DE60017017T2 - Immuntest unter verwendung von partikeln mit kaseinumhüllungen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft überzogene Partikel zur Verwendung in Bindungsassays. Sie betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der genannten Partikel und das Verfahren zur Verwendung der genannten Partikel.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Bindungsassays, einschließlich Immunoassays, werden gewöhnlich als medizinische Diagnosewerkzeuge zur Bestimmung des Vorliegens und der Konzentration verschiedener Analyte angewandt. Immunoassayverfahren sind seit vielen Jahren bekannt und schließen die früheren von Hand durchgeführten Verfahren ein, auf die die neueren automatisierten Verfahren folgten (z.B. diejenigen, die an den ACS:180®- und ADVTA®-CentaurTM-Geräten von Bayer durchgeführt werden).
  • Eine der in den Immunoassays verwendeten Komponenten ist eine Feststoffphase, und zwar oft ein paramagnetischer Partikel (PMP), das durch Überziehen magnetischer Partikel mit einem Material hergestellt wird, das eine Weiterreaktion der magnetischen Partikel mit Wirkbestandteilen ermöglicht, die im Immunoassay zur Anwendung gelangen. In der Vergangenheit sind die Magnetpartikel häufig mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen worden. Allerdings haben sich die mit BSA überzogenen Partikel gelegentlich als instabil erwiesen, um unzuverlässige Assayergebnisse zu liefern. Außerdem führt die Verwendung von BSA allein zu hoher nicht-spezifischer Bindung. Ferner ist in EP 0 713 095 offenbart, dass Proteine wie Rinderserumalbumin, Gelatine und Casein an einer Feststoffphase voradsorbiert werden können, um nicht-spezifische Adsorptionsstellen zu blockieren, wobei die Feststoffphase gegebenenfalls eine Perle, ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, Küvette, Membran, ein Film, eine Disk, ein Filterpapier, ein Magnetpartikel usw. sein kann.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist nun herausgefunden worden, dass Casein und Salze von Casein als Ersatz für oder zusätzlich zu BSA als Materialien zum Überziehen magnetischer Partikel geeignet sind, die in Immunoassays und weiteren Bindungsassays zur Abtrennung des gewünschten Analyt verwendet werden. Durch die Verwendung von Casein sind nun Immunoassayverfahren mit verbesserter Stabilität und weniger Widersprüchlichkeiten bezüglich der Probe entwickelt worden. Casein, das mit einer Konzentration von ca. 0,05 bis 4,0 g pro g paramagnetischer Partikel (optimal mit ca. 0,78 bis 1,2 g Casein pro g Magnetpartikel) verwendet wird, hat sich diesbezüglich als vorteilhaft erwiesen.
  • Außerdem ist ein Verfahren zum Überziehen magnetischer Partikel erfunden worden, wobei das Casein mit magnetischen Partikeln bei 30 bis 60°C 5 bis 180 h lang vermischt wird und das Verfahren Casein-überzogene paramagnetische Partikel ergibt, die entweder (1) mit im Bindungsassay benötigten Wirkbestandteilen kombiniert oder (2) dazu befähigt sind, mit den im Bindungsassay benötigten Wirkbestandteilen zu reagieren.
  • Des weiteren ist das Verwendungsverfahren der mit Casein überzogenen paramagnetischen Partikel entwickelt worden, wobei die genannten Partikel mit in den Immunoassayverfahren verwendeten Wirkbestandteilen direkt oder indirekt kombiniert werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Partikelgrößenverteilungen (in % Volumenänderung gegen die Partikelgröße) der Feststoffphase in einem Ferritin-Assay, als 1,2 g BSA oder Casein pro g PMP zum Überziehen der Feststoffphase verwendet wurden.
  • 2 zeigt die Stabilität bei 37°C (in % Dosis-Rückgewinnung gegen die Zeit in Tagen) für sowohl Testosteron als auch für FT3 für sowohl mit BSA überzogene magnetische Partikel (derzeitige) als auch für mit Casein überzogene Partikel (modifizierte).
  • 3 zeigt eine simulierte Auf-Brett-Stabilität (in % Dosis-Rückgewinnung gegen die Zeit in Tagen) für FT3, T3 und T4 für sowohl mit BSA überzogene magnetische Partikel (derzeitige) als auch für mit Casein überzogene Partikel (modifizierte).
  • 4 zeigt eine simulierte Auf-Brett-Stabilität (in % TU-Verhältnisrückgewinnung gegen die Zeit in Tagen) für die T-Aufnahme sowohl für die mit BSA überzogenen Magnetpartikel (die derzeitigen) als auch für die mit Casein überzogenen Partikel (die modifizierten).
  • 5 ist eine Korrelationsstudie, die die % T-Aufnahme für 100 Patientenproben zeigt, von denen eine jede unter Anwendung der mit Casein überzogenen Feststoffphase (der modifizierten) gegen die mit BSA überzogene Feststoffphase (die derzeitige) getestet wurde.
  • 6 zeigt die Feststoffphasenstabilität bei 37°C für einen CA 19-9-Assay (in % Dosis-Rückgewinnung gegen die Zeit in Tagen) für 3 verschiedene Analytspiegel sowohl für die mit BSA überzogenen Magnetpartikel (mit/ohne Casein) als auch für die mit Casein überzogenen Partikel (Casein).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bindungsassayverfahren sind seit vielen Jahren als Mittel zur Bestimmung des Vorliegens und der Konzentration von Analyten zur Durchführung medizinischer Diagnosetests angewandt worden. Der Begriff Bindungsassays soll einen breiten Bereich von Assayverfahren abdecken, einschließlich Nukleinsäure-Assays, Gen-Sondenassays, Immunoassays und Membran-Bindung.
  • Im Allgemeinen beinhalten diese Assayverfahren eine Reaktion des Analyt (oder von etwas, das mit der Analyt-Konzentration korreliert werden kann) mit einer Feststoffphase, um den Analyt aus einer Lösung abzutrennen, sowie eine Reaktion mit einer Markierung, die den Nachweis des Analyt ermöglicht.
  • Zwei Typen von Immunoassayverfahren werden durch kompetitive und nicht-kompetitive Assayverfahren dargestellt. Im kompetitiven Assay geht ein Signal, das gemessen wird, aus einem spezifischen Binder hervor, der den Analyt nicht bindet. Es gibt zahlreiche Formate kompetitiver Assayverfahren. Beispielsweise wird in einigen kompetitiven Assayverfahren der markierte Antikörper mit einer Probe inkubiert, die Analyt und ein Feststoffphase-immobilisiertes Analytderivat enthält. Der markierte Antikörper, der nicht an den Analyt gebunden wird, wird an die Feststoffphase gebunden, und das aus dem Feststoffphase-gebundenen markierten Antikörper austretende Signal wird gemessen. In weiteren Typen kompetitiver Assays wird unmarkierter Antikörper mit einer Probe inkubiert, die einen Analyt und ein markiertes Analytderivat (oder einen Schein-Analyt) enthält. Das markierte Analytderivat wird an diejenigen Antikörper-Bindungsstellen gebunden, die unbesetzt sind. Durch Messung des Signals, das aus dem markierten Analytderivat kommt, das an den Antikörper gebunden wurde, erhält der Chemiker tatsächlich einen Schätzwert der Konzentration von Antikörperstellen, die den Analyt nicht gebunden haben. Somit wird in beiden Typen kompetitiver Assays ein Signal gemessen, das mit dem Bruchteil spezifischer Bindungsstellen in Zusammenhang steht, an die der Analyt nicht gebunden wurde. Das aus einem kompetitiven Assay erzeugte Signal sinkt mit dem Anstieg der Analyt-Konzentration ab. Da kleine Analytspiegel großen Signalen entsprechen, führen kleine Änderungen bei niedrigen Analyt-Konzentrationen zu kleinen Differenzen zwischen großen Zahlen, die somit nur schwer genau zu messen sind.
  • Ein zweiter Typ eines Bindungsassay wird durch den nicht-kompetitiven Typ dargestellt. In diesem Assay wird ein markierter spezifischer Binder, z.B. ein markierter Antikörper, mit einer Probe inkubiert und an einen Teil des Analyt gebunden. In einer Variation eines nicht-kompetitiven Assay wird ein in Feststoffphase immobilisierter unmarkierter spezifischer Binder gleichzeitig oder in Abfolge zugefügt, um an ein weiteres Epitop am Analyt gebunden zu werden, in welchem Fall der Assay als "Sandwich"-Assay bezeichnet wird. Beispielsweise könnte das immobilisierte Molekül ein Antikörper gegen ein zweites Epitop am Analyt sein, und der Analyt könnte einen ternären Komplex mit dem markierten Antikörper und einem immobilisierten unmarkierten Antikörper bilden. Die feste Phase wird dann gewaschen, und das gemessene Signal ist das Signal, das aus dem ternären Komplex kommt, der den Analyt enthält. In diesem Fall steigt das Signal mit dem Ansteigen der Analyt-Konzentration ebenfalls an.
  • Alle der oben diskutierten Assayverfahren beruhen auf der Verwendung einer Feststoffphase und einer Markierung, die an der Feststoffphase befestigt (oder daran gebunden oder damit verbunden) wird. Viele Typen von Markierungen sind in Bindungsassayverfahren angewandt worden, z.B. radiochemische, lumineszente, fluoreszente, chemilumineszente, enzymatische, liposomale und verschiedene Metall- und Nicht-Metall-Partikel. Vorzugsweise ist die Markierung eine chemilumineszente Markierung, wie ein Acridiniumester. Die Markierung kann direkt am Binder durch eine kovalente Bindung oder indirekt mit einem Bindungspaar, wie Biotin/Avidin, DNP/anti-DNP oder mit weiteren Bindungspaaren, befestigt und gebunden werden.
  • Im Allgemeinen wird die Feststoffphase aus der Reaktionsmischung in einer Verfahrensstufe abgetrennt, und die an die genannte Feststoffphase gebundene Menge der Markierung wird bestimmt. Die Feststoffphase besteht im Allgemeinen aus Partikeln aus Glas mit gesteuerten Poren, aus Polymerpartikeln, Latex, kolloidalen Metall- oder Metalloxidpartikeln, einer unmischbaren Flüssigphase, einer vergrößerten Oberfläche, aus porösem Papier, porösem Gel, Liposomen, Lipos-Celluloseperlen, Emulsionen, einem System sehr kleiner Partikel, die sich nicht gleich beim Stehen oder Zentrifugieren absetzen, oder aus paramagnetischen Partikeln, Celluloseperlen, vernetztem Dextran oder aus weiteren Partikeln. Diese können Partikel, die bezüglich der Größe des Durchmessers von 10 nm bis einigen μm variieren, größere Perlen, flache Oberflächen, Teströhrchenwände, Tauchstaboberflächen, Fasern, Membranen, Stäbe, Disks und verlängerte oder teilchenförmige Oberflächen mit der Befähigung zum Tragen eines immobilisierten Binders einschließen. Die bevorzugte Feststoffphase ist ein magnetischer Partikel oder eine vergrößerte Oberfläche. Die Verwendung von Magnetpartikeln in Assayverfahren mit Trennstufen sind seit langem bekannt (siehe US 4,559,088 ). Magnetische Partikel werden oft mit Zwischenprodukten (z.B. mit Silanen und Glutaraldehyd) zur Bindung der biologischen Wirkkomponente zur Reaktion gebracht. Rinderserumalbumin ist als eine dieser Bindungskomponenten verwendet worden.
  • Bei der Herstellung der magnetischen Partikel ist herausgefunden worden, dass eine Instabilität wegen der Bildung eines nur dünnen Überzugs von BSA auf der PMP auftrat (d.h. wegen eines nur niedrigen Überzugsverhältnisses von BSA zu PMP). Außerdem verursachten die mit BSA überzogenen Partikel Interferenzen und Probenwidersprüchlichkeiten (d.h. unrichtige Assayergebnisse) in einigen Assayverfahren.
  • Es ist nun herausgefunden worden, dass Casein, ein inertes Protein, bei dessen Verwendung als Ersatz für BSA oder zusätzlich zu BSA half, die Probleme zu beseitigen. Als Casein im Bereich von 0,05 bis 4,0, vorzugsweise von 0,15 bis 3,2 und am meisten bevorzugt von 0,78 bis 1,2 g Casein pro g PMP verwendet wurde, wurden die Probleme stark verringert. Die Vermischung von Casein mit dem PMP erfolgte bei ca. 34 bis 60°C 5 bis 180 h lang und vorzugsweise bei ca. 37 bis 50°C 14 bis 144 h lang. (Ein typisches Verfahren zur Herstellung Casein-überzogener Partikel (angewandt im Ferritin-Assay) ist in Beispiel 5 angegeben. Variationen dieses Verfahrens können zur Herstellung der Feststoffphase für weitere Assayverfahren angewandt werden.)
  • Es wurde die Partikelstabilität durch Bewertung der Partikelgrößenverteilung vor und nach dem Schütteln auf einem ADVIA®-CentaurTM-Gerät untersucht. Die Reagenzien wurden beim Vermischen geschüttelt, als der Assay auf dem Gerät durchgeführt wurde. Die Casein-überzogenen Partikel zeigten und ergaben weniger Aggregation durch Partikel-Wechselwirkungen, oder sie zeigten und ergaben eine Entaggregation. Somit wird. angenommen, dass das Casein als Kissenschicht gedient hat, welche die Partikel vor der Bildung von Aggregaten schützt. Siehe 1, worin die Partikelgrößenverteilung der im Ferritin-Assay angewandten Feststoffphase unter Schütteln gegenüber einem statischen Zustand dargestellt ist, wobei das genannte Reagens mit 1,2 g BSA/g PMP (1a) oder mit 1,2 g Casein/g PMP (1b) überzogen wurde.
  • Auch wurde die thermische Stabilität mit gesamtem menschlichen (total human) chorionischen Gonadotropin (ThCG), Testosteron, CA 19-9 und mit freiem T3 untersucht, und als deutlich verbessert für die mit Casein überzogenen Partikel ermittelt (siehe unten 2 und 6, Tabellen 1 und 5 und Beispiel 1). Die Auf-Brett-Stabilität und die gelagerte Eichstabilität (durchgeführt wie unten beschrieben) erwiesen sich ebenfalls als verbessert für T4, T3, freies T3 und für die T-Aufnahme (siehe Beispiel 2 (unten), Tabelle 2 und 3 und 4).
  • Die gelagerte Eichstabilität wurde wie folgt untersucht. Am Tag 0 wurde ein Eichpunkt aus den bei 2 bis 8°C gelagerten bzw. aufbewahrten Reagensformulierungen an einem ADVIA®-CentaurTM-Analysengerät analysiert. Anschließend wurde eine Zeit-Querschnittsstudie mit den aufbewahrten Reagenzien 28 Tage lang durchgeführt. An einem spezifischen Tag wurden Assayverfahren sowohl mit BSA-überzogenen Partikeln als auch mit Caseinüberzogenen Partikeln durchgeführt. Jeder Datenpunkt wurde mit dem am Tag 0 aufbewahrten Eichpunkt für das entsprechende Reagens verglichen. Der Prozentsatz der Dosis-Rückgewinnungen von Vergleichs- und Patientenproben-Sammelvorräten, bezogen auf den Tag 0, wurde bestimmt.
  • Zur Durchführung der Auf-Brett-Stabilitätstests wurden Proben in der (bei 2 bis 8°C) gekühlten Kammer des ADVIA®-CentaurTM-Geräts für den Assay aufbewahrt, worin die Proben kontinuierlich geschüttelt wurden. Eine Probe wurde vor Beginn des Versuchs getestet (Tag 0-Wert). Weitere Proben wurden periodisch (bis zum Tag 28) zur Analyse gezogen. Die Ergebnisse wurden gegen die Daten vom Tag 0 aufgetragen, um die Auswirkungen der Auf-Brett-Aufbewahrung auf das Leistungsvermögen des Produkts zu ermitteln.
  • Casein oder seine Salze, wie Natrium- und Kaliumcaseinat, haben sich als geeignete Überzugsmittel erwiesen. Die Wahl der Form des Casein hängt, teilweise, vom Medium ab, in welchem die Synthese durchgeführt wird. Beispielsweise ist Casein selbst hydrophob und weist eine nur geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen auf. Das Salz Natriumcaseinat weist andererseits eine bessere Löslichkeit in wässrigen Lösungen auf, was daher zu höheren Konzentrationen des Caseinats in wässrigen Lösungen und demzufolge zu dickeren Filmen von auf der Feststoffphase abgeschiedenem Casein führt.
  • Die Verwendung von BSA, dem Material, das im Allgemeinen zum Überziehen von Feststoffphase-Partikeln verwendet wird, war für Interferenzen und nicht-spezifische Bindungen verantwortlich. Es wird geargwöhnt, dass, da das BSA mehrfache Bindungsstellen für Liganden aufwies, dies Interferenzen durch endogene Substanzen (d.h. durch diejenigen, die beim Menschen erzeugt werden), wie durch L-Thyroxin, Progesteron, Testosteron, Östradiol und durch Cortison, zuließ. Außerdem haben sich negativ geladene Arzneien (wie Ibuprofen und Salicylat usw.), neutrale Arzneien (wie Warfarin und Jopanoat usw.), positiv geladene Arzneien (wie Chinidin, Procain und Lidocain usw.) und anorganische Ionen (wie Cu+, Mn+2, Ni+2, Co+2, Ca+2 und Mg2+) als Ursache für Interferenzen erwiesen.
  • Die mehrfachen Bindungsstellen auf BSA können möglicherweise eine Probenwidersprüchlichkeit ergeben, falls der Patient mit bestimmten Arzneien medikamentiert ist. Es ist bekannt, dass viele Arzneien stark an Albumine gebunden werden (siehe Ulrich Kragh-Hansen, 33 Pharmacological Review (1981) 17–53, Molecular Aspects of Ligand Bindung to Serum Albumin). Bei Bindung der Arznei-Moleküle an BSA können Nebenreaktionen auf den Partikeln zusätzlich zur erwarteten Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion ausgelöst werden. Dies kann das Assay-System kompliziert gestalten und zu einem falschen Signal zur Missdeutung der Probe führen. Der Ersatz von BSA durch inertes Casein auf den Partikeloberflächen vermag dieses Problem zu beseitigen. Sogar wenn das BSA nicht vollständig eliminiert wird, sondern das Casein das Haupt-Überzugsmittel ist (umfassend mindestens 75 % des Casein/BSA-Mischüberzugs), wird eine Verbesserung festgestellt.
  • Die Abänderung hin zu Casein als dem Überzugsmatexial eliminierte die Interferenzen einer Thyroid-Hormon-, Steroid-Hormon- und einer weiteren nicht-spezifischen Bindung. Beispielsweise ergab, im T4-Assay, die Änderung von BSA zu Casein, dass die geringste nachweisbare Dosis von 0,24 μg/dL auf 0,18 μg/dL verringert wurde. Darüber hinaus wurde die Genauigkeit am niedrigen Ende des Assay (1,12 μg/dL) signifikant verbessert, und auch der Abweichkoeffizient wurde von 26,5 % auf 9,3 % verbessert.
  • Casein ist bereits früher in Diagnoseassays verwendet worden, es wurde aber nicht zum Überziehen von Partikeln und zur Verbesserung der Stabilität verwendet. Im US 4,828,980 von Snyder wurde Casein zum Überziehen von Membranstrukturen zur Verhinderung der nicht-spezifischen Bindung von Proteinen an die Membranoberflächen verwendet. Im US 4,812,414 von Warren wurden Partikel, die Tracer (Markierungen) enthielten, mit Casein zur Reaktion gebracht, um Hintergrundsignale aus positiv und negativ geladenen Materialien zu verringern (siehe Spalte 2, Zeilen 5–13, 57–60 darin). (D.h., das Casein zeigte und ergab einen gewissen Vorteil, nur als es eine Ladung-Ladung-Wechselwirkung verhinderte.) Mit dem Casein wurde nicht dargelegt, dass es einen Vorteil mit nicht-geladenen Rezeptormolekülen zeigt und ergibt. Außerdem verwendete Warren das Casein auf der Markierungsphase (siehe Anspruch 1 darin), und das Casein wurde gleichzeitig mit der Zugabe von Antikörper zugegeben (siehe Spalte 13, Zeilen 24–29 von '414). In US 5,132,208 von Freitag sind Teststreifen offenbart, die in einigen Immunoassayverfahren angewandt werden, in denen die Feststoffkomponente (eine Polyester-Textilie) mit einem Protein überzogen wird, das in der Probenflüssigkeit unter den Testbedingungen unlöslich ist. Casein erwies sich als geeignet und nützlich in diesen Assayverfahren, da es sich als nahezu vollständig unlöslich erwies und ermöglichte, dass das Wirkreagens auf der Casein-überzogenen Textilie abgeschieden wurde.
  • Es ist davon auszugehen, dass die Verwendung von Casein die Stabilität in allen Typen von Immunoassayverfahren verbessert, einschließlich derer für Thyroid-bezogene Assayverfahren (z.B. T-Aufnahme, Thyroxin (T4), 3,3',5-Trijodthyronin (T3), freies 3,3',5-Trijodthyronin (freies T3)), für Anämie-Assayverfahren (z.B. Ferritin), Hormon-Assayverfahren (z.B. gesamtes menschliches chorionisches Gonadotropin, Testosteron) und für Krebs-Marker-Assayverfahren (z.B. CA19-9).
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung noch weiter erläutern, sie aber nicht einschränken.
  • Beispiel 1
  • Thermische Stabilität
  • Die thermische Stabilität von bei 37°C mit Casein überzogenen Partikeln wurde untersucht, indem mehrere Flaschen mit Reagens in einen Ofen gestellt und 1 Flasche zu jedem Testpunkt zur Analyse entnommen wurden. Die Verwendung der Casein-überzogenen Partikel zeigte und ergab eine signifikante Verbesserung, wie dargestellt durch den Vergleich der als Funktion der Zeit bestimmten Analyt-Konzentration gegenüber der am Beginn des Versuchs ermittelten Analyt-Konzentration. Die in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine signifikante Verbesserung mit den Caseinüberzogenen Partikeln (die als "modifiziert" bezeichnet sind) vorliegt. Die Stabilität in Assayverfahren für Testosteron und FT3 ist in 2 dargestellt, während die Daten zur Stabilität im ThCG-Assay in Tabelle 1 angegeben sind. Die thermische Stabilität für CA 19-9 ist in 6 und Tabelle 5 dargestellt und angegeben.
  • Beispiel 2
  • Auf-Brett-Stabilität (Simuliertes Mischen in einem automatisierten Gerät)
  • Auf-Brett-Stabilitätstests wurden durchgeführt, um die Auswirkung eines Casein-Überzugs zu ermitteln. Die Auf-Brett-Stabilitätstests simulierten die kontinuierliche Vermischung, die vom ADVIA®-CentaurTM-Gerät für den Assay durchgeführt wurde. Siehe die Daten in 3 und 4 und in Tabelle 2 für Assaydaten aus freiem T3, T3, T4 und aus T-Aufnahmedaten. Die weiteren Assay-Leistungskriterien für die T-Aufnahme bilden gleichwertig, wie dargestellt in 5 und angegeben in Tabelle 3.
  • Beispiel 3
  • T4-Leistungstest
  • Ein Leistungstest wurde mit Reagenzien für den T4-Assay mit einer Version durchgeführt, enthaltend BSA, aufgebracht auf PMP (siehe "Derzeitige" in Tabelle 4) gegen PMP, überzogen mit Casein ("Modifizierte" in Tabelle 4). Siehe die Verbesserung, angegeben in Tabelle 4 für die kleinste nachweisbare Dosis und für die Genauigkeit. Bei den weiteren Attributen wurde keine Änderung zwischen den BSA- und Casein-überzogenen Festphasen festgestellt, wodurch aufgezeigt ist, dass der Caseinenthaltende Assay zuverlässig blieb. (Merke, dass die "Modifizierte" Festphase 0,1 g BSA und 1,0 g Casein/g PMP enthielt.)
  • Beispiel 4
  • CA 19-9-Stabilität
  • Die Stabilität im Assay für CA 19-9, einem Krebs-Marker, ist durch die Zugabe von Casein zur in diesem Assay verwendeten Feststoffphase signifikant verbessert worden. Siehe 6 und Tabelle 5, in denen die signifikant verbesserte Stabilität bei 3 Analytspiegeln (22,0, 88,9 und 173 E/mL) angegeben ist.
  • Beispiel 5
  • Typisches Verfahren zur Herstellung der Casein-überzogenen Partikel
    • 1. PMP wird durch Zugabe von 3,125 % Glutaraldehyd (in 0,01 M Natriumacetat, pH = 5,5) aktiviert, und es wird das Ganze 3 h lang bei Raumtemperatur vermischt.
    • 2. Antikörper wird an den mit Glutaraldehyd aktivierten PMP durch Zugabe von 140 mg Antikörper/g PMP und durch Reaktion über 16,5 h bei Raumtemperatur unter Vermischen gekoppelt.
    • 3. Der unreagierte Aldehyd wird durch Reaktion mit Ethanolamin gelöscht. Die PMP's werden magnetisch durch Anlegen einer Magnetkraft auf das Behältnis abgetrennt. Die Partikel werden mit 0,1 M Natriumphosphat- Puffer (pH = 8,0) gewaschen und dann in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 8,0) resuspendiert. Zu den suspendierten Partikeln wird Ethanolamin (1,1 M in der endgültigen Reaktionsmischung) gegeben, und die Mischung wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt.
    • 4. Die Schiff-Base wird durch Zugabe von Boran-Pyridin reduziert. Die Partikel werden durch Anwendung eines Magnetfelds abgetrennt und mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 8,0) gewaschen und dann in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 8,0) resuspendiert. Boran-Pyridin (Boran-Pyridin, gemischt mit Dimethylsulfoxid im 1:4 Vol/Vol-Verhältnis), 50 bis 100 mM in der endgültigen Reaktionsmischung, wird zugegeben und 1 h lang bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht.
    • 5. Die Partikel werden durch Anlegen einer Magnetkraft abgetrennt und mit 1 M NaCl-Lösung gewaschen. Die Partikel werden mit 0,01 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 8,0) gewaschen. Die Partikel werden mit Hitzebelastungspuffer gewaschen und dann in Hitzebelastungspuffer resuspendiert, und die Mischung wird bei 50°C 16,5 h lang inkubiert. (Der Hitzebelastungspuffer besteht aus 0,220 g/L Natriumphosphat (monobasisch), 9,03 g/L Natriumphosphat (dibasisch), 8,75 g/L Natriumchlorid, 1 g/L Sulfhydrylmodifiziertem BSA, 0,010 g/L Rinder-gamma-globulin (BgG) und aus 39 g/L Casein (Natriumsalz), mit pH = 8,0.)
    • 6. Die Partikel werden durch Anlegen eines Magnetfelds abgetrennt und mit 1 M NaCl gewaschen, magnetisch abgetrennt und mit Protein-Puffer gewaschen. (Der Protein-Puffer besteht aus 0,220 g/L Natriumphospha t (monobasisch), 4,03 g/L Natriumphosphat (dibasisch), 8,75 g/L Natriumchlorid, 1 g/L Sulfhydryl-modifiziertem BSA und aus 0,010 g/L BgG, mit pH = 8,0.) Die entstandenen Partikel werden in Festphase-Puffer (10 mM Natriumbarbital, 8,75 g/L Natriumchlorid, 0,095 % Natriumazid, 0,372 g/L Dinatrium-EDTA, 2,5 g/L Gelatine, 1,0 g/L BgG, 3,0 g/L Sulfhydrylmodifiziertem BSA, 0,02 g/L Maus-Immunoglobulin G (IgG), 0,02 g/L Ziegen-IgG, 0,2 mL/L Amphotericin B, 0,98 mL/L Gentamicinsulfat, 0,2 % Natriumcholat und 0,05 g/L Antischaum B, eingestellt auf pH = 8,5) resuspendiert.
  • Variationen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung stehen, sind für den Fachmann erkennbar.

Claims (16)

  1. Verwendung paramagnetischer Festphase-Partikel, die mit Casein überzogen sind, in Bindungsassayverfahren, wobei die Partikel direkt oder indirekt mit einem Wirkbestandteil kombiniert werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Nukleinsäuren, Nukleinsäurepolymeren und aus weiteren Rezeptoren, die im genannten Bindungsassay verwendet werden.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der genannte Bindungsassay ein Immunoassay oder ein Gen-Sondenassay ist.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das genannte Casein in der Form von Natriumcaseinat oder Kaliumcaseinat vorliegt.
  4. Verfahren zur Herstellung Casein-überzogener paramagnetischer Partikel, die Wirkbestandteile enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Nukleinsäuren, Nukleinsäurepolymeren, welche in Bindungsassayverfahren zur Anwendung gelangen, wobei das Verfahren Stufen umfasst, in denen man Casein mit paramagnetischen Partikeln und Wirkbestandteilen vermischt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Nukleinsäuren und aus Nukleinsäurepolymeren, wobei die genannte Vermischung bei 30 bis 60°C 5 bis 180 h lang durchgeführt wird, um Casein-überzogene paramagnetische Partikel zu bilden, und wobei die genannten Partikel gegebenenfalls eine oder mehrere Komponenten enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Avidin und aus Streptavidin, welche als ein intermediäres reaktives Ganzes wirken, um eine Mithilfe bei der Zugabe eines im genannten Bindungsassay benötigten Wirkbestandteils zu leisten.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die genannten paramagnetischen Partikel vorab mit den genannten Wirkbestandteilen gekoppelt wurden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das genannte Casein in der Form von Natriumcaseinat oder Kaliumcaseinat vorliegt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die genannte Vermischung bei 37 bis 50°C 14 bis 144 h lang durchgeführt wird.
  8. Mit Casein überzogene paramagnetische Partikel zur Verwendung in Bindungsassayverfahren, wobei die genannten überzogenen Partikel 0,05 bis 4,0 g Casein pro g paramagnetische Partikel aufweisen.
  9. Paramagnetische Partikel gemäß Anspruch 8, die 0,15 bis 3,2 g Casein pro g paramagnetische Partikel aufweisen.
  10. Paramagnetische Partikel gemäß Anspruch 8, die 0,78 bis 1,2 g Casein pro g paramagnetische Partikel aufweisen.
  11. Paramagnetische Partikel gemäß Anspruch 8, worin das genannte Casein in der Form von Natriumcaseinat oder Kaliumcasein vorliegt.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei der genannte Bindungsassay für einen Analyt durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ferritin, T-Aufnahme, Thyroxin, 3,3',5-Trijodthyronin, freiem 3,3',5'-Trijodthyronin, gesamtem menschlichen chorionischen Gonadotropin, CA19-9 und aus Testosteron.
  13. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin eine durch nicht-spezifische Bindung verursachte Interferenz verringert ist.
  14. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin eine durch Widersprüchlichkeit der Probe verursachte Interferenz verringert ist.
  15. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin die Stabilität durch die Zugabe von Casein verbessert ist.
  16. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin die genannten paramagnetischen Partikel auch mit Rinderserumalbumin überzogen sind.
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