JPH08507148A

JPH08507148A - 固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイ

Info

Publication number: JPH08507148A
Application number: JP6519035A
Authority: JP
Inventors: オベラート，ブルース
Original assignee: カーディオヴァスキュラーダイアグノスティクス，インク．
Priority date: 1993-02-17
Filing date: 1994-02-16
Publication date: 1996-07-30
Also published as: WO1994019690A1; AU6173494A; KR960701365A; CA2156174A1; US5677133A; EP0685069A4; IL108699A0; TW326074B; KR100305306B1; EP0685069A1; US5601991A; AU689768B2; IL108699A

Abstract

(57)【要約】分析物の存在をアッセイすべき試料を、カスケードイニシエーターに結合した分析物（ハプテン、抗原、抗体、レセプター、または相補的ポリヌクレオチド）、分析物と反応する抗体または他の結合対パートナー、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させて反応チャンバー内にアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物をインキュベートし、このアッセイ混合物に振動または移動する静磁界を加え、反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始し、振動または回転する磁界に対する磁性粒子の反応をモニターして時間とともに変化する信号を提供し、この時間とともに変化する信号を分析して試料の分析物濃度を測定することを含むアフィニティアッセイを行うための方法、また、アッセイを行なうためのキット、およびアッセイを行なうための診断システムが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイ技術分野本発明は、イムノアッセイなどの結合対アッセイを固相化学分析（ドライケミストリー）の様式で行なう方法に関する。背景技術結合対アッセイには種々のものがある。これには、種々のタイプのイムノアッセイ、ＤＮＡおよびＲＮＡプローブ・アッセイ、並びに生物学的に重要なその他の種々のリガンド−受容体アッセイが含まれる。今日では、対象とするものであるかもしれない特定の抗原または抗体の定量的測定を行なうためにイムノアッセイを利用できる。これらのタイプのアッセイの中には、エンザイムイムノアッセイがある（Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２２巻，１９８４年，第８９５〜９０４頁；Ｍｏｎｒｏｅ，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５６巻，第８号，１９８４年，第９２１ａ〜９３１ａ頁；およびＷｉｓｄｏｍ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２２／８，１９７６年，第１２４３〜１２５５頁参照）。エンザイムイムノアッセイにおいては、測定すべき試料におけるのと同一の抗原−抗体対の一方に結合する標識またはマーカーとして、酵素を使用する。酵素の結合した抗原／抗体は、それに対して相補的な抗原／抗体の供給に制限があるため、試料の抗原／抗体と結合部位に関して競合する。測定値または結果を得るために、結合対アッセイをなんらかの手段で変換器または測定システムと組み合わせなければならない。このタイプの全てのアッセイは、測定値を得るために別のシステムに結合される。上記のエンザイムイムノアッセイにおいては、比色分析、ケミルミネッセンス、螢光分析法、生物発光などの種々の方法を用いて酵素活性を測定することにより、試料の抗原／抗体レベルを間接的に測定する。従来のイムノアッセイ、より一般的には従来の結合対アッセイ、の問題は、これらの方式に３つの明らかな欠点があることである：１）これらは全血による定量的測定を行なうことかできない。エンザイムイムノアッセイの質は、測定すべき抗原またはハプテンの純度に非常に大きく依存するため、特に全血試料の分析には有用でない。また、全血は光度測定にあたって光学的な干渉を引き起こし、システムから有用な信号を得るための可能性を非常に低いものにしてしまう。２）一回の処理時間が長い。反応が遅く、結果を得るまでの試験時間が長い。３）多数の工程が必要となる。手作業で行なうと労働集約的なものとなり、インキュベーション、洗浄、サンプリング、および試薬添加など多くの工程を自動化すると高価で複雑な装置が必要となる。磁性粒子インタロゲーション（interrogation）法により、血液凝固についての便利な固相化学分析の動的測定を全血試料を対象として行なえることが示されている（Ｏｂｅｒｈａｒｄｔ，米国特許第４，８４９，３４０号および第５，１１０，７２７号参照）。磁性粒子インタロゲーション法では、血液試料を測りとり、磁性粒子と少なくとも一種の乾燥試薬とを組み合わせたものを含む反応スライドに加える。試料と乾燥試薬とを反応させ、移動または振動する磁界を加えた後、磁性粒子の運動をモニターして、凝固の終点を検出し、凝固時間を得る。全血およびその他の困難な生物学的試料の測定を簡便に定量的に行なえる方法は殆どないためこの方法は重要である。しかし、これと同じ技術をイムノアッセイ、より一般的には異なるタイプの結合対アッセイにおいて使用するためには、現行のアッセイ系を、免疫学的または結合対の“先端（front end）”と組み合わせるための方法を見出さなければならない。一つの可能性のある解決策は、抗体または抗原を磁性粒子に直接結合することである。しかし、抗体または抗原を磁性粒子に直接結合することにより免疫反応を読み取れる系を提供できるものの、そのような系を再現性のある固相化学分析の様式で使用することは困難である。これは、全ての粒子は凝集する性質があるためであり、このためそれらの熱力学的な自由エネルギーが極めて低くなってしまい、安定ではあるが凝集した系になってしまうからである。例えば、磁性ラテックスは磁気インタロゲーションによって定量化することは困難である。表面抗原または抗体分子に対して使用した場合、これらの粒子では再現性が悪かった。表面結合免疫分子に対して他のタイプの磁性粒子を使用することは完全には成功していない。磁鉄鉱（Ｆｅ₃Ｏ₄）粒子を“受動”モードで使用することも考えられた。即ち、表面抗体または抗原を使用せず、受動粒子の手法に基づく、作動可能なアッセイ系の開発は少しは成功している。受動粒子の手法は概念的には明快であるが、免疫学的または結合対の“先端” を、今までは凝固または線維素溶解アッセイの測定だけに使用されていた磁性粒子インタロゲーション技術とどの様に結合したらよいかは明確でない。抗体または抗原に結合した酵素を利用した酵素結合凝固アッセイが提案されており、これにおいては、凝固カスケード反応系における能動要素（active facto r）として酵素を用いる（Ｄｏｅｌｌｇａｓｔら，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４７，１９８５年，第５２９〜５３４頁；１５２，１９８６年，第１９９〜２０７頁；１６２，１９８７年，第１０２〜１１４頁；１６７，１９８７年，第９７〜１０５頁；および１８４，１９９０年，第３７５〜３８０頁；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４／２，１９８８年，第２９４〜２９９頁；およびＤｏｅｌｌｇａｓｔ，米国特許第４，６６８，６２１号参照）。しかし、提案された系は何れも、一回またはそれ以上の分離、洗浄および希釈工程を必要とするか、長い試料処理時間を必要とする。また、Ｄｏｅｌｌｇａｓｔらは、プラスミノーゲン活性化因子（例えば、ｔ− ＰＡ）の活性を測定するために酵素結合線維素溶解アッセイを提案した（ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５９，１９９０年、第７２３〜７３３頁）。しかし、上記の凝固アッセイの場合のように、アッセイを行なうために多数の分離、洗浄および希釈工程を必要とする。Ｂｌａｋｅらは、凝固カスケードまたはその他のカスケード系に基づくイムノアッセイを提案した（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８４年，３０／９、第１４５２〜１４１５６頁）。この系は立体障害を利用しており、分離および洗浄工程を利用していない。しかし、この系は比色分析に基づいており、したがって、全血試料または希釈された血液試料の分析には適さない。現在の所、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブや他の結合対アッセイについて類似の試みを行なった例は存在しない。したがって、全血試料に使用でき、高速、高感度で便利な結合対アッセイシステムであって、定量的で使用が簡単なシステムを提供することが強く望まれている。発明の開示したがって、本発明の目的は、高速、高感度で便利な、生物学的に困難な試料に使用される結合対アッセイシステムであって、定量的で使用が簡単なシステムを提供することにある。本発明の他の目的は、生物学的に困難な試料に使用される結合対アッセイシステムであって、結合対の片方と結合するイニシエーターを利用するシステムを提供することにあり、このイニシエーターの活性化により反応カスケードが開始され、分離または洗浄工程を必要とすることなく、興味の対象となっている結合対メンバーの測定が可能となる。本発明の他の目的は、上記の結合対アッセイシステムであって、イニシエーターが血液凝固カスケードまたは溶解（lytic）カスケード中の酵素であるシステムを提供することにある。本発明の他の目的は、全血系に有用なイムノアッセイシステムを提供することにある。本発明の他の目的は、例えばジゴキシン（digoxin）、キニジン（quinidine）、リドカイン（lidocaine）、メキシレチン（mexiletine）、ソタロール（sotal ol）、イミプラミン（imipramine）、プロパフェノン（propafenone）、チベンゾリン（cibenzoline）、エンカイニド（encainide）、フレカイニド（flecaini de）、インデカイニド（indecainide）、モリシジン（moricizine）、ペンティサミド（pentisamide）、トカイニド（tocainide）、ベタクソロール（betaxolo l）、ビソプロロール（bisoprolol）、ペンブトロール（penbutolol）、アミオダロン（amiodarone）、ベタニジン（bethanidine）、メオベンチン（meobentin e）、ベプリジル（bepridil）、ジルチアゼム（diltiazem）などの心血管疾患を治療する治療薬、およびその他の抗不整脈薬などの小さい分子のためのアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固末端の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、アポリポタンパクＡ−１、アポリポタンパクＢ−１００、アポリポタンパクＥ、リポタンパクＬｐ（ａ）、ＩｇＭなどのイムノグロブリン、フィブリノーゲンなどの大きな分子のための高速で便利なイムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するイムノアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、トロポニン、ＰＡＩ−１、トロンボモジュリン、およびトロンビン −アンチトロビン複合体などの重要な心血管タンパクのためのイムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するイムノアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、血小板またはその特定の受容体（即ち、ＩＩｂ、ＩＩＩａなど）；赤血球またはその特定の抗原（即ち、Ｒｈｏ）；白血球またはその特定の抗原（即ち、組織適合抗原）；または細菌細胞、ウイルス、リケッチア、カビまたはイーストなどの細胞要素またはそれらの表面抗原または受容体分子のための便利なアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、ＨＩＶ抗原、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）におけるＣＤ４／ＣＤ８およびＰＡＮＴ、並びに前立腺癌における前立腺特定抗原（ＰＳＡ）などの、重要な健康管理のためのスクリーニングおよび疾病管理に応用される高速で便利な定量的イムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するイムノアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、インシュリン、Ｔ４、Ｔ３、ＡＣＴＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨ、アンギオテンシンＩＩなどのホルモンのための高速で便利な診断イムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断イムノアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、コラーゲン、フィブロネクチン等の接着性レセプター、ピトロネクチン、その他のインテグリン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、アネクシン、細胞骨格成分、サイトカイン、成長因子などの、細胞外または細胞内の信号または構造要素のための高速で便利な診断イムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断イムノアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、細胞およびウイルス中の遺伝子材料に見られるような特定のポリヌクレオチドのための高速で便利な診断試験であって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断試験を提供することにある。本発明の他の目的は、肺洗浄液、または唾液などの血液以外の困難な生物学的試料のための高速で便利な診断試験であって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断試験を提供することにある。本発明の他の目的は、ウシ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、ヒトまたはウシ線維素溶解カスケード、ブタカスケード、昆虫血液凝固カスケード、またはカブトガニ血液リンパカスケードなどの、ヒト血液凝固以外に存在する可能性のあるカスケードシステムに基づく、血液またはその他の困難な生物学的試料のためのアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、フォン・ウィルブランド因子およびそのコラーゲンレセプターと血小板ＧＰＩｂレセプター、トロンビンとトロンボモジュリン、アセチルクロリンとその受容体などの、リガンドまたは受容体のための高速で便利な定量的診断アッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断アッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、例えば相違するが関連のある分析物のためのイムノアッセイなどのアフィニティアッセイのパネルであって、個々のアッセイが行なわれる多数の反応容量部と並列に接続された、反応スライドの試料ウエルに試料を適用することのみによって得られる医療的診断の決定を容易にし、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するパネルを提供することにある。本発明の他の目的は、反応スライドと、回転磁界および光学的な検出・照明手段を利用する装置とを含む、固相化学分析様式による定量的アフィニティアッセイを行なうための便利で効果的なシステムを提供することにある。これらおよびその他の目的は、アフィニティアッセイを行なう新規な方法を見出すことによって達成された。この方法は、分析物の存在をアッセイすべき試料を、反応カスケードイニシエーターに結合した分析物（ハプテン、タンパク、抗体、レセプター、または相補的ポリヌクレオチドなどの小さな分子または大きな分子）、前記分析物と反応する抗体、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させ、反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成させ、アッセイ混合物をインキュベートし、このアッセイ混合物に振動または移動する静磁界を加え、反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ、振動または回転する磁界に対する磁性粒子の反応を監視して時間とともに変化する信号を提供し、この時間とともに変化する信号を分析して試料の分析物濃度を測定することを含むものである。図面の簡単な説明添付図面との関連を考慮し、下記の詳細な説明を参照することによって本発明がより良く理解されたとき、本発明および本発明の他の利点の多くがより完全に理解されるであろう。添付図面中、図１は、本発明において有用な反応スライド（米国特許第４，８４９，３４０号および第５，１１０，７２７号に記載されており、これらを本明細書の一部を構成するものとして参照する）の分解図であり、ベース支持体（３０）、反応プレートまたはスペーサ（２０）および反応カバー（１０）を示すとともに、試料ウエル（６４）、通路（６１）および反応チャンバー（６２）の位置を示し、通路（６１）と反応チャンバー（６２）は反応容量部（６６）を含んでいる。図２は、組み立てられた反応スライドの上面図である。図３は、試料ウエル（６４）上の試料入口（１４）へのルアー形アダプター（１５）の取付状態を示す。図４ａおよび４ｂは、試料を、通路（６１）を通して試料ウエル（６４）に、そして反応チャンバー（６２）に導入するための２つの方法を示す：ａ）試料入口（１４）に圧力を加える方法；ｂ）排気口（７６）を真空にする方法。図５は、本発明の結合対アッセイ方法において使用できる立体化学的アッセイ方法の概略を示す。図６は、本発明の結合対アッセイ方法において使用できる除去アッセイ方法の概略を示す。図７は、実施例１におけるような磁性粒子を用いた反応スライド技術により得られたウシトロンビンについての標準曲線を示す。図８ａおよび８ｂは、実施例２におけるような磁性粒子を用いた反応スライド技術により得られたファクターＸａについての標準曲線を示す。図９ａおよび９ｂは、実施例３におけるような磁性粒子を用いた反応スライド技術により得られたラッセルクサリヘビ毒についての標準曲線を示す。図１０は、固相化学反応スライドからのファクターＸａのアッセイにおける全凝固時間を測定するための、実施例１の装置を用いた光ダイオード増幅器からの出力を示す。図１１ａ、１１ｂおよび１１ｃは、別々に試薬によって満たされ、処理され、そして乾燥された個々の反応スライドをどの様にして共通のキャリヤ上で組み合わせ、共通の試料ウエルから試料を満たして、アッセイパネルを提供できるかを示す。発明を実施するための最良の形態本発明は、アフィニティアッセイを行なうための方法を提供するものであり、その方法は、 −分析物の存在をアッセイすべき試料を、反応カスケードイニシエーターに共有結合的に結合した分析物、この分析物と反応する抗体、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させて反応チャンバー内にアッセイ混合物を形成させ； −このアッセイ混合物をインキュベートし； −このアッセイ混合物に磁界を加え； −反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ； −光学的手段によって磁性粒子の反応をモニターして光学的な振動信号を得；そして −光学的振動信号の分析によって試料中の分析物濃度を決定することを含む。本発明の方法は、イムノアッセイなどの広範な結合対アッセイに使用できる。本発明の方法を用いて実施できるアッセイのタイプの例としては、可溶性抗原のためのイムノアッセイ、細胞イムノアッセイ、非免疫的である種々のタイプのレセプター−リガンドアッセイ、およびＤＮＡおよびＲＮＡプローブが挙げられる。特に好ましい態様では、本発明方法は反応スライド上で行われる。反応スライドの一例が図１に示されている。反応スライドは、支持部材（３０）を含み、この支持部材（３０）に反応プレートまたはスペーサ（２０）が取り付けられる。反応プレートの中央において材料の一部を除去することによって、反応プレート（２０）内に反応チャンバー（６２）が画定されている。反応プレートの小さい方の寸法、即ち厚さ方向に横切って材料が除去される、即ち“打ち抜かれる”場合、第三の構造要素またはカバー（１０）を利用して反応チャンバーの天井を形成する。反応スライドを含む２個もしくは３個以上の構造要素を種々の方法で一緒に接着してもよい（例えば、前記のＯｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第４，８４９，３４０号および第５，１１０，７２７号に開示されている）。反応チャンバー（６２）内には、磁性粒子、イニシエーターと結合された分析物、およびこの分析物と反応する抗体を含む乾燥試薬材料が置かれる。アッセイを行なうのに必要なことは、そのテストカードを試験装置内に置き、微量の（またはピペットによって量り分けた少量の）試料を試料ウエル（６４）に加え、試料が通路（６１）を通過し、反応チャンバー（６２）を満たすようにする。これによって、反応が起こり、反応終了後にその結果を読む。好適な試料スライドは、Ｏｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第５，１１０，７２７号に記載されている。この特許は、上記のようなスライドの記載と調製を含んでおり、この特許を本明細書の一部を構成するものとしてここに参照する。試料を試料ウエルまたは反応チャンバー内に直接置くことのできる任意の手段により、分析すべき試料を反応スライドに加えることができる。好適な手段としては、マイクロピペット、ピペット、ルアーチップの注射器、毛細管などが挙げられる。より好ましい手段は、ピペット、ルアーチップの注射器である。ルアーチップの注射器を用いる場合、図３に示すように、試料ウエルの入口にルアーアダプターを付加することによって反応スライドを変更することが必要となる。乾燥試薬材料は、典型的には、イニシエーターと結合された分析物、その分析物と反応する抗体、および磁性粒子を含有する。実施される特定のアッセイと特定の反応カスケードにより、酵素、基質、活性化剤、中和剤、緩衝剤などのその他の成分が加えられる。試料を反応スライドの試料ウエル（６４）に加えると、試料は通路（６１）を通過して反応チャンバー（６２）内に入り、乾燥試薬との反応を開始する。好ましい態様では、試料を試料ウエル（６４）から反応チャンバー（６２）へ運ぶための移動力は、Ｏｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第５，１１０，７２７号に記載されているように、毛細管寸法を有する通路（６１）と反応チャンバー（６２）の毛細管作用によって発生される。他の態様では、試料を移動させるための移動力は、反応チャンバー（６２）の排気口（７６）を真空源に接続する（図４ａ参照）か、試料ウエル（６４）の入口（１４）に圧力を加える（図４ｂ）ことによって発生される。必要となる真空レベルまたは圧力レベルは、試料ウエルから反応チャンバーへの試料の動きを引き起こすのに十分な程度に大気圧に対して負または正方向にそれぞれ偏ったものであり、好ましくは、大気圧よりも５〜１０ｍｍ低くまたは高くなっている。真空あるいは圧力法を使用するためには、図４ａおよび４ｂに示すように、疎水性膜（５１）を反応チャンバー（６２）の排気口（７６）の上に設けることが好ましい。この疎水性膜は、気体透過性であるが液体に対しては非透過性でなければならない。好ましい膜は、０．５〜３ｍｉｌの厚さのもので、孔の大きさが０．０２〜０．０６ミクロンで３５〜５５％の孔げき率を有し、最も好ましくは：１ｍｉｌの厚さのもので、孔の大きさが０．０４ミクロンで４５％の孔げき率を有するものである。このような膜の例としては、セルガード（ＣＥＬＧＡＲＤ）２５００と呼ばれる膜で、ヘキスト・セラニーズ社から入手できる。更に、試料ウエルから反応チャンバーに通じる通路は、毛細管作用が自動的に起きて液体を移送してしまわないようにするため、非濡れ性であるか、濡れが極力少なくなければならない。プラスチック材料を選択するか、またはコーティングにより、液体／固体界面における接触角が大きくなるようにし、これにより濡れを好ましい程度にすることができる。カスケードシステムの生化学は、本アッセイシステムの“バック・エンド（後部）”に基づいている。カスケードは、一連の反応であり、１番目の反応の生成物が、２番目の反応における生成物の形成を触媒し、それ以降も同様である。カスケードシステムは、２個程度の少ない酵素工程の場合もある。本発明の方法で使用されるカスケードシステムの例としては、ヒトまたは哺乳動物の血液凝固カスケードにおけるチモーゲンから活性形態酵素への変換；カブトガニの血液リンパにおける相似生化学カスケード；および昆虫血液凝固カスケードが挙げられる。本発明において使用できる他のカスケードシステムは、ヒトのプラスミノーゲン・アクチベータ／プラスミノーゲンシステムなどの溶解（lytic）カスケードである。一般に、カスケードシステム上で一つのものが高くなり始めると、アッセイ測定で見られる増幅量は増加する。カスケードシステムの増幅が大きい程、結合対アッセイの感度が高くなる。しかし、ヒト血液凝固カスケードにおけるファクターＸのレベルにおいてでさえ、本発明は、２段のカスケードにおいて、リットル当たり０．１ピコモルのＸ_aという感度を提供する。したがって、商業的に重要なイムノアッセイの殆ど全てを実施するのに十分な感度を提供できる。３段のカスケードの場合、リットル当たりフェムトモル（femtomole）程度に感度が増加するであろう。リットル当たり３．６ピコモルの感度で、２５マイクロリットルの試料を受け入れる反応チャンバーの場合、理論的には約１０^-18モルの分析物を検出できるであろう。これは、複製後１０⁷〜１０⁹個の分子を検出することが要求されるＤＮＡおよびＲＮＡプローブアッセイについて必要とされる範囲に入るかまたは範囲を超えるものである。ＤＮＡまたはＲＮＡ、一般的にはポリヌクレオチド、のためのアッセイにおいては、所定のストランドとその相補的ストランドが結合対を構成するであろう。幾つかのアッセイでは、カスケードの最後の酵素であるトロンビンのみを使用するだけで十分である。このような場合、より高い感度は必要とされない。結合対から発生された信号を凝固カスケードに結合するために、カスケードシステムに加え、立体化学的または排他的なメカニズムが選択される。立体化学メカニズムを選択した場合、均質アッセイとなる。即ち、遊離した分析物と結合した分析物の分離を手作業の工程または装置による工程で行なう必要がなくなる。立体化学メカニズムは、典型的には低分子量の分析物のために選択される。除去メカニズムでは、洗浄工程なしに、反応スライド内で結合分析物から遊離分析物を分離する。この手法は、典型的には高分子量分析物あるいは細胞エレメントのために選択される。立体化学的または排他的結合メカニズムの選択可能性に加えてカスケード反応は次の二つの方法で開始することができる：即ち、開始用の分子をカスケード反応のための反応成分を含有するチャンバーに単に導入すること、または引き金（トリガー）となるイニシエーターを使用することである。引き金となるイニシエーターは、カスケード反応のための反応成分と接触するように配置するか、運動の結果接触かもたらされるようにして、外からのエネルギーの入力、例えば紫外線光、熱的パルスあるいはステップ機能によって活性化されるかまたはトリガーされるまで一切反応が起こらないようにされる。トリガーされうることが可能なイニシエーターの使用はカスケード反応が開始される前に完全に混合できるので、必要であればより一層精密なアッセイを簡単に行うことができる。上記のように、本発明方法は様々な種の幅広いアッセイに用いることができる。アッセイ対象は一般に次の３つに分類される：（１）低分子量種（＜２０００ダルトン）、（２）高分子量種（＞２０００ダルトン）、および、細胞エレメント。以下にこれらの各々を記載する。Ｉ．低分子量種（＜２０００ダルトン）のアッセイ：この態様においては、立体化学的あるいは除去メカニズムのいずれかが選択され、結合対からシステムへと信号を伝達する。分析物−イニシエーター結合体を用いた立体化学的メカニズムにおいては、結合対反応の後にイニシエーターの機能との立体化学的干渉が起これば、均質アッセイとなる。そうではなく、イニシエーターが結合対の非分析物メンバーに化学的に付着している場合には、立体化学メカニズムを利用することもできるが、それには、イニシエーターの化学的付着が結合対の非分析物メンバー上の結合部位に近いこと、およびイニシエーター機能の立体化学的障害が起こるのは分析物がその結合対補体に結合するときであることが必要となる。図５および６は立体化学メカニズムと除去メカニズムの概略説明図である。立体化学メカニズム：立体化学的アッセイを採用する場合は、分析物の遊離（非結合）結合対パートナーをイニシエーターとともに乾燥試薬中で使用し、イニシエーターが（相補的結合対パートナーと反応性を有する）分析物のレプリカに化学的にカップリングするか、あるいは、分析物の結合対パートナーに化学的にカップリングしたイニシエーターだけを使用する。対象とする試料を添加して一定時間インキュベートした後、熱や光などのエネルギーを加え、イニシエーターを活性化する。インキュベートの間、試料が対象とする分析物を含有していない場合は、イニシエーターにカップリングした分析物レプリカは、対応する結合対パートナーと反応する。このように、この反応は立体化学的に活性化イニシエーターをブロックしてカスケード反応が始まらないようにする結果、カスケードは阻止されるかあるいは大幅に進行が遅くなる。あるいは、イニシエーターが分析物の結合対パートナーにカップリングし、また試料が分析物を含有していない場合には、イニシエーターは立体化学的な障害を受けず、よってカスケード反応が開始され迅速に進行する。しかしながら、試料が対象とする分析物を含有している場合には、インキュベーションの間に、この遊離分析物は、結合対パートナーとともに効果的にイニシエーターに結合した分析物と競合反応する。このようにして、イニシエーターが活性化されると、これは結合対パートナーとは反応していない、結合分析物を含有するイニシエーターはカスケード反応を自由に開始することになる。カスケード反応の速度はブロックされていない活性イニシエーターの量に比例するか、あるいは試料中に存在する分析物の量に直接的に比例する。このように、試料中の分析物が高レベルになるにつれ、カスケード反応は一層速く進行し、この逆もまた同様である。また、イニシエーターにコンジュゲートした分析物の結合対パートナーを乾燥試薬中で使用する場合には、試料の分析物（もしこれが存在するなら）は結合対パートナーと反応し、これに結合し、よって立体化学的にイニシエーターに対する障害となり、活性化されたりトリガーされたときにイニシエーターがカスケード反応を開始するのを防ぐ。この態様においては、試料からの分析物の添加の後およびイニシエーターの活性化の後のカスケード反応の速度は、試料中に存在する分析物の量に反比例する。従ってこの場合、試料中の分析物のレベルが高いほどカスケード反応の速度は遅くなり、この逆も同様である。除去メカニズム：除去アッセイを採用する場合、典型的には、固相支持体に結合した分析物の結合対パートナーが用いられる。例えば、結合対パートナーは、反応スライド反応チャンバー内の表面、あるいは混合に用いられる磁性粒子、あるいは磁界が加えられたときに磁性粒子によって迅速に懸濁させることのできる非磁性粒子（例えばガラスビーズ）と共有結合的に結合することができる。このように、本発明で用いられる乾燥試薬系は、例えば結合抗体を、立体化学的アッセイ法における場合と同様、同じタイプの分析物と結合したイニシエーターと共に含有する。試料を、乾燥試薬を含有する反応スライドに加え、反応物をインキュベートした後、液体反応溶液を固相支持体から分離し、カスケード系の残存成分に添加してカスケード反応時間を測定する。対象とする試料が遊離分析物を含有していない場合には、分析物に結合したイニシエーターは、インキュベーションの間に、表面に付着したその結合対パートナーと反応する。固相支持体から液体を分離し、この液体をカスケード反応系の残存成分に添加した後、カスケード反応は大幅に減じるかあるいは停止したようにさえ見えるが、これは分析物と結合したイニシエーターが固相支持体と結合した抗体によって捕捉されるためである。しかしながら、対象とする試料が遊離分析物を含有している場合には、遊離分析物は、結合抗体を有する反応において、イニシエーターにコンジュゲートした分析物と効果的に競合する。このように、液体が固相支持体から分離され、カスケードの残存成分に加えられると、カスケード反応は液体中に存在するイニシエーターの量に比例した速度で進行するか、あるいはもとの試料中の遊離分析物のレベルに直接比例した速度で進行する。反応スライド技法によって固相支持体から液体を分離する方法には多くのものがあることに留意されたい。典型的には、液体の移動は、バルブや通気口を開口したときの毛細管現象によって、あるいは反応チャンバーの柔軟性のある上部に置かれたピストンの圧力で物理的に、またあるいは圧力源や真空源に接続された抜け口を移動させて反応スライド上の適切な抜け口と接触するようにした結果得られる圧力ポンプ効果や真空ポンプ効果を利用して行われる。これらの方法の幾つかは本明細書中に記載される。他のものは米国特許第４，８４９，３４０号中に記載されている。適切なタイミングで磁界を加えて第二の反応チャンバーへ液体が輸送されるまでの間この磁界を保ちつづけることによって、第一のチャンバー中の磁性粒子が第二の反応チャンバー中へ輸送される液体とともに運ばれて移動することを防ぐことができる。低分子量分析物の検出のための除去メカニズムの利用に関する別の態様においては、分析物レプリカは直接またはリンカー分子を介して固相支持体およびイニシエーターに結合した結合対パートナーに付着する。この態様においては、分析物はイニシエーターと結合したパートナーコンジュゲートに結合し、コンジュゲートを溶液中に残存させ、これによってコンジュゲートが固相支持体に付着した分析物に結合することを防ぐ。このように、液体が固相支持体から分離されてカスケードの残存成分に加えられると、カスケード反応は液体中に存在するイニシエーターの量に比例するか、あるいはもとの試料中の試料分析物のレベルに直接比例する速度で進行する。除去メカニズムの他の実施方法は、液体吸収モジュール（ＬＡＭ）を用いることによって反応チャンバー中の液体を分離する方法である。これは、吸収部材を反応チャンバーの通気口と接触させるものである。（米国特許第４，８４９，３４０号参照）。反応チャンバーからの液体の抽出の後、任意に洗浄工程を行うことができる。この洗浄工程は、付加的カスケード成分を最終工程で添加した後、反応チャンバー内のコンジュゲートを含有する結合したイニシエーターによってトリガーしうる手段によって行うのが有利であり、このときにカスケード反応が開始される。しかしながら、この方法は通常より多くの工程を経るものであり好ましくない。本発明方法においては、結合対反応の一メンバーに結合したイニシエーター成分を律速成分とするために、全てのカスケード成分が過剰量存在しなければならない。例えば、ヒトの血液凝固カスケードが系の基本に選択された場合には、例えば酵素、コファクター、基質、アクチベーター等の付加的なカスケード成分は全て大過剰量存在しなければならず、これによって試料に由来するこれらの同じ成分の欠陥が反応に影響を与えるのを防ぐ。さらに、試料中に存在する可能性のある天然の阻害剤は、乾燥試薬調製物中に含有される成分によって中和される。あるいは、天然の阻害剤は、アッセイを行う前に全試料を一定の希釈率で希釈することによって効果的に中和できる。しかしながら、この方法は追加の工程を要するものであるとともに希釈率と同じだけ分析物の検出感度を低下させる。カスケード系の第一の成分はイニシエーターと呼ばれるが、試料中に遊離体として存在しないように選択されなければならない。例えばファクターＸａの前駆体であるファクターＸおよびトロンビンの前駆体であるプロトロンビンは、通常血液中に存在する。しかしながら、ファクターＸａもトロンビンも通常血液試料には存在しない。トロンビンまたはＸａが存在する場合には、それらは血液中の天然阻害剤に結合しているので不活性である。従って、ファクターＸａおよびトロンビンはどちらも、血液凝固カスケードシステムを利用する場合、本発明方法において好適に使用しうるイニシエーターである。反応試薬において、イニシエーターは結合対の一方にリンカーを介して化学的にコンジュゲートを形成するか、あるいは共有結合的に一方と連結してそのコンジュゲート体を形成する。ある場合には、主に除去メカニズムを用いる場合、イニシエーターは長いリンカー（例えばビオチン−アビジンのような連結）と結合することにより、分析物や結合対パートナーから離れた所で保持される。それ以外の場合には、イニシエーターは分析物や結合対パートナーと近接して保持されるであろう。いずれの場合においても、コンジュゲート体が用いられる。結合対反応におけるこのコンジュゲートの反応の範囲は、立体化学メカニズムまたは除去メカニズムのいずれかによってカスケード反応へと伝達され、本アッセイの測定を可能とする。さらに、本発明においては、このコンジュゲートは磁性粒子を含有する固相化学組成物中に含有されるが、この磁性粒子は当該組成物全体中に実質的に均一に混合されていることが好ましい。場合によっては、分析物と結合パートナーを同じ固相化学分析の相で分離して、試料の添加前に相互作用が起きることを避けることが望ましいかもしれない。これらの場合において、分析物と結合パートナーは、反応チャンバー内で物理的に分離されてもよい。しかし、場合によっては分析物レプリカとその結合パートナーを固相化学分析の様式に転換する前に、意図的に反応させることが望ましいこともあろう。これによってもなお、アッセイの実行中に試料中の分析物によるレプリカの置換が可能であって、かつ、反応時間が長くなりまたおそらく対流混合を十分に行うことが必要とはなろうが、非分析物である物質種による非特異的結合を減少させるかもしれない。また、この固相化学分析の組成には、バッファー類が含有されていてもよく、前記のようにカスケードシステムの他の成分が含有されていてもよい。イニシエーターとそのコンジュゲート結合対メンバーは多くの方法でアッセイ系に利用できる。好ましい態様においては、トリガーされうるイニシエーターが用いられる。トリガーされうるイニシエーターは、通常は試料中に存在しないが、反応試薬中に不活性な形で含有され、例えば熱パルスまたは熱ステップ機能、光子（光エネルギー、即ち可視光線、紫外線、赤外線）パルスや光子ステップ機能、電気的エネルギー、音波エネルギー、またはその他のエネルギーなどのエネルギーが与えられると活性化され、一定のインキュベート時間ののちにはイニシエーターを活性にするものである。トリガーされうるイニシエーターの使用によって、アフィニティ反応のカスケード反応からの分離を一層向上させることができ、これらの反応を連続的に行うことができるという効果が得られる。本発明においては、トリガーされうるイニシエーターは、例えば使用されるカスケードシステムの成分から選択される変性酵素であってもよい。この変性酵素はカスケードシステムの上流か下流に位置するであろう。一態様においては、トリガーされうるイニシエーターはアッセイ結合対の一方に付着している。インキュベーションによって結合対のメンバーを相互に反応させた後、イニシエーターはカスケードの開始点となり、イニシエーターの「引き金」を引きカスケード反応を開始する。この開始点はカスケード反応におけるどのような酵素でもよい。別の態様においては、結合対の一方に結合している酵素はプロトロンビンなどのチモーゲンであるが、これは、カスケード反応を引き起こすためにはカスケード中におけるすぐ上の酵素を必要とする。この態様では、トリガーされうるイニシエーターは、カスケード中の結合対の一方に結合したチモーゲンより上の酵素であればどれでもよい。この場合も、イニシエーターの「引き金」により、カスケード中の活性酵素へと転換することによってカスケード反応が開始される。好適なトリガーされうるイニシエーターとしては、ｐＨを非常に狭い範囲で変えながら活性化される酵素を挙げることができる（ＭａｈｌｅｒおよびＣｏｒｄｅｓ，ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＨａｒｐｅｒａｎｄＲｏｗ，ニューヨーク，１９６６年，第２６３−２６７頁参照）。また、酵素は一般に、その酵素反応において最適ｐＨと最適温度を示す（ＭａｈｌｅｒおよびＣｏｒｄｅｓ，第２６３−２７７頁参照）。基質結合の熱力学上の変化が酵素の野性型および人工の突然変異体に起こしうる。酵素反応のアレーニウス曲線においては極端な屈曲がしばしば見られるが、これは酵素と溶媒の相互反応の律速段階や総特性における温度の変化からもたらされることがある。突然変異は、酵素溶媒シェルや局所的な構造によってエネルギー面での変化をもたらすこともある（Ｗｅｌｌｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１年，３０，第５１５１−５１５６頁）。酵素は、ある閾値を超えて温度が上昇すると非常に活性が高くなることがある。この閾値より下では、酵素は非常に活性が弱く、基質分子を殆ど意義ある速度では反応させることができない。酵素の化学修飾によって得られる形態のものは、一定の波長の十分な強度の光に暴露された時、その化学修飾基が開裂することによって活性化（あるいは不活化）することが知られている（Ｐｏｒｔｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８９年，１１１，第７６１６頁；Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０年，２９，第４８７１および８０４２頁；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９０年，５１，第３７−４３頁；さらにＰｏｒｔｅｒら，米国特許第５，１１４，８５１号参照）。しかしながら、そのような化学的に修飾された酵素を使用すると、反応媒体に分解生成物を混入させ、本発明のカスケード反応やカスケード時間の測定を干渉する場合がある。化学試薬の添加や、あるｐＨによって活性化されたり、不活化される酵素も知られている。しかし、これらはあまり役に立たず、またトリガー方式よりも実際的でない。なぜならこれらは付加的な化学的構成成分を必要とし、それが結合対反応や分析物の測定に影響を与えるとともに、付加的な反応工程を必要とするからである（Ｂｌａｋｅら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８４年，３０／９，第１４５２−１４５６頁；Ｓｉｄｄｉｇｉら，米国特許第４，９６０，６９３号；トヨマキら，米国特許第４，９８５，３５４号；エノモト，米国特許第５，０９３，２３７号；及びＨａｌｌら，ヨーロッパ特許出願第０，１２３，２６５号参照）。本発明のトリガーされうるイニシエーターに基づくシステムにおいては、試料および試薬の結合対メンバーは、当該試料が乾燥試薬に添加された後、インキュベーションの最初の時期には自由に相互反応する。この時、強制対流混合を行うことができる。これは磁性粒子を振動させたり回転移動させることによって行うのが好ましい。これにより、イニシエーターの「引き金」を引くことによってカスケード反応が始まるまで結合対反応が進行し、必要であれば近似的に平衡状態に至らせることができる。ある一定の時点に至ったとき、試験装置によって自動的にこの「引き金を引く」プロセスを行うことができる。他の態様では「引き金を引かない」方式でこのイニシエーターを用いる。この場合、２工程あるいは２−コンパーメントアッセイとなる。好ましくは磁性粒子を振動させたり回転させることにより一定時間強制的に対流混合を行いながら試料とイニシエーター−結合対−メンバー−コンジュゲートをインキュベートした後、反応混合物は毛細管運動やポンプ動作によって第二チャンバーに送られるが、そこには凝固カスケードシステムの残存成分が磁性粒子とともに乾燥状態で存在する。この磁性粒子は基本的には残存成分と均一に混合されていることが好ましい。必ずしも必要とされないが、第一のチャンバー中で混合するのに使用される磁性粒子は当該チャンバー中で磁力保持され、装置の操作によって試料のみが第二のチャンバーに移動するようにされるのが好ましい。第一のチャンバー内に存在するヘパリン等の阻害剤は、イニシエーターがカスケード反応を開始するのを防ぐ。第一のチャンバーからの阻害剤は第二のチャンバー内で中和される。例えば、ヘパリンはポリブレンやプロタミンで中和される。次いで磁性粒子は、振動磁界あるいは回転磁界および光検出器を用いて調べられる。光検出器は好ましくは発光ダイオード源、より好ましくは９００ナノメーターの光を発するダイオード源とともに用いる。凝固反応が進行し、ゲルの形成で終わる。フィブリン凝固形成に関連する曲線における凝固時間その他の特徴は、終点または動的速度の測定に用いることができる。凝固時間としては、振動系において振動のピークに達するまでの時間が採用される。血液凝固時間を求めるために磁性粒子を用いる場合、米国特許第４，８４９，３４０号および第５，１１０，７２７号（Ｏｂｅｒｈａｒｄｔ）に記載された方法にしたがって実施することができる。これらのうち、磁性粒子振動を調べることによって凝固時間を測定すること、およびこのような測定を行うための装置に関連する部分をここに参照して援用する。高度に対流的な場における凝固時間は、回転磁界によって駆動される円形移動システムにおける反射率測定での反応ベースラインからの「リフト−オフ」として測定するのが好ましい。この場合、磁性粒子は、凝固時間の終点に近づくにつれて凝集する傾向を示す。「引き金を引いて」開始させることのできるシステムにおいては、全ての成分は、磁性粒子を含有する単一の反応チャンバー内の固相化学混合物中に置くことが好ましい。これは好ましい態様であるとともに、測定と全ての反応が同一のチャンバー内で起こるため最も簡単なシステムでもある。前の場合と同様、凝固は凝固時間として読み取れる。他の態様として、凝固時間の代わりに溶解発生時間を用いることもできる（Ｏｂｅｒｈａｒｄｔら，ＤｒｙＲｅａｇｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＲａｐｉｄ，ＣｏｎｖｅｎｉｅｎｔＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄＦｉｂｒｉｏｌｙｓｉｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７，第５２０−５２６頁，１９９１年）。しかしながら、溶解に基づくシステムはカスケードが十分増幅されないため感度が低い。分析物濃度を決定するために、凝固時間または溶解開始時間を標準曲線から濃度について読み取る。これは装置で自動的に行うことができるであろう。低分子量種のアッセイ態様について、約３２４ダルトンの心臓薬であるキニジン（quinidine）についてのアッセイの例を以下に記載する。ファクターＸａの熱活性化可能な突然変異体をイニシエーターとして選択し、これを対象とする分析物であるキニジンに結合する。キニジンをＸａ突然変異体分子と結合するが、この結合は、キニジン特異抗体とのインキュベーションにおいて、抗体とキニジンとの結合が立体化学的にＸａ突然変異体の活性部位と干渉するような結合である。そうでないときにはこの酵素はなんら影響を受けないままであった。反応スライドを調製する。これには上記のＸａ突然変異体−キニジンコンジュゲート、所定量の抗キニジン抗体、過剰量のプロトロンビン、フィブリノーゲン、リン脂質、並びにファクターＶ、Ｖａおよび血小板因子３に対する過剰量の阻害剤（抗体）を、バッファーとしてのＨＥＰＥＳまたはＯＷＲＥＮＳ、および磁性粒子としての磁鉄鉱と組み合わせて含有させた。この混合物を反応スライドの反応容積部（あるいはチャンバー）に加え、凍結乾燥して固相化学分析用反応スライドを調製した。キニジンのアッセイを行うため、反応スライドを装置内に置き、自動的に操作温度に至らしめる。このアッセイ系では典型的には３７℃である。血液を一滴反応スライドと試料ウェルに加える。血液は試薬中に入っていきこれを溶解する。磁性粒子に振動磁界を加えて運動させ、対流によって反応物を混合する。この間、抗キニジン抗体をＸａ突然変異体−キニジンコンジュゲート上のキニジンと試料中に存在するであろうキニジンに結合させる。所定量の抗体は、反応が所定のインキュベーション時間続く間、コンジュゲートと試料中のキニジンとの間で分配される。インキュベーション時間の終わりに、温度の設定点を急速に毎分８℃ で、Ｘａ突然変異体の形態が変わり活性となるレベルまで上昇させる。この時点でＸａ酵素はプロトロンビンをトロンビンに変換しはじめるが、その変換率は活性Ｘａ酵素の濃度に比例する。抗体で立体化学的に不活化されたＸａ酵素はプロトロンビンをトロンビンに変換しないか、または、変換しても極度に低いか無視できる変換率である。従って、抗体と反応しなかったＸａ−キニジンコンジュゲートの濃度は、プロトロンビンからトロンビンへの変換率を決定する。生成したトロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、化学信号をさらに増幅する。フィブリンの形成が臨界段階に至れば、凝固（クロット）ないし終点を、磁性粒子の運動の変化によって検出する。熱的にトリガーしてからの凝固終点までの経過時間が凝固時間である。凝固時間はこのように試料中のキニジンに比例する。試料中の実際のキニジン濃度は、反応スライド中の該当ロットに対して測定装置中に記憶された標準曲線から自動的に読み取ることができる。この値は、もし必要ならば血液細胞によって占められる反応容積のフラクションに対して補正することにより、血漿キニジン濃度に変換することができる。全細胞容積に対する補正係数は、血液中では典型的にはヘマトクリットと等価であり、これを装置のコンピュータメモリに記憶させるか、あるいは簡単なチャートでこの変換を行う。ＩＩ．高分子量種（＞２０００ダルトン）および細胞エレメントのアッセイ：高分子量の分析物、ポリヌクレオチド、リポプロテイン、および細胞のアッセイに対しては、さらに別の態様が使用される。これは酵素−結合対コンジュゲートを、分析物の二つの結合対パートナーを用いたシステム（即ち抗体、レセプター、または相補的ポリヌクレオチド）中で用いるものであり、このシステム中では結合対パートナーの一つがイニシエーターにコンジュゲートしているがどの表面にも付着しておらず、他方はイニシエーターにコンジュゲートしているが、表面に付着している。分析物の二つの結合対パートナーの各々は分析物の異なる領域に結合し、双方とも同時に分析物に結合できる。この態様は除去性およびトリガーに基づくものである。このシステムにおいては、第一の結合対パートナーは固相支持体に共有結合的に結合する。この支持体は反応スライドの基材であることもできる一方、磁性粒子であってもよい。この磁性粒子はその後運動を与えられて反応チャンバー内に対流を起こす。第一の結合対パートナーは過剰量用いられ、分析物の分子または細胞の一以上の領域に結合する。第二の結合対パートナーは分析物の分子または細胞のこれと異なった領域に結合する。この第二の結合対パートナーは、コンジュゲーション酵素の形態でトリガー可能なイニシエーターにコンジュゲートされる。この酵素は、上記のように第二の反応チャンバー内でエネルギーによって活性化される。血液凝固カスケードシステム中のフィブリノーゲン、カルシウム、プロトロンビンなどのカスケード成分およびその他の成分は、第二のチャンバー内、Ｆｅ₃Ｏ₄などの磁性粒子を含有する乾燥試薬中に存在する。第一のチャンバー内における所定のインキュベーション時間の後、開口部のカバーまたはバルブを開放し、液体を第二のチャンバー内に通す。第一のチャンバーが試料ウェルであれば、第二のチャンバーは実際には最初のかつ唯一の毛細管チャンバーである。液体が毛細管チャンバーに流入するとき、第一のチャンバー内の磁性粒子は液体とともに流出せず、永久磁石または直流電磁場によって静的に保持される。従って、未結合の第二の結合対パートナー分子だけが毛細管チャンバーに入る。この結合対パートナーはイニシエーターにコンジュゲートされるか、または血液凝固カスケードの場合には、ファクターＸａなどの凝固酵素にコンジュゲートされる。この凝固酵素はトリガーされるまで不活性のままである。次いで、熱や紫外線などのエネルギーを与えることによって酵素をトリガーし、凝固カスケードを開始させる。このように、凝固時間は活性化されたイニシエーターの残存遊離物濃度に逆比例し、よって分析物濃度に直接比例する。その後、得られた凝固時間を用いて、標準曲線から分析物濃度を読み取る。高分子量種を用いた態様を、アテローム性動脈硬化症に関連するラージリポプロテイン分子であるアポリポプロテインＢ−１００と、急性心筋梗塞のマーカーであるＣＫＭＢに対するアッセイの例によって以下に記載する。アポリポプロテインＢアッセイ：第一のチャンバーからの液体が装置からの指令によって第二のチャンバー内に移動できるように、バルブあるいは開口部カバーで連絡された二つのチャンバー固相反応スライドを調製した（このような反応スライドは米国特許第４，８４９，３４０号および５，１１０，７２７号（Ｏｂｅｒｈａｒｄｔ）に記載されており、既に参照して本明細書に援用されているものである）。第一のチャンバーは固相化学分析における固相混合物を含有し、これはアポリポプロテインＢ−１００（ＡｐｏＢ）分子の特定のエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体にコンジュゲートされた所定量のトロンビンと、このモノクローナル抗体によってトリガーされるものとは異なるＡｐｏＢ分子上の様々なエピトープに対して特異的でかつ共有結合的に結合されたポリクローナル抗体を含有する磁性粒子を含有する。トロンビンは化学的に不活性にされているが、紫外線照射で活性化できる。ポリクローナル抗体は過剰量存在し、磁性粒子の非常に大きい表面積上に分布する。第二のチャンバーはフィブリノーゲン、抗体非含有磁性粒子あるいはこの磁性粒子に結合した他の成分、およびＨＥＰＥＳなどのバッファーを含有する固相化学分析用試薬を含む。固相化学分析試薬を調製するために、各反応チャンバーを液体試薬混合物で満たし、反応スライド全体を凍結乾燥する。ＡｐｏＢのアッセイを行うにあたって、反応スライドを分析装置に置き、両チャンバーを自動的に３７℃の定温とする。次いで試料を試料ウェルに過剰量適用し、第一のチャンバーを満たして乾燥試薬を溶解する。回転磁界によって磁性粒子を駆動して対流混合させ、所定のインキュベーション時間継続して混合する。この間、粒子上の抗体は基本的に試料中の全てのＡｐｏＢに結合する。同時にトロンビン−抗体のコンジュゲートの一部は、存在するＡｐｏＢ分子の数に比例して選択的にＡｐｏＢに結合する。このようにＡｐｏＢは二重に結合する。所定のインキュベーション時間が終わったとき、開口部のカバーを持ち上げるかバルブを動かして、反応液を第二のチャンバーに移動させる。磁性粒子は第一のチャンバーの下方領域に直流電磁場をかけて保持する。遊離のトロンビン−抗体コンジュゲートを含有する液体は第二のチャンバーに移動し、第二の乾燥試薬を溶解する。第二チャンバー内の磁性粒子は所定の短い時間の間回転磁界によって対流様式で駆動し、次いで装置内のＵＶランプから、あるいは装置内のフラッシュ管からの連続フラッシュ光によって、紫外線光のステップ機能を反応スライドの第二のチャンバーに適用する。この時点でトロンビンは活性化され、フィブリノーゲンからフィブリンへの凝固カスケードの最終段階を開始する。移動する磁性粒子を光検出器とこれに接続された信号処理回路により、９００ｎｍでモニターする。粒子の運動の特徴によって凝固の終点を正確に決定することができる。ＵＶ照射から凝固の終点までの経過時間は試料中のＡｐｏＢ濃度に比例し、標準曲線から読み取れる。ＣＫＭＢアッセイ：第一のチャンバーからの液体が分析装置からの指令によって第二のチャンバー内に移動できるように、バルブあるいは開口部カバーで連絡された二つのチャンバー固相化学分析用試薬を含有する反応スライドを調製した。第一のチャンバーは固相化学分析における固相混合物を含有し、これは心筋タンパクＣＫＭＢの「Ｂ」領域に特異的な抗体を大過剰量含有する。この抗体は磁性酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）粒子に共有結合的に結合し、各粒子の表面積の多くの部分が抗体で覆われる。残る粒子表面は「ブロック」されるかあるいは受動的に中性化され結合反応には関与しない。ブロッキングは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、あるいはその他、対象とする反応に関与しないタンパクで残る粒子表面をコーティングすることによって行われる。ＣＫＭＢのＢ−領域に対する粒子と結合した抗体に加え、特定量のＭ−領域に対する第二抗体もまたコンジュゲートの形態で存在する。このコンジュゲートは、ラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ）に共有結合したＭ−領域に特異的な抗体からなる。ＲＶＶは凝固ファクターＸをＸａに転換する蛇毒である。この反応率はファクターＶの存在下で上昇する。試料はＣＫＭＢ（心筋タイプ）を含有するが、また干渉物質であるＣＫＭＭ（骨格筋タイプ）およびＣＫＢＢ（脳タイプ）をも含有する。ＣＫＭＭやＣＫＢＢ存在下でのＣＫＭＢのアッセイは以下の方法で行われる。試料を毛細管チャンバーである第一のチャンバーに導入する。試料は血漿、血清、または全血試料である。好ましくは、試料は、第一のチャンバーに適用する前にバッファーやコントロール用の血漿で希釈し、存在する凝固カスケード阻害剤を正規化する。試料が第一のチャンバーに導入されると試薬は溶解し、磁性粒子は１８００−３６００ＲＰＭの回転磁界中で自由に運動する。この結果、対流が起こり、ＣＫＭＢとＣＫＢＢとの粒子上のＢ−特異抗体への結合を向上させる。Ｍ−特異抗体とＲＶＶのコンジュゲートはＣＫＭＢに結合し、これは粒子に結合したＣＫＭＢに付着するとともに溶解したＣＫＭＭにも付着する。対流は所定期間続けられる。次いで開口部カバーを装置によって自動的に持ち上げるかバルブを開放すると、反応液の一部が第二のチャンバーに流入してこれを満たす。第二のチャンバーは第一のチャンバーより小さいことが好ましい。第一のチャンバー内の磁性粒子は回転磁界によって保持されるか、あるいは直流磁界をかけることによって第一の反応チャンバーの底に運ばれる。第二のチャンバーにおいて、反応液は凝固ファクターＸ、ファクターＶ、リン脂質、プロトロンビン、カルシウム、フィブリノーゲン、ＨＥＰＥＳやＯＷＲＥＮＳなどのバッファー、および磁性酸化鉄粒子を含有する乾燥試薬を迅速に溶解する。磁性酸化鉄粒子はコーティングされていなくてもよいが、ＢＳＡコーティングなどでブロックされていてもよい。磁性粒子は回転磁界または振動磁界で駆動されて運動する。運動している磁性粒子は９００ｎｍで発光ダイオードによって照らされ、光検出器でモニターされる。粒子の運動によって凝固の終点が正確に決定される。凝固時間は第二の反応チャンバーに流入する液体中に存在する抗体に結合したＲＶＶの濃度に反比例して変化する。この抗体とコンジュゲートしたＲＶＶは未結合の状態かあるいはＣＫＭＭ分子に結合した状態で存在するであろう。抗体とコンジュゲートしたＲＶＶで第二のチャンバーに流入しないものは、磁性粒子上の第一のＢ−領域に特異的な抗体によって捕捉されたＣＫＭＢ（ＣＫＢＢではない）に結合しているものである。従って、第二のチャンバー内で測定された凝固時間は、試料中のＣＫＭＢ濃度に直接関係することになる。ＣＫＭＢに対するアッセイの上記のタイプのものは、Ｘａ分子、または紫外線に暴露されるまでは酵素として機能しないＸａ分子を用いて行うこともできる。紫外線による引き金機構は、固相化学分析用試薬が溶解され十分混合された後、第二の反応チャンバーで作動されるとより高い精度と再現性を有するアッセイを提供できる。上記の二チャンバー式アッセイは、希釈された血清、血漿、全血などの希釈試料を用いて行われる。これはキニジンアッセイの例とは異なった手法であって、個々の患者の試料中の凝固因子における差を最小にすることができる。上記のアッセイにおいては、Ｘ、Ｖ、リン脂質、プロトロンビン、およびフィブリノーゲンなどの個々の凝固因子を用いる代わりに乾燥試薬としてプール血漿試料を利用できる。アテローム性動脈硬化症のスクリーニングなどにおいて、心筋梗塞などに関するテストを提供するアッセイパネルが望まれる場合には、異なる反応試薬を組み合わせて含有する反応エレメントを使用することがしばしば必要となる。これは反応エレメントを組み合わせるという大きな挑戦であり、異なる反応成分、異なる乾燥時間、固相化学分析の調製における異なる温度、などが必要となるであろう。パネルテストを行う一つの方法は、個々の反応スライド成分を、従来の独立した生産プロセスの仕様に従って個々に調製して処理し、後でそれらを再結合して組み合わせの形態として共通の試料ウェルにパネル中の全テストを開始させるものである。これは図１１Ａ、ＢおよびＣにおいて示されるようにして行われる。図１１Ａにおいて、反応スライド１１７、１１８、１１９および１２０は、接続部材１２１およびキャリアーカード１１２と容易に結合される。接続部材１２１が反応スライドと組み合わされた時の図を図１１Ｂに示す。試料ウェル（１）は接続部材１２１の上面に位置し、出口（図１１Ａで２０６、２０４、２０４’ および２０６’）は１２１の底面に位置して、反応スライド１１７、１１８、１１９及び１２０の上面とそれぞれ対応する試料入口１０１、１０２、１０３および１０４と連結する。出口は、接続部材１２１の底面を個々の反応スライド（１１７、１１８、１１９および１２０）の上面に結合することによって液密形態の入口と連結する。反応スライド部材はそれぞれキャリアカード１２２上のスロット（１２５、１２６、１２７および１２８）に個々に嵌合していてよく、超音波溶接、溶媒結合、接着剤などによって直接キャリアカードに搭載される。最終組立て体（１２４）は、同様にしてキャリアカード（１２２）に直接搭載された接続部材（１２１）を含んでいてもよい。図１１Ｃにおける最終形態においては、パネルを容易に作動できる。試料が試料ウェル２０１に添加されると、試料は（毛細管作用、圧力、真空、またはシリンジフィルで）導管２０２へと移動し、次いで導管２０３と２０３’に分岐してさらに出口２０４、２０４’、導管２０５、２０５’、および２０６、２０６’ と移動する。出口２０４と２０４’において、試料は入口１０２と１０３に入り、それぞれ反応スライド１１８と１１９上の導管１０６と１０７へと進み、それぞれの反応チャンバーである１１０および１１１を満たす。流れは通気口１１４と１１５（これらは、反応スライドを満たすための駆動力として毛細管作用を利用しない場合には、図示していない疎水性膜で覆われていても良い）で止まる。同様に、試料充填導管２０５および２０５’はそれぞれ出口２０６と２０６’へと進み、反応スライド１１７においては領域１０１、１０５および１０９を横切って１１３で止まり、また反応スライド１２０においては１０４、１０８および１１２を横切って１１６で停止する。凍結乾燥を応用した他の先行技術では、アッセイの化学成分を個々に処理し乾燥するのと同時にマルチテストやパネルを達成するのは困難であるかあるいは不可能であった（例えばＳｃｈｅｍｂｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３８／９，第１６６５−１６７０頁，１９９２年参照）。本発明を総体的に記述したが、以下に記載する特定の実施例を参照することによりより一層の理解が得られるであろう。但しここに掲載する実施例は、例示のためだけのものであってなんら本発明を限定するものではない。実施例１）カスケードの概念を示すために、プラスチックフィルムで反応スライドを作成した。これは１０×８×０．１７８ｍｍの長方形の毛細管スペースからなり、この毛細管スペースには８×３ｍｍの通気開口が一端に近接して設けられるとともに、一端が２ｍｍと細く形成されこの端部で直径６．５ｍｍの円形の試料ウェルと連通している９ｍｍのネック領域部が設けられている。基材は乳白色であってカバーとスペーサーは透明であった。基材とカバーは厚さが０．２５ｍｍであって、スペーサーは厚さが０．１７８ｍｍであった。空の反応スライドを装置内に置き、磁性粒子の一斉運動を測定した。測定は最高出力が９００ｎｍのＬＥＤ光源を用いて光拡散／反射によって９００ｎｍで行い、また光検出器と直流増幅器も使用した。振動磁界は、７００ガウスのＵ−字型アルニコ磁石を用いて発生させた。このＵ−字型磁石の二つの６．３５ｍｍの広さの極を反応スライドに対面させて使用した。磁石は直流モーターの軸に磁石中心のドリル孔を介して取り付けられ、その軸を回転中心として２４００ＲＰＭで回転した。極は反応スライド基材の５ｍｍ下方に位置させた。反応スライドの温度は電気線ヒーターを磁石と反応スライドの間に位置させることによって３７℃に保持した。この様な装置によって、血液凝固反応を測定することができる。なぜなら懸濁した磁性酸化鉄粒子の凝結およびフィブリンクロット中への取り込みによって光拡散と吸収の減少が進行し、その結果、カード基材からのバックグラウンド反射を増大させるからである。固相化学分析における反応スライドは、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ミリモルの塩化カルシウム、および０．１％の３４００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に、平均粒子径が０．３ミクロンのＦｅ₃Ｏ₄（磁鉄鉱）７ｍｇ／ｍｌの懸濁液を加えたものを、反応スライドの反応容積部に入れ、液体窒素で−１９５℃で凍結することにより調製した。このようにして得た反応スライドを凍結乾燥機に入れ、初期の棚温度を−４５℃に設定して凍結乾燥した。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、ジップロック（Ｚｉｐｌｏｃｋ）の小袋に乾燥剤とともに包装して使用時まで４℃で保存した。磁性粒子インタロゲーション・システムを使用した凝固カスケードシステムによって免疫的「先端部」なしで達成される感度を示すため、カスケード反応を以下のようにして試験した：ＯＷＲＥＮＳバッファーに溶解したトロンビン溶液３マイクロリットルを反応スライドのネック部に添加した。第二段階において２７マイクロリットルのウシフィブリノーゲン（７．３マイクロモル）を添加し、トロンビン溶液３マイクロリットル中に流した。反応チャンバーに液体が入った時点で磁性粒子を乾燥試薬から開放し、渦を巻かせ、十分混合した。トロンビン濃度によって時間は異なるが、暫くすると血漿中のフィブリノーゲンが凝固した。凝固の進行を前記のように光学的に測定し、終点を容易に決定できた。図７は、ウシトロンビン濃度に対する凝固時間をプロットしたものであり、１ナノモル／リットルという極微量のトロンビンが検出できることが示された。２）２段階カスケードを示すため、反応スライドを実施例１のようにして調製し、同じ分析装置を使用した。今回はファクターＸａの１００ミリモル塩化カルシウムとＯＷＲＥＮＳバッファーの溶液を使用した。この溶液３マイクロリットルを、反応スライドのネックにピペットで量り取った。第２段階において、再調製されたプール血漿２７マイクロリットルを加え、Ｘａ溶液３マイクロリットル中に流した。液体が反応チャンバーに入った時点で磁性粒子を試薬から開放し、対流を起こした。磁性粒子は、凝固の終点を測定する手段として前記のようにして用いた。図８ａおよび８ｂはファクターＸａ濃度に対する凝固時間をプロットしたものである。添加した血漿試料が全カスケード成分を十分な濃度で含有していれば、即ち、凍結乾燥した血漿が脂質（１：１５のウサギ脳セファリン、シグマケミカル社）と５マイクログラム／ｍｌのウシファクターＶ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社）で強化されていれば、感度はリットル当たりＸａ０．１ピコモルである。このシステムを用いて、下方の感度がリットル当たりＸａで約１ナノモルであるカスケード反応の標準曲線を作製することもできる。これは、幾つかのカスケード成分（例えばファクターＶ）の濃度を極小にすることによって行われ、これにより多くのイムノアッセイにおいて十分な固有感度を提供できるであろう。３）３段階カスケードを示すため、反応スライドを実施例１のようにして調製し、同じ分析装置を使用した。この実施例ではＯＷＲＥＮＳバッファーで希釈したラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ）溶液を用いた。この溶液３マイクロリットルを、反応スライドのネックにピペットで量り取った。第２段階において、再調製されたプール血漿２７マイクロリットルを脂質で１：１５に強化したものを加え、ＲＶＶ溶液３マイクロリットル中に流した。実施例１、２に記載のようにして凝固終点から標準曲線を得た。試料希釈曲線の最後の３点を別のグラフに示してあるが、これは脂質−強化血漿の新しいロットからのデータのためである。図９ａおよび９ｂより、本発明システムによって下方の感度がリットル当たり約２．５ピコモルであるカスケード反応の標準曲線を作製することができる。この感度は恐らく実施例２のように血漿にファクターＶを添加することによって改善することができるであろう。４）イニシエーターとして阻害された酵素を用いた例を示すため、ファクターＸａをα−メチル−２−ヒドロキシ−４−ジエチルアミノ桂皮酸（ＡＭＨＤＡＣ）で不活化した。この化合物の調製については、Ｐｏｒｔｅｒ及びＢｒｕｎｋｅ，ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，５１（１），３７−４３，１９９０年を参照されたい。阻害と光分解反応は以下のようにして行った：薄光または暗室中の赤色光で、２ミリグラムのＡＭＨＤＡＣを２ミリリットルのメチルアルコールに溶解した。この溶液の分割量１００マイクロリットルを、１００ミリモルの塩化カルシウムを含有する９００マイクロリットルのＴＲＩＳ／メチルアルコール（５０／５０）に添加した。この溶液の分割量２０２マイクロリットルを、１００ミリモルの塩化カルシウムを含有する２９８マイクロリットルのＴＲＩＳに添加した。この最終溶液を、等容量の、塩化カルシウム１００ミリモルを含有するＯＷＲＥＮＳバッファーに溶解したファクターＸａ（１．５×１０^-6モル）に添加した。最終溶液は酵素の阻害を確実にするために過剰量のＡＭＨＤＡＣを含有するものであった。反応のアッセイは暗条件下で３０−９０秒毎に反応スライドのネックを３マイクロリットルの混合物で満たし、次いで２７マイクロリットルの血漿を添加して行った。凝固時間が２５０秒を超えた場合に完全な阻害であるとした。再活性化には、この溶液３マイクロリットルを実施例１の反応スライドに置き、次いでプール血漿２７マイクロリットルを加えた。凝固反応は観察されなかった。テストカードを装置から外し、３６５ナノメーター、４ワット、一体フィルター付き長波長紫外線管（１１ｃｍ長）、最大強度６”で５４０マイクロワット／ｃｍ²の条件で、２秒間紫外線照射した。光は反応スライドの平坦な毛細管反応容積部を通して照射した。カードは直ぐに装置に戻し、凝固終点を１５秒後に測定した。このように、磁性粒子インタロゲーション・システムをカスケード反応システムと組み合わせて使用することによって感度を向上させ、さらにまた結合対アッセイやイムノアッセイにおけるカスケードシステムのための活性化可能なイニシエーターと組み合わせることによって、迅速で使用が容易なアッセイシステムを得ることができる。これを例えば医師の職場等で使用すると、患者が帰る前に結果を知ることができる。商業的に入手できる同様の感度を有するイムノアッセイが数時間を要するのに対し、本発明によれば典型的には３分以下で結果が得られる。加えて、本発明方法によって達成される感度は基本的にはあらゆる市販のイムノアッセイについて十分なものであり、他のタイプの結合対アッセイに関しても適切な範囲にあるものである。５）実施例１と同様にして反応スライドを調製した。ただし、Ｆｅ₃Ｏ₄、ＢＳＡ、およびＰＥＧの他に溶液を塩化カルシウム１０ミリモルおよびファクターＸａ３２ナノモルに調製した。反応スライドを実施例１と同様に処理し、次いで実施例１で用いた装置で試験した。試験においては、正常なクエン酸血漿試料を単に反応スライドの試料ウェルに反応容積部に満ちるまで過剰量添加しただけであった。得られた波形を図１０に示す。これから凝固時間は７０秒であることが判る。ｔ＝０は試料が添加されて試薬を溶解しはじめた点である。ｔ＝７０秒において、光信号が増大し、凝固終点に至ったことを示す。この応答は振動磁界や交流磁界で得られるものとは異なっており、後者においては光信号は凝固終点で減少する。上記の記述から本発明に対し多くの改変例や変形例が考えられることは明白である。よって添付の請求の範囲で、本発明をこの明細書中に明記した以外の仕方で実施することができるものであることが理解されなければならない。

Claims

【特許請求の範囲】１．アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分析物の存在を調べるためのアッセイ対象試料を、反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートし、分析物、当該分析物と反応可能な結合対パートナー、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させ、反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成し； − 当該アッセイ混合物をインキュベートし； − 振動磁界または運動する静磁界である磁界を当該アッセイ混合物に加え； − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ； − 磁性粒子の磁界に対する応答を光学的手段でモニターして時間とともに変化する光信号を得；さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによって決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。２．反応カスケードイニシエーターが、光または熱に暴露することによって活性化されるものである請求項１記載の方法。３．反応カスケードイニシエーターが、アッセイ混合物を反応チャンバーの第一の部分から反応チャンバーの第二の部分へと移動させることによって活性化され、当該第一の部分には一以上の阻害剤が存在してイニシエーターの活性化を防止し、当該第二の部分には一以上の中和剤が存在し、前記一以上の阻害剤を中和してイニシエーターを活性化するものである請求項１記載の方法。４．結合対パートナーが、遊離抗体または固相支持体に結合した抗体である請求項１記載の方法。５．固相支持体が反応スライドである請求項４記載の方法。６．固相支持体が磁性粒子である請求項４記載の方法。７．乾燥試薬が、イニシエーターによって反応が開始されたとき反応カスケードを完了するために必要な一以上のカスケード成分をさらに含有するものである請求項１記載の方法。８．一以上のカスケード成分が、反応カスケードにおいてイニシエーターの初期反応を律速段階とするのに十分な量存在する請求項７記載の方法。９．反応カスケードイニシエーターが、反応カスケードにおける酵素である請求項２記載の方法。１０．光学的手段が、光検出器および発光源を含む請求項１記載の方法。１１．発光源か９００ナノメーターの発光ダイオードである請求項１０記載の方法。１２．磁界が回転磁界または交流磁界である請求項１記載の方法。１３．磁界が交流磁界である請求項１２記載の方法。１４．磁界が回転磁界である請求項１２記載の方法。１５．反応カスケードが、ヒト血液凝固カスケード、ウシ血液凝固カスケード、ブタ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、補体カスケード、溶解カスケード、カブトガニ血リンパカスケード、及び昆虫血カスケードからなる群より選ばれるものである請求項１記載の方法。１６．請求項１記載のアフィニティアッセイを実施するためのキットであって、 − 反応チャンバーを有する反応スライド；および − 当該反応チャンバー中において、反応カスケードイニシエーターに結合したアッセイされるべき分析物、当該分析物と反応可能な結合対パートナー、磁性粒子、磁界生成手段、および光学的手段を含有する乾燥試薬を含有するキット。１７．一以上のカスケード成分が、プール血漿試料として提供されるものである請求項７記載の方法。１８．分析物がキニジンであり、イニシエーターが血液凝固カスケードのファクターＸａであり、磁性粒子が磁鉄鉱であり、抗体が抗キニジン抗体であり、一以上のカスケード成分がプロトロンビン、フィブリノーゲン、またはリン脂質であり、乾燥試薬が血液凝固カスケードのファクターＶ、Ｖａ、および血小板因子３に対する阻害剤並びにバッファーをさらに含有する請求項７記載の方法。１９．アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分子量が＞２０００ダルトンで２以上の結合領域を有する分析物の存在を調べるためのアッセイ対象試料を、当該分析物の第一の結合領域と反応性を有し、固相支持体に結合している第一の結合対パートナー、および当該分析物の第二の結合領域と反応性を有し、反応カスケードイニシエーターに結合している第二の結合対パートナーを含有する第一の乾燥試薬に接触させ、第一の反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成し； − 当該アッセイ混合物をインキュベートし； − インキュベートされたアッセイ混合物を、磁性粒子および開始によりカスケード反応を完了するために有効な量の一以上の付加的カスケード成分を含有する第二の乾燥試薬を含有する第二の反応チャンバーに移し； − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ； − 磁性粒子の、振動磁界または運動する静磁界に対する応答を光学的手段でモニターして時間とともに変化する光信号を得；さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによって決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。２０．分析物がアポリポプロテインＢであり、第一の結合対パートナーがアポリポプロテインＢの第一のエピトープに特異的なポリクローナル抗体であり、イニシエーターがトロンビンであり、イニシエーターに結合した第二の抗体がアポリポプロテインＢの第二のエピトープに特異的なモノクローナル抗体であり、固相支持体が磁性粒子であり、付加的なカスケード成分がフィブリノーゲンであり；第二の乾燥試薬がさらにバッファーを含有し、第一の乾燥試薬の固相支持体が、第一の反応チャンバー内において、第二の反応チャンバーへと移動される直前に磁界を加えることによって保持されるものである請求項１９記載の方法。２１．分析物がＣＫＭＢであり、第一の結合対パートナーがＣＫＭＢの「Ｂ」領域エピトープに特異的な抗体であり、固相支持体が磁性粒子であり、イニシエーターがラッセルクサリヘビ毒であり、第二の結合対パートナーがＣＫＭＢの「Ｍ」領域エピトープに特異的な抗体であり；第二の乾燥試薬の一以上の付加的カスケード成分が、凝固ファクターＸ、ファクターＶ、リン脂質、プロトロンビン、カルシウム、およびフィブリノーゲンであり、第二の乾燥試薬がさらにバッファーを含有し；第一の乾燥試薬の固相支持体が、第一の反応チャンバー内において、第二の反応チャンバーへと移動される直前に磁界を加えることによって保持されるものである請求項１９記載の方法。２２．イニシエーター活性化段階が、反応カスケードイニシエーターを紫外線光で照射することを含む請求項１９記載の方法。２３．一以上の付加的なカスケード成分がプール血漿試料として提供されるものである請求項１９記載の方法。２４．結合対パートナーがレセプター分子である請求項１記載の方法。２５．結合対パートナーが遊離レセプター分子である請求項２４記載の方法。２６．結合対パートナーが表面に結合されたレセプター分子である請求項２４記載の方法。２７．結合対パートナーがリガンドである請求項１記載の方法。２８．結合対パートナーが抗体または抗原である請求項１６記載のアフィニティアッセイを実施するためのキット。２９．結合対パートナーがレセプターまたはリガンドである請求項１６記載のアフィニティアッセイを実施するためのキット。３０．分析物が抗原であり、第一の結合対パートナーがポリクローナル抗体であり、第二の結合対パートナーがモノクローナル抗体である請求項１９記載の方法。３１．分析物がリドカインである請求項１８記載の方法。３２．乾燥試薬が、さらに血液凝固カスケードにおける過剰量のファクターＶおよびＶａと、過剰量の血小板因子３を含有し、付加された阻害剤を含有しないものである請求項１８記載の方法。３３．反応カスケードが哺乳類血液凝固カスケードである請求項１記載の方法。３４．請求項１９記載のアフィニティアッセイを実施するためのキットであって、 − 二つの反応チャンバーを有する反応スライド、 − 反応チャンバーの各々の中に含有され、磁性粒子を含む乾燥試薬：および − 磁界生成手段と光学的手段を含むキット。３５．光学的手段が、近赤外線領域の照射手段および検出手段を含む請求項１６記載のキット。３６．光学的手段が、さらにイニシエーターを活性化するための紫外線光源を含むものである請求項３５記載のキット。３７．光学的手段が、近赤外線領域の照射手段および検出手段を含む請求項３４記載のキット。３８．光学的手段が、さらにイニシエーターを活性化するための紫外線光源を含むものである請求項３７記載のキット。３９．分析物が反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートされておらず、結合対パートナーが反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートされ、分析物と結合対パートナーとの結合が立体化学的にイニシエーター分子機能と連結するようにされたものである請求項１記載の方法。４０．乾燥試薬がジゴキシン−ラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートを含有する請求項７記載の方法。４１．乾燥試薬がリドカイン−トロンビンのコンジュゲートを含有する請求項７記載の方法。４２．乾燥試薬がファクターＩＸａコンジュゲートを含有する請求項７記載の方法。４３．乾燥試薬がファクターＩＸａコンジュゲートを含有する請求項１９記載の方法。４４．アフィニティアッセイを実施するための診断システムであって、ａ）１）分析すべき試料を適用する試料ウェル、２）当該試料ウェルと液通して連結している反応チャンバー、３）磁性粒子と、反応チャンバー内に置かれた固相化学分析アフィニティ試薬および凝固カスケード試薬を含有する反応スライド、ｂ）回転磁界を生成する手段、ｃ）照射手段と検出手段を含む光学的検出システム、ｄ）光学的検出システムからの信号を増幅および処理して試料中の分析物の濃度を決定する手段、を含み、信号が回転磁界中の磁性粒子の応答を表すものである診断システム。４５．反応スライドの試料ウエルが反応チャンバーの並列アレーに液通しており、反応チャンバーの各々が異なった固相化学組成物を含有し；各々が分離した反応容量部のために設けられた複数の回転磁界を生成する手段と；各々が分離した反応容量部のために設けられた複数の光学検出システムと；試料中の多数の分析物を分析するための増幅および信号処理手段とを有している請求項４４記載の診断システム。４６．反応チャンバーに紫外線の供給手段をも含む請求項４４記載の診断システム。４７．反応チャンバーが、アフィニティ反応を行なうための第１チャンバー、凝固カスケード反応を行なうための隣接した第２チャンバー、第１チャンバーから隣接第２チャンバーに液体を移送する手段、各チャンバー内の磁性粒子、および各チャンバーのための回転磁界とを有する請求項４４記載の診断システム。４８．分析物が小分子である請求項１記載の方法。４９．分析物が抗不整脈薬である請求項１記載の方法。５０．分析物が、大分子、細胞、細胞断片およびウイルスから成る群より選択されるものである請求項１９記載の方法。５１．分析物がハプテンである請求項１記載の方法。５２．分析物がアポリポプロテインである請求項１９記載の方法。５３．分析物がペプチドである請求項１記載の方法。５４．分析物が小さいポリペプチドである請求項１記載の方法。５５．分析物がタンパクである請求項１９記載の方法。５６．分析物が、リポプロテイン、アポリポプロテイン、ホルモン、酵素、インテグリン、成長因子、サイトカイン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、アネクシン、コラーゲン、細胞骨格成分、細胞表面分子、細胞表面レセプター、およびポリヌクレオチドから成る群より選択される請求項１９記載の方法。５７．アフィニティアッセイがイムノアッセイであり、分析物が細胞表面抗原である請求項１記載の方法。５８．アフィニティアッセイがイムノアッセイである請求項１記載の方法。５９．アフィニティ反応を行なう第１チャンバーの並列アレー、各第１チャンバーからそれに隣接する凝固カスケード反応を行なうための第２チャンバーに液体を移送する手段、各チャンバー内の磁性粒子、および各チャンバーのための回転磁界と含み、試料中の多数の分析物を分析できるようにした請求項４５記載の診断システム。６０．アテローム硬化症のリスクを評価するために、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＡ−１およびＡｐｏ（ａ）から成るアポリポプロテインイムノアッセイパネルを含んでいる請求項６０記載の診断システム。６１．急性心筋梗塞の確認のために、ＣＫＭＢ、トロポニンＴ、ミオグロビン、線維素ペプチドＡおよび線維素から成るイムノアッセイパネルを含んでいる請求項６０記載の診断システム。６２．乾燥試薬がトロンビンコンジュゲートを含有するものである請求項１記載の方法。６３．乾燥試薬がファクターＸａコンジュゲートを含有するものである請求項１記載の方法。６４．乾燥試薬がファクターＩＸａコンジュゲートを含有するものである請求項１記載の方法。６５．乾燥試薬がラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートを含有するものである請求項１記載の方法。６６．乾燥試薬がトロンビンコンジュゲートを含有するものである請求項１９記載の方法。６７．乾燥試薬がラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートまたはファクターＩＸａコンジュゲートを含有するものである請求項１９記載の方法。６８．乾燥試薬がファクターＸａのコンジュゲートを含有するものである請求項１９記載の方法。６９．温度制御のための加熱手段、および反応スライドと試料を認識するための手段とを更に含む請求項４４記載の診断システム。７０．更に、反応チャンバーに通気口含み、この通気口が疎水性膜で覆われており、通気口を真空にして試料を試料ウエルから反応チャンバーに移動させるための移動力を提供する手段を含む請求項４４記載の診断システム。７１．更に、入口を試料ウエル内に、通気口を反応チャンバーに含み、この通気口が疎水性膜で覆われており、入口に圧力を加えて試料を試料ウエルから反応チャンバーに移動させるための移動力を提供する手段を含む請求項４４記載の診断システム。７２．更に、ルアー・アダプターを取り付けた入口を試料ウエル内に、通気口を反応チャンバーに含み、この通気口が疎水性膜で覆われており、液体試料に圧力を加えて試料を試料ウエルから反応チャンバーに移動させるための移動力を提供するルアー・アダプターに結合されたシリンジ手段を含む請求項４４記載の診断システム。７３．アフィニティアッセイを実施するための診断システムであって、ａ）１）分析すべき試料を適用する試料ウェル、２）当該試料ウェルと液通して連結している複数の反応チャンバー、３）磁性粒子と共に反応チャンバーの各々に加えられる、アフィニティ試薬、酵素試薬、および凝固カスケード試薬からなる群より選ばれる一以上の固相化学分析試薬、を含有する反応パネルテストカード、ｂ）回転磁界を生成する手段、ｃ）照射手段と検出手段を含む光学的検出システム、ｄ）光学的検出システムからの信号を増幅および処理して試料中の分析物の濃度を決定する手段、を含み、信号が回転磁界中の磁性粒子の応答を表すものである診断システム。７４．アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分析物の存在を調べるためのアッセイ対象試料を、反応カスケードのチモーゲンにコンジュゲートした分析物、当該分析物と反応可能な結合対パートナー、反応カスケードイニシエーター、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させ、反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成し； − 当該アッセイ混合物をインキュベートし； − 振動磁界または運動する静磁界である磁界を当該アッセイ混合物に加え； − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ； − 磁性粒子の磁界に対する応答を光学的手段でモニターして時間とともに変化する光信号を得；さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによって決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。７５．反応カスケードイニシエーターが、反応カスケードにおいて分析物に結合するチモーゲンよりも高いトリガー可能な酵素である請求項７５記載の方法。７６．反応カスケードイニシエーターが光または熱に暴露することによって活性化されるものである請求項７５記載の方法。７７．結合対パートナーが遊離抗体または固体支持体に結合した抗体である請求項７５記載の方法。７８．固相支持体が反応スライドである請求項７８記載の方法。７９．固相支持体が磁性粒子である請求項７８記載の方法。８０．乾燥試薬が、イニシエーターによって開始された反応カスケードを完了させるために必要な一種以上のカスケード成分を更に含有している請求項７５記載の方法。８１．一種以上のカスケード成分が、反応カスケードにおいてイニシエーターの初期反応を律速段階とするのに十分な量存在する請求項８１記載の方法。８２．光学的手段が、光検出器および発光源を含む請求項７５記載の方法。８３．発光源が９００ナノメーターの発光ダイオードである請求項８３記載の方法。８４．磁界が回転磁界または交流磁界である請求項７５記載の方法。８５．磁界が交流磁界である請求項８５記載の方法。８６．磁界が回転磁界である請求項８５記載の方法。８７．反応カスケードが、ヒト血液凝固カスケード、ウシ血液凝固カスケード、ブタ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、補体カスケード、溶解カスケード、カブトガニ血リンパカスケード、及び昆虫血カスケードからなる群より選ばれるものである請求項７５記載の方法。８８．更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含む請求項１記載の方法。８９．更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含む請求項１９記載の方法。９０．更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含む請求項７５記載の方法。９１．複数の反応チャンバーの各々の反応チャンバーを、パネルテストカード上への載置および試料ウエルとの結合の前に、異なる試薬処理条件におくようにした請求項７４記載のシステム。