CN107614458B

CN107614458B - 稳定的纳米磁性颗粒分散体

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Publication number: CN107614458B
Application number: CN201680031170.3A
Authority: CN
Inventors: D·高赫尔; H·张; J·兰森
Original assignee: Biolegend Inc
Current assignee: Biolegend Inc
Priority date: 2015-05-01
Filing date: 2016-04-30
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2036-04-30
Also published as: CA2984506A1; JP2018514794A; EP3288912A1; EP3288912A4; US11630104B2; US20160320376A1; IL255354B; JP6716683B2; US20230160884A1; CN107614458A; IL277137A; US10585088B2; IL277137B; IL255354A0; WO2016179053A1; US20200200746A1

Abstract

描述用于制备可用于体外和体内生物医学应用的新的、胶体稳定、涂覆型纳米磁性颗粒的方法和组合物，所述生物医学应用包括细胞靶向以及捕获细胞、微生物和细胞器或诸如外来体的实体。这些纳米磁性颗粒由于其尺寸小且磁矩高而可用作成像造影剂。所述纳米磁性颗粒包括提供到纳米尺寸磁性晶体簇(例如，磁铁矿颗粒)上的一系列有序添加的稳定化表面涂层，以在复杂的生物样品中赋予胶体稳定性，同时实现极少涂层材料浸出、高结合能力和低非特异性结合。本发明的另一个益处是利用生成外部和内部磁场的分离装置来实现所述磁性纳米颗粒的分离的能力。

Description

稳定的纳米磁性颗粒分散体

相关申请：

本申请要求2015年5月1日提交且具有相同标题的美国临时专利申请序列号62/156,141(代理人案号为BLD-0010-PV)的权益和优先权，出于任何和所有目的，其内容以引用的方式整体并入本文。

发明背景：

在过去的几十年里，已经建立和改进了用于分离(separation)和离析(isolation)细胞、核酸、蛋白质和其他生物分子的基于磁性颗粒的技术。磁性颗粒通常与特异性靶向部分(诸如抗体或核酸)缀合，从而使颗粒结合至存在于复杂混合物(诸如细胞群或蛋白质和核酸混合物)中的靶分子。然后可使用磁场装置将结合至靶生物材料的磁性颗粒与混合物分开，从而为靶标提供纯化或富集方法。此类基于磁性颗粒的生物靶向离析方法已用于分离或富集带有靶抗原、细菌种、核酸和蛋白质的真核细胞。它们还被用于临床检测应用中，诸如用作免疫测定或放射免疫测定(RIA)的固体支持体。

用于制备用于此类应用的磁性颗粒的方法通常存在两种通用类型。一种通用方法包括在制备聚合物颗粒期间将磁性颗粒均匀地分散在聚合物基体内、在聚合物颗粒核周围构建磁性材料壳，或将磁性材料引入到聚合物颗粒内预先存在的孔中。前一种方法的实例可见于例如美国专利号4,358,388，并且第二种方法的实例可见于例如美国专利号5,320,944和5,091,206。后一种方法在美国专利号5,648,124和4,654,267中举例说明。所有这些方法产生尺寸大于0.3um(微米)的磁性颗粒。

用于制备用于生物材料应用的磁性颗粒的第二种通用方法包括首先生成裸磁性材料颗粒，其用作通过在第一磁性材料核周围构建壳而生成的较大颗粒的核。一种形式的初级涂层(primary coating)是硅烷涂层，但是其他涂层也有所描述。例如，美国专利号3,933,997描述了使用涂覆磁性颗粒并直接缀合至特异性抗体的硅烷偶联剂。据报道，这种材料意图用于RIA方法。美国专利号4,554,088描述了金属或氧化铁颗粒核的构造，所述颗粒核被与生物亲和分子(诸如抗体)直接偶联的聚合物硅烷涂覆。美国专利号4,695,392(前述‘088专利的分割案)将与生物亲和分子直接连接的硅烷涂层进一步定义为具有两个离散的官能团–第一个吸附性地或共价地偶联至金属氧化物核颗粒，并且第二个共价偶联至生物亲和有机分子。在两个专利中，颗粒的尺寸限定在0.1um至1.5um的范围内。美国专利申请公布号2007/0026435(现已放弃)公开了磁性颗粒核上的羟基硅烷、优选羟烷基三烷氧基硅烷初级涂层。在这项申请中，颗粒尺寸在0.1um至100um的范围内，并且颗粒被指定用于从混合物中离析特定核酸。当‘392专利和2007/0026435公布中所公开的磁性颗粒牢牢地粘附到其中所包含的引用实例时，所述磁性颗粒产生直径超过1um的高度聚集的磁性颗粒。美国专利号7,169,618公开了尺寸范围为0.07um至0.45um的磁性颗粒的制备，所述磁性颗粒首先用有机硅烷涂覆，然后通过有机硅烷上的侧基官能团来将所述有机硅烷与多糖材料缀合。美国专利申请公布号2010/0012880公开了具有磁性材料核的磁性颗粒，所述磁性材料核具有初级疏水性保护层，其上有层亲水性烷基硅烷涂层。此类颗粒的直径公开为0.2um至0.4um。

与也用作生物亲和分子的偶联试剂的硅烷涂层不同，核磁性颗粒上的非硅烷初级涂层也已被报道。这些非硅烷初级涂层包括聚戊二醛(参见例如美国专利号4,267,234)、丙烯酰胺、丙烯酸正丁酯或N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或(参见例如美国专利号4,454,234)、聚丙烯醛(参见例如美国专利号4,783,336)、聚乙烯醇(参见例如美国专利号6,204,033)、如葡聚糖(参见例如美国专利号4,452,773)的天然聚合物以及牛血清白蛋白(参见例如美国专利号4,795,698)。据报道，所有这些磁性颗粒初级涂层均用作可缀合另外的生物分子(诸如抗体或核酸)的基质。在使用所有这些方法的情况下，不容易控制所得到的生物亲和磁性颗粒产品的形状和尺寸，颗粒产品的尺寸范围相对较宽，直径通常大于0.5um，并且产品颗粒往往容易彼此粘附而形成颗粒团块。

尽管取得了这些进展，但仍对进一步改进的磁性颗粒以及用于制备和使用此类颗粒的方法存在需求。

发明概述：

本发明解决这些需求，并且提供一种用于产生硅烷(玻璃)包封的纳米磁性颗粒的高度可再现方法，在所述纳米磁性颗粒上进一步包封稳定化蛋白质/聚合物复合混合物，以产生可重悬纳米磁性颗粒，其可在颗粒尺寸没有任何实质性增加的情况下承受对于强磁场(例如，0.5-1.0特斯拉)的多轮暴露。然后通过将靶向部分共价连接到蛋白质/聚合物复合层来使此类多层纳米磁性颗粒对一个或多个期望的生物分子物种、细胞或组织类型具有特异性。所得到的纳米磁性颗粒另外具有非常窄的尺寸分布，其中多分散指数(PDI)值(≤0.10)接近单分散性颗粒的多分散指数值。可使用本发明产生直径为约5nm至约500nm、优选约30nm至约300nm的纳米磁性颗粒。本发明的优选的纳米颗粒包括由氧化亚铁、具体地磁铁矿(Fe₃O₄)晶体簇构成的磁性核颗粒。其他优选的磁性核包括Fe₂O₃；氧化铬，例如CrO₃；或包含取代的金属离子(例如，Mn、Co、Ni、Zn、Gd和Dy)的稳定金属氧化物。特别优选的磁性核颗粒(包括由磁铁矿晶体簇构成的那些)具有约5nm至约300nm范围内的直径。

如此产生的纳米磁性颗粒在纳米尺寸的核磁性颗粒周围具有三层涂层，即硅烷或玻璃层、蛋白质/聚合物层以及最后的由靶向部分构成的最外层，所述靶向部分是生物亲和配体对的一个成员，诸如用于靶向感兴趣的抗原的抗体、细胞表面受体或受体片段等。靶向部分或生物亲和配体(其可以是例如抗体或抗原结合抗体片段、链霉亲和素、肽、核酸聚合物或感兴趣的其他受体或配体)优选地共价缀合至存在于蛋白质/聚合物层上的充足的官能团。在优选的实施方案中，玻璃层是由有机官能烷氧基硅烷分子、任选包含可偶联端基的有机官能烷氧基硅烷分子形成的硅烷层，所述可偶联端基任选地为选自由氨基、巯基、羧基和羟基端基或反应基组成的组的可偶联端基。端基可受到保护或不受保护；如果受到保护，则优选在蛋白质/聚合物复合层偶联之前使用脱保护步骤。在优选的实施方案中，蛋白质/聚合物复合层共价结合至玻璃层。优选地，蛋白质/聚合物复合层由血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)、葡聚糖或酪蛋白构成。在一些实施方案中，蛋白质/聚合物复合层通过将组合物从约45℃加热至约85℃而永久结合。然后将靶向部分或生物亲和配体(即高亲和力结合对的一个成员)优选共价缀合至蛋白质/聚合物层。优选的靶向部分包括抗体(优选单克隆抗体)、抗原结合抗体片段(例如，Fab片段)、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合细胞外结构域、核酸(包括基于核酸的适体)、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素和出于靶向药物递送目的的药物化合物。

当并入具有复杂液体(例如，哺乳动物全血或哺乳动物全血的小部分)的反应混合物中时，本发明的靶向纳米磁性颗粒表现为稳定的胶体。此外，本发明的靶向纳米磁性颗粒优选地在长期(例如，1年至5年)储存期间不表现出显著或有害的磁性、生物亲和性和/或颗粒尺寸以及靶向特性的变化。生物样品的优选来源是获自哺乳动物(包括人)以及伴侣动物(例如，猫和狗)或具有商业意义的动物(例如，牛；家禽，诸如鸡、火鸡和鸭；山羊；马、猪、绵羊等)的生物样品。

包含本发明的纳米磁性颗粒的组合物可以任何合适的方式配制，包括干燥的易分散制剂(例如，冻干制剂)或液体组合物。在制备之后，通常将此类组合物以所需量(例如，以适合于进行单次磁性分离或多次分离的量)分配到合适的容器中，然后通常将所述容器包装到试剂盒中以供后续分配和使用。根据本发明的试剂盒优选地包括用于使用试剂盒中的试剂，包括使用本发明的纳米磁性颗粒来进行一次或多次所需磁性分离的说明书。在一些实施方案中，此类试剂盒可包含多个靶向纳米磁性颗粒物种，其中每个靶向纳米磁性颗粒物种均包含不同的靶向部分物种。优选地，在包含多个不同靶向纳米磁性颗粒物种的试剂盒中，每个物种优选包装在试剂盒中的单独容器中。在一些实施方案中，此类试剂盒还可包括还用于进行从由生物样品制备的反应混合物中漂浮(buoyant)分离一个或多个特定生物分子物种的组合物。

因此，本发明涉及使用磁性分离来分离靶生物分子，例如待从复杂混合物(诸如生物样品)中离析或分离出的细胞、细胞器、外来体、肿瘤体和其他生物材料。为了实现此类分离，本发明提供一类新的用于磁性分离程序中的可取得专利的纳米磁性颗粒组合物。

本发明的这些和其他方面、目标和实施方案(不限于或不受限于本概述中的信息)提供在下文中(包括在权利要求中)。

附图简述：

图1示出在超声处理之前和之后对本发明的非硅烷化和硅烷化纳米磁性颗粒进行的酸溶解研究的结果。所述绘图示出暴露于4MHCl 15分钟后溶解的铁的百分比。

图2示出根据本发明制备的各种纳米磁性颗粒的磁性分离效率。

图3示出抗体缀合的可商购获得的纳米珠产品的磁性分离效率。

图4示出使用链霉亲和素缀合纳米磁性颗粒和适当的生物素化抗体阴性选择的CD4阳性细胞的纯度，所述纳米磁性颗粒和所述生物素化抗体在各种温度下储存，然后在两个月的过程中测试细胞分离性能。

图5示出链霉亲和素缀合纳米磁性颗粒的CD4阳性细胞产率，所述纳米磁性颗粒在各种温度下储存并且在两个月的过程中如图4中测试细胞分离性能。

图6示出大鼠抗小鼠CD19抗体缀合纳米磁性颗粒的纯度，所述纳米磁性颗粒在各种温度下储存并且在两个月的过程中测试CD19阳性细胞分离性能。

图7示出大鼠抗小鼠CD19抗体缀合纳米磁性颗粒的产率，所述纳米磁性颗粒在各种温度下储存并且在两个月的过程中测试CD19阳性细胞分离性能。

图8是示出与根据下面实施例1产生的本发明的磁性颗粒相比，可商购获得的各种常规磁性颗粒的颗粒尺寸分布的图。使用动态光散射进行测量，并且将各种‘尺寸组’中的颗粒百分比作为实际颗粒尺寸的函数进行绘图。

图9具有两张图即图A和图B，每张图包含3张透射电子显微照片。图A中的显微照片示出通过HGMS使用市售HGMS相容性磁性颗粒磁性选择的细胞，而图B中的显微照片示出通过HGMS使用本发明的靶向纳米磁性颗粒磁性选择的细胞。

图10示出相对荧光单位(RFU)相对于用于涂覆微孔以驱使细胞增殖的抗小鼠CD3抗体的浓度的绘图。RFU是每种条件下细胞的相对数量的指数。

图11示出本发明的“磁性漂浮”分离方法的通用方案。

图12示出使用微泡离析特定细胞的原理。

图13示出本发明的“磁性漂浮”稀有细胞分离方法的通用方案。

图14示出从复杂混合物中离析人CD4+淋巴细胞。

详述：

如本领域技术人员将了解，以下详述详细描述本发明的某些优选实施方案，因此仅是代表性的，并且未描绘本发明的实际范围。在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方面和实施方案，因为这些可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制由所附权利要求书限定的本发明的范围。

已知用于分析和分选细胞群和其他生物分子的许多方法，包括基于细胞尺寸、密度或粒度的方法，其中仅通过沉降或通过沉降与密度梯度和离心或洗脱组合实现分离。其他方法包括基于细胞对渗透性裂解的差异抗性的方法，如例如可用于从全血中分离白细胞。此外，使用与细胞表面标记物反应的特异性抗体从更复杂的生物样品中消除不需要的细胞(或其他生物分子)(即减少其数量)的方法可用于去除或减少表达所述标记物的细胞的数量。还其他的细胞分离方法包括流式细胞术和磁性细胞分选(例如，使用磁性颗粒缀合抗体)，以及对特定生物分子(包括细胞表面蛋白)采用抗体亲和力(或其他高亲和力结合对)的其他方法。使用这些技术，对缀合至标记的检测/分离试剂的特别期望的即“靶标”或“靶”细胞群(即表达可被高亲和力结合部分(例如，抗体、Fab片段、受体等)靶向的标记物的细胞群)可实现正向富集或消除。

因此，本发明解决从更复杂的生物样品(诸如细胞混合物(例如，全血、匀化活检物或组织样品等))中分离一个或多个期望或靶生物分子物种，具体地是一个或多个靶细胞群。“靶生物材料”或“靶生物分子”是指使用者期望分离、富集、消除或靶向并且可制备特异性结合部分(配偶体)以便特异性标记或结合材料的任何生物基质，例如细胞、细胞器和其他生物材料。合适的靶生物分子的列表很广泛，并且包括：微生物，诸如原生动物、细菌、酵母和其他真菌；来自多细胞生物体(包括哺乳动物和其他脊椎动物细胞、病毒以及细胞和病毒的片段)的培养细胞；表达一种或多种可靶向细胞表面抗原的真核细胞群；以及包含可靶向蛋白或其他生物分子(例如，碳水化合物、脂质等)的细胞器或其他亚细胞结构(例如，外来体、蛋白酶体、核糖体等)。实际上，可由靶向部分靶向的任何生物材料(即生物分子)(单一分子(例如，蛋白质)或一个或多个分子(相同或不同分子物种)的有组织的或无定形的聚集体)可使用本发明的纳米磁性颗粒和方法进行离析或纯化。

本方法基于使用本文所述的一类新的可取得专利的靶向纳米磁性颗粒，其可用于通过磁性细胞分离技术将靶标生物分子(直至包括完整的活细胞)与反应混合物中的其他组分分离。如果需要，还可进行其他分离，以便富集或消除存在于反应混合物中(作为存在于待分析的原始样品中的结果)的一个或多个其他生物分子物种(例如，细胞群)。实际上，在相关方面，基于使用靶向漂浮微粒(例如，微泡等)的靶标生物分子分离可与磁性分离结合使用，以平行或串行处理生物样品，以便富集两个或更多个期望细胞群(或其他生物分子物种)，或富集至少一个靶细胞群(或其他生物分子物种)并消除另一个。可例如通过与其特异性反应的单克隆抗体而被靶向以从生物样品中分离靶细胞群的特别优选的蛋白质包括以下细胞表面蛋白：

在本发明的背景下，通过使用缀合至可分离颗粒的靶向部分(例如，本发明的纳米磁性颗粒、常规磁性颗粒、漂浮颗粒(例如，微泡)等)来实现靶向分离(用于富集或消除)。靶向部分通常是高亲和力结合试剂，其可通过合适的化学过程(优选涉及不破坏高亲和力结合试剂与靶标生物分子、优选在靶标细胞群、细胞器或其他生物分子表面上表达的蛋白质之间的结合的共价键合的化学过程)缀合至可分离颗粒。此类高亲和力结合试剂的实例包括高亲和力结合对的成员。此类成员包括抗体(具体地单克隆抗体)、抗原结合抗体片段(例如，Fab片段)或高亲和力结合对(其中一个成员缀合至可分离颗粒，并且另一个是存在于被靶向的生物分子或结构上的“靶”)的另一个成员。在一些实施方案中，高亲和力结合试剂和/或其缀合的可分离颗粒用适合于细胞分离(例如，FACS)的可检测试剂(诸如荧光染料)标记。

在使结合试剂特异性结合其对应靶标(例如，在抗体、抗原结合抗体片段等的情况下是抗原)的条件下，缀合至可分离(例如，通过磁场或电场、浮力等)颗粒的高亲和力结合试剂可用于将期望生物分子(例如，表达特定细胞表面抗原的细胞群)与其他反应混合物组分分离。

本发明的分离方法的实施包括以下步骤：在反应混合物中，固定存在于已知或疑似包含靶生物分子的生物样品中的靶生物分子(例如，表达特定细胞表面标记物的靶细胞群)，所述生物分子在铁磁性基体中通过使用磁场被本发明的纳米磁性颗粒的靶向部分特异性结合；洗涤基质以去除反应混合物中未结合的组分；以及去除磁场以从基体中洗脱靶标生物分子。因此，靶生物分子(例如，靶细胞群)被富集；此外或可替代地，生物样品被消除靶生物分子(前提条件是从基体上洗涤下来的材料被保留以供进一步使用)。可使用重力流动、离心、真空过滤或压力梯度来进行从铁磁性基体中洗脱材料。

术语“磁性分离”是指复杂样品(例如，生物样品)的组成组分的分离程序。此类程序包括由靶向部分介导的磁性分离，所述靶向部分包含缀合至或以其他方式连接到根据本发明的纳米磁性颗粒的高亲和力结合对的一个成员(例如，特异性结合靶细胞表面抗原的单克隆抗体)。磁性分离可与其他分离程序组合，所述分离程序包括采用靶向漂浮颗粒和/或本领域已知的也依赖于高亲和力结合对(例如，抗体及其同源抗原)的分离技术(例如，亲和色谱法、“淘选”(其中高亲和力结合对的一个成员连接到固体基体，例如微量滴定板的孔))的那些。如果荧光标记包括在靶向可分离颗粒中，则也可使用荧光激活细胞分选术(FACS)。实际上，任何现在已知或以后开发的配体依赖性分离技术可与依赖于靶生物分子的物理特性而非亲和力的阳性和/或阴性分离技术(包括过滤、尺寸排阻色谱法和密度梯度离心法)结合使用。

本发明还包括用于单独地或除其他分离方法之外进行本文所述的磁性分离方法的试剂盒。此类试剂盒包括靶向期望生物分子(例如，在特定细胞类型的表面上表达的细胞表面抗原)的本发明的靶向纳米磁性颗粒。靶向纳米磁性颗粒通常包装在容器中，所述容器包括进行一个或多个磁性分离程序所需的量的颗粒。在任何这种试剂盒中也通常包括用于使用靶向纳米磁性颗粒(以及任何其他包括的试剂，例如靶向漂浮微泡)的说明书(或包含此类说明书的链接或网站地址)。

磁性分离

已知用于分离生物材料或样品的组分的技术是利用磁性分离技术的那些技术。磁性分离方法通常将磁性材料选择性地保留在设置于磁场中的室或柱中。此类方法通常包括使生物材料或样品通过一个或多个分离柱。简而言之，通过使用缀合至颗粒的靶向部分连接到本发明的靶向纳米磁性颗粒来对生物材料或样品进行磁性标记，所述靶向部分靶向已知或疑似存在于样品中，例如，显示在已知或疑似存在于所述样品中的某些细胞的表面上的期望(或“靶”)生物分子。然后将标记的靶样品的悬浮液施加到分离室或分离柱。为了从反应混合物的剩余部分中分离靶标生物分子物种，在磁场存在下将靶向生物材料保留在室中。然后可通过改变磁场强度或消除磁场来洗脱保留的靶向生物材料。

在一些实施方案中，使用高梯度磁性分离(HGMS)(Miltenyi等人，Cytometry，11，231(1990))。在HGMS中，将具有合适磁化率的材料基体(诸如铁丝绒或钢珠)放置于室或柱中，使得当施加磁场时，在基体表面附近局部诱发高磁场梯度，从而允许保持磁化颗粒和通过存在于混合物中的高亲和力结合对的成员缔合而形成的靶标生物材料的复合物。

本发明的靶向纳米磁性颗粒和方法可用于磁性分离或磁性标记并离析(如果需要)任何期望的靶物质或分析物(例如，细胞、细胞器等)。特别感兴趣的是从复杂的生物混合物中分离特定生物分子。本发明具有很大的效用，因为几乎任何靶物质就都可被分离，只要所述物质的特异性结合成员可用。靶向部分可以是特异性高亲和力结合对的任何成员或与特异性高亲和力结合对的成员缔合的物质。例如，细胞表面抗原-抗体结合对可用于离析抗原本身、表达抗原的细胞、参与抗原加工的特定细胞器等。本发明的装置和方法还有利地应用于涉及受体和配体结合的诊断技术，诸如免疫测定法等。

靶向纳米磁性颗粒

两种类型的磁性氧化物即铁氧体和非铁氧体可用于生产本发明的靶向纳米磁性颗粒。铁氧体或含铁过渡金属氧化物通常可表示为XO.Fe₂O₃，其中“X”可以是Fe、Ni、Cr、Co、Mn、Mg、Mo、Gd、Cu、V、Dy、Ey、Tm或Yb。因此，在合成磁铁矿超簇的过程中，将用前述二价金属离子盐中的一种取代含Fe²⁺的铁盐。这种类型的铁氧体中最优选的是FeO.Fe₂O₃，其更常称为磁铁矿或Fe₃O₄。非铁氧体类型的磁性氧化物不含铁原子，而是被以下这些过渡金属的两种或更多种离子的组合取代：Cr；Co；Mn；Ni；Mo；Gd；Dy；Ey；Tm；以及Yb。此类基于非铁氧体的磁性氧化物通常产生一系列彩色纳米磁性颗粒，但是其比铁氧体类型的磁性氧化物的磁性响应小。

近一个世纪以前首次合成磁铁矿晶体。磁铁矿晶体的后续加工和稳定化大量产生了许多不同类型、不同尺寸的磁性颗粒，其具有不同的表面涂层并用于不同的应用。在优选的实施方案中，首先使用任何合适的方法合成磁铁矿(Fe₃O₄)晶体，包括熟知的水基共沉淀方法[Massart 1982，Schwertmann 1991]。在惰性气氛下用强碱滴定亚铁(Fe²⁺)和三价铁(Fe³⁺)铁盐的化学计量混合物，以产生1um-3μm直径的磁铁矿晶体。对变量诸如铁盐的摩尔比(例如，1.0M Fe²⁺:2.0MFe³⁺至2.0M Fe²⁺:1.0M Fe³⁺)、反应温度(例如，40℃至95℃)、使用的碱抗衡离子类型(例如，铵、钠、钾)以及碱添加速率(例如，2mL/分钟至200mL/分钟)进行优化，以便产生最高质量的“裸”磁铁矿晶体。接下来以高功率对这些磁铁矿晶体进行超声处理，以便产生90nm–110nm(纳米)尺寸的准稳定态纳米磁性颗粒，立即使用酸性水溶液硅烷化程序、伴随着高温脱水对所述纳米磁性颗粒进行硅烷化，以便获得硅烷化纳米磁性颗粒。

硅烷化可使用任何合适的工艺来实现。例如，使用0.5英寸的钛探针针尖在高功率(750W)下超声处理25分钟后，将纳米磁性颗粒转移到保持在包含50v％甘油的氮气下的具有顶置式搅拌器的3颈圆底玻璃反应容器中。然后以0.5ml/分钟添加10重量％(相对于铁质量)的硅酸钠溶液，随后立即以1mL/分钟添加0.5M冰醋酸直至pH达到6。然后将温度升至180℃，并且使混合物脱水至少2小时，然后冷却并用水洗涤。

在各种优选的实施方案中，首先使用强金属离子螯合剂(诸如EGTA)将“裸”磁铁矿晶体胶溶化，以便使另外的种子羟基可用于与硅烷化试剂缩合。通过在螯合剂(例如，EGTA)存在下超声处理2um尺寸的磁铁矿超簇以便将另外的羟基引入到磁铁矿颗粒上并提供更大的胶体稳定性来实现胶溶作用。在又另一优选的实施方案中，依序使用两种硅烷化试剂，以便增强包封并且借助于二级硅烷化试剂中的固有官能团提供另外的可偶联基团。依序硅烷化可例如通过以下方式实现：首先使用如上所述的硅酸钠对超声处理的磁铁矿颗粒进行硅烷化，随后立即添加氨基硅烷，诸如氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，之后在180℃下脱水(参见下面的实施例2)。

进行第二轮高功率超声处理，但是简短，以便减小颗粒尺寸，优选地减小至95nm-105nm。接下来，将这些硅烷化纳米磁性颗粒与含蛋白质/聚合物混合物(例如，BSA(牛血清白蛋白)和多糖葡聚糖(99重量％BSA:1重量％葡聚糖至50重量％BSA:50重量％葡聚糖))的加热溶液混合。这可例如通过就在将含BSA和葡聚糖的混合物的溶液与超声处理的磁铁矿颗粒在氮气气氛下在密封的3颈反应容器中混合之前将所述溶液加热至70℃来实现。使涂覆过程进行30分钟。然后将悬浮液冷却并使用例如高场磁偶极分离器洗涤。

已知将浓缩的BSA溶液加热至超过58℃的温度产生通过二硫键形成和单个BSA分子之间的β片层的氢键合介导的不可逆的BSA聚集体[Wetzel，1980]。在一个优选的实施方案中，马来酰亚胺基在与超声处理的硅烷化颗粒混合之前被引入到BSA蛋白中，以便进一步促进二硫键的形成。然后借助于强偶极/四极型磁性分离器洗涤BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒，以去除过量的涂层材料并将颗粒的尺寸分布缩小至最终尺寸为约110nm。来自这个磁性分级分离步骤的初始洗涤上层清液包含显著量(按铁质量计～50％)的30nm-80nm尺寸的BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒。此类尺寸较小的纳米磁性颗粒还可有效地用于磁性捕获/纯化细胞内和/或细胞外靶标，诸如分别为但不限于内体和外来体。如此产生的BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒通常具有≤0.1的PDI。这种PDI编号是颗粒尺寸分布宽度的量度，并且是在基于DLS的尺寸测量期间自动获得的。通常，小于0.1的多分散指数通常称为“单分散性”颗粒悬浮液。更确切地说，PDI＝标准偏差的平方除以平均直径，并且是无因次数。然后使用标准的异/同-双功能偶联化学过程将生物亲和配体即“靶向部分”(诸如抗体和/或链霉亲和素)缀合至110nm直径的BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒。如此制备的链霉亲和素涂覆的纳米磁性颗粒用高离子强度盐溶液(1M至5M NaCl)进一步热处理以便稳定颗粒上的表面涂层。

在一些实施方案中，用可检测标记(例如，放射性同位素或荧光分子)标记与本发明的靶向纳米磁性颗粒缔合的靶向部分，以便使得颗粒或颗粒/靶标细胞(或其他生物分子结构)复合物可通过使用互补标记检测仪器或系统检测。此类标记可包括在本发明的纳米磁性颗粒的磁性核颗粒中和/或一个或多个外层中。在期望颗粒/细胞检测的其他实施方案中，可采用用于检测颗粒磁信号的技术，其代表性实例是可用于借助于磁性标记产生的磁场来检测所述磁性标记的SQUID技术[Clarke和Braginski，SQUID Handbook，第1卷，(2004)]。

体内应用

本发明的靶向纳米磁性颗粒可适用于许多体内诊断和治疗用途，包括成像、细胞疗法以及将治疗剂递送至细胞。

细胞疗法

如今，许多人类疾病用标准药物不能得到满意治疗。对于这些疾病中的一些，细胞疗法提供有吸引力的替代选择。基于细胞的疗法通常需要对细胞产品进行大量处理和加工。当前的细胞治疗方法需要大量基础设施和设备来满足生产和法规要求，包括良好生产规范，其包括使用合适的洁净室和人员来将房间、装置、生产、质量控制和质量保证程序保持在确保不污染样品的条件下以保持无菌性。基于细胞的产品通常使用不同装置和一次性用品的组合进行加工。此类过程中产物和试剂的转移可以是手动的和/或自动的。

磁性细胞分离可包括富集和消除程序。如果可使用细胞表面蛋白(或其他细胞表面生物分子)鉴定靶细胞，则可通过一轮或多轮富集和/或消除来将它们富集至高纯度。在其他情况下，可从所得细胞产物中鉴定出并移出靶细胞，所述细胞产物可以是不同期望细胞的非均匀混合物，其中靶向移出的细胞数量减少。当然，可使用富集和消除的组合。

使用本发明的靶向纳米磁性颗粒对细胞进行磁性标记包括合适的靶向部分，通常是高亲和力结合对的特异性结合成员。然后可使用磁性分离装置离析靶细胞/颗粒复合物。多能细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)的离析是特别感兴趣的，但本发明可应用于宽范围的细胞类型或其他生物材料或样品。

根据本发明产生的细胞产品可立即用于疗法中或使用已知的方法储存以供后用。配制步骤包括将分离的包含细胞的制备物调节至期望体积或细胞浓度；用可注射溶液交换处理液体；添加稳定剂(例如，自体血浆或血清、血清白蛋白、其他蛋白质或合成聚合物等)或佐剂，补充有冷冻保护剂(诸如DMSO)用于后续储存；抽取保留等分试样用于质量控制，递送至袋或注射器的组合用于输注等。

重要的是，本发明的靶向纳米磁性颗粒可使用任何合适的方法(包括过滤灭菌(由于颗粒尺寸小))进行灭菌，以用于强制要求或期望无菌处理的治疗和/或体内/体外过程。

体外应用

本发明的靶向纳米磁性颗粒还可适用于许多体外诊断和治疗用途。过去曾使用磁性颗粒来离析或富集真核细胞、细菌种、核酸和蛋白质。除了颗粒离析或细胞分离之外，磁性纳米颗粒还用于通过将细胞激活配体涂覆在颗粒表面上来刺激或激活细胞，使得与溶液相激活方案相比，靶标接合的全三维方面(在生物系统中通常是重要的)被更准确地再现。近年来，磁性颗粒已经被研究用于更新的体外测试。这些的实例包括评价纳米磁性颗粒的潜在健康效应(Kevin等人，Biosensors and Bioelectronics，43，88(2013))以及用于递送si-RNA的基于纳米技术的体系的潜在健康影响(Dim等人，J.Nanobiotechnology，13，61(2015))。纳米颗粒也在研究和开发测试中作为靶向加热组分应用，所述组分可开发用于治疗癌症的局部磁热疗条件(Makridis等人，Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.，63，663(2016))。

实施例

提供以下实施例以说明本发明的某些方面并且在其实施中帮助本领域技术人员。这些实施例决不被视为以任何方式限制本发明的范围，并且具有可适用领域普通技术或更高技术的人员将容易地认识到，本说明书彻底描述了本发明，并且可容易地应用于实现目标并获得所提及的结果和优点以及其中固有的结果和优点。

1.硅烷化BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒的合成

这个实施例描述用于合成用于本发明的硅烷化BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒的优选方法。这种合成分三个阶段进行，并且包括：首先是裸(未涂覆)磁铁矿超簇的合成、随后是这些超簇的硅烷化、以及最后是使用BSA/葡聚糖混合物进行的蛋白质/聚合物涂覆步骤。

简而言之，将5.02g硫酸亚铁和7.22g硫酸铁(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)分别溶解于25mL脱气去离子水中，然后在70℃下在持续搅拌下添加到包含250mL脱气去离子水的反应容器中。接下来，将35mL的10M氢氧化铵(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)以9mL/分钟的速率添加到反应烧瓶中，并且使磁铁矿超簇的形成进行30分钟。然后使用壳体内构造的陶瓷低梯度磁性分离器(LGMS)来用去离子水彻底洗涤沉淀物，并且最后在氮气封顶(cap)下储存在脱气去离子水中。如通过动态光散射(Malvern Nano-S ZetaSizer；Westborough，MA)所测量的，这些磁铁矿超簇通常具有2至3um范围内的流体动力学直径。

接下来，使用冷却的带夹套的反应烧杯将1.65g磁铁矿超簇在100mL体积的低离子强度磷酸盐缓冲液(ACS级磷酸二氢钠，分子量为137.99g/mol)中借助于VCX750超声波处理器(Sonics&Materials Inc.，Newtown，CT)超声处理至最终尺寸为～110nm，然后立即转移到包含硅油浴的反应烧瓶中。接下来，将2.5mL的66mg/mL硅酸钠(SiO₂ ^-)溶液(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)以0.5mL/分钟的速率添加到反应烧瓶中，随后用以1mL/分钟添加的～8mL的0.5M乙酸酸化至最终pH值为6.0。然后将油浴的温度升高至170℃，并且使颗粒悬浮液脱水约3小时，以便促进纳米磁性颗粒表面硅烷化。冷却至室温后，将颗粒悬浮液放置于LGMS磁性分离器中30分钟，并且回收磁性粒化颗粒并用低离子强度的HEPES缓冲液(VWR，Visalia，CA)将其彻底洗涤。这些硅烷化或SiO₂-衍生化磁铁矿簇通常具有约200nm的流体动力学尺寸，并且在强酸中比其非硅烷化型式溶解得慢得多(参见下表1)。

为了制备BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒，使用冷却的带夹套的反应烧杯将1.4g硅烷化磁铁矿簇在135mL体积的低离子强度磷酸盐缓冲液中借助于VCX750超声波处理器(Sonics&Materials Inc.；Newtown，CT)超声处理至最终尺寸为～100nm，然后立即转移到恒温至70℃的带夹套的1L反应烧瓶中，所述反应烧瓶包含20mg/mL BSA(LampireBiologicals；Pipersville，PA)和0.2mg/mL葡聚糖(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)的400mL混合物。使这种涂覆反应在70℃下进行30分钟。然后将涂覆的纳米磁性颗粒冷却至室温，并在4℃下静置过夜。

接下来，借助于保持在容器底部的低场陶瓷磁体将颗粒从容器中缓慢地倾析出，以便沉淀掉大尺寸(～300nm)的颗粒聚集体。然后使所收集的上层清液(直径为～100nm)在低离子强度HEPES缓冲液(VWR；Visalia，CA)中经受7个循环的高场磁性洗涤。除了去除过量的反应物之外，这些高场洗涤还可用于将颗粒尺寸分布显著缩小至PDI值≤0.1。最终的流体动力学颗粒尺寸通常为约115nm。从1.65g磁铁矿超簇开始的总产率通常为至少50％。将通常具有～70nm的流体动力学尺寸并且占总颗粒产率的～35％的第一高场磁性洗涤上层清液收集作为副产物，并且可用于产生更小尺寸(<100nm)的纳米磁性颗粒产品以用作体内/体外跟踪/捕获标记并与HGMS柱(参见下面的实施例3)协同用于磁性细胞离析。

最后，生物亲和配体对的成员(诸如链霉亲和素、抗体或其他期望配体)可使用如对于本领域技术人员而言所熟悉的标准异/同双功能偶联化学过程来共价缀合至存在于这些BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒上的充足的BSA来源的官能团。

2.通过胶溶作用和其他类型硅烷化剂合成纳米磁性颗粒

诸如螯合剂(更普遍地称为EDTA、EGTA)以及弱碱和弱酸的电解质在其有助于将沉淀物分散到胶体溶胶中的情况下称为胶溶剂。在这个实施例中，在如上述实施例1中形成磁铁矿超簇后立即添加(以0.25摩尔EGTA/摩尔铁)强效铁螯合剂EGTA(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)。在如上述实施例1中洗涤磁铁矿超簇之前，使这个螯合步骤在70℃下进行1小时。不同于～2.5um尺寸的起始磁性超簇，这些EGTA胶溶化磁铁矿簇通常具有约1um的流体动力学直径，并且这种尺寸减小指示磁铁矿超簇成功分散。

在另一个实施方案中，使用依序硅烷化方法，由此如上述实施例1中对EGTA胶溶化磁铁矿超簇进行超声处理和硅烷化，并且在添加硅酸钠溶液之后立即添加等摩尔量的氨基官能化硅烷化剂氨丙基三甲氧基硅烷或APS(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)，并使颗粒在酸化至pH为6.0后在160℃下脱水90分钟。仅使用APS代替如上述实施例1中的硅酸钠也可实现硅烷化，并且使脱水步骤在160℃下进行75分钟。

另一种硅烷化剂羟甲基三乙氧基硅烷(Gelest，Morrisville，PA)非常亲水，并且也成功地用于产生可用于本发明背景下的硅烷化纳米磁性颗粒。在这种特定情况下，使用15重量％的这种硅烷化剂(相对于铁含量)，并且使脱水在160℃下进行2小时。

如上面实施例1中所述，所有前述硅烷化磁性颗粒成功地涂覆有BSA/葡聚糖混合物。当用BSA/葡聚糖混合物包封时，这些类型的硅烷化纳米磁性颗粒通常在暴露于4M HCL15分钟后表现出≤50％的酸溶解。简而言之，为了进行溶解，将100uL的0.1mg/mL(以铁含量计)颗粒悬浮液与200uL的6M盐酸一起孵育，并且将这种混合物的等分试样以各种时间间隔取出，并通过与硫氰酸钾络合作为比色终点读出来测定元素(或溶解的)铁的存在。下面的表1显示所有这些前述硅烷化磁铁矿簇的酸溶解行为。

表1：对于各种硅烷化磁铁矿簇随酸暴露时间而变的氧化铁溶解百分比

上述表1中的数据显示，本文所述的硅烷化方法实际上提供对抗酸溶解的保护，并且还用于在磁性颗粒的表面上提供高度交联的硅烷分子。例如，在15分钟的时间点，与只有50％至70％的硅烷化磁铁矿簇相比，90％的(裸)磁铁矿超簇被酸溶解。

图1示出在超声处理之前和之后对硅烷化纳米磁性颗粒进行的酸溶解研究的结果。这项研究显示，如上述实施例1中所述，在第二轮高功率超声处理之后，硅烷(玻璃)涂层在纳米磁性颗粒表面上保持完整。

在没有初级玻璃涂层的情况下产生的纳米磁性颗粒在生物流体(诸如血浆和全血)中通常不稳定，并且此外，其甚至在低离子强度的溶液中也易于聚集。与其他磁性纳米颗粒相比，由本文所述的硅烷化方法提供的此类保护性官能团(例如，稳定性、减少的聚集)显著有助于本专利中所要求保护的靶向纳米磁性颗粒在生物学研究中的实用性。

3. 70nm BSA/葡聚糖涂覆的硅烷化纳米磁性颗粒副产物的衍生化、加工和细胞标记功效

首先使用可商购获得的HGMS‘XS’柱(目录号130-041-202；Miltenyi Biotec，SanDiego，CA)使来自上述实施例1的第一高场磁性洗涤上层清液(其中的磁性颗粒具有约70nm的流体动力学尺寸)经受HGMS纯化，所述HGMS‘XS’柱装填有小铁磁珠以便去除过量的涂层试剂。将‘XS’柱定位在均匀磁场中，所述磁场通过将2英寸x 1英寸x 0.25英寸厚的‘北极’面和相同尺寸的‘南极’面磁体相对于彼此定位而产生。‘XS’柱/磁性组件附接到蠕动泵以有利于纳米磁性颗粒快速自动加工。

将30mL(12.5mg铁)第一高场磁性洗涤上层清液HGMS纯化成低离子强度的HEPESpH 7.5缓冲液。在从均匀磁场中取出‘XS’柱并用3mL HEPES pH 7.5缓冲液重悬之后，基于铁含量回收约90％的颗粒。这些HGMS纯化的纳米磁性颗粒具有73nm的流体动力学直径，然后使用异双功能偶联化学过程缀合至大鼠抗小鼠CD4抗体(目录号100506；BioLegendInc.，San Diego，CA)。简而言之，将HGMS纯化的73nm BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒用SMCC交联剂(目录号S1534；ThermoFisher Scientific，San Diego，CA)激活并缀合至使用2-亚氨基四氢噻吩(目录号26101；ThermoFisher Scientific，San Diego，CA)硫醇化的大鼠抗小鼠CD4抗体。这些抗体缀合纳米磁性颗粒的最终流体动力学尺寸测量为83nm。虽然没有彻底优化，但是当这种缀合颗粒与‘MS’型HGMS柱(目录号130-042-201；Miltenyi BiotecInc.，Auburn，CA)结合用于靶向来自脾细胞悬浮液的小鼠CD4⁺细胞时，通过流式细胞术用适当的荧光标记抗体(具有CellQuest软件的FACSCalibur；BD Biosciences，San Diego，CA)测量而获得超过90％的纯度和产率。

这些结果显示，与本文其他地方所描述的较大的颗粒相比，这些较小的颗粒也可有效地缀合并用于离析生物材料。

4.链霉亲和素缀合纳米磁性颗粒的胶体稳定性

将根据上述实施例1产生的115nm直径的BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒按照上述实施例3中所描述的方法共价缀合至链霉亲和素，以产生135nm直径的链霉亲和素缀合纳米磁性颗粒。在室温下将纳米颗粒重悬并储存在高离子强度溶液(1M NaCl)中之后，在各个时间点进行颗粒尺寸测量。对相同纳米颗粒在其正常储存缓冲液中进行对照尺寸测量，所述缓冲液是补充有BSA和叠氮化钠的低离子强度缓冲液。下面的表2示出这项研究的结果。这项研究证实本发明的纳米磁性颗粒的显著抗聚集性和增强的胶体稳定性。

表2：1M氯化钠中的颗粒尺寸稳定性

储存溶液	0小时处的尺寸	1小时处的尺寸	72小时处的尺寸
				正常储存缓冲液	135nm	137nm	137nm
1M氯化钠	139nm	139nm	140nm

5.本发明的纳米磁性颗粒的磁性分离效率

图2示出根据本发明制备的各种纳米磁性颗粒的磁性分离效率，所述颗粒包括113nm直径的BSA/葡聚糖涂覆的颗粒、127nm抗体缀合颗粒和130nm链霉亲和素缀合颗粒，其中后两者使用上述实施例3中所描述的方法进行缀合。这项研究使用如美国专利号5,186,827中所述构造并设计来适合标准的12mm x 75mm一次性实验室试管的四极磁性分离器和用于生理缓冲液(诸如等渗磷酸盐缓冲盐水溶液)中包含25μg/mL铁的稀释纳米磁性颗粒悬浮液进行。用于与试管一起使用的类似强磁性分离器购自StemCell Technologies(部件号18000；Vancouver，British Columbia，Canada)。图2显示，所有这些前述纳米磁性颗粒在仅几分钟内快速且定量地分离。

在四极磁性分离器中还针对磁性分离效率对可商购获得、具有82nm测量流体力学直径的抗体缀合微珠(目录号130-049-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)进行测试，并且结果在图3中示出。如图3所示，在这个实施例中，这些82nm的微珠在上述四极磁性分离器中完全没有进行定量分离。相反，在30分钟之后，只有约40％的这些磁性颗粒可被分离。这些结果证实，这些类型的微珠只适合与基于HGMS柱的磁性分离方法一起使用。然而，本发明的纳米磁性颗粒适合于在基于外场(偶极、三极、四极、六极型)以及内场(HGMS)的磁性分离器中进行基于磁性颗粒的定量分离。

这种特性代表了在本说明书中所描述的纳米磁性颗粒的实用性方面的显著区分者，因为发明人目前不知道在内部和外部类型的磁性分离器中起作用的其他磁性颗粒。

6.纳米磁性颗粒与哺乳动物细胞的非特异性结合

下面的表3示出根据上述实施例1在6个月期间内合成的不同批次的BSA/葡聚糖涂覆的纳米磁性颗粒的非特异性结合(NSB)。在这项研究中，将小鼠脾细胞(每管总共1x10⁷个细胞)在4℃下与相对大量的纳米磁性颗粒(约2000个颗粒/细胞或每个样品总数2x10¹⁰个颗粒)一起孵育20分钟。然后借助于四极磁性分离器使用仅5分钟的磁性分离时间来将细胞/纳米磁性颗粒反应混合物磁性洗涤两次。

洗涤步骤如下进行：将细胞悬浮液用等渗PBS/BSA/EDTA缓冲液(5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)、pH 7.2、2.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)以及10mM EDTA)稀释至总体积为4mL，并且将管放置于四极磁性分离器中5分钟。然后通过轻轻倒转磁性分离器或借助于巴斯德吸管吸出来弃去上层清液。然后取出试管，并且将其内容物再次用4mL等渗缓冲液重悬，并放回到磁性分离器中再分离5分钟。第二次吸出后，将细胞离心，并且将细胞沉淀物用小体积的等渗缓冲液重悬，然后分析非特异性收集细胞的存在。然后将磁性收集的细胞离心一次(以300x g离心5分钟)以去除过量或游离的纳米磁性颗粒。然后使用自动细胞计数器(

VISION Trio；Nexcelom Bioscience，Lawrence，MA)计数磁性收集的细胞的数量，其与起始细胞数一起能够计算磁性选择(称之为非特异性结合)的细胞的百分比。需注意，2x10¹⁰个颗粒相当于质量为约40ug的铁。更典型地，为了以高纯度和高产率离析细胞，对于总共包含1x10⁷个细胞的样品，仅需要添加约10ug至20ug的纳米磁性颗粒(以铁含量计)。

使用高梯度磁性分离(HGMS)柱(部件号130-042-201；MS柱；Miltenyi BiotecInc.，Auburn，CA)代替试管四极磁性分离器来重复这些非特异性结合实验(参见下面的表3)。由于在此类HGMS柱分离器中生成的磁场梯度非常高，纳米磁性颗粒与细胞比急剧降低至每1个细胞约20个颗粒或每个样品约2x10⁸个颗粒。发现10:1至50:1的颗粒与细胞比提供最佳的靶细胞产率和纯度(参见下面的表5和6)。

这些研究用常用的标准的细胞相容性缓冲液(PBS)进行，所述缓冲液补充有0.5重量％BSA、2mM EDTA和0.1重量％酪蛋白，并调节至pH 7.2。

表3

颗粒批号	颗粒直径(nm)	磁性分离方法	非特异性结合％
				MAG05	110	四极	1.1
MAG06	113	四极	1.5
				MAG07	110	四极	1.9
MAG08	105	四极	1.1
				MAG09	114	四极	1.4
MAG010	114	四极	1.1

MAG05	110	MS柱	1.1
				MAG06	113	MS柱	1.0
MAG07	110	MS柱	1.0
				MAG08	105	MS柱	1.2
MAG09	114	MS柱	0.8
				MAG10	114	MS柱	1.1

上述表3中的与本发明的纳米磁性颗粒的非特异性结合(NSB)结果非常低，这使达到多至约99％的靶细胞纯度成为可能。大多数(如果不是所有的话)当前可用的商业磁性颗粒不能达到如此低的NSB水平。

7.与HGMS分离器相比，使用四极磁性分离器特异性结合并捕获哺乳动物细胞

下面的表4示出在使用小鼠脾细胞的情况下127nm直径的大鼠抗小鼠CD4抗体(克隆RM4-5；目录号100506；BioLegend Inc.，SanDiego，CA)缀合纳米磁性颗粒(如上述实施例3中所述那样制备)的滴定结果。这种滴定使用500:1至1500:1的颗粒与细胞比进行。所使用的方案与上述实施例6中上述方案基本上相同，不同之处在于在去除过量的纳米磁性颗粒之后，用适当的荧光染料缀合抗体(出于表型目的)进行另外的孵育，并且在流式细胞仪(具有CellQuest软件的FACSCalibur；BD Biosciences，San Diego，CA)上分析细胞以确定磁性选择的细胞的百分比纯度。

表4

颗粒与细胞比	纯度％	产率％
			500:1	93.0	91.2
750:1	91.6	90.2
			1000:1	92.6	92.9
1200:1	92.1	95.1
			1500:1	89.3	90.7

这项研究清楚地说明本发明的纳米磁性颗粒用于以高产率和高纯度离析感兴趣的靶细胞以供进一步询问的生物医学效用。

下面的表5示出使用相同的127nm直径的大鼠抗小鼠CD4抗体缀合纳米磁颗粒与小鼠脾细胞一起进行的类似滴定研究的结果；然而，在这项研究中，HGMS柱用于进行磁性洗涤步骤。如前(在上述实施例6中)所述，在这种基于HGMS的研究中使用5:1至50:1的较低颗粒与细胞比。

下面的表6示出类似滴定研究的结果，所述类似滴定研究也使用HGMS柱、但用129nm直径的大鼠抗小鼠CD19抗体(克隆6D5；目录号115502；BioLegend Inc.，San Diego，CA92121)缀合纳米磁性颗粒(如上述实施例3中所述制备)进行，以便证实本发明的纳米磁性颗粒在基于HGMS的细胞离析方案中的多功能性。

这两项研究在相对较宽范围的颗粒与细胞比下对于磁性(纯化的)捕获的靶细胞的纯度和产率均产生优异的结果。

测量可商购获得的磁性颗粒具有170nm的流体动力学直径，并且还如这个实施例中所述进行滴定，结果在下面的表7中示出。

表7

颗粒与细胞比	纯度％	产率％
			10:1	93.7	88.7
15:1	91.0	60.0
			20:1	95.2	62.0
30:1	93.9	37.0

这种可商购获得的磁性颗粒未表现出足够宽的颗粒与细胞使用比，使得可获得可靠且可再现的结果，因此这表明此类常规磁性颗粒与HGMS型磁性分离方法的使用不相容。用这些磁性颗粒滴定时产率的快速损失最可能是由于在HGMS柱中的金属(或铁磁性)基体中截留相对较大尺寸的磁性颗粒，从而导致保留在去磁化HGMS柱上的磁性标记的细胞的回收低效。如本领域技术人员将理解的，此类常规磁性颗粒实际上只能与强外磁场磁性分离器(诸如上述研究中使用的四极型磁性分离器)一起使用。

8.根据上述实施例1和3产生的纳米磁性颗粒的稳定性

为了评估本发明的纳米磁性颗粒的长期稳定性，根据上述实施例1和3制备链霉亲和素缀合颗粒和大鼠抗小鼠CD19抗体缀合颗粒。然后将这些颗粒的多个小等分试样储存在三种不同温度(4℃、25℃和37℃)下，并且在两个月的过程中的各个时间点进行磁性细胞分离测试以监测这些纳米磁性颗粒的整体生物稳定性。BioLegend的MojoSort^TM小鼠CD4T细胞分离试剂盒(目录号480005)是阴性选择测试，所述测试使用链霉亲和素纳米磁性颗粒连同与生物素化抗体混合物以便磁性选择所有CD4阴性细胞。另外，BioLegend的MojoSort^TM缓冲液和MojoSort^TM磁体用于执行这个实施例中所描述的细胞选择方案。来自磁性分离步骤的“未受影响的”细胞或上层清液包含期望的CD4-阳性细胞。然后在流式细胞仪(具有CellQuest软件的FACSCalibur；BD Biosciences，San Diego，CA)上分析这些“未受影响的”细胞，以便确定靶标CD4-阳性细胞的纯度和产率。还使用BioLegend的MojoSort^TM小鼠CD19纳米珠(BioLegend，目录号480001)进行类似分析，所述纳米珠是用于阳性选择CD19阳性细胞的大鼠抗小鼠CD19抗体缀合纳米磁性颗粒。

图4和图5分别示出使用链霉亲和素纳米磁性颗粒和适当的生物素化抗体阴性选择的CD4阳性细胞的纯度和产率，所述纳米磁性颗粒和所述生物素化抗体在各种温度下储存并且在两个月的过程中测试细胞分离性能。

类似地，图6和7分别示出大鼠抗小鼠CD19抗体缀合纳米磁性颗粒的纯度和产率，所述纳米磁性颗粒在各种温度下储存并且在两个月的过程中测试细胞分离性能。需注意，称为CD45R/B220的非交叉反应的荧光标记的B细胞特异性抗体(目录号103223；BioLegendInc.，San Diego，CA)用于鉴定磁性选择的B细胞。

这些稳定性研究的结果清楚地证实本发明的纳米磁性颗粒的优异的生物稳定性。在这些研究中所使用的两组纳米磁性颗粒在37℃的升高温度下具有至少30天或更多天的生物稳定性，这可推断出在4℃下超过多于4年的生物稳定性，这一事实可归因于本说明书中所提出的可取得专利性的纳米磁性颗粒组合物和合成设计。相比之下，已经报道尺寸在80nm至1000nm范围内的常规磁性颗粒即使在4℃冷藏时也只具有几个月至约20个月范围内的储存寿命或生物稳定性。

9.颗粒尺寸分布的比较

测量在靶标细胞分离市场中高度利用的可商购获得的各种常规磁性颗粒的颗粒尺寸分布，并且将其与使用上述实施例1产生的那些进行比较。使用动态光散射(MalvernNano-S ZetaSizer；Westborough，MA)进行这些测量，并且将各种“尺寸组”中的颗粒百分比作为实际颗粒尺寸的函数进行绘图，如图8所示。在Malvern Nano-S ZetaSizer仪器上测量流体动力学直径，所述仪器使用‘动态光散射’原理，由此用激光照射颗粒，并且针对强度波动分析散射光。本发明的纳米磁性颗粒(在图8中标记为“BioLegend”)具有约130nm的流体动力学直径和相对不显著数量的直径大于约300nm的颗粒(为了使磁性颗粒在基于‘外场’和‘内场’的磁性分离器中同样好地进行的重要标准)。需注意，图8中标记为“常规颗粒‘A’”的颗粒具有约82nm的流体动力学直径，因此将只适合与‘内场’生成柱或HGMS柱(也参见上面的图3)一起使用。

10.使用HGMS选择的细胞的透射电子显微镜

在这项研究中，通过HGMS使用市售HGMS相容的磁性颗粒(图9，图A)和本发明的靶向纳米磁性颗粒(图9，图B)来磁性选择细胞。图9所示的代表性电子显微照片使用磁性选择的细胞的55nm冷冻切片并在透射电子显微镜上成像而产生。使用MojoSort^TM小鼠CD19纳米珠(BioLegend，CA)和商业小鼠CD19微珠(Miltenyi，Germany)根据BioLegend和Miltenyi推荐的方案制备来自C57BL/6小鼠脾的单细胞悬液以离析CD19+B细胞。通过用CD45R/B220(克隆RA3-6B2)PE染色所得细胞并由流式细胞术分析来鉴定离析的CD19细胞纯度(来自BioLegend的为97％，来自Miltenyi的为94.9％)。然后将细胞离心，并且将细胞沉淀物在改良的Karnovsky’s固定剂(2.5％戊二醛和2％多聚甲醛的0.15M二甲胂酸钠缓冲液，pH为7.4)中重悬4小时。然后将制备物在1％四氧化锇的0.15M二甲胂酸盐缓冲液中后固定1小时，并在2％醋酸铀酰中整块染色1小时。然后将样品在乙醇中脱水，包埋在Durcupan环氧树脂(Sigma-Aldrich)中，在Leica UCT超薄切片机上以50至60nm切片，并在弗姆瓦(formvar)和碳涂覆的铜网格上捡取。将切片用2％醋酸铀酰染色5分钟，并用佐藤氏铅(Sato's lead)染色剂染色1分钟。然后将网格在JEOL 1200EX II(JEOL，Peabody，MA)透射电子显微镜上观察，并使用Gatan数字相机(Gatan，Pleasanton，CA)拍照，或者使用配备有Eagle 4k HS数字相机(FEI，Hilsboro，OR)的Tecnai G2Spirit BioTWIN透射电子显微镜观察。

在来自每种样品类型的40个图像上，与常规标记的磁性颗粒相比，类似地观察到本发明的靶向纳米磁性颗粒数量较低。这些电子显微照片清楚地显示，结合至靶细胞的本发明的靶向纳米磁性颗粒比显示由常规标记的磁性颗粒结合的细胞的显微照片中的要少得多。这些显微照片中的箭头对这些细胞表面上可视化磁性颗粒的位置作标记。这(每个细胞用非常少的纳米磁性颗粒来介导磁性分离的能力)是本发明的靶向纳米磁性颗粒的非常重要的属性，因为此类磁性选择的细胞基本上处于“天然的”或“未受影响的”状态，极少地(如果有的话)扰乱细胞的生物过程。这使得细胞以生物完整和响应性状态被捕获(参见实施例12)。

11.纳米磁性颗粒冻干研究

将根据上述实施例3和4产生的小鼠抗CD19缀合纳米珠(总共2x10⁸个颗粒)和SAv缀合纳米珠(总共2x10⁸个颗粒)分别重悬于各种补充的溶液中，并且在Genesis Pilot冻干机(SP Scientific)上经受3天的冻干(Lyo)周期。具体地，将硅烷化玻璃小瓶中所包含的颗粒悬浮液冷冻至-46℃，然后在-80℃下冷冻3小时，并且回到-46℃，并在密封的真空室中保持3天。然后将温度升高至22℃。然后用PBS重构冻干的纳米磁性颗粒，并且使用MojoSort^TM小鼠CD19纳米珠(BioLegend Inc.，San Diego，CA；目录号480001)和MojoSort^TM小鼠CD4T细胞分离试剂盒(BioLegend Inc.，San Diego，CA；目录号480005)测试性能。结果分别在下面的表8和9中示出。

表8：通过使用重构的冻干(lyo)CD19纳米珠进行的小鼠CD19阳性选择的纯度和产率

表9：通过使用重构的冻干(lyo)SAv颗粒进行的小鼠CD4阴性选择的纯度和产率

这些冻干和重构的纳米磁性珠显示出优异的生物活性保留，这表明冻干有利于将本发明的靶向纳米磁性珠储存/稳定性延长很长时间段。

12.磁性选择的细胞的功能研究

磁性选择的细胞通常用于下游加工，诸如基因/蛋白质/RNA谱分析；然而，许多(如果不是大多数的话)可商购获得的磁性颗粒对细胞具有毒性效应，因此，获得连接有磁性颗粒的活细胞或有活力细胞以供进一步研究/探测是相当具有挑战性的。在这项研究中，在磁性离析靶CD4+细胞之后，针对细胞功能性对本发明的靶向纳米磁性颗粒和广泛使用、可商购获得、缀合至抗小鼠CD4抗原的抗体的磁性颗粒进行并行测试。

简而言之，使用HGMS柱(目录号130-042-201；Miltenyi BiotecInc.，Auburn，CA)测试大鼠抗小鼠CD4抗体(克隆RM4-5；目录号100506；BioLegend Inc.，San Diego，CA)缀合纳米磁性颗粒(如上述实施例3中所述制备)和抗CD4(克隆L3T4；目录号130-049-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)缀合微珠。本发明的抗CD4缀合纳米磁性颗粒具有127nm的流体动力学直径，而L3T4缀合微珠具有82nm的流体动力学直径。下面的表10示出在根据制造商说明书用于从小鼠脾中离析CD4+细胞时从这两种类型的这些磁性颗粒中离析的CD4+细胞的纯度和产率。

表10

在磁性离析CD4+细胞后，将来自两种离析方法的等量CD4+细胞(1x 10⁶个细胞)接种到用不同浓度的小鼠抗CD3(克隆17A2；目录号100201；BioLegend Inc.，San Diego，Ca)抗体涂覆并补充有1ug/mL可溶性小鼠抗CD28(克隆37.51；目录号102101；BioLegend Inc.，San Diego，CA)的96孔微板，并且在37℃下孵育3天。接下来，将测量活细胞代谢活性的荧光氧化还原标记物刃天青(目录号TOX8-1KT；SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)的溶液以10％体积比添加到孔中，并且在孵育7小时之后使用SPECTRAmax Gemini XPS荧光微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量相对荧光强度。相对荧光单位(RFU)相对于用于涂覆微孔的抗小鼠CD3抗体的浓度的绘图在图10中示出。需注意，在图10中，荧光强度越高，活细胞数就越高。

这种功能细胞测定的结果清楚地证实，本发明的纳米磁性颗粒对磁性选择的细胞不具有显著的毒理学效应，即使这些纳米磁性颗粒大于测试的商业磁性微珠。

13.微泡与纳米磁性颗粒结合用于细胞离析的组合用途

微小尺寸的漂浮气泡是中空(或充气)的微米尺寸的球体，其可商购获得、具有用于靶向感兴趣的部分的官能化表面或涂覆的配体。可与细胞特异性配体(例如，细胞抗原特异性抗体)缀合并用于离析特定细胞群的可商购获得的实例包括来自Targeson(SanDiego，CA)的气体包封微泡和来自Akadeum Life Sciences(Ann Arbor，MI)的漂浮微泡。研究文献中所描述的实例包括Shi等人，Methods，64，102(2013)的全氟化碳微泡、Hsu等人，Technology(Singapore World Science)，3，38(2014)的玻璃微泡、Liou等人，PLoS One，20，10(2015)的白蛋白微泡以及Shi等人，PLoS One，8，1(2013)的充气免疫微泡。描述使用基于微泡的系统用于离析分析物或细胞的专利文献的实例包括美国专利和公布的专利申请号5116724、5246829、8835186、US2003/0104359A1、US 2007-0036722A1和US 2011/0236884A1。这些实例说明使用基于浮力的系统用于特异性离析靶细胞和分析物的价值。然而，在本发明之前，没有一项发明将基于浮力的系统与磁性纳米颗粒组合以提供更快、更高效和更有效的期望靶离析。

在这个实例中，描述可取得专利的方法，其中任何组合物的靶向微泡和任何组合物的靶向纳米磁性颗粒均可依序和/或同时用于获得一个、两个或三个感兴趣的细胞群。磁性和漂浮离析的组合或“磁性漂浮”程序将使有困难的分离得以实现。细胞离析的此类“磁性漂浮”方法显著减少离析不同感兴趣细胞所需的时间和资源，并且可以非常高的纯度获得细胞群。本发明的磁性纳米颗粒特别适合于这种应用，这是由于本发明的磁性纳米颗粒在各种流体中的高稳定性、小尺寸、更高的磁性响应特性、与其他磁性颗粒相比在更低颗粒与细胞比下分离细胞的能力以及与其他磁性颗粒相比快速响应于磁场的能力。这些优点先前没有实现和/或商业化。图11示出基本原理。

鉴于图11，如果将包含两个期望亚群(A和B)的不同细胞类型(A、B、C、D)混合物与具有靶向一种细胞类型(A)的微泡和靶向第二类型(B)的磁性颗粒的反应混合物合并，然后使第一组A细胞漂浮到表面，同时将第二组B细胞吸引到强磁场(诸如上述实施例5中所描述的四极磁行分离器)，这将使得磁化靶细胞与微泡靶向细胞的悬浮方向成直角地分离。以这种方式，两个细胞群可同时离析，并且可从相同的初始反应混合物中单独收获以供进一步使用。在这个简单的实施例中，可能期望两个不同细胞群(A和B)以供进一步使用，并且它们可容易收获。可替代地，一个群体可能是不需要的细胞，其例如以将其作为第二离析群体的潜在污染物去除的意图而弃去。最后，还可收获第三“剩余部分”群体(在这个实例中是细胞类型C和D)，即不被微泡或磁性颗粒靶向的群体以供进一步使用，因为这种(这些)群体也可在收获两个靶向群体(A和B)时被保留下来。

作为背景，图12示出仅使用微泡离析小鼠CD19+细胞的原理。在这个实施例中，将大鼠抗小鼠CD19(克隆6D5；目录号115502；BioLegend Inc.，San Diego，CA)缀合微泡(使用上述实施例3中所描述的缀合方法制备，不同之处在于对于所有洗涤步骤使用离心)与小鼠脾细胞一起在旋转器上的小微量离心管中在4℃下孵育15分钟(参见图12中的(a))。然后将细胞悬浮液转移到试管中并用等渗细胞缓冲液稀释至总体积为4mL，并以300x g离心5分钟(参见图12的(b))。然后将漂浮的细胞轻轻地倾倒或吸出并转移到新的试管中(参见图12的(c))。然后用荧光CD45R/B220抗体缀合物(藻红蛋白缀合的大鼠抗小鼠/人CD45R/B220；目录号103207；BioLegend Inc.，San Diego，CA)染色细胞，并将所收集的细胞在流式细胞仪(具有CellQuest软件的FACSCalibur；BD Biosciences，San Diego，CA)上进行分析。下面的表11示出使用此类抗体缀合微泡获得的小鼠CD19+靶细胞的纯度和产率。

表11

	离析前	离析后
			纯度	55％	98.6％
产率	100％	92.4％

实施例i：用于稀有细胞离析的磁性漂浮方法

用于离析稀有细胞(即诸如干细胞、循环肿瘤细胞、胎儿细胞、内皮细胞等的细胞)的可商购获得的方法是基于磁性颗粒的两步方案，其中首先进行阴性消除步骤以去除不需要的细胞，随后进行洗涤步骤和阳性选择步骤来捕获稀有细胞。由于固相材料(即磁性和非磁性珠)的非特异性结合以及靶向和结合至这些稀有细胞的巨大困难，稀有细胞的直接阳性选择仅获得有限的成功，所述稀有细胞以非常低的频率(通常为总共每1百万(或更多)个细胞1个靶细胞)存在。此外，通常用于直接阳性选择稀有细胞的起始细胞悬浮液是非常具有挑战性的细胞制备物，诸如全血、血沉棕黄层和/或裂解的全血。起始或天然细胞悬浮液的任何显著操作对存在于样品中的任何稀有细胞的回收/产率具有消极影响，这是由于在细胞样品处理的每个阶段经历固有的细胞损失。

图13示出用于使用CD45抗体(克隆2D1-抗人CD45；目录号368502；BioLegendInc.，San Diego，CA)缀合微泡的方案。CD45微泡与缀合至纳米磁性颗粒(优选根据本发明制备的纳米磁性颗粒)的稀有细胞特异性CD326抗体(克隆9C4-抗人CD326[EpCAM]；目录号324202；BioLegend Inc.，San Diego，CA)结合使用。在一起使用的情况下，颗粒的组合使得以单一步骤实现直接且有效的循环肿瘤细胞富集。

在图13中，(a)表示标准组织培养管中的与可商购获得的磁性分离器相容的反应混合物。在进行孵育步骤以使靶向漂浮颗粒群体和磁性颗粒群体结合至其相应靶细胞之后，将管插入到磁性分离器中，其中磁性颗粒和同源细胞被吸引至磁场、在管壁上，同时，微泡使其同源细胞浮起到表面(b)。当管仍在磁性分离器中时，缔合微泡的细胞可在不干扰磁性保留细胞的情况下吸出或者简单地倒掉。倾析管(b)并将其从磁性分离器中取出后，将这些稀有肿瘤细胞的非常纯的悬浮液留在管(c)中以进一步询问和研究。

实施例ii：用于以非常高的纯度离析人CD4+细胞的磁性漂浮方法

因为靶向CD4抗原受体的抗体也在单核细胞上共表达，所以上述图13所示的基本原理也可应用于离析人CD4+淋巴细胞。当前用于以高纯度从外周血单核细胞中离析人CD4+细胞的方法需要预富集步骤(用磁性颗粒或通过粘附到塑料板)，以去除污染的单核细胞。然后使用抗CD4涂覆的磁性颗粒来离析CD4+淋巴细胞。

如图14所示，将识别单核细胞标记物CD14的单核细胞特异性抗体(诸如克隆号63D3(目录号367102；BioLegend Inc.，San Diego，CA))缀合至微泡，并且将抗CD4特异性抗体(诸如克隆号SK3(目录号344602；BioLegend Inc.，San Diego，CA))缀合至纳米磁性颗粒。在使用磁性漂浮细胞离析的情况下，将漂浮的CD14/CD4双阳性单核细胞从CD4单阳性T细胞中提离，其用磁力捕获到管壁。这导致处理时间显著减少，并且可实现生产量增加。

定义：

在上述本发明的背景下以及下面的权利要求书中，以下术语将被理解为具有所赋予的含义。除了这些术语之外，必要时在说明书中的其他地方定义其他术语。除非在下文或本说明书中其他地方另有明确定义，否则本说明书中使用的术语将具有其本领域公认的含义。

如本文所用，除非上下文另有清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。

如本文所用，术语“约”是指与指定值相差大约+/-10％的变化。应理解，这种变化总是包括在本文提供的任何给定的值中，无论是否明确提及。

“分析物”是指可能疑似存在于样品(即生物样品)中的待检测物质。分析物可以是存在天然存在的特异性结合配偶体或可制备特异性结合配偶体的任何物质。因此，分析物是可结合至一种或多种特异性结合配偶体或被一种或多种特异性结合配偶体结合的物质。

“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。这个术语涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合抗体片段，以及由免疫球蛋白基因序列工程化的分子所述分子特异性结合感兴趣的抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其继而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端界定了主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别是指这些轻链和重链。

抗体作为完整的免疫球蛋白存在，或作为通过用各种肽酶消化产生的良好表征的许多抗原结合抗体片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下方消化抗体以产生Fab的二聚体F(ab)’₂，其本身是通过二硫键接合到VH-CH1的轻链。F(ab)’₂在温和条件下可还原以断裂铰链区中的二硫键，从而使(Fab’)₂二聚体转化成Fab’单体。Fab'单体实质上是具有部分铰链区的Fab。虽然各种抗原结合抗体片段根据完整抗体的消化加以定义，但是技术人员将了解，此类Fab'片段可以化学方法或通过利用重组DNA方法来从头合成。因此，在本发明的背景下，术语“抗体”还包括通过修饰全抗体产生的或使用重组DNA方法从头合成的抗原结合抗体片段。抗体包括单链抗体(作为单一多肽链存在的抗体)、单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链接合在一起(直接或通过肽连接子)以形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异源二聚体，其可从包括直接接合或通过编码肽的连接子接合的编码VH和VL的序列的核酸表达。虽然VH和VL作为单一多肽链彼此连接，但是VH和VL结构域非共价缔合。scFv抗体和许多其他结构将天然聚集、但化学分离的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转化成折叠成与对于本领域技术人员来说已知的抗原结合位点结构基本上相似的三维结构的分子。

高亲和力结合对的“结合配偶体”或“成员”是结合对(即一对分子，其中分子中的一个结合至第二分子)的成员。特异性结合的结合配偶体被称为“特异性结合配偶体”。“高亲和力”结合对是成员以高亲和力结合的结合对。除了通常用于免疫测定中的抗原和抗体结合配偶体之外，其他特异性结合配偶体可包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)、碳水化合物和凝集素、具有互补核苷酸序列的核酸、配体和受体分子、辅因子和酶，酶抑制剂和酶等。此外，特异性结合配偶体可包括为原始特异性结合配偶体的类似物(例如分析物-类似物)的配偶体。免疫反应性特异性结合配偶体包括抗原、抗原片段、抗体(单克隆和多克隆)和抗原结合抗体片段。

“生物样品”是从患者或受试者取得的生物材料的样品，以及从组织培养物或组织培养上层清液或可包含感兴趣的分析物的任何其他来源取得的样品。生物样品包括从体液和组织(例如，来自活检物)或组织制备物(例如，组织切片、匀浆等)取得的样品。“体液”是获自或来源于受试者的适合根据本发明使用的任何流体。此类流体包括全血、血液级分(诸如血清和血浆)、尿液、汗液、淋巴液、粪便、腹水、精液、痰、乳头吸出物、术后血清肿、伤口引流液、唾液、滑液、骨髓、脑脊液、鼻腔分泌物、羊水、支气管肺泡灌洗液、外周血单核细胞、总白细胞、淋巴结细胞、脾细胞和扁桃体细胞。

术语“例如”、“诸如”等意指“例如”，因此不限制其解释的术语或短语，而术语“即”等术语意指“也就是”，因此限制其解释的术语或短语。

如本文所用，术语“一个表位”或“多个表位”或“感兴趣的表位”是指任何分子上被识别并且能够结合至其特异性结合配偶体上的互补位点的位点。携带表位的分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是多肽、蛋白质、半抗原、糖类抗原(诸如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖，并且所述表位的特异性结合配偶体可以是但不限于抗体，例如自身抗体。通常，表位包含在较大的分子框架内(例如，在蛋白质抗原活性区的背景下，表位是蛋白质的具有能够由与所述表位反应的抗体结合的结构的区域或片段)并且是指已知与特异性结合配偶体接触的精确残基。如已知的，抗原或抗原活性片段有可能包含多于一个表位。

“本文”意指在本申请中，包括可以引用的方式并入的任何内容。

术语“包含”、“包括”及其变化意指“包括但不一定限于”。因此，例如，短语“组合物包含药物和载体”意指组合物包含药物和载体，但同样还可包含一种或多种其他未指明组分。

如本文所用，特异性结合对的成员(例如，抗原和特异性结合这种抗原的抗体)之间的相互作用的背景下的“特异性的”或“特异性”是指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合至”和类似的术语是指抗体特异性结合至抗原(例如，优先与抗原反应)而不特异性结合至其他实体的能力。可例如通过诊断免疫测定(例如，放射免疫测定(“RIA”)和酶联免疫吸附测定(“ELISA”))、表面等离子体共振或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定特异性结合至特定抗原的抗体或抗原结合抗体片段。在一个实施方案中，术语“特异性结合”或“特异性反应的”指示靶分析物的结合偏好(例如，亲和力)比非特异性靶分子(例如，随机生成的缺乏特异性识别位点的分子)高至少约2倍，更优选地至少约5倍、10倍、100倍、1，000倍、100万倍或更多倍。

术语“标记的”是指用可检测标记标记或在使用期间用可检测标记变成标记的分子(例如，抗体、纳米颗粒等)。“可检测标记”包括可检测或可变得可检测的任何部分。参考标记的可分离颗粒，“直接的标记”是与颗粒共价或非共价连接或缔合的可检测标记，并且“间接的标记”是特异性结合颗粒的可检测标记。因此，间接的标记包括为检测剂部分的特异性结合配偶体的部分。生物素和抗生物素蛋白是可采用的此类部分的实例，例如通过使生物素化抗体与标记的抗生物素蛋白接触以制备间接标记的抗体(以及因此标记的纳米磁性颗粒)。“标记”是指可检测的化合物或组合物，诸如直接或间接缀合至靶特异性结合成员的化合物或组合物。标记本身可以是可单独检测的(例如，拉曼标记、放射性同位素、荧光标记等)，或者在酶标记的情况下可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

“微粒”是指可通过任何合适的方法(例如，磁性分离或缔合、超速离心等)回收的小颗粒。微粒通常具有近似约1微米或更小的平均直径。

“纳米颗粒”是指可通过任何合适的方法(例如，磁性分离或缔合、超速离心等)回收的小颗粒。纳米颗粒通常具有近似约500纳米(nm)或更小、优选约20nm至约300nm的平均直径或在这种1nm–约500nm尺寸范围内的任何尺寸或尺寸范围。

根据本发明的“可取得专利的”方法、机器或制品意味着主题在进行分析时满足针对专利性的所有法定要求。例如，关于新颖性、创造性等，如果后续审查揭示一个或多个权利要求涵盖将否定新颖性、创造性等的一个或多个实施方案，则按定义限制于“可取得专利的”实施方案的权利要求明确排除不能取得专利的实施方案。此外，本文所附的权利要求书应被解释为提供最宽的合理范围并保持其有效性。此外，如果对专利性的一项或多项法定要求进行修改，或者如果从本申请提交或作为专利被授权之时到一个或多个所附权利要求的有效性受到质疑之时，评估是否满足针对专利性的特定法定要求的标准发生了变化，则权利要求书应以以下方式解释：(1)保留其有效性；以及(2)在所述情况下提供最宽泛的合理解释。

“多个”意指多于一个。

术语“分离的”、“纯化的”、“离析的”等意味着样品或反应混合物中的一种或多种组分已经从存在于混合物中的一种或多种其他组分中物理地去除或在所述一种或多种其他组分存在下稀释。

术语“物种”在本文中在各种背景下使用，例如特定的靶生物分子物种。在每种背景下，所述术语是指在特定背景下所提及种类的化学模糊分子的群体。

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***

按照本公开，在不进行过度实验的情况下就可制备和执行本文所公开和要求保护的所有组合物、制品、装置、系统和方法。虽然本发明的组合物、制品、装置、系统和方法已经根据优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可向组合物、制品、装置、系统和方法施加变化。对于本领域技术人员显而易见的所有此类变化和等同物，无论是现在存在的还是以后开发的，均被视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内。

说明书中提及的所有专利、专利申请和公布指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和公布出于所有目的而以引用的方式整体并入本文，并且其程度如同出于任何和所有目的而明确且单独地指示每个单个公布以引用的方式整体并入。

本文说明性地描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任何元素时适当实施。因此，例如，在本文的每个例子中，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个可用其他两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用此类术语和表达时并不意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，各种修改在所要求保护的本发明范围内是可能的。因此，应理解，虽然本发明已由优选实施方案和任选特征具体公开，但是本领域技术人员可采用本文公开的概念的修改和变化，并且此类修改和变化被视为在由所附权利要求书限定的本发明的范围内，其甚至也可包含本发明的其他实施方案。

Claims

1.一种靶向纳米磁性颗粒，其包括：

(a) 磁性核颗粒；

(b) 包封所述磁性核颗粒的玻璃层；

(c) 蛋白质/聚合物复合层，其中所述蛋白质/聚合物复合层（i）包含血清白蛋白并且（ii）通过从45℃加热至85℃共价并永久结合到所述玻璃层；以及

(d) 靶向部分，所述靶向部分包括生物亲和配体对的共价缀合至所述蛋白质/聚合物复合层中的血清白蛋白的一个成员，

其中所述靶向纳米磁性颗粒具有30 nm-300 nm的直径。

2.根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒，其进一步包括以下特征的至少一个：

（a）所述磁性核颗粒被胶溶化；

（b）所述磁性核颗粒包括磁铁矿(Fe₃O₄)晶体；

（c）所述玻璃层是由有机官能烷氧基硅烷分子形成的硅烷层；

（d ）所述靶向部分选自由以下各项组成的组：抗体、抗原结合抗体片段、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合胞外结构域、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素；

（e ）可检测标记;

（f ）所述磁性核颗粒由以下各项构成：氧化亚铁；Fe₃O₄或Fe₂O₃；氧化铬；或包含选自由Mn、Co、Ni、Zn、Gd和Dy组成的组的取代金属离子的稳定的金属氧化物；和

（g ）所述血清白蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

3.根据权利要求2所述的靶向纳米磁性颗粒，其中所述有机官能烷氧基硅烷分子包含可偶联端基。

4.根据权利要求3所述的靶向纳米磁性颗粒，其中所述可偶联端基选自由氨基、巯基、羧基和羟基端基组成的组。

5.根据权利要求2所述的靶向纳米磁性颗粒，其进一步包括特征（h ）所述蛋白质/聚合物复合层进一步包含葡聚糖或酪蛋白。

6.根据权利要求2-5任一项所述的靶向纳米磁性颗粒，其中所述所述磁性核颗粒包括磁铁矿(Fe₃O₄)晶体，所述磁铁矿晶体具有5 nm-300 nm的直径。

7.根据权利要求2-5任一项所述的靶向纳米磁性颗粒，其中所述磁性核颗粒由氧化铬组成，其中氧化铬为CrO₃。

8.根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒，其用于诊断和/或治疗。

9.一种组合物，其包含多个根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多个靶向纳米磁性颗粒包括多个靶向纳米磁性颗粒种类，其中每个靶向纳米磁性颗粒种类包括不同的靶向部分。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，其是干燥且易分散的组合物或液体组合物。

12.一种试剂盒，其包括在容器中的根据权利要求9或10所述的组合物和用于使用所述组合物的说明书。

13.一种制备根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒的方法，其包括：

(a) 获得磁性核颗粒，其具有多个30 nm-300 nm的直径；

(b) 用玻璃层包封所述磁性核颗粒以形成第一包封磁芯颗粒，其中所述玻璃层具有1nm-50 nm的厚度；

(c) 将所述第一包封磁性核颗粒包封在蛋白质/聚合物复合层中以形成第二包封磁性核颗粒，其中所述蛋白质/聚合物复合层具有5 nm-50 nm的厚度；以及

(d) 将靶向部分共价缀合至所述第二包封磁性核颗粒，其中所述靶向部分包括生物亲和配体对的一个成员。

14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括：

(e) 将药物化合物或可检测标记结合至所述第二包封磁性核颗粒。

15.根据权利要求14所述的方法，其中将所将药物化合物或可检测标记共价结合至所述第二包封磁性核颗粒。

16.根据权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述靶向部分独立地选自由以下各项组成的组：抗体、抗原结合抗体片段、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合胞外结构域、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、出于靶向药物递送目的的药物化合物。

17.根据权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述磁性核颗粒被胶溶化。

18.一种形成生物分子/颗粒复合物的方法，其包括将权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒体外结合至与所述靶向纳米磁性颗粒的所述靶向部分直接或间接特异性反应的目标生物分子以形成生物分子/颗粒复合物。

19.一种分离生物分子/颗粒复合物的方法，其包括：

(a) 使已知或疑似包含目标生物分子的生物样品与根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒接触以形成生物分子/颗粒复合物；以及

(b) 使用磁场来离析所述生物分子/颗粒复合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中磁性柱分离或高梯度磁分离方法用于离析所述生物分子/颗粒复合物。

21.一种从生物样品中分离靶生物分子物种的方法，其包括：

(a) 在反应混合物中，使已知或疑似包含目标生物分子的生物样品与根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒接触以形成生物分子/颗粒复合物；以及

(b) 使用磁场来从所述反应混合物中离析所述生物分子/颗粒复合物。

22.一种从生物样品中分离多个靶生物分子物种的方法，其包括：

(a) 在反应混合物中，使已知或疑似包含目标第一生物分子物种和目标第二生物分子物种的生物样品：与靶向所述目标第一生物分子物种的根据权利要求1所述的靶向纳米磁性颗粒接触接触，以形成第一靶生物分子/颗粒复合物；并且与靶向所述目标二生物分子物种的靶向漂浮微粒接触，以形成第二靶生物分子/颗粒复合物；

(b) 使用磁场来从所述反应混合物中离析所述第一生物分子/颗粒复合物；以及

(c) 从所述反应混合物中分离所述第二靶生物分子/颗粒复合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向纳米磁性颗粒的所述磁性核颗粒包括磁铁矿(Fe₃O₄)晶体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述磁铁矿晶体具有5 nm-300 nm的直径。