DE60023998T2 - Immunoassay - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Immunoassay zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagens, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper.
  • 2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
  • Bislang waren verschiedene Immunoassays unter Nutzung der Antigen-Antikörper-Reaktion wie Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA), Turbidimetrieimmunoassay (TIA) und Latexagglutination-Immunoassay (LPIA) bekannt.
  • In diesen Immunoassays wird die Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, ausgehend von seinen analytischen Messwerten (Absorption, Transmission, Trübung, Fluoreszenz, Reaktionsgeschwindigkeit und andere gemessene physikalische Werte) bestimmt. Die Eichung zur Auftragung des Verhältnisses zwischen der Konzentration und den analytischen Messwerten eines Messgegenstands, der in einer Standardprobe enthalten ist, wird durch Messen der Standardprobe, enthaltend den Messgegenstand in einer im Voraus bekannten Konzentration durchgeführt, um die Konzentration des Messgegenstands durch Vergleich mit der Eichkurve zu bestimmen. Für all diese konventionellen Immunoassays wird vorausgesetzt, dass die Probe und die Standardprobe in verschiedenen Reaktionsgefäßen gemessen werden und dass diese Messungen immer unter denselben Bedingungen durchgeführt werden.
  • Da es jedoch Variationen der Temperatur (wie der Temperatur des Geräts, des Raumes, des Reagens etc.), Variationen durch die Stabilität des Reagens, Variationen verursacht durch den Gebrauchszustand des Reagens (zum Beispiel Veränderungen der Reaktivität durch Kontaminationen und Ähnliches, die Verdunstung von Wasser aus einer Reagensflasche, Verringerung der Aktivität etc.), in der Tat gibt, wenn die Messung am nächsten Tag oder einige Tage nach dem Ende einer Serie von fortlaufenden Messungen neu ausgeführt wird oder wenn die Charge des Reagens gewechselt wird, muss eine Eichkurve direkt vor dem Beginn des Messens neu angefertigt werden, um die Messgenauigkeit zu wahren. Das bedeutet, dass die Kalibrierung in diesen Immunoassays Zeit benötigt und es schwierig ist, von einem Immunreagens effektiv Gebrauch zu machen. Sogar dann, wenn die Eichung durchgeführt wird, ist es schwierig, einen Fehler, verursacht durch Veränderungen innerhalb eines Tages (Temperaturvariationen, Veränderungen bei der Intensität des Lichtes einer Lichtquelle, Fluktuationen in einem Detektor etc.), zu eliminieren.
  • Inzwischen wird eine Standardprobe an einem Punkt oder mehreren Punkten unmittelbar vor dem Beginn der Messung gemessen, um die zuvor angefertigte Eichkurve zu korrigieren, um einen effektiven Nutzen aus einem Immunreagens zu ziehen.
  • Sogar in diesem Immunoassay wird jedoch, um die Messgenauigkeit weiter zu verbessern, eine Eichkurve vorzugsweise für jede Probe im Voraus korrigiert, was hinsichtlich Gesichtpunkten von Zeit und Kosten nachteilig ist.
  • Daher war ein Immunoassay zur effektiven und genauen Messung der Konzentration eines Messgegenstands ohne Verschwendung von Immunreagens und Zeit erwünscht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Um diese Anforderung zu erfüllen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensive Untersuchungen durchgeführt und gefunden, dass eine Reaktion zwischen Immunreagens und einer Standardprobe, enthaltend einen Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration (bekannten Konzentration), und eine Reaktion zwischen Immunreagens und einer Probe kontinuierlich im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden, um das vorstehende Problem zu lösen. Die vorliegende Erfindung ist somit auf Basis dieses Befunds zustande gekommen.
  • Das heißt, ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für einen Immunoassay zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, das dadurch charakterisiert ist, dass es umfasst: einen Standardreaktionsschritt des Reagierens einer Standardprobe, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts mit der Probe und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, enthalten in der Probe, durch Vergleich der Reaktivität des Standardreaktionsschritts mit der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  • Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für einen Immunoassay zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, das dadurch charakterisiert ist, dass es umfasst: einen Standardreaktionsschritt des Reagierens einer Standardprobe, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts mit der Probe; einen Schritt des Korrigierens der zuvor hergestellten Eichkurve unter Verwendung der Reaktivität des Standardreaktionsschritts und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands aus der korrigierten Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  • Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für einen Immunoassay zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, umfassend: zwei oder mehr Standardreaktionsschritte des Mischens und des Reagierens von zwei oder mehr Standardproben in aufeinanderfolgender Weise mit der Reaktionslösung, die das Immunreagens enthält; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des letzten Standardreaktionsschritts mit der Probe; einen Schritt des Erstellens einer Eichkurve anhand der Reaktivität jedes Standardreaktionsschritts; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands unter Verwendung der Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts, wobei zumindest die Standardproben eines zweiten oder späteren Standardreaktionsschritts den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthalten.
  • Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein für das vorstehende Verfahren eines Immunoassays verwendeter Immunoassay-Testkit und ein Immunoassay-Apparat.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In den begleitenden Zeichnungen:
  • 1 zeigt einen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Testkit;
  • 2 zeigt einen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Immunoassay-Apparat;
  • 3 zeigt ein konzeptionelles Diagramm des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Immunoassay-Apparates;
  • 4 zeigt einen im ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 5 zeigt einen im ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 6 zeigt einen im ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 7 zeigt einen im ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 8 zeigt einen im dritten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 9 zeigt einen im dritten erfindungsgemäßen Immunoassay verwendeten Testkit;
  • 10 zeigt eine in Beispiel 1 erhaltene Eichkurve;
  • 11 zeigt eine im Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Eichkurve;
  • 12 ist ein Diagramm, welches die Korrelation zwischen der Konzentration von AFP in zwölf in Beispiel 1 gemessenen Proben und der durch Vergleichsbeispiel 1 gemessenen Konzentration zeigt;
  • 13 zeigt eine in Beispiel 3 erhaltene Eichkurve und
  • 14 zeigt eine in Beispiel 4 erhaltene Eichkurve.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für einen Immunoassay zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagens, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Probe ist allgemein eine biologische Probe wie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit, Stuhl oder Punktionsflüssigkeit. Der in der Probe enthaltene Messgegenstand ist allgemein ein Antigen oder Antikörper, zum Beispiel Plasmaprotein wie Albumin, Immunglobulin oder Komplement; Tumor-assoziiertes Antigen wie α-Fetoprotein (AFP), CA19-9, carcinoembryonisches Antigen (CEA) oder saure Phosphatase der Prostata (PAP), mit infektiöser Erkrankung assoziierter Antigen/Antikörper wie Hepatitis B, Hepatitis C, Syphilis, HIV oder CRP; Blutgerinnung-Fibrinolyse-assoziierte Substanz wie das Fibrin-/Fibrinogen-Abbauprodukt, D-Dimer oder Antithrombin III, myocardialer Infarkt-verwandtes Protein wie Myoglobin oder CK-MB, Hormone wie Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyroxin (T4), Insulin oder menschliches Chorion-Gonadotropin oder Wirkstoffe wie Digoxin oder Theophyllin.
  • Das Verfahren des erfindungsgemäßen Immunoassays kann in den folgenden bekannten Immunoassays verwendet werden.
    • <1> ein Immunoassay, der eine Antigen-Antikörper-Agglutinationsreaktion, hervorgerufen durch ein immunologisches Binden zwischen einem in einem Immunreagens enthaltenen Antigen oder Antikörper und einem Messgegenstand, nutzt
    • <2> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <1> unter Verwendung des gelösten Antikörpers oder Antigens als ein Immunreagens
    • <3> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <1> unter Verwendung von unlöslichen Trägerpartikeln mit einem daran immobilisierten Antikörper oder Antigen als Immunreagens
    • <4> der Immunoassay gemäß einem beliebigen der vorstehenden <1>–<3> zum Messen der durch die Immunreaktion verursachten Agglutination durch Trübung, erhalten durch Messen der Absorption Streulicht
    • <5> ein Immunoassay unter Verwendung eines Immunreagens, erhalten durch Markierung eines Antikörpers oder Antigens mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Fluoreszenzpartikel als Immunreagens
    • <6> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <5> zur Beobachtung von Veränderungen bei der Rotationsentspannungszeit, verursacht durch Änderungen der Molekülgröße eines markierten Antikörpers, markierten Antigens oder einem Immunkomplexes daraus durch immunologische Bindung zwischen einem Antigen oder Antikörper, enthalten in einem Immunreagens, und dem Messgegenstand
    • <7> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <6> zur Beobachtung von Veränderungen bei der Rotationsentspannungszeit durch Eliminierung der Fluoreszenzpolarisation
    • <8> ein Immunoassay zur Beobachtung einer Energietransfer-Reaktion, verursacht durch eine Verringerung des Abstands zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen durch immunologische Bindung zwischen einem in einem Immunreagens enthaltenen Antigen oder Antikörper und dem Messgegenstand unter Verwendung von zwei Immunreagenzien, erhalten durch Markierung von Antikörpern oder Antigenen mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
    • <9> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <8> zum Messen einer Energietransfer-Reaktion aus der Erhöhung oder Verringerung der vom Fluoreszenzfarbstoff bei verschiedenen Lichtemissionszeiten emittierten Lichtmenge
    • <10> ein Immunoassay zur Beobachtung der immunologischen Bindung zwischen einem Messgegenstand und einem Immunreagens auf einer Festphase unter Verwendung eines an einen Festphasenträger immobilisierten Antigens oder Antikörpers als ein Immunreagens
    • <11> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <10> zur Beobachtung der immunologischen Bindung durch Oberflächenplasmon-Resonanz
    • <12> der Immunoassay gemäß den vorstehenden <5> und <10> zur Beobachtung der immunologischen Bindung von einer Fluoreszenz, die durch eine evaneszente Welle angeregt wird
    • <13> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <10> zur Beobachtung der immunologischen Bindung von einer Veränderung der Frequenz eines Quarz-Oszillators
    • <14> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <10> zur Beobachtung der immunologischen Bindung durch eine Veränderung des Potenzials oder der Spannung einer Elektrode
    • <15> der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <10> zur Beobachtung der immunologischen Bindung durch eine Veränderung der Spannung oder des Widerstands, verursacht durch die Veränderung der Menge eines Ionenkanals Das Verfahren eines erfindungsgemäßen Immunoassays wird besonders effektiv in homogenen Immunoassays verwendet.
  • In der vorliegenden Erfindung wird Folgendes als zu vergleichende „Reaktivität" verwendet.
    • A. die Reaktionsgeschwindigkeit einer Partikelagglutination, verursacht durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese kann zum Beispiel aus der durchschnittlichen Absorptionsänderungsgeschwindigkeit oder der maximalen Absorptionsänderungsgeschwindigkeit berechnet werden.
    • B. die Menge an Partikeln, die durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion agglutiniert werden. Diese kann zum Beispiel durch eine Änderung der Absorption berechnet werden.
    • C. die Reaktionsgeschwindigkeit, berechnet aus der Änderungsgeschwindigkeit des maximalen Resonanzwinkels der Oberflächenplasmonen-Resonanz.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genau beschrieben, wobei beispielsweise der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <3> als Immunoassay herangezogen wird und für den Fall, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der Partikelagglutination, verursacht durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, als Reaktivität gemessen wird.
  • [Immunoassay 1]
  • Das erste erfindungsgemäße Immunoassay-Verfahren umfasst den Standardreaktionsschritt des Reagierens einer Standardprobe, enthaltend einen Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, mit einem Immunreagens in einer Reaktionslösung, den Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts mit einer Probe und den Schritt des Bestimmens der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands durch Vergleich der Reaktivität des Standardreaktionsschritts mit der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  • <Messen der Probe>
  • (1) Standardreaktionsschritt
  • Eine Reaktionspufferlösung, enthaltend ein Antigen (Messgegenstand) in einer bestimmten Konzentration (Standardprobe) und ein Immunreagens, erhalten durch Immobilisierung eines Antikörpers an unlösliche Trägerpartikel, werden zu einem Reaktionsgefäß gegeben und zum Reagieren der Standardprobe mit dem Immunreagens für eine bestimmte Zeit gerührt.
  • (2) Probenreaktionsschritt
  • Eine Probe wird zu demselben Reaktionsgefäß gegeben, mit der Reaktionslösung des vorstehenden Standardreaktionsschritts gemischt und für eine bestimmte Zeitspanne reagiert.
  • Die Absorption wird zumindest vor und nach jeder Reaktion des Standardreaktionsschritts und des Probenreaktionsschritts gemessen, um die durch die Antigen-Antikörper-Reaktion verursachte Agglutination zu messen.
  • (3) Berechnung der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts (V1) und die Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts (V2) werden als durchschnittliche Absorptionsänderungsgeschwindigkeit (Änderung der Absorption/Reaktionszeit), berechnet aus der vor und nach der jeweiligen Reaktion gemessenen Absorption, berechnet.
  • Danach wird das Verhältnis (V2/V1) der Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts (V2) zur Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts (V1) berechnet.
  • Die Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands wird unter Verwendung der zuvor erstellten Eichkurve und des vorstehenden Verhältnisses (V2/V1) berechnet.
  • <Erstellen der Eichkurve>
  • Dieselben Reaktionen wie in der vorstehenden Messung der Probe werden ausgeführt, außer dass ein Standardreagens, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, anstelle der Probe zugegeben wird, um das Verhältnis (V2/V1) der Reaktionsgeschwindigkeit des letzteren Standardreaktionsschritts (zweiter Standardreaktionsschritt) (V2) zur Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Standardreaktionsschritts (V1) zu berechnen.
  • Dieselben Reaktionen werden durch Änderung der Konzentration der Standardprobe, die in der zweiten Standardreaktion zuzugeben ist, wiederholt.
  • Eine Eichkurve wird mit dem bestimmten Verhältnis (V2/V1) der Reaktionsgeschwindigkeiten und der Konzentration des in der Standardprobe der zweiten Standardreaktion enthaltenen Messgegenstands erstellt.
  • Gemäß diesem Verfahren können sehr genaue Messergebnisse ohne Korrigieren der zuvor erstellten Eichkurve erhalten werden.
  • Im vorstehenden Verfahren wird das Verhältnis (V2/V1) der Reaktionsgeschwindigkeiten zum Vergleich der Reaktivität in der vorstehenden Beschreibung verwendet, aber der Unterschied der Reaktionsgeschwindigkeit (V1–V2) und verschiedene Ergebnisse des Arbeitsgangs unter Verwendung von V1 und V2 können verwendet werden.
  • Im vorstehenden Verfahren wird der Probenreaktionsschritt nach dem Standardreaktionsschritt ausgeführt. Die Reihenfolge kann jedoch umgedreht werden und der Standardreaktionsschritt kann nach dem Probenreaktionsschritt ausgeführt werden. Das heißt die Probe und das Immunreagens werden in einer Reaktionslösung miteinander umgesetzt (Probenreaktionsschritt) und dann wird die Reaktionslösung des Probenreaktionsschritts und eine Standardprobe, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, vermischt und miteinander umgesetzt (Standardreaktionsschritt) und die Reaktivität des Standardreaktionsschritts und die Reaktivität des Probenreaktionsschritts werden miteinander verglichen, um die Konzentration des Messgegenstands in der Probe zu bestimmen. Wenn die Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands jedoch gering ist, wird empfohlen, den Probenreaktionsschritt nach dem Standardreaktionsschritt auszuführen, um eine hohe Messgenauigkeit zu erzielen.
  • Bezüglich der Reaktionszeit jeder Reaktion beträgt – allgemein gesagt – die Reaktionszeit des ersten Reaktionsschritts 1 Sekunde bis 10 Minuten und die Reaktionszeit des nachfolgenden Reaktionsschritts beträgt 10 Sekunden bis 1 Stunde. Vorzugsweise beträgt die Reaktionszeit des ersten Reaktionsschritts 1 bis 5 Minuten und die Reaktionszeit des nächsten Reaktionsschritts beträgt 1 bis 15 Minuten.
  • [Immunoassay 2]
  • Das zweite erfindungsgemäße Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands mittels eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, umfasst einen Standardreaktionsschritt des Reagierens einer Standardprobe, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung, einen Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts mit der Probe, einen Schritt des Korrigierens der zuvor erstellten Eichkurve um die Reaktivität des Standardreaktionsschritts und den Schritt des Bestimmens der Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands aus der korrigierten Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  • Dieses Immunoassay-Verfahren ist im Reaktionsablauf dasselbe wie das vorstehende Verfahren des Immunoassay 1, unterscheidet sich jedoch vom vorstehenden Immunoassay 1 bei der Datenverarbeitung.
  • <Messen der Probe>
  • (1) Standardreaktionsschritt
  • Eine Reaktionspufferlösung, enthaltend ein Antigen (Messgegenstand) in einer bestimmten Konzentration (Standardprobe) und ein Immunreagens, erhalten durch Immobilisierung eines Antikörpers an unlösliche Trägerpartikel, werden zu einem Reaktionsgefäß gegeben und zur Reaktion miteinander für eine bestimmte Zeitspanne gerührt.
  • (2) Probenreaktionsschritt
  • Eine Probe wird zu dem vorstehenden Reaktionsgefäß gegeben, mit der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts gemischt und für eine bestimmte Zeitspanne reagiert.
  • Die Absorption wird zumindest vor und nach jeder Reaktion des Standardreaktionsschritts und des Probenreaktionsschritts gemessen, um die durch die Antigen-Antikörper-Reaktion verursachte Agglutination zu messen.
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts (V1) und die Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts (V2) werden als durchschnittliche Absorptionsänderungsgeschwindigkeit (Änderung der Absorption/Reaktionszeit), berechnet aus der vor und nach der jeweiligen Reaktion gemessenen Absorption, berechnet.
  • (3) Korrigieren der Eichkurve
  • Die zuvor erstellte nachstehende Eichkurve wird unter Verwendung der Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts zum Messen der Probe (V1) korrigiert.
  • Das Korrigieren der Eichkurve wird durch Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts zum Messen der Probe (V1) mit der Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Standardreaktionsschritts für den Assay, welcher zur folgenden Eichung (V1) ausgeführt wird, ausgeführt. Zum Beispiel wird der Unterschied oder das Verhältnis der beiden V1 verwendet, um die Eichkurve zu korrigieren.
  • Wenn eine Vielzahl von Assays zum Erstellen einer Eichkurve durchgeführt wird, wie die Reaktionsgeschwindigkeit des zum Korrigieren der Eichkurve verwendeten Standardreaktionsschritts (V1), kann eine Geschwindigkeit des Standardreaktionsschritts von einem der Assays verwendet werden. Vorzugsweise kann der Durchschnitt der Reaktionsgeschwindigkeit der Standardreaktionsschritte aller Assays verwendet werden.
  • (4) Berechnung der Konzentration des in einer Probe enthaltenen Messgegenstands
  • Die Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands wird aus der korrigierten Eichkurve und der Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts (V2) berechnet.
  • <Erstellen der Eichkurve>
  • Dieselben Reaktionen wie in der vorstehenden Messung der Probe werden durchgeführt, außer dass ein Standardreagens, enthaltend den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration, anstelle der Probe zugegeben wird.
  • Dieselben Reaktionen werden durch Änderung der Konzentration der Standardprobe, die in die zweite Standardreaktion zuzugeben ist, wiederholt.
  • Eine Eichkurve wird mit der Reaktionsgeschwindigkeit der zweiten Standardreaktion (V2) und der Konzentration des in der Standardprobe der zweiten Standardreaktion enthaltenen Messgegenstands erstellt.
  • Gemäß diesem Verfahren kann das Korrigieren der zuvor erstellten Eichkurve und das Messen der Probe in einem Gefäß zur selben Zeit durchgeführt werden, wodurch es ermöglicht wird, Immunreagens zu sparen und Messzeit und Arbeitsaufwand zu verkürzen.
  • Wie bei Immunoassay 1 kann die Reihenfolge des Standardreaktionsschritts und des Probenreaktionsschritts umgekehrt werden. Wenn die Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands jedoch gering ist, wird es bevorzugt, den Standardreaktionsschritt und dann den Schritt der Probenreaktionsmessung auszuführen.
  • Bezüglich der Reaktionszeit jeder Reaktion beträgt -allgemein gesagt- die Reaktionszeit des ersten Reaktionsschritts 1 Sekunde bis 10 Minuten und die Reaktionszeit des nachfolgenden Reaktionsschritts beträgt 10 Sekunden bis 1 Stunde. Vorzugsweise beträgt die Reaktionszeit des ersten Reaktionsschritts 1 bis 5 Minuten und die Reaktionszeit des nächsten Reaktionsschritts beträgt 1 bis 15 Minuten.
  • [Immunoassay 3]
  • Das dritte erfindungsgemäße Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagens, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, umfasst zwei oder mehr Standardreaktionsschritte des Mischens und des Reagierens von zwei oder mehr Standardproben in aufeinanderfolgender Weise mit einer das Immunreagens enthaltenden Reaktionslösung, einen Probenreaktionsschritt des Mischens und des Reagierens der Reaktionslösung des letzten Standardreaktionsschritts mit der Probe, einen Schritt des Erstellens einer Eichkurve anhand der Reaktivität jedes Standardreaktionsschritts und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, unter Verwendung der Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts, wobei zumindest die Standardproben eines zweiten oder späteren Standardreaktionsschritts den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthalten.
  • Da dieser Immunoassay die Eichung und die auszuführende Messung der Probe gleichzeitig durch eine einmalige Messung ermöglicht, kann die Zeit und der Arbeitsaufwand zur Eichung gekürzt werden und genaue Messergebnisse können erhalten werden.
  • <Messen der Probe>
  • (1) Standardreaktionsschritt
  • 1. Erster Standardreaktionsschritt
  • Eine Reaktionspufferlösung, enthaltend ein Antigen (Messgegenstand) in einer bestimmten Konzentration (Standardprobe 1) und ein Immunreagens, erhalten durch Immobilisierung eines Antikörpers an unlösliche Trägerpartikel, werden zu einem Reaktionsgefäß gegeben und für eine bestimmte Zeitspanne gerührt, um sie miteinander zu reagieren. Es ist erwünscht, dass die Konzentration des in der Standardprobe 1 enthaltenen Messgegenstands „0" ist. Die Standardprobe kann jedoch den Messgegenstand enthalten.
  • 2. Zweiter Standardreaktionsschritt
  • Eine Standardprobe 2 wird zu dem vorstehenden Reaktionsgefäß gegeben und die Reaktionslösung des vorstehenden ersten Standardreaktionsschritts und der Standardprobe 2 werden gemischt und für eine bestimmte Zeitspanne miteinander reagiert.
  • Der zusätzliche Standardreaktionsschritt kann mit dem vorstehenden Verfahren ein oder mehrere Male durch Zugabe des Messgegenstands, der in der Standardprobe enthalten ist, durchgeführt werden.
  • Bezüglich der Reaktionszeit jeder Reaktion beträgt – allgemein gesprochen – diese 1 Sekunde bis 10 Minuten und vorzugsweise 1 bis 5 Minuten. Die Reaktionszeit jedes Reaktionsschritts kann gleich oder unterschiedlich sein.
  • Die Anzahl der Standardreaktionsschritte ist allgemein insgesamt 2 oder 3. Da die Standardproben in den Standardreaktionsschritten zu demselben Reaktionsgefäß zugegeben werden, wobei die Konzentration einer i-ten Standardprobe des i-ten Standardreaktionsschritts durch Ci bezeichnet wird, könnte von der Standardprobe mit der Konzentration, ausgedrückt durch
    Figure 00140001
    angenommen werden, dass sie zum Immunreagens im n-ten Standardreaktionsschritt gegeben wird.
  • Genau genommen ist das Korrigieren des Volumens der Standardprobe notwendig. Wenn das Volumen der zugegebenen Standardprobe jedoch kleiner als das gesamte Volumen der Reaktionslösungen ist, ist das Korrigieren nicht notwendig.
  • Nach dem Ende des Standardreaktionsschritts wird die Probe, deren Konzentration unbekannt ist, zugegeben, um den Probenreaktionsschritt durchzuführen. Um einen so breiten Bereich für die Konzentration der Probe wie möglich abdecken zu können, muss
    Figure 00140002
    auf eine geeignete Konzentration oder geringere Konzentration im messbaren Bereich des Messgegenstands geregelt werden. Genauer gesagt ist im allgemeinen Immunoassay das Verhältnis zwischen der Konzentration des Messgegenstands und der Reaktivität, welche sich gemäß dem Messgegenstand und dem Messverfahren unterscheidet, in den meisten Fällen wie eine sigmoidale Kurve. Es wird gewünscht,
    Figure 00140003
    auf einen Wert zu setzen, der in einen Konzentrationsbereich fällt, der das genaue quantitative Messen in der sigmoidalen Kurve sicherstellen kann.
  • (2) Probenreaktionsschritt
  • Die Probe wird zu demselben Reaktionsgefäß gegeben, mit der Reaktionslösung des vorstehenden Standardreaktionsschritts gemischt und für eine bestimmte Zeitspanne reagiert (Probenreaktionsschritt).
  • Die Absorption wird zumindest vor und nach jeder Reaktion des Standardreaktionsschritts und des Probenreaktionsschritts gemessen, um die durch die Antigen-Antikörper-Reaktion verursachte Agglutination zu messen.
  • (3) Erstellen einer Eichkurve
  • Eine Eichkurve wird mit der Konzentration des in der Standardprobe enthaltenen Messgegenstands und der Reaktionsgeschwindigkeit jedes Standardreaktionsschritts erstellt.
  • Da die Standardproben in den Standardreaktionsschritten zu demselben Reaktionsgefäß zugegeben werden, wenn die Konzentration einer i-ten Standardprobe des i-ten Standardreaktionsschritts durch Ci bezeichnet wird, könnte von der Standardprobe mit der Konzentration, ausgedrückt durch
    Figure 00150001
    angenommen werden, dass sie zum Immunreagens im n-ten Standardreaktionsschritt zugegeben wird.
  • Somit wird die Eichkurve durch das Ausführen von zum Beispiel linearer Regression, quadratischer Kurvenregression oder Log-Logit-Regression mit „n" Datensätzen
    Figure 00150002
    der Konzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit jedes Standardreaktionsschritts erstellt.
  • (4) Berechnung der Konzentration eines in einer Probe enthaltenen Messgegenstands
  • Wenn die Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, durch C bezeichnet wird, könnte von der Standardprobe mit der Konzentration, ausgedrückt durch
    Figure 00150003
    angenommen werden, dass sie zum Immunreagens im Probenreaktionsschritt zugegeben wird.
  • Somit könnte die Konzentration eines in der Probe enthaltenen Messgegenstands, ausgedrückt durch
    Figure 00150004
    durch Extrapolation der Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts und der vorstehenden Eichung und Subtraktion von
    Figure 00150005
    vom erhaltenen Wert bestimmt werden.
  • Unter der Voraussetzung, dass in diesem Fall von
    Figure 00150006
    und
    Figure 00150007
    die Konzentrationen nicht durch das Volumen wie der Quantität der Reaktionslösung der zugegebenen Standardproben oder der zugegebenen Proben, korrigiert werden müssen.
  • Bekannte Immunreagenzien oder Ähnliche können als das im erfindungsgemäßen Immunoassay verwendete Immunreagens verwendet werden. Zum Beispiel kann das Folgende im Immunoassay gemäß dem vorstehenden <3> verwendet werden.
  • Beispiele des Materials der im Immunreagens verwendeten unlöslichen Trägerpartikel umfassen organische Polymere, erhalten durch Emulsionspolymerisierung von Polymeren oder Co-Polymeren, bestehend aus Styrol, Vinyltoluol, Methyl-Methacrylat und Methacrylsäure oder Ähnlichem, Substanzen aus einem lebenden Körper wie eine rote Blutzelle, kolloidale Metallpartikel wie Goldkolloid, Lipidpartikel wie Liposomen und anorganische Partikel wie Kieselgel. Die Partikelgröße der unlöslichen Trägerpartikel ist im Allgemeinen 0,01 bis 10 μm, vorzugsweise 0,1 bis 1 μm.
  • Die Menge des an die unlöslichen Trägerpartikel immobilisierten Antikörpers oder Antigens ist im Allgemeinen 50 ng bis 500 μg, vorzugsweise 500 ng bis 200 μg, basierend auf 1 mg der unlöslichen Trägerpartikel. Um den Antikörper oder das Antigen zu immobilisieren, können bekannte Verfahren wie das physikalische Adsorptionsverfahren und das chemische Bindungsverfahren unter Verwendung eines kondensierenden Agens wie Carbodiimid verwendet werden.
  • Bezüglich der Konzentration der unlöslichen Trägerpartikel ist die Gewichtskonzentration der unlöslichen Trägerpartikel in der Immunreaktionslösung im Allgemeinen 0,0001 bis 1%, vorzugsweise 0,0003 bis 0,3%.
  • Beispiele eines Dispersionsmedium zur Dispersion der unlöslichen Trägerpartikel umfassen Wasser, Pufferlösungen wie Trishydroxymethyl-Aminomethan und Phosphorsäure (im Allgemeinen 1 bis 500 mM, im Allgemeinen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise 6 bis 9), das 0,01 bis 10% eines Bestandteils eines lebenden Körpers, wie Rinderserumalbumin oder Gelatine, enthält, das 0,1 bis 10% eines Salzes wie Natriumchlorid enthält, das 0,0001 bis 1% einer oberflächenaktiven Substanz (nicht-ionisch, anionisch, kationisch oder amphoter) enthält, und eine Kombination davon.
  • Als Reaktionspufferlösung kann eine erwähnt werden, die ein anorganisches Salz wie Natriumchlorid (0,5 bis 20%), 0,1 bis 10% einer Biokomponente wie Rinderserumalbumin oder normales Kaninchenserum und 0,0003 bis 1% einer oberflächenaktiven Substanz in einer Pufferlösung wie Trishydroxymethyl-Aminomethan, Phosphorsäure, Natriumacetat, Glycin oder Borsäure (1 bis 500 mM, pH-Wert von 1 bis 10) enthält.
  • Es gibt zwei Fälle im Hinblick auf ein Reaktionssystem: einen Fall, in dem nur eine Reaktionspufferlösung verwendet wird und der andere Fall, in dem zwei oder mehrere verschiedene Pufferlösungen verwendet werden. Wenn eine Reaktionspufferlösung verwendet wird, wird in den meisten Fällen der neutrale pH-Wert von 6 bis 9 verwendet.
  • Die Konzentration eines Salzes und die Konzentration eines Proteins werden gemäß dem Reaktionssystem geeignet angepasst.
  • Bekannte Apparate können im erfindungsgemäßen Immunoassay verwendet werden. Eine Beschreibung des im Immunoassay gemäß dem vorstehenden <3> verwendeten Apparates wird im Nachfolgenden gegeben.
  • 1 zeigt einen Testkit, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird und eine Immunreagenshalterung 1 zur Aufbewahrung des Immunreagens, Standardprobenhalterungen 2 zur Aufbewahrung der jeweiligen Standardproben, eine Probenhalterung 3 für die zu injizierende Probe und ein Reaktionsgefäß 4 umfasst. Die Standardprobenhalterungen werden entsprechend der benötigten Anzahl der Standardproben bereitgestellt. Wenn es nicht bevorzugt wird, das Immunreagens zur Lagerung mit einer Pufferlösung zu verdünnen, und es bevorzugt wird, das Immunreagens und die Pufferlösung zum Zeitpunkt einer Reaktion zusammen zu mischen, wird eine weitere Pufferlösungshalterung 5 bereitgestellt, um das Immunreagens und die Pufferlösung getrennt zu lagern.
  • Dieser Testkit wird in eine Testkithalterung 6 des Immunoassay-Apparates der 2 eingesetzt. Der Immunoassay-Apparat der 2 umfasst die Halterung 6 für den in 1 gezeigte Immunoassay-Testkit, Mittel zum Ausführen einer Standardreaktion zwischen einem Standardreagens und einem Immunreagens, Mittel zum Ausführen einer Probenreaktion zwischen einer Probe und dem Immunreagens, Mittel zum Messen des Zustands einer Reaktionslösung zumindest vor und nach jeder Reaktion der Standardreaktion und der Probenreaktion, Mittel zum Bestimmen der Konzentration eines in der Probe enthaltenen Messgegenstands durch Bearbeitung der Messdaten, bestimmt durch die Standardreaktion und die Probenreaktion und zuvor abgelesener Daten der Eichkurve, und Mittel zur Anzeige der bestimmten Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands.
  • 3 zeigt ein schematisches Diagramm des Immunoassay-Apparates. Der Messvorgang wird mit Bezug auf die 2 und 3 beschrieben. Bezüglich des Betreibungsverfahrens wird der Testkit der 1 zunächst in die Testkithalterung 6 eingesetzt und die Probe wird in die Probenhalterung 3 des Testkits injiziert. Die Messbedingungen werden durch Eingabe in ein Eingabefenster in eine Dateneingangseinheit oder durch das Lesen von Strichcodes oder Ähnlichem, aufgedruckt auf eine Testkassette, eingegeben. Wenn die Messung gestartet wird, führt eine Reaktionsausführungseinheit eine Reaktionsausführung gemäß den in die Dateneingabeeinheit eingegebenen Messbedingungen durch. Die Reaktionsausführungseinheit injiziert das Immunreagens, die Standardprobe, Probe und Ähnliches des Reagenskits von einer im Apparat bereitgestellten Probendüse nacheinander in das Reaktionsgefäß und bewirkt, dass sie durch Mischen mit der im Apparat bereitgestellten Mischdüse miteinander reagieren. Der Zustand (wie die Absorption) der Reaktionslösung wird durch eine Nachweiseinheit 8 gemessen. Der Zustand der Reaktionslösung wird zumindest vor und nach jeder Reaktion gemessen. In den vorstehenden Immunoassays 1 und 2 liest die Dateneingabeeinheit die Eichkurvendaten, die in Form von Strichcodes oder Ähnlichem auf den Reagenskit gedruckt sind, eine Datenverarbeitungseinheit berechnet die Konzentratration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands aus den Daten der Eichkurve und den Messdaten und eine Datenanzeigeeinheit 9 zeigt die Ergebnisse an oder druckt die Ergebnisse auf Papier aus. Im vorstehenden Immunoassay 2 können die Daten (V1), die zum Korrigieren der Eichkurve benötigt werden, auf die Testkassette gedruckt werden und die Daten können zur Datenverarbeitung verwendet werden. Im vorstehenden Immunoassay 3 zeichnet die Datenverarbeitungseinheit aus den Messdaten eine Eichkurve und berechnet die Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, und die Datenanzeigeeinheit 9 zeigt die Daten an oder gibt die Ergebnisse aus.
  • Der Testkit kann ein Testkit sein, umfassend ein Substrat, darauf tragend die Immunreagens-Halterung, die Standardprobenhalterung und die Probenhalterungen, welche mit dem Reaktionsgefäß durch Röhren verbunden und auf demselben Substrat angeordnet sind (4 bis 9). Als eine Einheit zur Versorgung des Reaktionsgefäßes mit dem Immunreagens, der Standardprobe oder der Probe wird zum Beispiel jede Extrusionsluftschicht 10 in der Immunreagens-Halterung, in der Standardprobenhalterung und in der Probenhalterung gebildet. In diesem Fall wird jede Luftschicht gemäß den im voraus in den Apparat eingegebenen Reaktionsbedingungen durch die Reaktionsdurchführungseinheit im Messapparat in aufeinanderfolgender Weise komprimiert, so dass das Immunreagens, die Standardprobe und die Probe eine nach der anderen in das Reaktionsgefäß gegeben werden. Die ausgepresste Luft oder Flüssigkeit wird in der Abfallaufbewahrung 12 gesammelt. Die Abfallaufbewahrung kann ein Luftloch haben. Im Falle der vorstehenden Immunoassays 1 und 2 können die Testkits der 4 bis 7 verwendet werden. Wenn es nicht bevorzugt wird, das Immunreagens im mit einer Pufferlösung verdünnten Zustand aufzubewahren, und das Immunreagens und die Pufferlösung getrennt aufbewahrt werden sollen, wird der Reagenskit der 6 verwendet. Wenn in der Probe enthaltene Blutkörperchen vor einer Reaktion abgetrennt werden sollen, wird, wie in 7 gezeigt, ein Blut-Trennungsfilter 11 vorzugsweise zwischen der Probenhalterung und dem Reaktionsgefäß zwischengeschaltet. Im Falle des vorstehenden Immunoassays 3 können Testchips mit zwei oder mehr Standardprobenhalterungen, gezeigt in den 8 und 9, verwendet werden. Die Standardprobenhalterungen werden entsprechend der benötigten Anzahl der Standardproben bereitgestellt.
  • Der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <3> wurde vorstehend als ein Beispiel beschrieben. Ein Beispiel, bei dem der Immunoassay gemäß dem vorstehenden <11 > verwendet wird, wird nachstehend beschrieben.
  • In einem Reaktionsgefäß mit Goldsubstrat in einem unteren Teil davon wird ein Antikörper an das Goldsubstrat gebunden. Verfahren zur Bindung des Antikörpers an das Substrat umfassen eines, in dem ein Antikörper physikalisch an das Substrat adsorbiert wird, eines, in dem ein Antikörper chemisch an das Molekül Dextran oder Polyethylenglykol gebunden wird, welche physikalisch an ein Substrat adsorbiert sind, und eines, in dem ein Reagens für selbst zusammengelagerte Einzelschichten mit einer Thiolgruppe an ein Substrat gebunden ist, und eine funktionelle Gruppe wie eine Carboxylgruppe, die in den gebildeten selbst zusammengelagerten Monolayern vorkommen, und ein Antikörpermolekül werden chemisch aneinander gebunden oder Ähnliches.
  • Zum Beispiel werden im vorstehenden Immunoassay 1 der Antikörper auf dem Substrat und ein Standardantigenprodukt mit einer bestimmten Konzentration veranlasst, in einer Reaktionspufferlösung miteinander zu reagieren (Standardreaktionsschritt) und dann werden die Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts und eine Probe vermischt und miteinander reagieren gelassen (Probenreaktionsschritt). Während jeder Reaktion wird das Reaktionsgefäß von unten beleuchtet, um die Oberflächenplasmonen-Resonanz zu messen. Zusammen mit dem Fortschreiten einer Antigen-Antikörper-Reaktion verändert sich der maximale Resonanzwinkel oder die maximale Resonanzabsorptionswellenlänge verschiebt sich. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird aus der Änderungsgeschwindigkeit berechnet. Das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeit des Standardreaktionsschritts zur Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts wird berechnet und die Konzentration des in der Probe enthaltenen Messgegenstands wird aus der zuvor erstellten Eichkurve berechnet.
  • [Beispiele]
  • Die folgenden Beispiele werden zum Zweck der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.
  • Beispiel 1
  • Der LPIA-A700 (Mitsubishi Chemical Corp.) wurde als Immunoassay-Apparat verwendet.
  • 0,5 mg eines anti-α-Fetoprotein (AFP)-Antikörpers (Kaninchen-F(ab')2) wurden durch chemische Bindung an 10 mg Polystyrol-Latexpartikel immobilisiert und mit 10 ml einer Tris-Pufferlösung, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma), verdünnt, um ein Latexreagens zum Messen von AFP herzustellen.
  • <Messen der Probe>
  • (1) Standardreaktionsschritt
  • 20 μl einer Standardprobe (20 ng/ml), erhalten durch Verdünnung von AFP mit einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung, 150 μl einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung, 100 μl eines zuvor hergestellten Latexreagens zum Messen von AFP und 30 μl Wasser wurden zum Reaktionsgefäß gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 7 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 1 (V1) zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als durchschnittliche Geschwindigkeit der Änderung der Absorption bestimmt.
  • (2) Probenreaktionsschritt
  • Anschließend wurden 20 μl eines Serums als eine Probe zu demselben Reaktionsgefäß gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 10 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 2 (V2) zu bestimmen und das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (V2/V1) zu berechnen. Zwölf Proben wurden mit demselben Verfahren gemessen.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • Eine Reaktion wurde unter denselben Bedingungen wie in der vorstehenden Messung der Probe ausgeführt, ausgenommen, dass eine Standardprobe (0, 10, 25, 50, 100 oder 250 ng/ml) anstelle der Probe zugegeben wurde, um das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (V2/V1) aus jeder Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Eine Eichkurve wurde aus der Konzentration von in der Standardprobe enthaltenem AFP (0, 10, 25, 50, 100 oder 250 ng/ml), verwendet in der zweiten Standardreaktion, und dem Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (V2/V1) erstellt. Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt. Es wird aus 10 verständlich, dass eine zufriedenstellende Eichkurve erstellt wurde.
  • Die Konzentration des im Serum der Probe enthaltenen AFP wurde aus dieser Eichkurve und den Messergebnissen der Probe berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Vergleichendes Beispiel 1
  • Um die Genauigkeit der Messung der Konzentration von AFP in der Probe durch das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren zu bestätigen, wurde die Messung durch das konventionelle Latex-Agglutinations Immunreaktionsverfahren als Kontrollimmunoassay durchgeführt. Die in Beispiel 1 verwendete Reaktionspufferlösung (Latexreagens zur Messung von AFP), 0,1% BSA enthaltende Tris-Pufferlösung, AFP-Standardprobe und Probe wurden für die Messung verwendet.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • Zu einem Reaktionsgefäß wurden 20 μl einer AFP-Standardprobe (0, 10, 25, 50, 100 oder 250 ng/ml), 30 μl Wasser, 150 μl einer Reaktionspufferlösung und 100 μl eines Latexreagens zur Messung von AFP gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 10 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit (V) zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als durchschnittliche Geschwindigkeit der Absorptionsänderung berechnet. Das Verhältnis zwischen der AFP-Konzentration der Standardprobe und der Reaktionsgeschwindigkeit (V) wird in 11 gezeigt. Es wird aus 11 verständlich, dass eine zufriedenstellende Eichkurve erstellt wurde.
  • <Messen der Probe>
  • Anschließend wurde dieselbe Reaktion wie in der vorstehenden Messung der AFP-Standardprobe ausgeführt, ausgenommen, dass die Probe anstelle der AFP-Standardprobe zugegeben wurde, um die Reaktionsgeschwindigkeit (V) und die Konzentration von in der Probe enthaltenem AFP unter Verwendung der zuvor erstellten Eichkurve zu berechnen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00220001
  • 12 zeigt ein korrelatives Diagramm von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1. Die Korrelation war zufriedenstellend mit Y = 0,9127X + 2,0495 und R2 = 0,9959. Somit zeigen die durch die Messung mit dem konventionellen Latex-Agglutinationsimmunoassay erhaltenen Ergebnisse und die Ergebnisse, die durch die Messung mit dem erfindungsgemäßen Immunoassay erhalten wurden, eine extrem gute Korrelation. Das heißt, dass es möglich ist, die Konzentration von im Serum enthaltenen AFP mit dem erfindungsgemäßen Immunoassay zu messen.
  • Beispiel 2
  • LPIA-A700 (Mitsubishi Chemical Corp.) wurde als Immunoassay-Apparat verwendet.
  • 0,5 mg eines anti-AFP-Antikörpers (Kaninchen F(ab')2) wurden durch chemische Bindung an 10 mg Polystyrol-Latexpartikel immobilisiert und mit 10 ml einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung verdünnt, um sechs verschiedene Latexreagenzien zur Messung von AFP durch Änderung der Produktionscharge herzustellen.
  • <Messen der Probe>
  • (1) Standardreaktionsschritt
  • 20 μl einer Standardprobe (20 ng/ml AFP), erhalten durch Verdünnung von AFP mit einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung, 150 μl einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung (Reaktionspufferlösung), 100 μl eines zuvor hergestellten Latexreagens zur Messung von AFP und 30 μl Wasser wurden zum Reaktionsgefäß gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 7 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 1 (V1) zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als durchschnittliche Änderungsgeschwindigkeit der Absorption bestimmt.
  • (2) Probenmessungsschritt
  • Anschließend wurden 20 μl eines Serums als eine Probe zu demselben Reaktionsgefäß gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 10 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 2 (V2) zu bestimmen.
  • Zwei verschiedene Proben (K, S) wurden gemessen. Dieselbe Probe wurde sechsmal durch Änderung der Produktionscharge des Latexreagens zur Messung von AFP gemessen.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • Das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (V2/V1) wurde durch Messung in der gleichen Art und Weise wie in der vorstehenden Messung der Probe ausgeführt, ausgenommen, dass das Reagens der Produktionscharge 1 als das Latexreagens zur Messung zur Messung von AFP und einer AFP-Standardprobe (0, 10, 25, 50, 100 oder 250 ng/ml) anstelle der Probe verwendet wurde, um eine Eichkurve zu zeichnen.
  • Die Konzentration des in der Probe enthaltenen AFP wurde aus der Eichkurve und den Messergebnissen der Probe, gemessen durch Änderung der Produktionscharge des Latexreagens zur Messung von AFP, berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
  • Vergleichendes Beispiel 2
  • Die Messung wurde durch die konventionelle Latex-Agglutinationsimmunreaktion unter Verwendung von sechs verschiedenen Latexreagenzien als Kontrollimmunoassay durchgeführt. Das Latexreagens, die Reaktionspufferlösung, die Standardprobe und die in Beispiel 2 verwendete Probe wurden für die Messung verwendet.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • Zu einem Reaktionsgefäß wurden 20 μl einer AFP-Standardprobe (0, 10, 25, 50, 100 oder 250 ng/ml), 150 μl einer 0,1% BSA enthaltenden Tris-Pufferlösung, 30 μl Wasser und 100 μl eines Latexreagens der Produktionscharge 1 gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 800 nm für 10 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als die durchschnittliche Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bestimmt. Eine Eichkurve wurde aus der in der Standardprobe enthaltenen Konzentration von AFP und der Reaktionsgeschwindigkeit erstellt.
  • <Messen der Probe>
  • Eine Reaktion wurde in der gleichen Weise wie vorstehend ausgeführt, ausgenommen, dass die Probe anstelle von Standardprobe zugegeben wurde. Dieselben Proben (K, S) wurden sechsmal durch Änderung der Produktionscharge des Latexreagens gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2 Beispiel 2
    Figure 00250001
  • Vergleichsbeispiel 2
    Figure 00250002
    • SD: Standardabweichung
    • CV (%): Variationskoeffizient (relative Standardabweichung)
  • Tabelle 2 zeigt, dass der CV 40,0 oder 42,6 (%) im konventionellen Immunoassay und 13,0 oder 13,7% im erfindungsgemäßen Immunoassay war, wenn die Reagenzien von sechs verschiedenen Produktionschargen verwendet wurden. Variationen, die durch Unterschiede zwischen den Produktionschargen der Reagenzien bedingt sind, können im Gegensatz zum konventionellen Immunoassay durch den erfindungsgemäßen Immunoassay korrigiert werden.
  • Beispiel 3
  • Die Messung wurde durch einen Turbidimetrieimmunoassay unter Verwendung von LPIA-S500 (Mitsubishi Chemical Corp.) als Immunoassay-Apparat durchgeführt.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • (1) Erster Standardreaktionsschritt
  • Zu einem Reaktionsgefäß wurden 3 μl einer IgG-Standardprobe (250 mg/dl), 240 μl einer 1:1-Mischung von RA und RB eines latroace-IgG-Reagens (Immunreagens von Dia-latron Co., Ltd.) und 100 μl Wasser gegeben und gerührt, um Veränderungen bei der Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 660 nm für 5 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 1 (V1) zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als die maximale Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bestimmt. Die IgG-Standardprobe wurde durch Verdünnung eines 5.000 mg/dl Standardprodukts für latroace (Dia-latron Co., Ltd.) mit einem dafür vorgesehenen Verdünnungsmittel hergestellt.
  • (2) Zweiter Standardreaktionsschritt
  • Zu demselben Reaktionsgefäß wurden 20 μl einer IgG-Standardprobe (0, 10, 25, 50, 100, 250 oder 500 mg/dl) gegeben und gerührt, um die maximale Absorption des Lichts mit einer Wellenlänge von 660 nm für 10 Minuten zu beobachten, um die Reaktionsgeschwindigkeit 2 (V2) zu bestimmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde als die maximale Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bestimmt.
  • Eine Eichkurve wurde aus dem Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (V2/V1) und der IgG-Konzentration der Standardprobe der zweiten Standardreaktion erstellt. Die Ergebnisse werden in 13 gezeigt. Da eine zufriedenstellende Eichkurve erhalten wurde, ist es selbstverständlich, dass der erfindungsgemäße Immunoassay auf den Turbidimetrieimmunoassay angewendet werden kann.
  • Beispiel 4
  • Eine Polarisierungseinheit (ein Gerät mit Fluoreszenz-Polarisierungszubehör P/N250-0036 für das F-4010-Typ-Spektrofluorometer von Hitachi, Ltd.) wurde in ein F4010-Spektrofluorometer (Hitachi) als Immunoassay-Apparat eingesetzt.
  • T3 (3,3',5-Trijodothyronin) (Sigma) wurde mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) (Research Organics) markiert, um ein Fluoreszenzreagens herzustellen, das ein T3-FITC-Konjugat ist.
  • T3 wurde mit einer 0,1% BSA enthaltenden Pufferlösung verdünnt, um eine T3-Standardprobe (0, 10, 20, 50, 100 oder 200 μg/ml) herzustellen.
  • <Erstellen einer Eichkurve>
  • (1) Erster Standardreaktionsschritt
  • Zu 300 μl des FITC-markierten T3 (0,14 μg/ml) wurden 10 μl der T3-Standardprobe (200 μg/ml) und 10 μl eines monoclonalen anti-T3-Antikörpers (Biospacific) (0,3 mg/ml) gegeben und gerührt, um die Fluoreszenzpolarisation (P1) für 1 Minute zu messen.
  • (2) Zweite Standardreaktion
  • Zu demselben Reaktionsgefäß wurden 10 μl der T3-Standardprobe (0, 10, 20, 50, 100 oder 500 μg/ml) gegeben und gerührt und die Fluoreszenzpolarisation (P2) wurde für 4 Minuten direkt nach dem Rühren gemessen.
  • Die Fluoreszenzpolarisation wurde unter einer Bedingung gemessen, dass eine Anregungswellenlänge bei 495 nm, und eine Fluoreszenzwellenlänge bei 529 nm ist und es wurde eine Polarisator-Umschaltzeit von 10 sec gewählt.
  • Es wurde bestätigt, dass eine zufriedenstellende Eichkurve anhand der Konzentration von T3 und dem Verhältnis (P1/P2) der Fluoreszenzpolarisationen erhalten wurde (14). Daher ist es selbstverständlich, dass der erfindungsgemäße Immunoassay auf den Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay angewendet werden kann.
  • Der erfindungsgemäße Immunoassay macht es möglich, höchst genaue Messungen durch Unterdrückung eines Messfehlers durch Variationen der Reaktionsbedingungen auszuführen, die Menge des verwendeten Immunreagens zu vermindern und den Arbeitsaufwand und die Zeit für das Messen zu verringern.

Claims (15)

  1. Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, mittels eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei das Verfahren umfasst: einen Standardreaktionsschritt des Reagierens einer Standardprobe, die den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthält, mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschrittes mit der Probe; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, durch Vergleichen der Reaktivität des Standardreaktionsschritts mit der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  2. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, basierend auf dem Verhältnis oder der Differenz zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit des Standard-Reaktionsschritts und der Reaktionsgeschwindigkeit des Probenreaktionsschritts bestimmt wird.
  3. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktivität des Standardreaktionsschritts und/oder des Probenreaktionsschritts bestimmt wird durch Messen der Agglutination, die verursacht wird durch immunologisches Binden zwischen dem Messgegenstand und dem Immunreagens, anhand der Trübung.
  4. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend einen Schritt der vorangehenden Erstellung einer Eichkurve und einen Schritt des Messens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, unter Verwendung des Resultats des Vergleichs zwischen der Reaktivität des Standardreaktionsschritts und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts sowie unter Verwendung der Eichkurve.
  5. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Antigen oder Antikörper, markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff, als Immunreagens verwendet wird.
  6. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Antigen oder Antikörper, das/der auf einem festen Träger immobilisiert ist, als Immunreagens verwendet wird, und wobei das Binden von Messgegenstand und Immunreagens beobachtet wird anhand einer Veränderung des maximalen Resonanzwinkels oder der maximalen Resonanzabsorptionswellenlänge der Oberflächenplasmonen-Resonanz, einer Veränderung der Fluoreszenzintensität, die von einer exponentiell gedämpften („evanescent") Welle angeregt wird, einer Änderung in der Frequenz eines Quarz-Oszillators, einer Änderung des Potenzials oder Stroms einer Elektrode oder einer Änderung im Strom eines Ionenkanals.
  7. Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagens umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei das Verfahren umfasst: einen Probenreaktionsschritt des Reagierens der Probe mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Standardreaktionsschritt des Mischens und Reagierens der Reaktionslösung des Probenreaktionsschritts mit einer Standardprobe, die den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthält; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, durch Vergleichen der Reaktivität des Standardreaktionsschritts mit der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  8. Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei das Verfahren umfasst: einen Standardreaktionsschritt des Reagierens der Standardprobe, die den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthält, mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und Reagierens der Reaktionslösung des Standardreaktionsschritts mit der Probe; einen Schritt des Korrigierens einer zuvor erstellten Eichkurve mit der Reaktivität des Standardreaktionsschritts; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, anhand der korrigierten Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  9. Immunoassay-Verfahren zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen und einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei das Verfahren umfasst: einen Probenreaktionsschritt des Reagierens der Probe mit dem Immunreagens in einer Reaktionslösung; einen Standardreaktionsschritt des Mischens und Reagierens der Reaktionslösung des Probenreaktionsschritts mit einer Standardprobe, die den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthält; einen Schritt des Korrigierens einer zuvor erstellten Eichkurve mit der Reaktivität des Standardreaktionsschritts; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, anhand der korrigierten Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts.
  10. Immunoassay-Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei das Verfahren umfasst: zwei oder mehr Standardreaktionsschritte des Mischens und Reagierens von zwei oder mehr Standardproben in aufeinanderfolgender Weise mit einer Reaktionslösung, die das Immunreagens enthält; einen Probenreaktionsschritt des Mischens und Reagierens der Reaktionslösung des letzten Standardreaktionsschritt mit der Probe; einen Schritt des Erstellens einer Eichkurve anhand der Reaktivität jedes Standardreaktionsschritts; und einen Schritt des Bestimmens der Konzentration des Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, unter Verwendung der Eichkurve und der Reaktivität des Probenreaktionsschritts, wobei zumindest die Standardproben eines zweiten oder späteren Standardreaktionsschritts den Messgegenstand in einer bestimmten Konzentration enthalten.
  11. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Standardprobe eines ersten Standardreaktionsschritts nicht den Messgegenstand enthält.
  12. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 10, wobei jede der Standardproben aller Standardreaktionsschritte den Messgegenstand enthält.
  13. Immunoassay-Testkit zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei der Kit umfasst: eine Immunreagens-Halterung zum Aufbewahren eines Immunreagenses, Standardprobenhalterungen zum Aufbewahren von Standardproben, eine Probenhalterung für eine Probe, die injiziert wird, und ein Reaktionsgefäß, wobei der Immunoassay-Testkit zum Bestimmen der Konzentration eines Messgegenstands verwendet wird, der in der Probe enthalten ist, durch Reagieren des Immunreagenses mit entweder der Standardprobe oder der Probe im Reaktionsgefäß, gefolgt von Hinzufügen und Reagieren des jeweils anderen mit der Reaktionsmischung im Reaktionsgefäß, und Vergleichen der Reaktivitäten jeder Reaktion.
  14. Immunoassay-Testkit zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei der Immunoassay-Testkit umfasst: ein Substrat, das darauf ein Reaktionsgefäß zum Durchführen einer Immunreaktion, eine Immunreagenshalterung zum Aufbewahren eines Immunreagenses, Standardprobenhalterungen zum Aufbewahren von Standardproben und eine Probenhalterung für eine zu injizierende Probe trägt, die mit dem Reaktionsgefäß über eine Röhre verbunden sind.
  15. Immunoassay-Testkit zum Messen der Konzentration eines Messgegenstands, der in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung eines Immunreagenses, umfassend ein Antigen oder einen Antikörper für den Messgegenstand, wobei der Immunoassay-Testkit umfasst: ein Substrat, das darauf ein Reaktionsgefäß zum Durchführen einer Immunreaktion, eine Immunreagenshalterung zum Aufbewahren eines Immunreagenses, Standardprobenhalterungen zum Aufbewahren von Standardproben und eine Probenhalterung für eine zu injizierende Probe trägt, die mit dem Reaktionsgefäß über eine Röhre verbunden sind, wobei alles auf dem gleichen Substrat angeordnet ist und wobei der Immunoassay-Testkit verwendet wird für das Bestimmen der Konzentration eines Messgegenstands, der in der Probe enthalten ist, durch Reagieren des Immunreagenses mit entweder der Standardprobe oder der Probe im Reaktionsgefäß, gefolgt von Hinzufügen und Reagieren des jeweils anderen mit der Reaktionsmischung im Reaktionsgefäß, und Vergleichen der Reaktivitäten jeder Reaktion.
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