CN101013132A - 一种免疫荧光磁球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫荧光磁球、及其制备方法和应用。免疫荧光磁球外壳层表面连接有单克隆抗体，粒径分布为70－105nm。可将荧光磁球表面修饰上氨基活性基团，然后用缩合剂将荧光磁球与抗体共价连接。此免疫荧光磁球在荧光显微镜下直接可见，具有定向性，能用于分离特异性物质，操作简单，不需要昂贵的仪器。
Description
技术领域
本发明涉及纳米磁性材料领域和生物学领域，具体地说，是免疫荧光磁性的纳米材料。
背景技术
目前磁性微粒(或称磁性微球)在生物医药方面的应用，以免疫磁性微球为代表，发展较快，也有很多成功应用的成果。近年磁性纳米材料在医学科学研究及临床诊治疾病中的应用越来越广泛，尤其发展较快、具有重要应用价值的当属免疫磁球。磁性纳米材料是构成磁性微球的重要组成部分，因此磁性微粒的应用也就是磁性纳米材料的应用。常用的磁性材料为γ-三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等。这些磁性材料具有较好的磁响应性，采用适当的方式可以方便地得到这些大小在纳米尺度的磁性材料。例如：取一定量的磁性材料分别溶于适量的蒸馏水中，过滤后混合。在室温中，保持搅拌，以一定速度向体系中加入碱溶液，滴加完后继续搅拌半小时。移至磁场中，使氧化铁颗粒沉降，除去上清液，反复用双蒸水洗涤，弃洗液，烘干、研磨，加入TritonX-100、正己醇、环己烷混匀，超声分散，过滤，即得氧化铁磁性纳米颗粒，再经高温锻烧，即得二氧化硅包裹的磁性纳米微球。
随着科学技术的发展，仅仅是磁性微粒已满足不了研究人员和相关应用人员的需求。因为，这种磁性粒子只是一种新材料，如要作为载体，还需进一步改进。近年磁性纳米材料在医学科学研究及临床诊治疾病中的应用越来越广泛，尤其发展较快、具有重要应用价值的当属免疫磁球。免疫磁球(Immunomagnetic Beads，IMB)是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。由于需要在磁性微球的表面结合上适当的抗体，因此要求所用的磁性微粒能通过其表面的化学基团与单克隆抗体牢固的结合。这种连接有吸附结合与共价结合两种形式，吸附结合依靠微球表面对抗体的非特异吸附力，而共价结合依靠微球表面的活性基团与抗体共价反应，后一种在实际应用中结果可靠，防止了因反应条件的变化而引起靶物质的丢失。免疫磁球主要用于细胞分离等方面工作。由于它能特异性地与靶物质结合并具有良好的磁响应性，因此将免疫磁性微球与含有欲分离的靶物质共同孵育，通过一个磁场装置时，与免疫磁球结合的靶物质就会被磁场滞留，从而与其他复杂物质分离开来。近年，临床上出现了一种磁分离仪(clinMACS)，用它分离的免疫标记细胞，用于临床治疗某些疑难病症。为临床医师增添了新的治疗手段。
在制备磁性微粒时，在其核中加入具有荧光特性的稀土元素-铕(Eu)，制成了既有磁性，也有荧光的荧光磁球。此研究成果已申请了专利(专利申请号：200610029899.6)，并2007.1.3号出版的中国专利报予以公开。
荧光标记的抗体，在临床诊断中发挥了巨大的作用。就流式细胞分选仪(FACS)而言，通过对标记不同荧光色谱的抗体的分选，确定了生理状态下，各组细胞的正常数值，病理情况下的各种生命活动成分的变化。为临床诊治提供了可靠的依据。
以上这些分离方法各有优、缺点：磁性粒子对靶物质进行分离时，缺乏定向性；免疫标记解决了定向的问题，但对结果的检测需要昂贵的仪器，耗资较高；免疫磁球能定向分离，但乏荧光物质，能用却看不见。鉴于此种形势，需要一种能用荧光显微镜看得到、表面修饰共价连接抗体能特异性结合靶物质、也能用简单的方法进行分离的工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫荧光磁性纳米微球。
本发明的第二个目的在于提供该免疫荧光磁性纳米微球的制备方法。
本发明的另一个目的是将这种免疫荧光磁性纳米微球应用于检测和分离纯化生物材料。
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种能用荧光显微镜看得到、表面修饰共价连接抗体能特异性结合靶物质、也能用简单的方法进行分离的工具，即“免疫荧光磁球”。经过实际应用，获得了令人满意的结果。
免疫磁球主要用于细胞分离等方面工作。由于它能特异性地与靶物质结合并具有良好的磁响应性，因此将免疫磁性微球与含有欲分离的靶物质共同孵育，通过一个磁场装置时，与免疫磁球结合的靶物质就会被磁场滞留，从而与其他复杂物质分离开来。利用这一原理，我们在制备磁性微球时，在其核中加入具有荧光特性的稀土元素-铕(Eu)，制成了既有磁性，也有荧光的荧光磁球。此研究成果已申请了专利(专利申请号：200610029199.6；公开号CN1888007)，并于2007年1月3号出版的中国专利报予以公开。
在原来我们发明的荧光磁球的基础上，在其表面修饰，共价连接了抗体。
本发明的免疫荧光磁球，为核壳型结构，包括内核与外壳，内核为包括三价铁离子与铕离子的复合物，外壳层表面连接抗体。
所连接的可以是单克隆抗体，如CD34、CD19和CD33。
这类免疫荧光磁球的粒径分布为70-105nm。
外壳可以是SiO2等。
免疫荧光磁球的制备方法，包括以下步骤：
a.使荧光磁球表面带氨基活性基团；
b.将表面带氨基活性基团的荧光磁球与抗体通过缩合剂连接。
缩合剂可选用N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)或乙酰基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)等。
抗体可以选用任何单克隆抗体，如CD19、CD33、CD34等。
步骤b中，所用的表面带氨基活性基团的荧光磁性纳米微粒与抗体的质量比为100∶1～100∶4。
荧光磁球可通过以下方法制备：
向二价铁离子、三价铁离子和铕离子的混合液中加入碱，取沉淀，洗涤研磨，得到铁离子与铕离子复合物的荧光磁球内核；将此荧光磁球内核包裹上外壳，外壳可以是SiO2等。
二价铁离子与铕离子摩尔之比为0.4-1.6，三价铁离子与铕离子摩尔之比为0.5-2。
所述碱选自NaOH、KOH或氨水等。
本发明的免疫荧光磁球弥补了磁性微粒、免疫磁球和荧光素标记抗体的不足。既具有定向性，能结合特异性靶物质，可以利用磁场定向分离。又因其具有荧光物质，能用荧光显微镜看得到，不需要昂贵的仪器，也可用简单的方法进行分离，可以应用于生物材料检测和分离纯化。免疫荧光磁球可广泛用于基础医学、临床医学、免疫学、环境检测、食品检测、蛋白工程分离、基因工程药学分离目的基因产物等领域。尤其是在通过对脐带血单个核细胞的分离获得了较理想的结果。
从Baidu、Google、Ncbi MedPub所查资料，目前已有磁性微粒、荧光磁球，免疫磁球，但未发现有免疫荧光磁球的报道。
附图说明
图1CD34单抗-免疫荧光磁球分离CD34+细胞显微组图
a.高表达CD34抗原细胞(400x)；
b.低表达CD34抗原细胞(200x)；
c.高表达CD34抗原细胞(200x)；
d.双光(荧光、电光)CD34+细胞。
图2CD19单抗-免疫荧光磁球分离CD19+细胞显微组图
a.免疫荧光磁球结合于CD19+细胞表面，并有明显的伪足样结构(400X)；
b.高表达CD19+细胞(左上)和CD19+细胞凋亡小体(右下)，表面仍有抗原物质存在(200X)；
c.2个CD19+细胞，中间为高表达细胞，下部为低表达细胞(200X)；
d.2个CD19+细胞，左下为类似于分叶核细胞(200X)；
e.高表达CD19抗原细胞，上方可见一碎裂的CD19+细胞凋亡小体(400X)；
f.左下为较典型的APC细胞，可见明显的多个胞膜突起形状(400X)；
g.CD19+细胞凋亡小体(200X)；
h.吖啶橙(AO)染色的脐血单个核细胞(200X)。
图3CD33单抗-免疫荧光磁球分离CD33+细胞显微组图
a.CD33抗原高表达的荧光细胞，胞浆中颗粒物质清晰可见(200X)；
b.CD33抗原阳性细胞(200X)；
c.低表达CD33抗原细胞(200X)；
d.3个CD33+细胞及多个凋亡小体(200X)。
具体实施方式
实施例1荧光磁球的制备
(a)取0.12mol FeSO4·7H2O、0.2mol FeCl3和0.2mol EuCl2·6H2O溶解于蒸馏水，搅拌，待完全溶解后，边搅拌边向溶液中滴加2.5mol/L NaOH，所得沉淀在60℃下陈化2.5h。用waterman4#滤纸或中华滤纸过滤，在磁场反复用双蒸水洗涤，90℃干燥24h，在玛瑙研钵中研磨至纳米级颗粒。
(b)取TritonX-100、正己醇、环己烷＝1∶1∶4的液体，混匀，待形成透明的乳胶液后，加入荧光磁球100mg，超声处理15min，再倒入三角烧瓶中，置22℃恒温水浴锅中搅拌30min，依次向反应体系中滴加28％氨水1min，搅拌30min后，加入正硅酸四乙酯2ml，搅拌反应12h，所得粒子在外磁场中用乙醇反复洗涤，650℃煅烧2h。即得到SiO2包裹的荧光磁球。
实施例2荧光磁球表面修饰加氨基
取500mg SiO2包裹的荧光磁球，加入25ml甲醇和15ml丙三醇，混合后，超声处理30min，弃上清，再取1.5ml AEAPS[N-(2-胺乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷]加入混合液中，超声处理40min，用甲醇和水洗涤2-3次，150℃真空干燥，收集粒子并将其配成1mg/ml溶液。经测定，粒径范围70-105nm。
实施例3CD34单抗-免疫荧光磁球的制备
取实施例2制备的荧光磁球1mg，置EP管中，加入生理盐水1ml，在外磁场中反复洗涤，最后加入880μl的PBS，1μg/μl的CD34抗体20μl，混合，再加入1mol/L的DCC(缩合剂)0.1ml，37℃孵育箱中反应15-30min，在外磁场中弃残液，加入1ml青、链霉素(各100U/ml)混合液，浸泡5-10min即可用于实验。
实施例4CD19单抗-免疫荧光磁球的制备
用2μg/μl CD19抗体代替实施例3中的CD34抗体，其余步骤与实施例3相同。
实施例5CD33单抗-免疫荧光磁球的制备
用3μg/μl CD33抗体代替实施例3中的CD34抗体，其余步骤与实施例3相同。
实施例6脐血单个核细胞的分离
取肝素抗凝的脐血50ml，0.9％NaCl稀释，加于装有1.077g/cm3的淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心30min，小心用尖吸管吸取雾状层单个核细胞，培养液洗涤2遍，细胞计数，待用。
实施例7免疫荧光磁球分离靶细胞
取实施例3、4、5中制得的免疫荧光磁球各10μl，分别与1×106的单个核细胞加入塑料离心管中，混合；37℃孵育箱中放置15min后，在离心管外加一永磁铁磁化10min，并在磁场中轻轻去除残液，并用生理盐水洗涤2遍，去除磁铁，收集细胞，待用。
分别取免疫荧光磁球分离的细胞悬液20μl滴加于载玻片上，上覆盖玻片，在340nm-550nm波长范围激发荧光，荧光显微镜下观察结果、照相记录。
结果如图1至图3所示。
Claims (10)
1、一种免疫荧光磁球，为核壳型结构，包括内核与外壳，内核为包括三价铁离子与铕离子的复合物，其特征在于，外壳层表面连接有抗体。
2、权利要求1的免疫荧光磁球，其特征在于，粒径分布为70-105nm。
3、权利要求1的免疫荧光磁球，其特征在于，外壳层表面连接的抗体为单克隆抗体。
4、权利要求1的免疫荧光磁球，其特征在于，外壳层为SiO2。
5、权利要求1-4任一项免疫荧光磁球的制备方法，包括以下步骤：
a.使荧光磁球表面带氨基活性基团；
b.将表面带氨基活性基团的荧光磁球与抗体通过缩合剂连接。
6、权利要求5的免疫荧光磁球制备方法，其特征在于，步骤b中，所述表面带氨基活性基团的荧光磁球与抗体的质量比为100∶1～100∶4。
7、权利要求5的免疫荧光磁球制备方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
8、权利要求5的免疫荧光磁球制备方法，其特征在于，所述荧光磁球的制备包括以下步骤：
向三价铁离子、二价铁离子与铕离子混合物中加入碱性溶液，取沉淀洗涤、干燥、研磨后，即得包括铁离子与铕离子复合物的荧光磁球内核；将所得的荧光磁球内核包裹外壳。
9、权利要求8的免疫荧光磁球制备方法，其特征在于，所述三价铁离子与铕离子的摩尔之比为0.4-1.6，二价铁离子与铕离子的摩尔之比为0.5-2；所述碱性溶液选自NaOH溶液、KOH溶液或氨水中的一种。
10、权利要求1-4任一项免疫荧光磁球在生物材料检测和分离纯化中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN104209087A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-17 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法 |
| CN107614458A (zh) * | 2015-05-01 | 2018-01-19 | 百进生物科技公司 | 稳定的纳米磁性颗粒分散体 |
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