼 또는 마우스와 같은 동물에 주입하고 충분한 시간 후에 동물을 희생시키고 비장 세포를 얻다. 대안적으로, 면역화되지 않은 동물의 비장 세포는 시험관 내에서 면역원에 감작될 수 있다. 원하는 면역글로불린에 대한 염기 서열을 암호화하는 비장 세포 염색체는 일반적으로 비이온성 세제, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜의 존재 하에 비장 세포를 골수종 세포주와 융합함으로써 압축될 수 있다. 융합된 하이브리도마(hybridomas)를 포함하는 생성된 세포는 HAT-배지와 같은 선택적 배지에서 성장하도록 허용되고, 생존한 불멸화 세포는 제한 희석 조건을 사용하여 이러한 배지에서 성장된다. 세포를 적절한 용기, 예를 들어 미세역가 웰에서 성장시키고, 상청액을 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 항체에 대해 스크리닝한다. 세포를 수용하는 포유동물 숙주의 복강 내로 하이브리도마 세포를 주입하고, 복수액을 수확하는 것과 같은, 모노클로날 항체의 수율을 향상시키기 위한 다양한 기술이 존재한다. 복수액 내에 모노클로날 항체의 양이 충분하지 않은 경우, 숙주의 혈액에서 항체를 채취할 수 있다. 대안적으로, 원하는 항체를 생산하는 세포는 중공사 세포 배양 장치 또는 스피너 플라스크 장치에서 성장될 수 있으며, 이들 둘 모두는 당업계에 잘 알려져 있다. 다른 단백질 및 기타 오염물질로부터 모노클로날 항체의 분리 및 정제를 위한 다양한 통상적인 방법이 존재한다(상기 Kohler 및 Milstein 참조).
하기 절차를 이용하여 재조합 모노클로날 항체, 특히 화학식 1의 면역원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 단일 B-세포 스크리닝, 클로닝 및 발현을 수행하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 토끼의 전혈로부터 분리하고 동일자로 배양하고 단일 B 세포를 40 x 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 40 x 96 웰 플레이트를 B 세포 배양 배지에서 7일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 상청액을 SDMA-SBAP-BSA 항원에 대한 간접 ELISA로 스크리닝하여 항원 양성 웰을 결정하였다. 항원-양성 웰은 RNA 용해 완충액에 보존하고 -80℃에서 보관하였다. mRNA는 Dynabeads mRNA DIRECT 정제 키트(Ambion, 카탈로그 번호 61012)에 의해 선택된 B 세포 웰(SDMA-SBAP-BSA 항원 양성 웰)에서 분리되었다. cDNA를 합성하고 2회의 PCR을 수행하여 클로닝용 항체 가변영역 cDNA를 제조하였다. 토끼 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 cDNA를 각각 토끼 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 갖는 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 발현 구성물을 HEK 293 세포에 공동 형질감염시키고 SDMA-SBAP-BSA 항원에 대한 간접 ELISA에 의해 검정된 세포 배양 상청액을 분석하였다. 상청액으로부터 항체 정제를 위한 표준 접근법에 따라 항체를 정제하였다. 일반적으로, 항체는 크로마토그래피, 예를 들어 DEAE 크로마토그래피, ABx 크로마토그래피 등과, 여과 같은 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다. 항체는 여러 기술 중 임의의 것을 사용하여 스크리닝될 수 있으며, 예를 들어 도 10에 예시된 바와 같은 동종 효소 면역검정 형식을 사용하고, 결합 억제, 곡선 크기 및 교차 반응성 등과 같은 특성을 고려하여 스크리닝될 수 있다.
선택된 양성 토끼 모노클로날 항체에 대해 DNA 시퀀싱을 수행했다. 토끼 IgG 중쇄 서열은 약 1200 bp이며 5' 말단에서 시퀀싱하여 신뢰할 수 있는 전장 가변 서열을 얻을 수 있다. 토끼 카파 경쇄는 약 700bp이며 5' 방향에서의 시퀀싱으로부터 신뢰할 수 있는 전장 가변 서열을 얻을 수 있다. 모든 중쇄 및 카파쇄 가변 영역 서열이 번역되었다. 예시적인 항체의 VH 및 VL의 생성된 아미노산 서열은 상기 표 1에 제공된다.
조성물
본 개시내용은 또한 조성물을 제공한다. 일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 임의의 화합물, 항체, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 액체 배지에 존재하는 본 개시내용의 임의의 화합물, 항체, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 세포를 포함한다. 액체 배지는 물, 완충 용액 등과 같은 수성 액체 배지일 수 있다. 염(예를 들면, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4), 완충제(Tris 완충제, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 나트륨염(MES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS) 등), 가용화제, 세제(예를 들면, Tween-20 등과 같은 비이온성 세제), 뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 글리세롤, 킬레이트제, 및 등과 같은 하나 이상의 첨가제가 이러한 조성물에 존재할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 임의의 동종 효소 면역검정을 포함하는 본 개시내용의 임의의 면역검정을 수행하는 시약으로서의 용도가 발견된다. 예를 들어, 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물, 본 개시내용의 임의의 항체, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 이러한 면역검정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 시약은 예를 들어 안정성, 편의성 등을 증가시키기 위해 동결건조된 형태로 제공된다. 하나만 예를 들면, 본 개시내용의 화학식 1의 화합물 중 임의의 것, 본 개시내용의 임의의 항체, 또는 양자 모두를 포함하는 조성물은 미국 특허 제5,413,732호에 기술되어 있으며, 그 개시 내용은 모든 목적을 위해 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 요약하면, 그러한 구형상체는 예를 들어 시약의 동종 용액을 형성함으로써 제조될 수 있으며; 용액의 균일한 방울 측정(예를 들면, 2 내지 50μL); 균일하고 측정된 액적을 교반되지 않은 극저온 액체(예를 들면, 액체 질소)에 분배하여 액적을 동결시키는 단계; 극저온 액체로부터 동결된 방울을 수집하는 단계; 및 동결된 방울을 동결건조시켜 복수의 동결건조된 시약 구체를 형성하는 단계를 포함한다.
면역검정
본 개시내용의 양태는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물 및/또는 본 개시내용의 임의의 항체를 사용하는 방법을 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 이러한 화합물 및/또는 항체는 배지, 예를 들어 관심 생물학적 시료를 포함하는 배지에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 검출(양의 결정 포함)하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에 따르면, 배지에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하는 방법이 제공되며, 이 방법은 배지에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 및 본 개시내용의 임의의 항체의 결합을 포함한다. 이러한 방법은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 및 항체를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복합체의 존재는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재를 나타낸다. 특정 실시예에서, 배지는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 배지는 대칭 디메틸아르기닌 모이어티 및 검출 가능한 표지(예를 들면, G6PDH와 같은 효소)를 갖는 대칭 디메틸아르기닌 결합체를 추가로 포함할 수 있다.
적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료는 임의의 관심 시료일 수 있다. 특정 실시예에서, 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 가래, 정액, 타액, 안구 수정체액, 뇌액, 척수액, 양수, 조직 배양 배지 등 및 이들의 희석액을 포함한다.
본 개시내용은 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 또는 부재를 평가하기 위한 면역검정 방법을 제공한다. 본 개시내용의 면역검정은 다양한 형식일 수 있다. 면역검정은 분리 면역검정(이종 면역검정으로도 알려짐) 또는 동종 면역검정일 수 있다. 또한, 면역검정은 정성적이거나 또는 정량적일 수 있다. 본 개시내용의 검정은 샌드위치 및 경쟁 검정의 양자를 포함한다. 면역검정은 면역 침전을 포함하는 특정 검정에서와 같이 샌드위치나 경쟁 검정이 아닌 다른 유형의 검정을 구현할 수 있다. 특정 실시예에서, 면역검정은 동종 면역검정이며, 여기서 검정 시약 및 시료는 동종 검정 혼합물을 형성하기 위해 함께 혼합된다.
특정 실시예에서, 면역검정은 생물학적 유체 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 검정에 사용되는 동종 효소 면역검정 시스템이다. 일부 예에서, 면역검정은 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 항체 결합 부위에 대해 표지된 Nα-아실화-SDMA 및/또는 Nα-알킬화-SDMA 간의 경쟁을 기반으로 한다. 일부 실시예에서, 표지는 효소와 같은 단백질이다. 예를 들어, 표지는 분광광도계로 활성을 측정할 수 있는 효소일 수 있다. 하나의 비한정적인 예에서, 본 개시내용의 검정은 항체 결합 부위에 대해 효소 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)로 표지된 Nα-아실화-SDMA 및/또는 Nα-알킬화-SDMA를 사용한다. 특정 실시예에서, 효소 활성은 항체에 결합할 때 감소하여 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도가 효소 활성의 관점에서 측정될 수 있다. 어떤 경우에는 활성 효소가 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 NADH로 전환하여 분광 광도계로 측정되는 흡광도 변화를 초래한다. 특정 예에서, 내인성 혈청 G6PDH는 조효소 NAD+가 검정에 사용된 박테리아(Leuconostoc mesenteroides) 효소와만 기능하기 때문에 면역 검정을 방해하지 않는다.
일반적으로, 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재(또는 부재)를 검출하기 위한 본 개시내용의 면역검정은 반응 혼합물에 (i) 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료 및 (ii) 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적으로 결합하는 항체와 시료에 존재할 수 있는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 사이에 복합체를 형성하는 항체를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이 방법은 또한 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 복합체의 존재(또는 부재)는 시료에서의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재(또는 부재)를 나타낼 수 있다. 더욱이, 형성된 복합체의 양은 시료에 존재하는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도를 결정하기 위해 평가될 수 있다(예를 들어, 시료를 얻은 대상에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 혈청 또는 조직 농도의 평가를 제공하기 위해). 복합체의 존재 및/또는 양은 직접적으로(예를 들어, 복합체에서 결합된 항체를 검출함으로써) 또는 간접적으로(예를 들어, 대칭 디메틸아르기닌 효소 결합체가 항체에 결합되지 않은 경우, 대칭 디메틸아르기닌 효소 결합체에서 효소의 활성을 평가함으로써, 반응 혼합물에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체가 시료로부터 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 의해 결합되었음을 나타내는 검출 가능한 신호가 생성된다)(예를 들어, 도 10 참조).
일반적으로, 본 개시내용의 면역검정은 배지(예를 들어, 검정 배지 또는 검정 반응 혼합물)에서, 시료 내의 분석물과 항체의 사이에 안정한 복합체의 형성을 허용하는 조건하에, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체와 시료가 조합하는 것을 수반한다.
검정은 용액에서 수행되거나 고체(불용성) 지지체(예를 들면, 폴리스티렌, 니트로셀룰로스 또는 비드)를 사용할 수 있으며, 임의의 표준 방법(예를 들면, Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed.; John Wiley & Sons, New York, 1992. 에 기술됨)을 사용한다. 이러한 방법에는 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), IRMA(면역방사선 검정) 및 RIA(방사성 면역검정)가 포함된다. 특정 실시예에서, 분석은 용액에서 수행되며, 예를 들어, 검정은 고체 지지체에 부착되거나 결합된 검정 시약 없이 수행된다.
검정이 용액에서 수행되는 경우, 테스트 시료(및 선택적으로 대조군 시료)는 분석물 및 친화성 시약 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 비대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체는 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성핵종, 형광물질 또는 효소를 포함할 수 있다. 그런 다음 시료를 처리하여 과량의 미반응된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체로부터 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 복합체를 분리한다(예를 들면, 이차 항체(예를 들면, 항-면역글로불린 항혈청)를 첨가하고, 원심분리하여 이차 복합체를 침전함으로써, 또는 Sepharose® 또는 플라스틱 우물과 같은 고체 기질에 고정된 두 번째 표지되지 않은 항체와 같은 친화성 표면에 결합함으로써). 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체의 검출은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 필요한 경우 검출 가능한 표지에 대한 기질을 시료에 추가할 수 있다.
검정이 고체 지지체를 사용하는 경우 지지체는 지지체 표면에 결합된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체(또는 결합체)를 가질 수 있다. 검정 시약의 결합은 시료(또는 경쟁적 결합 검정에서와 같이 시료로부터 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합되지 않고, 반응 혼합물에 존재할 수 있는 항체)가 항체에 대한 특이적 결합을 통해 고체 지지체에 대한 안정적, 내수성 결합을 용이하게 한다. 불용성 지지체는 항체 또는 적합한 대칭 디메틸아르기닌 결합체가 결합될 수 있고, 가용성 물질로부터 분리될 수 있고, 그렇지 않으면 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 전체 검출 방법과 양립가능한 임의의 조성물일 수 있다.
이러한 지지체의 표면은 견고하거나 다공성일 수 있으며 임의의 편리한 모양을 가질 수 있다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 또는 대칭적으로 디메틸아르기닌 결합체가 결합되는 적합한 불용성 지지체의 예는 비드, 예를 들어 자기 비드, 막 및 미세역가 플레이트를 포함한다. 이들은 유리, 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스로 구성될 수 있다.
검정 시약은 본 명세서에 개시된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 뿐만 아니라 선택적으로 검출가능하게 표지될 수 있는 2차 항체를 포함할 수 있다. 지지체에 검정 시약을 결합한 후, 지지체가 차단제로 처리되어 검정 시약이 차지하지 않는 영역에서 지지체에 결합된다. 적절한 차단제는 소혈청 알부민, 카제인, 젤라틴 등과 같은 비간섭 단백질을 포함한다. 선택적으로, Tween, NP40, TX100 등과 같은 비간섭 농도의 세제를 사용할 수 있다. 이러한 차단 처리는 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 검정은 정성적 및 정량적 검정 모두를 포함한다. 일반적인 정량적 방법은 분석물을 미리 결정된 양의 시약 항체와 혼합하고 검사될 시료에 대해 예상 범위 내의 기지 양의 분석물을 포함하는 표준 시료를 사용하여 결정된 관계를 사용하여 원래 시료의 분석물의 양과 형성된 복합체의 양을 연관시키는 것을 포함한다. 정성적 검정에서는 분석물을 포함하거나 포함하지 않는 것으로 알려진 시료에 의해 설정된 역치 수준보다 높거나 낮은 충분한 복합체를 사용하여 검정 결과를 설정할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용에서 "측정" 또는 "결정하는" 행위는 정성적 및 정량적 결정을 모두 포함한다.
본 명세서에 기술된 검정에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 면역검정 시약은, 한정하는 것은 아니지만, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체, 대칭적인 디메틸아르기닌 결합체 및 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물(예를 들면, 경쟁적 결합 검정에서의 대조군으로서)을 포함한다. 면역검정 시약은 완충 수용액으로 제공될 수 있다. 이러한 용액에는 표면 활성 첨가제, 유기 용매, 소포제, 완충제, 계면활성제 및 항균제와 같은 추가 성분이 포함될 수 있다. 표면 활성 첨가제는 용액에서 소수성 또는 용해도가 낮은 화합물을 유지하고 용액의 구성 요소를 안정화하기 위해 도입될 수 있다. 예로서는, β-락토글로불린(BLG) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 증량제; Tween-20, Plurafac A38, Triton X-100, Pluronic 25R2, 토끼 혈청 알부민(RSA), 소 혈청 알부민(BSA) 및 탄수화물과 같은 소포제 및 계면활성제를 포함한다. 유기 용매의 예는 메탄올 및 기타 알코올을 포함할 수 있다. 다양한 완충액을 사용하여 보관 중 용액의 pH를 유지할 수 있다. 예시적인 완충제는 HEPES, 붕산염, 인산염, 탄산염, 트리스, 바르비탈 등을 포함한다. 항균제는 또한 면역검정 시약의 저장 수명을 연장한다.
검정에서 시약으로 사용되는 대칭 디메틸아르기닌 결합체 및/또는 대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체는 고체 지지체에 부착하여 불용화될 수 있다. 이것은, 미립자, 또는 예를 들어, 부유 상태로 유지할 수 있지만 원심분리 또는 정밀여과와 같은 물리화학적 수단으로 제거할 수 있는 고분자량 담체에 대한 시약이 들어 있는 용기의 벽일 수 있다. 어떤 경우에는 부착이 하나 이상의 공유 결합을 통해 이루어진다. 부착은 공유적일 필요는 없지만 적어도 검정 절차의 일부일 수 있는 분리 기술(세척 포함)을 감내할 수 있을 정도의 충분한 강도 및/또는 영구성을 가져야 한다. 일부의 경우에, 고체 지지체는 대칭 디메틸아르기닌 결합체 및/또는 대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체의 고체 지지체에의 부착을 용이하게 하는 반응성 기를 포함하도록 작용화될 수 있다. 사용될 수 있는 반응기의 비제한적인 예는 -COOH, -NH2, -C(O)H, -SH 등을 포함한다. 일부 실시예에서, 대칭 디메틸아르기닌 결합체 및/또는 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물 항체는 단백질 담체에 결합될 수 있고 단백질 담체는 고체 지지체에 결합될 수 있으며, 따라서 대칭 디메틸아르기닌 결합체 및/또는 대칭 디메틸화 아르기닌을 고체 지지체에 간접적으로 부착시킬 수 있다. 특정 미립자 물질에는 아가로스, 폴리스티렌, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 라텍스 입자, 자성 입자 및 고정 적혈구가 포함되지만 이에 국한되지는 않다. 상업적으로 이용 가능한 매트릭스의 예에는 Sepharose®(Pharmacia), Poros® 수지(Roche Molecular Biochemicals), Actigel Superflow™ 수지(Sterogene Bioseparations Inc.) 및 Dynabeads™(Dynal Inc.)가 포함되지만 이에 국한되지는 않다. 특정 실시예에서, 고체 지지체의 선택은 안정성, 용량, 커플링된 항체의 접근성, 유속(또는 반응 혼합물에서 수지를 분산시키는 능력), 및 분리 용이성 중 하나 이상에 의존할 수 있다.
상술한 바와 같이 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 검출을 위한 면역검정은 다양한 형식일 수 있다. 일반적으로, 면역검정은 배지(예를 들면, 반응 혼합물 또는 검정 혼합물)내에서 시료(즉, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 시료)와 함께 하나 이상의 면역검정 시약(예를 들면 적어도 하나의 비대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체)을 섞는 것을 포함한다. "반응 혼합물" 또는 "검정 혼합물"은 일반적으로 본 개시내용에 예시된 바와 같은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 시료 및 하나 이상의 면역검정 시약의 조합을 지칭하며, 시료 내에서의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 또는 부존재의 검출을 용이하게 하며, 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 면역검정 시약(들)이 용액 내에 있거나 지지체(예를 들면, 비드와 같은 기질)에 고정될 수 있지만 반응 혼합물은 일반적으로는 수용액이다. 반응 혼합물은 면역검정과 양립할 수 있는 다른 성분, 예를 들어 완충액, 시약 등을 포함할 수 있다.
면역검정은 일반적으로 여러 가지 방법 중 하나로 분류된다. 예를 들어, 면역검정은 사용된 검출 방식에 따라 분류될 수 있으며, 예를 들어 효소 면역검정, 방사선 면역검정, 형광 편광 면역검정, 화학발광 면역검정, 탁도 검정 등이다. 또 다른 분류 방법은 사용된 검정 절차, 즉 경쟁 검정 형식, 샌드위치 유형 검정 형식 및 침전 또는 응집 원리를 기반으로 하는 검정에 따른다. 특정 예에서, 세척 단계가 절차에 포함되는지(소위 이종 검정) 또는 반응 및 검출이 세척 단계 없이 수행되는지(소위 동종 검정)에 따라 추가 구별이 이루어진다. 특정 검정은 아래에 더 자세히 설명되어 있다.
면역검정은 이종적이거나 동종적인 것으로 기술될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "동종 면역검정"은 복합체가 미반응 반응 성분으로부터 분리되지 않고, 그 대신 복합체의 존재가 반응물 중 적어도 하나가 복합체 내로 편입된 결과로서 획득하거나 상실하는 특성에 의해 검출되는 분석법을 의미한다. 동종 검정에는 서로 다른 시약에 대한 형광색 및 형광색 소광 쌍; 다른 시약의 효소 및 효소 억제제 쌍; 다른 시약의 발색단 및 발색단 수정자 쌍; 및 라텍스 응집 검정을 포함하는 시스템이 포함된다.
특정 동종 검정은 대칭 메틸아르기닌이 활성 효소에 결합된 정량적 동종 효소 면역검정이다. 일부 실시예에서, 대칭 메틸아르기닌 결합체에 대한 대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체의 결합이 결합체의 효소 활성에 정성적 또는 정량적 방식으로 영향을 미치도록 결합이 배열된다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 포함하는 시료를 항체와 미리 혼합하면, 항체가 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 복합체를 형성하여 효소 결합체에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 이러한 방식으로, 결합체에서의 효소의 활성은 시료에 존재하는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양과 상관될 수 있다.
G6PDH는 이러한 검정에 유용한 특정 효소이다. 일부 실시예에서, G6PDH는 하나 이상의 라이신 잔기가 결실 또는 치환되거나, 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입된 천연 발생 G6PDH의 변이체이다. 예를 들어, Leuconostoc mesenteroides G6PDH는 NAD+ 또는 NADP+를 이용함으로써 D-글루코노-델타-락톤-6-포스페이트의 산화에 대한 촉매 작용을 하는 이량체 효소이다. NAD+를 사용하는 이러한 특성은 이러한 효소를 NADP+만을 효과적으로 사용하는 인간 G6PDH와 구별하고, 예를 들어 인간 유래 시료에서와 같이 인간 G6PDH의 존재 하에 L. mesenteroides-특이적 G6PDH 활성을 측정할 수 있도록 한다. G6PDH를 선택하는 두 개의 특정한 박테리아의 속(屬)은 Leuconostoc 및 Zymomonas이다. 이들 속 중에서 L. mesenteroides, L. citreum, L. lactis, L. dextranicum 및 Z. mobilis가 관심 대상이며 L. mesenteroides, L. citreum 및 L. lactis 가 구체적인 예이다. 동종 검정 시스템의 또 다른 예는 복제된 효소 공여자 면역검정이다.
티올 반응성 기를 갖는 대칭 디메틸아르기닌 유도체는 상술한 바와 같이 제조될 수 있고, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH) 돌연변이 효소와 반응하여 각각의 효소 결합체를 형성할 수 있다(예를 들어, 도 7 참조). 돌연변이 효소는 미국 특허 제6,090,567호 및 제6,033,890호에 기술된 절차에 의해 얻을 수 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참조로 결함된다.
일부 실시예에서, 면역검정은 대칭 디메틸아르기닌 모이어티 및 검출가능한 표지를 갖는 대칭 디메틸아르기닌 결합체를 시료에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 또는 부재는 검출가능한 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 검출가능한 표지는 효소를 포함할 수 있고, 검출은 효소의 활성을 분석함으로써 수행될 수 있다. 특정 실시예에서, 효소는 G6PDH와 같은 탈수소효소이다.
발광 산소 채널링 검정(LOCI)은 분석물에 대한 비오틴화된 항체가 스트렙타비딘 코팅된 공여자 비드에 결합하고 분석물에 대한 두 번째 항체가 LOCI 수용체 비드에 직접 결합되는 화학 발광 동종 면역검정이다. 검정 물질이 존재하는 경우, 두 개의 비드가 근접하게 된다. 680 nm에서 도너 비드의 여기는 LOCI 수용체 비드에서 일련의 화학 반응을 유발하는 단일항 산소 분자를 생성하여 615 nm에서 검출 가능한 광 방출 피크를 생성한다(Ullman, EF et al.(1996) Clin. Chem. 42, 1518-1526).
분리 기반 또는 "이종" 검정에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체와 분석물의 복합체 검출에는 형성된 복합체가 미반응 분석물, 미반응 항체 또는 양자 모두로부터 물리적으로 분리되는 과정이 포함된다.
이종 면역검정에 있어서는, 항체와 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 복합체는 먼저 유체상에서 형성된 다음, 고체상 시약에 의해 포획되거나 겔 여과 또는 침전과 같이 변경된 물리적 또는 화학적 특성을 기반으로 분리될 수 있다. 대안적으로, 시약 중 하나는 다른 시약과 접촉하기 전에 고체상에 부착될 수 있고, 이어서 미반응 시약이 없는 고체상을 세척함으로써 복합체를 회수할 수 있다. 분리-기반 검정은 일반적으로 복합체의 검출 또는 정량을 용이하게 하기 위해 표지된 유도체 또는 표지된 항체의 사용을 포함한다. 적합한 표지에는 125I와 같은 방사성 동위원소, 페록시다아제 및 b-갈락토시다제와 같은 효소, 및 플루오레세인 이소티오시아네이트와 같은 형광 표지가 포함된다. 분리 단계는 미반응 표지 시약에서 복잡한 형태로 존재하는 표지 시약을 제거하는 것을 포함한다. 복합체의 표지 양은 직접 측정하거나 미반응으로 남겨진 양에서 유추될 수 있다.
본 개시내용의 검정은 샌드위치 및 경쟁 검정 모두를 포함한다. 샌드위치 검정은, 일반적으로 측정할 분석물이 복합체의 분리에 궁극적으로 사용되는 첫 번째 항체와 같은 한 시약과, 분리된 복합체의 마커로 사용되는 두 번째 항체와 같은 다른 시약 사이에 끼워져 있는 복합체 형성을 포함한다. 경쟁 검정은 측정할 분석물이 항체와 같은 다른 시약에 결합도록 분석물의 유도체와 경쟁하는 시스템을 포함한다. EMIT®를 사용한 경쟁 검정의 예는 미국특허 제3,817,837호에 설명되어 있다.
*현재 개시된 구체예의 화합물 및 방법은 또한 측면 유동 크로마토그래피(later flow chromatography) 기술에서 이들 물질의 사용을 포함한다. 측면 유동 크로마토그래피는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대하여, 비동위원소 신호 생성 모이어티와 같은 검출 장치를 포함하는 멤브레인 스트립을 포함한다. 그런 다음 환자의 시료를 멤브레인 스트립에 적용할 수 있다. 시료는 검출 장치와 상호 작용하여 결과를 생성할 수 있다. 결과는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 부재, 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 및/또는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도를 포함하여 여러 가지를 의미할 수 있다.
특정 실시예는 측면 유동 크로마토그래피의 사용을 통해 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 또는 부재를 정성적으로 결정하는 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 정성적 측면 유동 장치의 기본 설계는 다음과 같다: 1) 시료 패드는 시료가 적용되는 곳이다. 시료 패드는 완충제 또는 염과 같은 화학 물질로 처리되며, 이는 재용해될 때 결합체, 테스트 및 대조 시약과의 반응을 위해 시료의 화학적 성질을 최적화한다. 2) 결합체 이형 패드는 일반적으로 항체 콜로이드성 금 결합체와 같은 결합체 시약으로 처리된 폴리에스터 또는 유리 섬유 재료이다. 결합 패드를 처리하는 일반적인 공정은 함침 후 건조하여 사용하는 것이다. 사용 중에 테스트에 추가된 액체 시료는 결합체를 다시 용해하여 멤브레인으로 흐를 것이다. 3) 멤브레인 기판은 일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 항체 포획 성분이 고정된 유사한 물질로 만들어진다. 4) 위킹(wicking) 패드는 혈장과 전혈을 분리해야 하는 검사에 사용된다. 함침 과정은 일반적으로 시료를 조절하고 세포 분리를 촉진하기 위한 시약으로 이 패드를 처리하는 데 사용된다. 5) 흡수 패드는 장치를 통해 흐르는 유체를 수집하기 위한 저장소 역할을 한다. 6) 상부 층들과 멤브레인 시스템은 구조 부재 역할을 하는 접착 재료가 있는 플라스틱 지지대에 적층된다.
특정 실시예는 측면 유동 크로마토그래피의 사용을 통해 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재를 정성적으로 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 실시예에서, 막 스트립은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 특이적인 항체를 갖는 결합체 방출 패드인 시료 패드를 포함한다. 이 항체는 콜로이드성 금 입자와 같은 비-동위원소 신호 생성 모이어티에 결합될 수 있다. 측면 유동 크로마토그래피 환경에서 유용한 다른 검출 모이어티로는 염료, 착색된 라텍스 입자, 형광 표지된 라텍스 입자, 비동위원소 신호 생성 모이어티 등이 포함된다. 일부 경우에, 멤브레인 스트립은 캡처 라인을 추가로 포함하며, 여기서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항원 또는 대칭적으로 디메틸아르기닌 결합체가 스트립에 고정된다. 일부 실시예에서, 이러한 고정은 임의로 연결기를 통해 막 스트립에 대한 공유 부착을 통해 이루어진다. 다른 실시예에서, 고정화는 막 스트립에 대한 비공유 부착을 통해 이루어진다. 또 다른 실시예에서, 포획 라인에서 고정된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물은 BSA와 같은 면역원성 담체와 같은 반응성 파트너에 부착된다.
환자로부터의 시료를 시료 패드에 적용하면 결합체 방출 패드의 항체와 결합하여 용액을 형성할 수 있다. 이 용액은 막을 가로지르는 모세관 작용에 의해 크로마토그래피적으로 이동할 수 있다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 시료에 존재할 때, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 복합체가 형성될 수 있으며, 이는 모세관 작용에 의해 막을 가로질러 이동한다. 용액이 포획선에 도달하면, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 복합체가 항체의 제한된 결합 부위에 대해 이동하지 않는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 경쟁할 수 있다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물질의 충분한 농도가 시료에 존재할 때 제한된 항체 결합 부위를 채울 수 있다. 특정한 경우에, 이것은 포획 라인에서 착색된 항체-비이동 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 복합체의 형성을 방지하게 된다. 따라서 캡처 라인에 색상이 없다는 것은 시료내에 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 검정 물질이 존재함을 나타낸다.
시료에 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 없는 경우, 용액이 멤브레인 스트립의 캡처 라인에 도달하면 착색된 항체-비이동 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 복합체가 형성될 수 있다. 어떤 경우에는, 포획 라인에 이 복합체가 형성된다는 것은 시료에 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 없다는 증거이다.
특정 실시예는 측면 유동 크로마토그래피의 사용을 통해 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 정량적으로 결정하는 방법을 제공한다. 이 기술은 미국 특허 제4,391,904호; 제4,435,504호; 제4,959,324호; 제5,264,180호; 제5,340,539호; 및 제5,416,000호에 기술되어 있으며, 그 개시 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다. 일부 실시예에서, 항체는 막 스트립의 전체 길이를 따라 고정될 수 있다. 일반적으로 멤브레인 스트립이 종이로 만들어지면 항체는 멤브레인 스트립에 공유 결합될 수 있다. 멤브레인 스트립이 니트로셀룰로스로 만들어진 경우, 항체는 예를 들어 소수성 및 정전기 상호작용을 통해 멤브레인 스트립에 비공유적으로 부착될 수 있다. 멤브레인 스트립은 검출기 부분에 부착된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 포함하는 결합체 방출 패드를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 검출기 모이어티는 양고추냉이 페록시다아제(HRP)와 같은 효소이다.
특정 실시예에서, 환자로부터의 시료는 결합체 방출 패드에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자와 결합하여 용액을 형성할 수 있는 막 스트립에 적용된다. 이 용액은 멤브레인을 가로지르는 모세관 작용에 의해 크로마토그래피로 이동될 수 있다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 시료에 존재할 때, 시료 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물과 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자 모두는 항체의 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁한다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물질의 충분한 농도가 시료에 존재할 때 제한된 항체 결합 부위를 채울 수 있다. 어떤 경우에는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자가 멤브레인 스트립에서 계속 이동하도록 한다. 멤브레인 스트립에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자의 이동 거리가 짧을수록, 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도가 낮아지고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자가 효소를 포함하는 경우, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물/검출기 분자의 이동 길이는 효소 기질을 멤브레인 스트립에 적용하여 감지할 수 있다. 효소 반응 생성물의 검출은 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 특정 실시예에서, 변형된 N,N-디메틸아닐린과 같은 효소의 색상 생성 기질은 막 스트립에 고정되고 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라존은 막에 수동적으로 적용되어, 발색반응의 시각화를 위한 별도의 시약의 필요성을 경감한다.
형광 분극 검정(Fluorescence polarization immunoassay: FPIA) 기술은 경쟁적 결합을 기반으로 한다. FPIA 기술은 예를 들어 미국 특허 제4,593,089호, 제4,492,762호, 제4,668,640호 및 제4,751,190호에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 결합된다.
FPIA 기술은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재를 식별하는 데 사용할 수 있으며 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 정량화하는 검정에 사용할 수 있다. 부분적으로, 용액에서 분자의 회전 특성은 분극의 정도가 분자의 크기에 정비례하도록 한다. 따라서 분자 크기가 커질수록 편광도 증가할 수 있다. 즉, 용액 내에서 작고 빠르게 회전하는 형광 표지 또는 기타 발광 표지된 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물을 여기하기 위해 선형 편광을 사용하면 방출된 빛이 크게 탈분극될 수 있다. 형광 표지된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 항체와 상호작용하거나 항체에 결합되면 회전이 느려지고 방출되는 빛이 고도로 편광될 수 있다. 어떤 경우에는 항체가 복합체의 크기를 유의하고 측정 가능하게 증가시키기 때문이다. 또한, 시료에서 표지되지 않은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 증가시키면, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체에 의한 형광 표지된 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 결합이 감소하여 시료에서 방출되는 빛의 편광이 감소할 수 있다. 시료에서 표지되지 않은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 농도와 극성 사이의 정량적 관계는 알려진 농도의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물로 보정의 편광 값을 측정하여 설정할 수 있다. 따라서 FPIA는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재와 농도를 식별하는 데 사용할 수 있다.
면역탁도 검정(immunoturbidimetric assay)이라고 부를 수 있는 동종 미립자 면역검정 기술은 용액내에서의 입자와 화합물의 응집을 기반으로 한다. 입자 및/또는 화합물이 응집되면 입자 크기가 증가하고 용액의 탁도가 증가할 수 있다. 따라서, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 존재 및 선택적으로 양을 평가하기 위해 미립자와 함께 사용될 수 있다. 동종 미립자 면역검정은 면역검정이 혈액, 혈액 용혈액, 혈청, 혈장, 조직 및/또는 기타 시료에 대해 수행될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 동종 미립자 면역검정은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물을 사용하여 수행하고 미립자에 로딩하거나, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체를 미립자에 로딩하여 수행하도록 구성할 수 있다. 동종 미립자 면역검정 또는 면역탁도 검정은 시료에서 물질의 응집을 측정하는 데 사용된다. 면역탁도 검정 기술은 예를 들어 미국 특허 제5,571,728호, 제4,847,209호, 제6,514,770호, 및 제6,248,597호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참조로 통함된다. 이러한 검정에는 광 감쇠, 네펠로메트릭 또는 탁도 측정 방법이 포함된다.
복제 효소 공여자 면역검정("CEDIA®", ThermoFisher)은, 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합할 수 있는 항체에 결합하기 위하여, E.coli 로부터 β-D-갈락토시드 갈락토하이드롤라제 또는 β-갈락토시다제("β-gal")와 같은 비활성 유전자 조작 효소 공여자("ED") 단편을 포함하는 대칭 디메틸아르기닌 결합체와 생물학적 시료 내에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 경쟁을 기반으로 한다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 시료에 존재하는 경우, 항체에 결합하여 ED-유도체 결합체의 ED 부분을 자유롭게 남겨두고 반응 혼합물에서 β-D-갈락토사이드 갈락토하이드롤라제 또는 β-gal의 효소 활성을 회복하여 효소 수용체("EA") 단편과의 결합을 할 수 있도록 한다. ED와 EA를 포함하는 활성 효소는 적절한 기질에 노출되었을 때 정량 가능한 반응 생성물을 생성할 수 있다. 기질의 예는 활성 효소에 의해 갈락토스 및 CPR로 절단될 수 있는 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노시드("CPRG")이며, 여기서 CPR은 파장이 약 570nm에서의 흡광도로 측정된다. 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 시료에 존재하지 않으면 항체가 ED-유도체 결합체에 결합하여 ED 단편과 EA 단편의 결합을 억제하고 효소 활성의 회복을 억제할 수 있다. 반응 생성물의 양과 결과적인 흡광도 변화는 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양에 비례한다.
화학발광 미립자 면역검정("CMIA") 기술을 사용하는 경쟁 검정은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물이 시료에 존재하는지 여부를 평가하는 데에도 사용될 수 있다. 다양한 유형의 CMIA 기술을 사용하여 시료에서 분석물의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다. CMIA 분석은 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 결합할 수 있는 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체의 사용을 포함할 수 있으며, 이는 여과, 침전 및/또는 기타 수단에 의한 분리에 적합한 입자 또는 자성 입자와 같은 입자에 결합된다. 또한, 적절한 화학발광 부분에 연결된 대칭 디메틸아르기닌 또는 유도체를 포함할 수 있는 추적자를 사용하여 입자 상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체의 제한된 양에 대해 환자 시료의 유리 대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물과 경쟁할 수 있다. 시료, 추적자 및 항체 입자가 상호작용하고 일상적인 세척 단계에서 결합되지 않은 추적자가 제거된 후, 항체 입자에 결합된 추적자의 양은 화학발광에 의해 측정될 수 있으며, 여기서 화학발광은 상대 광 단위(RULE)로 표현된다. 화학발광의 양은 환자의 시료에 있는 유리 검정물의 양과 반비례하며 농도는 알려진 분석물의 값을 사용하여 표준 곡선을 구성하여 결정된다.
일부 실시예에 따르면, 생물학적 유체(예를 들면, 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 가래, 정액, 타액, 수정체액, 뇌액, 척수액, 양수, 조직 배양 배지 등, 및 이들의 희석액 포함)에서 SDMA의 검정을 위한 동종 효소 면역검정이 제공된다. 검정은 생물학적 유체에 존재하는 SDMA와 항체 결합 부위에 대한 효소(예를 들면, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH))로 표지된 Nα-아실화-SDMA 또는 Nα-알킬화-SDMA 간의 경쟁을 기반으로 한다. 항체에 결합하면 효소 활성이 감소하므로 생체액 내 SDMA 농도를 효소 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 활성 G6PDH는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 NADH로 전환하여 분광광도계로 측정할 수 있는 흡광도 변화를 초래한다. 조효소 NAD+ 는 오로지 박테리아 효소와 작용하기 때문에, 내인성 혈청 G6PDH가 간섭하지 않도록 박테리아(Leuconostoc mesenteroides) 효소를 검정에 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 동종 효소 면역검정을 비롯한 본 개시내용의 면역검정에서, 하나 이상의 시약이 동결건조된 형태로 제공된다. 하나만 예를 들자면, 본 개시내용의 화학식 1의 화합물 중 임의의 것, 본 개시내용의 임의의 항체, 또는 양자 모두를 포함하는 조성물은 그 개시 내용이 모든 목적을 위해 전체가 참조로 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,413,732호에 기술된 바와 같이 동결건조된 시약 구체(또는 "비드")의 형태로 제공될 수 있다. 간단히 말해서, 이러한 구형상체는 예를 들어 시약의 동종 용액을 형성함으로써 제조될 수 있으며; 용액의 균일한 액적 측정(예를 들면, 2 내지 50μL); 균일하고 측정된 액적을 교반되지 않은 극저온 액체(예를 들면, 액체 질소)에 분배하여 액적을 동결시키는 단계; 극저온 액체로부터 동결된 액적을 수집하는 단계; 및 동결된 액적을 동결건조시켜 복수의 동결건조된 시약 구체를 형성하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 하나 이상의 시약이 동결건조된 형태로 제공되는 실시예를 포함하는 일부 실시예에 따르면, 미세유체 로터(또는 "디스크")를 포함하는 원심 분석기가 본 개시내용의 면역검정에 사용된다. 예를 들어, 본 개시내용의 면역검정은 혈장 또는 혈청을, 하나 이상의 시약(예를 들어, 상기 기재된) 및 혈장 또는 혈청을 복수의 개별 시험 웰에 분배하는 단계를 포함한다. 전혈을 혈장으로 분리하는 데 필요한 챔버 및 통로는 정확하게 측정된 양의 혈액 및/또는 희석제를 분리 챔버로 전달하는 계량 챔버에서 방사상 바깥쪽으로 위치한다. 분리 챔버는 방사상으로 바깥쪽을 향하는 세포 트랩을 포함한다. 로터를 회전시키면 전혈의 세포 성분이 세포 트랩에 격리된다. 그런 다음 분리된 혈장은 다수의 테스트 웰 또는 큐벳으로 전달된다. 상술한 분리 및 분취 단계는 일반적으로 회전하는 회전자에 의해 생성된 원심력의 결과로 발생한다. 상기 설명한 로터와 조합하여 상술한 동결건조된 시약 구체는 혈장 또는 희석된 혈장을 검정하는 데 특히 적합하다. 또한 소변, 가래, 정액, 타액, 수정체액, 뇌액, 척수액, 양수, 조직 배양 배지와 같은 다양한 기타 생물학적 유체와 식품 및 산업용 화학 물질 등에 유용하다. 미세유체 로터를 포함하는 이러한 원심 분석기에 관한 세부사항은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,061,381호, 제5,173,193호; 제5,122,284호 및 제5,186,844호에 개시되며, 이들의 내용은 모든 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 통합된다.
일부 실시예에서, 면역검정은 로터 내의 제1 및 제2 챔버 사이에 사전 측정된 부피의 액체(예를 들면, 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 시료)를 전달하기 위한 사이펀(siphons)을 포함하는 미세유체 로터를 포함하는 원심 분석기를 사용한다. 사이펀은 제1 챔버에서 유체의 반경방향 가장 안쪽 지점의 반경방향 안쪽에 있는 엘보우를 포함할 수 있다. 로터가 회전함에 따라, 유체가 엘보우를 지나 흐르지 않는다. 일단 로터가 멈추면, 모세관이 엘보우 바로 주변에서 유체를 끌어 당겨 사이펀을 "프라임(prime)"한다. 로터가 재시동하면 원심력은 계량 챔버의 유체 레벨이 사이펀의 출구와 동일한 반경 거리에 있을 때까지 계량 챔버의 나머지 유체를 수용 챔버로 끌어당긴다. 사이펀은 제1 챔버 상의 사이펀의 입구가 제2 챔버 상의 사이펀 출구의 반경방향 외측에 있도록 설계될 수 있다. 사이펀의 입구와 출구의 위치는 특정한 장점을 제공한다. 예를 들어, 사이펀의 입구는 유체가 제2 챔버로 이송된 후에 항상 제1 챔버에 있는 유체의 메니스커스의 최종 위치의 반경방향 외측에 위치될 수 있다. 따라서, 메니스커스가 최소화되기 때문에 다른 유체에서 다른 모양의 메니스커스와 관련된 측정의 부정확도가 최소화된다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, 사이펀 내의 유체 열이 안정적이지만 로터가 섭동되면 쉽게 파손되기 때문에 모든 사이펀은 반안정적이다. 유체의 열(train)이 단절되면, 원심력에 따라 사이펀에 포함된 유체가 방사상 가장 바깥쪽 지점으로 흐르게 된다. 앞서의 사이펀에서는 이 지점이 사이펀 배출구이다. 따라서, 계량되지 않은 체적의 유체를 수용 챔버로 전달할 가능성이 있다. 본 명세서에 설명된 사이펀에서는, 사이펀의 방사상 가장 바깥쪽 지점은 사이펀 입구로 된다. 이 설계에서는 유체의 열이 끊어지면 유체가 첫 번째 챔버로 다시 흐르기 때문에 계량되지 않은 양의 유체를 전달하는 문제를 피할 수 있다. 본 발명의 임의의 방법/면역검정에 사용될 수 있는 미리 측정된 부피의 액체를 전달하기 위한 사이펀을 포함하는 원심 로터를 포함하는 분석기에 관한 추가 세부사항은 미국 특허 제7,998,411호에서 찾을 수 있으며, 모든 목적을 위해 그의 내용 전체는 참조로 본 명세서에 통합된다.
본 명세서에 기술된 대칭 디메틸아르기닌 유도체, 결합체, 항체, 면역원 및/또는 기타 결합체는 효소 또는 형광 및/또는 동종 면역검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 급속 측면 유동 검정, 및 항체 어레인 및 아직 개발되지 않은 형식을 포함하는 다양한 검출 시스템을 사용하는 다수의 다른 이종 면역검정에도 적합하다.
대칭 디메틸아르기닌 유도체, 결합체, 항체 및 면역원을 활용하는 다양한 면역진단 검정이 본 명세서에 기술되어 있지만, 이러한 검정은 또한 변형될 수 있다. 이와 같이, 이러한 면역검정을 수행하기 위한 단계 또는 작용의 다양한 변형이 본 명세서에 기재된 실시예의 범위 내에서 이루어질 수 있다. 검정 형식과 관련된 추가 정보는 David Wild(The Immunoassay Handbook, 4th Edition Published Date: 31st January 2013, Elsevier Science)에 설명되어 있다.
키트
본 개시내용의 실시형태는 키트를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 키트는 시료에서 적어도 하나의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하는 데 사용된다. 이러한 키트는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물, 본 개시내용의 임의의 항체, 또는 양자 모두를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 시료에서 하나 이상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위한 키트로서, 이러한 키트는 본 개시내용의 임의의 항체를 포함하고, 및 항체를 사용하여 시료내에서 하나 이상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위한 지침을 제공한다. 일부 실시예에 따르면, 항체는 대칭 디메틸아르기닌의 대사물(비제한적인 예로서 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌(Ac-SDMA)을 포함)에 특이적으로 결합하고, 키트는 대칭 디메틸아르기닌 대사물의 양을 결정하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 항체를 포함하는 키트는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 화합물은 Z가 표지, 예를 들어 효소, 예를 들면 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)이다.
또한, 시료에서 하나 이상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 측정하기 위한 키트가 제공되며, 이 키트는 본 개시내용의 임의의 화학식 1의 화합물을 포함하고, 시료에서 하나 이상의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위해 화합물을 사용하기 위한 지침이 제공된다. 특정 측면에서, 화합물은 Z가 표지인 것, 예를 들어 효소, 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)이다. 이러한 키트는 본 개시내용의 임의의 항체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 항체는 대칭 디메틸아르기닌의 대사물(비제한적인 예는 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌(Ac-SDMA)을 포함함)에 특이적으로 결합하고, 키트는 대칭 디메틸아르기닌 대사물의 양을 결정하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 본 개시내용의 키트는 예를 들어 대칭 디메틸아르기닌 및 이의 유사체, 대칭 Nα-아세틸-디메틸아르기닌과 같은, 시료내에서의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 측정을 위한 검정을 편리하게 수행하는 데 유용하다. 키트는: (a) 대칭 디메틸아르기닌 및 본 명세서에 기재된 화학식 1의 화합물(예를 들어, 대칭 디메틸아르기닌 결합체)에 특이적으로 결합하도록 생성된 항체; 및 (b) 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물의 양을 결정하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 또한 화학식 1의 화합물의 결합체를 포함하고, 여기서 결합체는 표지(예를 들어, 검출가능한 표지, 예를 들어 G6PDH)를 포함한다. 특정 예에서, 키트는 또한 분석물을 결정하기 위한 보조 시약을 포함한다. 키트의 항체는 본원에 기재된 화학식 1의 화합물에 대해 생성된 항체일 수 있다.
면역검정의 다양성을 향상시키기 위해, 키트 시약은 시약의 비율이 방법 및 검정의 실질적인 최적화를 제공하도록 액체 또는 동결건조된 형태로 동일하거나 별도의 용기에 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 특정 실시예에서, 키트는 본 개시내용의 항체, 본 개시내용의 화합물, 또는 양자 모두를 포함하며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 전체가 본 명세서에 참조로 결합되는 미국 특허 제5,413,732호에 기재된 바와 같은 동결건조된 시약 구형상체로서 제공된다. 키트에 제공된 시약은 각각 별도의 용기에 있거나 다양한 시약이, 예를 들어 시약의 교차 반응성 및 안정성에 따라 하나 이상의 용기에 조합될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 화학식 1의 화합물(예를 들어, 대칭 디메틸아르기닌 결합체)은 동결건조된 형태로 존재한다. 일부 실시예에서, 항체는 동결건조된 형태로 존재한다. 예를 들어, 화학식 1의 화합물은 제1 동결건조된 조성물(하나 이상의 부형제, 완충제, 안정화제 등을 추가로 포함할 수 있다)로 존재할 수 있고, 항체는 제2 동결건조된 조성물(이는 추가로 효소 기질 및 하나 이상의 부형제, 완충제, 안정제 등)로 존재할 수 있다. 제1 동결건조된 조성물 및 제2 동결건조된 조성물은 예를 들어 1회 사용을 위한 포장 또는 용기와 같은 단일 키트로 제공될 수 있다.
키트는 보조 효소 기질 등과 같은 보조 시약과 같은 검정을 수행하기 위해 별도로 포장된 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트에 있는 다양한 시약의 상대적인 양은 방법/면역검정(예를 들면, 동종 효소 면역검정)을 수행할 때 발생하는 반응을 실질적으로 최적화하고 추가로 검정의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 달라질 수 있다. 적절한 상황에서 키트에 있는 하나 이상의 시약은 본 발명에 관한 방법 또는 검정을 수행하기 위하여 적절한 농도를 가지는 시약을 제공하도록 일반적으로 부형제를 포함하여 동결건조된 건조 분말로 제공될 수 있다. 키트는 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 방법의 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
키트의 특정 예시적인 실시예의 설명은 "및/또는"이라는 언어를 사용하며, 이는 키트가 언급된 각 항목을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 의미한다. 이 언어는 간결함을 위해 사용된다. 일반적으로, 면역검정 키트는 분석물의 면역원에 대한 하나 이상의 항체, 예를 들어 대칭 디메틸아르기닌, 및 해당 분석물, 예를 들어 대칭 디메틸아르기닌 유도체의 효소 결합체에 해당하는 하나 이상의 효소 결합체(예를 들면, 표지 결합체)를 포함한다.
특정 실시예에서, 분석물 대칭 디메틸아르기닌 및/또는 대칭 디메틸아르기닌의 대사산물에 대한 검정을 위한 키트가 제공된다. 키트는 포장된 조합으로 다음을 포함할 수 있다: (i) 화학식 1의 화합물에 대해 생성된 항체; 및 (ii) 분석물의 유도체의 결합체. 본 개시내용의 또 다른 실시예는 패키지된 조합으로서 다음을 포함하는 대칭 디메틸아르기닌 및/또는 대칭 디메틸아르기닌의 대사물 검정용 키트가 제공된다: (i) 분석물의 유도체에 대해 생성된 항체; 및 (ii) 분석물의 합텐의 결합체(여기서 합텐은 화학식 1의 화합물임).
본 개시내용의 화합물, 방법 및 키트는 면역검정에 의한 대칭 디메틸아르기닌의 일상적인 모니터링에 사용된다. 특정 실시예에서, 이러한 면역검정은 빠른 처리 시간으로 표준 실험실 장비에 적합한 간단한 자동화 테스트를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 면역검정을 제공하기 위해 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물에 대한 항체가 생성된다. 유도체 및 면역원은 상응하는 항체를 통해 대칭 디메틸아르기닌에 대한 특이적 반응성을 부여하도록 설계되었다.
키트에 포함된 지침은 적절한 기록 매체에 기록할 수 있다. 예를 들어, 지침은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재에 인쇄될 수 있다. 이와 같이 지침은 패키지 삽입물로서 키트에, 키트의 용기 또는 그 구성요소의 표지에 존재할 수 있다(즉, 패키징 또는 서브패키징과 관련된) 등이 포함된다. 다른 실시예에서 지침은 적절한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, 예를 들어 휴대용 플래시 드라이브, DVD, CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자적 저장 데이터 파일로 존재한다. 또 다른 실시예에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만 원격 소스로부터 지침을 얻기 위한 수단, 예를 들어 인터넷을 통해 제공된다. 이 실시예의 예는 지침을 볼 수 있고 및/또한 있거나, 지침을 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 지침과 마찬가지로 지침을 얻기 위한 수단은 적절한 기판에 기록된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 통상의 지식을 가진 자에게 제공하기 위해 제시되는 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니다. 아래의 실험이 모두 또는 수행된 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이다. 사용된 숫자(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 담조하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. "평균"은 산술 평균을 의미한다. 표준 약어, 예를 들어 bp, 염기쌍; kb, 킬로베이스; pl, 피코리터; s 또는 sec, 초, 분; h 또는 hr, 시간; aa, 아미노산; kb, 킬로베이스; bp, 염기쌍; nt, 뉴클레오티드; i.m., 근육내; i.p., 복강내; s.c., 피하; 등이다.
화합물, 결합체 및 면역원과 관련하여 다음 약어가 사용된다. DCM은 디클로로메탄이고; DMF는 N,N-디메틸포름아미드이고; EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산이고; KLH는 키홀 림펫 헤모시아닌이고; SATA는 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트이고; TFA는 트리플루오로아세트산이고; EDCI는 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드히드로클로라이드이고; NHS는 N-히드록시숙신이미드이고; DTT는 디티오에리트리톨이고; G6PDH는 글루코스-6-인산 탈수소효소이며; EtOAc는 에틸 아세테이트이고; BSA는 소 혈청 알부민이고; DMO는 Dess-Martin 페리오디난이고; MeCn은 아세토니트릴이고; EA는 에틸 아세테이트이고; t-Boc는 tert-부틸옥시카르보닐 보호기이고; TLC는 박층 크로마토그래피이고; MeOH는 메탄올이고; AcOH는 아세트산이고; PBST는 Tween-20이 포함된 인산염 완충 식염수이고; TMB는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘이고; PBMC는 말초 혈액 단핵 세포이다.
일반 합성 절차
개시된 화합물의 합성에 유용한 일반적으로 알려진 화학적 합성 반응식 및 조건을 제공하는 많은 일반 참고문헌이 이용가능하다(예를 들어, Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Include Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978).
본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물은 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC, 분취 박층 크로마토그래피, 플래시 컬럼 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 정제 프로토콜에 의해 정제될 수 있다. 이온성 수지 뿐만 아니라 순상 및 역상을 포함하는 임의의 적합한 고정상을 사용할 수 있다. 특정 실시예에서, 개시된 화합물은 실리카 겔 및/또는 알루미나 크로마토그래피를 통해 정제된다. 예를 들어, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, ed. L. R. Snyder 및 J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979; 및 Thin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969를 참조한다.
대상 화합물의 제조 공정 중 임의의 관련 분자에서 민감성 또는 반응성 기를 보호하는 것이 필요 및/또는 바람직할 수 있다. 이것은 JFW McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, TW Greene 및 PGM Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", third edition, Wiley, New York 1999, "The Peptides"; Volume 3(Editors: E. Gross 및 J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, in"Methoden der Organischen Chemie", Houben-Weyl, 4판, Vol. 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgard 1974, H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, 및/또는 in Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974와 같은 표준 작업서에 개시된 종래의 보호기의 수단에 의하여 달성될 수 있다. 보호기는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 편리한 후속 단계에서 제거될 수 있다.
대상 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질 및/또는 통상적인 합성 방법에 의해 제조된 출발 물질을 사용하여 다양한 상이한 합성 경로를 통해 합성될 수 있다. 본원에 개시된 화합물을 합성하기 위해 사용될 수 있는 합성 경로의 다양한 예는 하기 반응식에 기재되어 있다.
실시예 1
SDMA-M 합텐의 제조
1 단계.
Figure pat00008
포화 NaHCO3(12mL) 중 (1)(534mg, 6.0mmol, 1.0당량)의 용액에 온도를 0℃를 유지하면서 (2)(930g, 6.0mmol, 1.0당량)를 소량으로 첨가하였다. 첨가 완료 시, 생성된 용액을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 모든 출발 물질이 표적 물질로 전환되었음을 보여주었다. 교반된 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 EtOAc로 추출하였다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, v/v로 용리)로 정제하여 (3)(0.91g, 91% 수율)을 투명한 오일로서 얻었다. 구조는 1H NMR로 확인하였다.
2 단계.
Figure pat00009
DCM(40mL)내에서 (3)(0.9g, 5.3mmol, 1.0 당량), Dess-Martin 산화 시약(4.5g, 10.6mmol, 2.0 당량) 및 NaHCO3 의 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 대부분의 출발 물질이 표적 물질로 변형되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 생성된 여액을 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트=1/1,v/v)로 정제하여 O330-04(0.35g, 40% 수율)를 투명한 오일로서 얻었다. 제품(4)은 공기에 극도로 민감하여 다음 단계에 즉시 사용되었다. 구조는 LC-MS에 의해 확인되었다.
Figure pat00010
MeOH 중 (4)(668 mg, 4 mmol, 2.0 당량) 및 대칭 디메틸아르기닌(SDMA)(404 mg, 2 mmol, 1.0 당량)의 용액에 AcOH(200 μL) 및 NaBH3CN(150 mg, 2.4mmol, 1.2 당량)이 첨가되었다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. LC-MS는 대부분의 출발 물질이 표적 물질로 변형되었음을 보여주었다. 반응을 물로 냉각하고 즉시 Biotage 역상 크로마토그래피로 정제하여 투명한 오일로서 SDMA-M(326 mg, TFA 염으로서 35% 수율)을 얻었다. 구조는 1H NMR로 확인하였다. 1H NMR(400MHz, D20): δ 6.81(s, 2H), 3.97(M, 1H), 3.51(m, 2H), 3.21(m, 2H), 3.08(m, 2H), 2.78(s, 6H), 1.98(m, 2H), 1.64(m, 6H). (도 5 참조).
실시예 2
SDMA-SBAP 합텐 제조
1 단계.
Figure pat00011
DMF(18mL) 중 (5)(1.4g, 7.2mmol, 1.0 당량) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)(1g, 8.7mmol, 1.2 당량)의 용액에 EDCI(2.78g, 14.5mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 모든 출발 물질이 표적 물질로 변형되었음을 보여주었다. 용액을 H2O(100mL)에 붓고 EA(100mL)로 추출했다. 유기상을 H2O 및 포화 식염수로 세척하였다. 유기 용매를 감압하에 제거하고 진공에서 건조하여 원하는 생성물(6)을 얻었다(2.0g 95.2% 수율). 구조는 1H NMR로 확인하였다.
2 단계.
Figure pat00012
DMF(5mL) 중 대칭 디메틸아르기닌(SDMA)(400mg, 2.0mmol, 1.0 당량)의 용액에 (6)(630mg, 2.2mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 모든 출발 물질이 표적 물질로 변형되었음을 보여주었다. 용매를 진공하에 제거하였다. 조 생성물을 MeCN 및 물(7.5 mL, 1/1, v/v)에 용해시킨 다음 Biotage 역상 크로마토그래피(표준 방법)를 사용하고 정제하여 순수한 생성물(7)(650mg, TFA의 염, 66.7% 수율)을 투명한 오일로 사용한다. 구조는 1H NMR로 확인하였다.
3 단계.
Figure pat00013
MeCN(10 mL) 중 (7)(650 mg, 1.33 mmol, 1.0 당량)의 용액에 TFA(4 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 교반하였다. LC-MS는 모든 출발 물질이 표적 물질(8)로 변형되었음을 보여주었다. 용매를 감압하에 제거하고 진공에서 건조하여 원하는 생성물을 정량적 수율(TFA 염으로서)로 얻었다. 구조는 LC-MS에 의해 확인되었다.
4 단계
Figure pat00014
(8)(258mg, 0.87mmol, 1.0당량), N-숙신이미딜 브로모아세테이트(9)(205mg, 0.87mmol, 1.0당량) 및 DIPEA(0.3mL, 1.74mmol, 2.0당량)의 혼합물 DMF(2mL)를 30℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 모든 출발 물질이 표적 물질로 변형되었음을 보여주었다. 용매를 진공하에 제거하였다. 조 생성물을 MeCN 및 물(3.5 mL, 1/1, v/v)에 용해시킨 다음, Biotage 역상 크로마토그래피(표준 방법)로 정제하여 순수한 생성물 SDMA-SBAP(175 mg, TFA의 염, 39.6 % 수율)을 투명한 오일로 수득하였다. 구조는 1H NMR로 확인되었다. 1H NMR(400MHz, D20) δ 4.36-4.32(m, 1H), 3.83(s, 2H), 3.45(t, J=6.4, 2H), 3.18-3.15(m, 2H), 2.76(s, 6H), 2.49(t, J = 6.4, 2H), 1.87-1.74(m, 1H), 1.73-1.58(m, 3H). 반응식을 도 6에 나타내었다.
실시예 3
SDMA-M-SH-KLH 면역원의 제조
Hapten SDMA-M은 티올기가 KLH에 화학적으로 도입된 KLH에 결합되었다. N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트를 보호된 설프히드릴을 첨가한 KLH의 1차 아민과 반응시켰다. 하이드록실 아민으로 보호된 설프히드릴의 탈보호로 원하는 티올화된 SH-KLH를 생성하였다(도 8). 합텐 SDMA-M과 SH-KLH의 결합은 면역원 SDMA-M-SH-KLH를 생성하였다(도 8 참조).
a) SH-KLH의 제조
동결건조된 KLH(20mg)를 탈이온수로 재구성하고 1M 탄산염-중탄산염 완충액을 사용하여 pH를 8.6으로 조정했다. N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트의 용액을 준비하고(4.67 mg을 92 μL의 DMF에 220 mM의 농도로 용해) KLH 용액에 4시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트를 첨가하면서 반응 혼합물을 실온에서 교반한 다음, 추가로 16시간 동안 저온실(4℃)에서 교반하였다.
가교에 사용하기 위한 설프히드릴을 생성하기 위한 탈아실화는 200 μL의 탈아세틸화 용액(12.5mM NaH2P04-Na2HPO4 완충액 중 0.7M 히드록실아민 용액, pH 7)을 첨가하여 수행되었다. 내용물을 혼합하고 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 생성물 SH-KLH를 생성하였다(도 8 참조). 이 반응의 마지막에 EDTA를 1mM의 농도로 첨가하였다.
b) SDMA-M-SH-KLH 면역원의 제조
상기 SH-KLH 용액에 디티오트레이톨 용액을 총 1mM 농도로 첨가하여 이황화 결합 형성을 최소화하였다. 1M 탄산염-중탄산염 완충액을 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다. SH-KLH 용액에, DMF(0.2mL DMF에 용해된 9.6mg)에 용해된 말레이미드 유도체 합텐 SDMA-M 146 μl를 4 내지 5시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 반응을 4℃에서 밤새 계속하였다. 혼합물을 2-8℃에서 4리터 NaH2P04-Na2HPO4 완충액 12.5mM, pH 7.0 중 10,000MWCO Slide-A-Lyzer®투석 카세트(Pierce)를 사용하여 투석에 의해 정제하였다. 이 절차는 면역원 SDMA-M-SH-KLH를 산출하였다(도 8 참조).
실시예 4
SDMA-SBAP-SH-G6PDH 결합체의 제조
실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된 합텐 SDMA-SBAP는 돌연변이 G6PDH(미국 특허 제6,455,288호, 제6,090,567호, 제6,033,890호 참조)와 같은 시스테인 기를 함유하는 단백질 또는 화학 반응에 의해 실시예 3에 기재된 바와 유사하게 G6PDH에 티올-기의 도입을 위해 설계된다.
SDMA-SBAP 합텐(7mg, 0.018mmol)을 DMF(0.21mL)에 용해시켰다. 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 SDMA-SBAP 솔루션은 다음과 같이 사용되었다.
디티오트레이톨 용액을 2mM 농도로 돌연변이 G6PDH에 첨가하여 디설파이드 결합으로 술프히드릴기에 연결된 시스테인 티올기를 환원시켰다. 생성된 효소 용액(0.9 mg, 1.5 mL)을 1M 탄산염 중탄산염 완충액으로 pH 7.2로 조정하고 대략 340배 몰 과량(0.07 mL)의 SDMA-SBAP 합텐과 혼합하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 부드럽게 교반되도록 하였다. 과량의 SDMA-SBAP 합텐은 12.5mM NaH2PO4-Na2HP04 완충액(pH 7.0) 중 Sephadex G-50 컬럼에 반응 혼합물을 통과시켜 효소-합텐 결합체로부터 분리했다. 효소-합텐 결합체를 함유하는 컬럼 분획을 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 풀링하여 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 수득하였(도 7 참조).
Hapten SDMA-SBAP는 상술한 것과 유사한 결합 절차를 사용하여 BSA와 결합되었다. SDMA-SBAP-SH-BSA 결합체(도 9)를 사용하여 실시예 6에 기재된 바와 같이 간접 ELISA에 의해 B-세포 및 모노클로날 항체를 스크리닝하였다.
실시예 5
SDMA에 대한 폴리클로날 항체의 제조.
완전 프로인트 항원보강제에 유화시킨, 실시예 3에서 제조한 SDMA-M-SH-KLH 면역원 200μg/토끼를 24마리의 암컷 흰색 뉴질랜드 토끼에 피하 주사하여 면역화시켰다. 토끼는 불완전 프로인트 항원보강제에 유화된 동일한 면역원의 100μg/토끼로 초기 주사 후 4주마다 부스팅되었다. 초기 면역화 134일 후, 각 토끼의 폴리클로날 항체를 포함하는 출혈을 중이 동맥에서 채취했다. SDMA-M-SH-KLH 항체를 함유하는 이들 출혈로부터의 항혈청은 효소 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH의 최대 항체 억제 및 실시예 7 및 8에 기재된 바와 같은 대칭 디메틸아르기닌 존재하에서의 조절을 측정함으로써 동종 검정 형식(도 10)으로 평가되었다.
이들 실험에서 토끼 21342 및 26494를 선택하여 SDMA-M-SH-KLH 면역원으로 면역화된 토끼로부터 복제를 위한 B-세포의 공급원으로서 PBMC를 분리하였다(실시예 6). SDMA-M-SH-KLH로 면역화된 24마리 토끼 폴리클로날항혈청의 초기 스크리닝 결과는 하기 표 1과 같다.
표 1
Figure pat00015
실시예 6
토끼 모노클로날 항체 제조
토끼 재조합 모노클로날 항체는 면역화된 토끼의 천연 항체 레퍼토리를 효율적으로 시료화하기 위한 단일 B-세포 스크리닝 방법을 사용하여 제조되었다. 이 기술은 일반적으로 본원에 기술된 대칭 디메틸아르기닌에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 데 적용할 수 있다.
면역된 동물 #21342 및 #26494의 토끼 말초 혈액 단핵세포(PBMC's)를 B-세포의 공급원으로 사용했다. 표준 밀도 구배 원심분리 절차를 사용하여 각 토끼의 약 40mL 전혈로부터 PBMC를 분리했다. PBMC를 PBS에 희석하고 이론적으로 웰당 단일 세포를 같은 날 40개의 96웰 플레이트에 분배하고 배양하였다.
각 웰로부터 생성된 상청액을 SDMA-SBAP-SH-BSA 항원에 대한 간접 ELISA에 의해 시험하였다(도 9). 40개의 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 0.1M 탄산염 완충액, pH 9.5에서 O.lμg/웰 SDMA-SBAP-SH-BSA로 코팅하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 플레이트를 비운 다음 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 PBST 중 3% 탈지분유로 차단하였다. 차단 용액을 제거한 후 플레이트를 PBST로 헹구었다. 25 μL의 PBST를 각 웰에 첨가한 후 모든 웰에 25μL의 세포 상청액을 첨가하고 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 총 세척 시간은 30분이었다. 그 후, PBST에 100 μL/웰 2차 항체 1:10,000(v/v) 염소 항-토끼 IgGFc-HRP 결합체를 첨가하고 플레이트를 일정한 진탕 하에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였고 총 세척 시간은 30분이었다. TMB 기질을 50uL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 어두운 곳에서 5분간 인큐베이션하여 색상이 발색되도록 한 후, 50μL의 1N HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 통해 색상을 읽고 데이터를 검정을 위해 컴퓨터로 전송했다. SDMA-M-SH-BSA 결합체에 결합된 상층액(웰에서 생성된 색상)은 양성으로 간주되었다. 총 32개의 세포가 클로닝 및 발현을 위해 선택되었다.
항원-특이적 항체가 있는 각 ELISA 웰에 대해, 해당 PBMC 배양 웰에서 mRNA를 분리하고 토끼 유전자, IgH 및 IgK의 가변 영역으로부터 cDNA를 별도로 합성하기 위해 분할하였다. 증폭을 위한 2회의 PCR 후, cDNA를 각각 중쇄 불변 IgG 영역 또는 경쇄 불변 IgK 영역을 갖는 별도의 포유동물 발현 벡터에 매끄럽게 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 E. coli로 형질전환하여 정확한 발현 구성체를 선택하고 배양하여 플라스미드를 분리하였다. 발현 구축물을 HEK293 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 2일 동안 배양하여 재조합 항체를 분비하였다. 재조합적으로 발현된 항체의 항원 결합 특성은 상기 기재된 바와 같이 SDMA-SBAP-BSA 항원에 대한 간접 ELIA에 의해 평가하였다. 선택된 클론은 실시예 7 및 8에 기술된 바와 같이 동종 효소 면역검정 형식에서 평가를 위해 추가로 사용되었다. 선택된 토끼 모노클로날 항체에 대해 DNA 시퀀싱을 수행하고 표준 코드로 번역하여 모든 중쇄 및 카파쇄 가변 영역 서열에 대한 단백질 서열 데이터를 제공했다. 이하의 표는 모노클로날 항체를 생성하는 개발 단계를 요약한 것이다.
표 2
Figure pat00016
실시예 7
SDMA 표준 및 교정 프로토콜의 준비
대칭 디메틸아르기닌 디(p-히드록시아조벤젠-p'-술포네이트)염(Sigma)을 DMF:H2O(1:1)에 용해시키고 합성 매트릭스에서 4μg/ml 스톡 용액의 SDMA의 최종 농도로 희석하였다. SDMA 스톡 용액을 0, 15, 50, 100, 150, 200μg/dL의 수준을 달성하기 위해 합성 매트릭스의 분취량으로 옮겼다. 합성 매트릭스는 HEPES(6.5mM, pH 6.7) 및 EDTA(0.25mM), 계면활성제, 소포제 및 보존제로 완충된 단백질성 용액으로 구성되었다. 표준은 LC/MS에 의해 검증되었다(도 17 참조).
6점 보정 곡선을 사용하여 시료에서 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌을 정량화했다. 각 교정기 수준을 이중으로 측정하여 Beckman Coulter AU480 자동화 임상 화학 분석기(실시예 7 및 8 참조)에서 교정 곡선을 생성했다.
Nα-아세틸-디메틸아르기닌(Ac-SDMA) 교정기는 상술한 것과 유사한 방식으로 제조되었다. Nα-아세틸-디메틸아르기닌은 SYNthesis med chem(호주)에 의해 합성되었다.
실시예 8
시약 및 검정
대칭 디메틸아르기닌 항체 및 효소 결합체는, 본 개시내용에 따라 시료 내에서 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물을 검출하기 위해 동종 검정 형식으로 유리하게 사용될 수 있다. 항체는 결합체 억제, 결합체 조절, 보정, 교차 반응성 및 소량 첨가 회수율과 같은 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 항체(폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 또는 토끼 #27420, 또는 복제된 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3K3 또는 5H1/5K1)는 항체 희석제에 첨가하여 항체 시약을 제조한다. 항체 시약은 상기와 같이 제조된 항체, 완충제, 염, 안정화제, 보존제, NAD+ 및 글루코스-6-포스페이트를 포함한다. 효소 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 결합체 희석제에 첨가하여 효소 결합체 시약을 제조한다. 효소 결합체 시약은 결합체, 완충제, 안정제, 염 및 방부제를 포함한다.
동종 효소 면역검정 형식에서 항체 및 효소 결합체를 평가하는 데 유용한 임상 화학 분석기는 Beckman Coulter AU480(Beckman Coulter, Brea, CA)이다. Beckman AU480은 의료 실험실에서 소변, 뇌척수액, 구강액, 혈장 및 혈청과 같은 생물학적 유체 표본을 처리하는 데 사용하는 자동화된 생화학 분광광도계 분석기이다. 분석기는 일정한 온도를 유지하고, 시료를 피펫팅하고, 시약을 혼합하고, 흡광도를 측정하고, 반응 시간을 정확하게 측정할 수 있다.
동종 효소 면역검정은 상술한대로 바로 사용할 수 있는 액체의 두 가지 시약 검정을 사용하여 수행된다. 일반적으로 2-15 μL의 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물 함유 시료를 75-150 μL의 항체 시약과 함께 배양한 다음 50-100 μL 효소 결합체 시약을 첨가한다.
검정은 생물학적 유체에서 SDMA 분석에 사용되는 동종 효소 면역검정 기술이다. 분석은 검체의 SDMA와 항체 결합 부위에 대한 효소 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)로 표지된 Nα-아실화-SDMA 또는 Nα-알킬화-SDMA 간의 경쟁을 기반으로 한다. 항체에 결합하면 효소 활성이 감소하므로 시료 내 약물 농도를 효소 활성으로 측정할 수 있다. 활성 효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 NADH로 전환하여 340nm에서 분광광도계로 측정되는 흡광도 변화를 초래한다. 내인성 혈청 G6PDH는 조효소 NAD+가 검정에 사용된 박테리아(Leuconostoc mesenteroides) 효소하고만 기능하기 때문에 간섭하지 않다. 340 nm에서 흡광도의 변화는 분광광도계로 측정할 수 있고 효소 결합체 활성에 비례하며 이는 차례로 분석물 농도와 관련된다(도 10 참조).
실시예 9
대칭 디메틸아르기닌 분석물을 사용한 항체 및 보정
대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 및 효소 결합체(SDMA-SBAP-SH-G6PDH)를 동종 검정 형식으로 사용하여 실시예 7에 기재된 바와 같은 대칭 디메틸아르기닌 표준을 사용하여 보정 곡선을 생성하였다. 항체 시약은 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조하였다. 대칭 디메틸화 아르기닌 분석물 폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 복제된 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3K3, 또는 5H1/5K1를 사용하여 제조되었다. 효소 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 사용하여 결합체 시약을 제조하였다. 실시예 7 및 8에 기재된 바와 같이 Beckman AU480 임상 화학 분석기에서 6-포인트 보정 곡선을 생성하였다. 전형적인 보정 곡선은 하기 표에, 용량-반응 곡선은 도 11 및 도 12에 나타내었다. 이 실험은 폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 복제된 단일 클론 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3K3 또는 5H1/5K 들이 용량-반응 관계를 나타내는 대칭 디메틸아르기닌에 대한 반응에 결합하는 항체를 가지고 있음을 입증했다.
표 3
Figure pat00017
실시예 10
Nα-Acetyl-Symmetric Dimethylarginine Analyte를 사용한 항체 및 보정
대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 항체 및 효소 결합체(SDMA-SBAP-SH-G6PDH)를 동종 검정 형식으로 사용하여 실시예 7에 기재된 바와 같이 Nα-아세틸-대칭 디메틸아르기닌을 사용하여 제조된 표준을 사용하여 검량선을 생성하였다. 항체 시약을 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 8에서 대칭 디메틸화된 아르기닌 분석물 폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 복제된 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3H1/5, 또는 효소 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 사용하여 결합체 시약을 제조하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이 Beckman AU480 임상 화학 분석기에서 6-포인트 보정 곡선을 생성하였다. 전형적인 보정 곡선은 하기 표에, 용량-반응 곡선은 도 13 및 도 14에 나타내었다.
이 실험은 폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 클로닝된 모노클로날 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3K3 또는 5H1/5K들이 용량-반응 관계를 나타내는 대칭 디메틸아르기닌에 대한 반응에 결합하는 항체를 가지고 있음을 입증했다.
표 4
Figure pat00018
실시예 11
소량 첨가 회수율
알려진 양의 대칭적으로 메틸화된 아르기닌 검정 스톡 용액(4 pg/mL)을 실시예 7에 기술된 바와 같이 합성 매트릭스에 첨가(스파이크)하여 0, 15, 50, 100, 150, 200 pg/dL의 농도를 달성했다. 이들 시료는 실시예 8에 기술된 바와 같이 Beckman AU480 상의 소량 첨가 회수율(회수)를 확인하기 위해 동종 효소 면역검정에 의해 3중으로 정량화되었다. 시료는 6-포인트 보정 곡선을 생성함으로써 별도로 준비된 표준 세트를 사용하여 정량화되었다. 테스트 중인 시료에서 정량화되는 분석물과 동일한 분석물을 사용하여 준비된 표준을 사용하여 보정 곡선을 생성했다. 효소 결합체 시약은 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 포함하고 항체 시약은 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 항체 클론 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, /1K4, 3H1/3K3 또는 5H1/5K1 였다. 소량 첨가 회수율 실험에서 회수된 대칭적으로 메틸화된 아르기닌 분석물 농도를 공지된 농도와 비교하고 플롯팅하였다(도 15-18). 이 실험은 폴리클로날 항체 토끼 #21342, 토끼 #26494, 토끼 #27420 및 복제된 항체 1H4/1K4, 8H1/8K3, 18H1/18K2, 1H2/1K4, 3H1/3K3 또는 5H1/5K1이 대칭적인 디메틸아르기닌 및 Nα-아세틸-SDMA에 대한 항체 반응을 가지고 있음을 입증했다.
다른 실험에서, 상기와 동일한 시료를 동종 효소 면역검정법(실시예 8 참조) 및 LC-MS-MS에 의해 이중으로 정량화하였다. 내부 표준인 중수소화 비대칭 디메틸아르기닌을 LC-MS-MS 방법에 사용했다. 항체 시약의 클론 3H1/3K3과 효소 결합체 시약의 효소 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 사용하여 동종 효소 면역검정을 준비했다. 결과는 동종 효소 면역검정이 LC-MS-MS와 일치하는 SDMA 수준을 정량화한다는 것을 보여준다.
다른 실험에서, 공지된 양의 SDMA-Gly-Gly 디펩티드를 실시예 8에 기술된 바와 같이 Beckman AU480에서 소량 첨가된 시료의 농도(회수율)를 확인하기 위해 동종 효소 면역검정에서 검정했다. 이를 사용하여 제조된 표준을 사용하여 보정 곡선을 생성했다. 분석물은 테스트 중인 시료에서 정량화되는 분석물이다. 효소 결합체 시약은 결합체 SDMA-SBAP-SH-G6PDH를 포함하고 항체 시약은 항체 클론 8H1/8K3 또는 3H1/3K3을 포함하여 제조되었다. 스파이크-회복 실험에서 회수된 SDMA-Gly-글리디펩티드 분석물 농도를 알려진 농도와 비교하고 플롯팅하였다(도 19).
실시예 12
대칭 디메틸아르기닌 및 Nα-아세틸-대칭 디메틸아르기닌 분석물을 사용한 항체 및 보정
토끼 #27410 및 SDMA-SBAP-SH-G6PDH로부터의 폴리클로날 항체를 사용하여 시약을 제조하고 실시예 8에 기재된 바와 같이 대칭 디메틸화 아르기닌 및 Nα-Ac-SDMA 분석물을 검출하기 위해 동종 검정 형식으로 사용하였다. SDMA 및 Nα-Ac- SDMA 시료를 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하고 SDMA를 사용하여 제조된 표준으로부터 생성된 보정 곡선으로부터 정량화하였다. 토끼 #27410의 폴리클로날 항체를 사용하여 실시예 11에 기재된 바와 같이 소량 첨가 회수율 실험을 수행하였다. 도 20은 토끼 #27410의 폴리클로날 항체가 SDMA 및 Nα-Ac-SDMA 모두에 실질적으로 결합한다는 것을 보여준다. 토끼 #27410의 폴리클로날 항체에 대한 최대 억제(%) 및 조절(%)은 위의 표 1에 나와 있다.
상술한 내용은 단지 본 개시내용의 실시예들의 원리들을 예시할 뿐이다. 통상의 지식을 가진 자는 본 명세서에 명시적으로 설명되거나 도시되지는 않았지만 실시예의 원리를 구현하고 그 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 안출할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 실시예 및 조건부의 언어들은 주로 읽는 사람으로 하여금 실시예의 원리 및 본 발명이 기술을 발전시키는 데 기여한 개념을 이해하도록 돕기 위한 것이며, 이러한 구체적으로 인용된 실시예 및 조건에 제한 없이 해석되어야 한다. 더욱이, 본 개시의 원리, 양태, 및 실시예 뿐만 아니라 그의 특정 예를 인용하는 본원의 모든 진술은 그의 구조적 및 기능적 등가물의 전부를 포함하도록 의도된다. 또한, 그러한 등가물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 모든 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ARK Diagnostics, Inc. Valdez, Johnny Moon, Byung S Chung, Ki Chen, Yunfei <120> Antibodies to Symmetrically Dimethylated Arginine Analytes and Use Thereof <130> ARKD-008 <140> US 16/414,553 <141> 2019-05-16 <150> US 62/828,769 <151> 2019-04-03 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 1 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Ser Tyr Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Asp Ile Lys Thr Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu 85 90 95 Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Arg Val Tyr Val Ser Gly Asn Asp His Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 2 <211> 7 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360 gatttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc ccgtg 405 <210> 38 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 38 atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60 gagcagctgg tggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120 tgcacagctt ctggattctc cttcagcagc accaagtaca tgtgctgggt ccgccaggct 180 ccagggaggg ggcctgagtg ggtcgcatgt attggtgttg gtagtcgtgg tagcacttac 240 tacgcgagcc gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 300 ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gaggagtagt 360 actactggtt attatatttt atggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc gagcggacag 420 ccgaaa 426 <210> 39 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 39 atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 aggtgtgcat tcgagatgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120 gtcaccatca agtgccaggc cagtgagagc atttacagct acttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacaaggcat ccactctggc atctggggtc 240 tcatcgcggt tcaaaggaag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcggcgtg 300 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caaaactatt atacttttac tgagaatgat 360 gtcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa ggtgatcccg tg 402 <210> 40 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 40 atggagactg ggccgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60 gagcagctgg cggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120 tgcacagcct ctggattctc cttctggcgc tacatgtgct gggtccgcca ggctccaggg 180 aaggggctgg agtgggtcgc atgtattgat ggtggcaata ctaataggct ctattacgcg 240 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctgcac 300 atgaccagtc tgacagtcgc ggacacggcc acctatttca gtgcgagagt tcggcttggt 360 aataatgatt atatagactt gtggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc gagcggacag 420 ccgaaa 426 <210> 41 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 41 atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 agatgtgatg ttgtgctgac ccagactcca gcctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120 gtcaccatca agtgccaggc cagtcagagc attagtaact acttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacagggcat ccactctggc atctggggtc 240 ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 300 gagtgtgccg atgctgccac ttactactgt caacagggtt ataattggga tcttgatggt 360 gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc ccgtg 405

Claims (5)

  1. 화학식 1의 화합물:
    Figure pat00019

    여기에서:
    R1은 -Y-Z;
    Y는 연결기; 또한
    Z는 표지 효소.
  2. 제1항에 있어서,
    연결기는 -(CH2)nC(O)-, -C(O)(CH2)n-, -C(O)(CH2)nNHC(O)-, -C(O)(CH2)nNHC(O)(CH2)n-, -(CH2)nSCH2C(O)-, -(CH2)nC(O)NH(CH2)n-, -(CH2)nNHC(O)-, -(CH2)nNHC(O)(CH2)n-, -NH(CH2)nC(O)-, -(CH2)n-, -(CH2)n(헤테로사이클릴)S(CH2)nC(O)- 로 구성된 군으로부터 선택되고, n은 1 내지 10의 정수인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 표지 효소가 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)인, 화합물.
  4. 화학식 1의 화합물:
    Figure pat00020

    여기에서:
    R1은 -Y-Z;
    Y는 -(CH2)nC(O)-, -C(O)(CH2)n-, -C(O)(CH2)nNHC(O)-, -C(O)(CH2)nNHC(O)(CH2)n-, -(CH2)nSCH2C(O)-, -(CH2)nC(O)NH(CH2)n-, -(CH2)nNHC(O)-, -(CH2)nNHC(O)(CH2)n-, -NH(CH2)nC(O)-, -(CH2)n-, -(CH2)n(헤테로사이클릴)S(CH2)nC(O)- 로 구성된 군 및 이들의 산염으로부터 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이고, 또한
    Z는 표지 효소.
  5. 제4항에 있어서, 표지 효소가 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)인, 화합물.
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