CN104568923A - 电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒。用富集缓冲液将血液样本移至离心管中，并定容，混匀；离心，弃上清，裂解红细胞并重选细胞；加富集缓冲液，重悬细胞；离心，弃上清，加入富集缓冲溶液和EpCAM抗体磁珠，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座后除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤后得磁性微球体系；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体加到磁性微球体系中，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座上，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；置于电致化学发光检测仪中，测出肿瘤细胞表面抗原的含量。发明可显著提高检测外周血中循环肿瘤细胞抗原的检测范围和灵敏度，快速、准确、伤害性小。
Description
技术领域
本发明涉及外周血中循环肿瘤细胞抗原电化学发光免疫检测方法及试剂盒。
背景技术
在全球范围内，乳腺癌是女性群体中最常见的恶性肿瘤，在所有病例中，约有20-30%为“最凶险的乳腺癌”——HER2阳性乳腺癌。相对于其他类型的乳腺癌，HER2阳性乳腺癌的疾病进展速度更快，恶性程度更高，更容易复发和转移，预后也较差。
中国的乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，尤其在京、津、沪等大城市，乳腺癌已位居女性恶性肿瘤发病率之首。根据乳腺癌的生物学特性，可以把其分成4～5个分子亚群，不同的亚群有不同的预后和治疗策略。现代医学已经进入了乳腺癌分类治疗的时代，搞清患者的分子类型是正确治疗的前提，在所有乳腺癌患者中，属于HER2基因过表达者占20%-30%，和其他亚群乳腺癌相比，该类型乳腺癌患者更容易出现复发和转移。如果只接受常规综合治疗，HER2阳性乳腺癌患者的生存时间仅为HER2阴性患者的一半；相反，如果能及早确定HER2状态，及早采用针对性治疗，与普通乳腺癌患者相比，HER2阳性患者的生存机会就会接近HER2阴性患者。
自从1987年Slamon等发现了HER2在人类乳腺癌发病机制中的作用，而经典的抗HER2靶向治疗药物曲妥珠单抗自1998年经美国FDA批准用于临床以来也已应用了10余年，认为乳腺癌HER2状态是乳腺癌患者重要的预后因子和靶向药物疗效的预测因子。大量研究数据和临床实践已使大家在抗HER2治疗作用机制和临床疗效等方面达成一定的共识。而目前临床上检测HER2状态都是基于患者原发灶或者转移灶组织的检测，而这些检测往往会受到肿瘤组织（取材、固定和保存等操作不当）、检测方法、肿瘤异质性或变异等影响，造成患者的HER2状态无法确定，特别是一些复发转移性患者，以往肿瘤组织保存时间较长或者转移灶无法活检获取组织等情况，更无法在治疗过程中对患者进行动态的监测。针对HER-2阳性乳腺癌患者的靶向治疗，目前的临床指南是：① HER2阳性乳腺癌术后辅助治疗建议使用赫赛汀靶向治疗一年为标准治疗；② 进展期HER-2阳性乳腺癌建议赫赛汀使用至少一年，并推荐使用直至进展，甚至，在靶向维持治疗进展后仍可继续赫赛汀靶向治疗基础上更换新的化疗。
从HER-2阳性乳腺癌患者的生物学特征和靶向治疗的疗效，只有尽早、准确进行HER2状态的检测，才能对患者进行复发风险度准确评估和采取正确的针对性治疗（赫赛汀等靶向药物）。传统对石蜡包埋组织采用常规免疫组化法和FISH（原位荧光杂交）方法对组织标本制作和保存有较高的要求，因此，一旦这些手术或者活检组织标本不能满足检测要求，患者的HER-2状态就无法确定，肿瘤分子分型和分类治疗就无法进行，临床上屡见这类患者，如标本保存时间太长、术前化疗前标本留取太少、以往的检测方法不标准、反复检测HER-2属于临界状态、患者复发转移与原肿瘤生物学行为不符但转移灶无法重新活检等，临床上无法鉴定患者真正的HER-2状态；HER-2靶向药物赫赛汀本身相当昂贵，还有潜在的心脏毒性，这使得临床医生在患者使用靶向治疗的决策上左右为难、难以取舍。此外，除了客观有效率的评价之外， HER-2阳性乳腺癌患者接受靶向治疗期间处于稳定或者完全缓解情况下，目前临床上还无法对其进行进一步的动态疗效检测，循环肿瘤标记物和循环肿瘤细胞（CTC）检测只能在一定程度上发挥作用，但并非真正反映体内HER-2阳性乳腺癌细胞的动态变化和疗效。
目前，循环肿瘤细胞（CTCs）检测是目前公认的能够很好监测肿瘤患者体内肿瘤负荷的理想方法，在癌症治疗中，医生常常希望将循环肿瘤细胞水平作为监控和调整治疗和预后的诊断依据，但传统检测方法往往无法准确地确定患者体内的CTCs水平，CellSearch血液中循环肿瘤细胞系统是Veridex公司专有的一项技术，已通过美国FDA准入应用于预测有转移性的乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无进展存活率和总存活率。该检验方法可随时进行，便于对此类癌症患者进行连续监测。在欧洲，CellSearch也被认定是一个有效的诊断检验工具。我国已经完成了该项技术的临床研究，正在向国家FDA申请批件，研究结果与国外同类研究基本一致。CellSearch检测的工作原理是，采用了一种可同铁微粒相结合的抗体（称为铁磁流体），这种抗体/铁磁流体同CTCs有极强的特异性结合能力。结合后再应用强力磁体将这些CTCs从血液样本中提取出，达到细胞富集的作用，在进行生物或化学染色后可以在CellSearch检测仪上准确识别CTCs并计数。目前认为晚期乳腺癌患者检测血液中循环肿瘤细胞系统 CTC 临界值是≥5 CTCs，研究已经证明，乳腺癌患者治疗前≥5 CTCs者PFS（无进展生存时间）较短，在治疗后如果患者的循环肿瘤细胞数降低到5个以下，则其PFS将得到明显延长。因此，CTCs检测对于乳腺癌患者预后和疗效评估十分重要，能够改进晚期乳腺癌的治疗策略。目前市场上CellSearch检测仪的价格大约在400万元上下，不计检测试剂，一般医疗机构无法引进该项检测技术，一旦引进，其检测的价格亦不菲。因此，普通患者无法承受其作为常规检测，更不能作为治疗期间的动态监测。
近年来，生物分析技术与纳米技术的深入结合是国际生物医学分析技术领域的前沿和热点问题。与传统材料相比，纳米级的颗粒存在比表面积大和小尺寸效应等特点。而磁性高分子微球的研究始于20世纪70年代，是利用纳米技术制备出的一种具有磁性特性的微球。此类微球一方面，它具有有机聚合物微球的众多特性，如可通过共聚、表面改性等途径，赋予其表面多种反应性官能团(如羟基、氨基、羧基等)，可通过吸附或共价键合的方式与抗体、DNA、RNA等生物活性物质结合；另一方面，由于它具有磁性可以很方便地在外加磁场作用下从介质中分离出来。与传统的分离技术相比，该方法将分离与富集结合于一体，其较大的比表面积大大提高了分离过程中反应物之间相互作用的动力学速度，具有高效、快速、非玷污的优点。因此，磁性高分子微球被广泛地应用作分离材料和载体，如在临床诊断、靶向药物、细胞分离、细胞标记等领域有着广阔的应用前景。
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了从放射免疫检测（RIA），酶联免疫检测（ELISA），到化学发光免疫检测（CLIA）几个过程。
本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。CLIA是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与RIA和ELISA相似，不同之处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。其中电化学发光技术具有试剂稳定（2～5℃可保持一年以上）、线性范围宽（＞104）、灵敏度高（可达pg／ml或pmol水平）、特异性优异、检测菜单丰富、准确性好、精密度高和操作简便（检测时间：9/18min）等优点，是目前非常先进的标记免疫测定技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒。
一种电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法，用富集缓冲液将血液样本移至离心管中，并定容，混匀；离心，弃上清，裂解红细胞并重选细胞；加富集缓冲液，重悬细胞；离心，弃上清，加入富集缓冲溶液和EpCAM抗体磁珠，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座后除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤后得磁性微球体系；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体加到磁性微球体系中，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座上，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；置于电致化学发光检测仪中，测出肿瘤细胞表面抗原的含量。
所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记EpCAM抗体的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤，然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。
所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记二抗的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；再加入EpCAM抗体溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。
所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体。
所述的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的合成方法如下：首先分别称取0.2g二氯二联吡啶钌Ru(bpy)2Cl2，0.2gNaHCO3和0.15g 2,2'-联吡啶-4,4'二羧酸(dcbpy)置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL80%甲醇，混合溶液在硅油浴80℃下加热回流l0h，所得溶液在冰浴中冷却2h，边冷却边用1mol/L的H2SO4将pH值精确调节到4.4，形成的沉淀用滤纸过滤，再用甲醇洗涤沉淀3次，每次用量2-3mL，过滤后取滤液，向所得滤液中加入6.25mL7.44×10-4 mol/L的NaPF6溶液，并在磁力搅拌器上搅拌30min使其混合均匀，然后将上述溶液置于冰箱中4℃下挥发其滤液，10天后将其过滤，用甲醇洗涤沉淀3次,每次用量2-3mL。得到的晶体再用甲醇进行重结晶，收集重结晶得到的紫红色结晶即为Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；分别称取0.46g (2.2mmol)二环乙基碳二亚胺(DCC)和0.24g (2.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于3mL无水DNF中并进行搅拌，然后放在冰水混合物中冷却，再称取0.31g的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于2 mL的DNF中，上述两种溶液在冰浴条件下混匀，置于25℃水浴中磁力搅拌5h，所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。
所述的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体制备方法如下：向离心管中依次加入50μL 2.0×10-5mol/肿瘤细胞抗体，50μL的1.93×10-2mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，10μL的DMF和388μL0.lmol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.2)，室温搅拌孵育6h，可以得到Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体；然后通过超滤离心除去溶液中过量的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，得到纯的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。
其中一种优选方式，用富集缓冲液将7.5mL Her2待测血液样本移至50mL 离心管中，并定容至45mL，室温翻转孵育8 min；400×g 室温离心5 min，弃上清，保留余量液体，并用手指温和地将细胞弹起，加红细胞裂解液至45mL，裂解并重选细胞，重复2次；加富集缓冲液至45mL，重选细胞后计数；400×g室温离心5min，弃上清，加入1 mL PBS 溶液和0.5mg EpCAM抗体磁珠，混匀；室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2加入到磁性微球体系中，混匀，室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次；再将其置于电致化学发光检测仪中，磁铁吸住磁珠，采用两台相同速度的低速蠕动泵分别将TPA溶液倒入体系和吸出体系，电极加电压，启动ECL反应过程；光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，测出待测物质的含量。
一种采用所述方法检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，包括EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS、肿瘤细胞抗体；或EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。
所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体。
所述的试剂盒，进一步包括所述的富集缓冲液、清洗缓冲液、缓冲溶液。
本发明的有益效果：
本发明可大大提高检测外周血中循环肿瘤细胞抗原的检测范围和灵敏度，快速、准确、伤害性小，具有很大的市场前景。通过此技术手段，可以观察HER-2阳性和阴性乳腺癌患者外周血HER-2阳性循环肿瘤细胞的表达差异等分子机理方面的研究，为乳腺癌的发生、发展提供更多的科学数据。
附图说明
图１是免疫磁珠对荧光染色的细胞富集的特异性实验中可见光及DAPI结果（200X）；
图２是标准曲线。
具体实施方式
实施例1 制备EpCAM抗体标记的磁珠
利用Vortex 搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后用微管取100μL的粒子均匀溶液（相当于1mg 粒子）；加入含有2μg 生物素标记EpCAM抗体（抗体可以来源于人，鼠，兔，山羊等目前已知的生物来源或者合成抗体，此实施例选用鼠抗）的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入100μL的清洗缓冲液，洗涤2次，然后将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。所述的磁珠的规格为粒径在0.5-5um之间的。
实施例2制备抗EpCAM抗体（二抗）标记的磁珠
利用Vortex 搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后用微管取100μL的粒子均匀溶液（相当于1mg 粒子）；加入含有2μg 生物素标记二抗的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入100μL的清洗缓冲液，洗涤3次；再加入EpCAM抗体溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入100μL的清洗缓冲液，洗涤2次；然后将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。
实施例3 抗体标记磁珠对CTC富集能力的评价一
将101个BT474 Her2阳性乳腺癌细胞放入到200uL的总体系中，加入2uL EpCAM抗体磁珠（可以选用实施例1和实施例2中的免疫磁珠，此处选用实施例1的免疫磁珠，下同），混匀，在室温的条件下，对微管进行均匀颠倒混合孵育20min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入200uL的清洗缓冲液，洗涤3次，显微镜计数为61个，富集效率为60.0%。
实施例4抗体标记磁珠对CTC富集能力的评价二
将97个BT474 Her2阳性乳腺癌细胞放入到200uL的总体系中，加入10uL EpCAM抗体磁珠，混匀，在室温的条件下，对微管进行均匀颠倒混合孵育20min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入200uL的清洗缓冲液，洗涤3次，显微镜计数为63个，富集效率为65.0%。
实施例5抗体标记磁珠对CTC富集能力的评价三
将90个BT474 Her2阳性乳腺癌细胞放入到200uL的总体系中，加入100uL EpCAM抗体磁珠，混匀，在室温的条件下，对微管进行均匀颠倒混合孵育20min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入200uL的清洗缓冲液，洗涤3次，显微镜计数为68个，富集效率为75.0%。
实施例6 免疫磁珠富集Her2阳性乳腺癌病人血液样本中的乳腺癌细胞
用富集缓冲液将7.5mL Her2阳性乳腺癌病人血液样本移至50mL 离心管中，并定容至45mL，室温翻转孵育8 min；400×g 室温离心5 min，弃上清，保留少量液体，并用手指温和地将细胞弹起，加红细胞裂解液至45mL，裂解并重选细胞，重复2次；加富集缓冲液至45mL；400×g室温离心5min，弃上清，加入1 mL PBS 溶液和0.5mg EpCAM抗体磁珠，混匀；在室温的条件下，对微管进行均匀颠倒混合孵育20min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次，显微镜计数。
实施例7 对乳腺癌阳性细胞进行荧光染色
悬浮培养的BT474乳腺癌阳性细胞系离心收集后，加500μL的DAPI工作液洗一次；再加入500μL的DAPI工作液重悬细胞，取一定体积待染色的BT474细胞，加入待染色样品体积3倍的DAPI染色液，混均；室温孵育10min；1000rpm离心收集细胞，弃去染色液；用PBS洗涤6次，每次1000rpm，15min,洗掉未结合的DAPI；加入Buffer重悬细胞，显微镜下计数。
实施例8 免疫磁珠对荧光染色的细胞富集的特异性实验
将117和113个DAPI染色的BT474细胞分别参入到约200,000个阴性细胞中，1500rpm，离心30min，去上清，加入2μL结合EpCAM抗体的磁珠，室温下孵育20min，于磁性底座上除去上清液，并用PBS清洗三次。分别捕获到91，90个BT474细胞，回收率分别为77.8%，79.6%。荧光显微镜以340/380nm紫外光激发，500×（40×12.5）观察、拍照。荧光染色结果如图１所示，蓝光的细胞为预先进行DAPI染色的BT474细胞，未发蓝光的细胞则为阴性细胞。荧光照片显示EpCAM磁珠富集到BT474细胞(图b白色箭头与图d白色箭头)，对比可见光的结果可知，磁珠捕获后的细胞中还夹杂有阴性细胞(图b深色箭头)。图１中a，b是在可见光下，c，d是在荧光下，ac视野是对应的，bd视野是对应的。a中可见是3个细胞，对应的c中也是3个，认为此3个都是阳性细胞。从b中可以清楚的发现2个细胞，通过和d比对发现其中一个是阴性一个是阳性。所以从两个视野抽样结果可以推出特异性较高。
实施例９三联吡啶钌N-羟基琥珀酰亚胺的合成
首先分别称取0.2g二氯二联吡啶钌Ru(bpy)2Cl2，0.2gNaHCO3和0.15g 2,2'-联吡啶-4,4'二羧酸(dcbpy)置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL80%甲醇，混合溶液在硅油浴80℃下加热回流l0h。所得溶液在冰浴(冰水混合物)中冷却2h，边冷却边用1mol/L的H2SO4将pH值(用pH计检测)精确调节到4.4。形成的沉淀用滤纸过滤，再用甲醇洗涤沉淀3次，每次用量2-3mL。过滤后取滤液，向所得滤液中加入6.25mL7.44×10-4 mol/L的NaPF6溶液，并在磁力搅拌器上搅拌30min使其混合均匀，然后将上述溶液置于冰箱中4℃下挥发其滤液。10天左右将其过滤，用甲醇洗涤沉淀3次,每次用量2-3mL。得到的晶体再用甲醇进行重结晶，收集重结晶得到的紫红色结晶即为Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2。分别称取0.46g (2.2mmol)二环乙基碳二亚胺(DCC)和0.24g (2.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于3mL无水DNF中并进行搅拌，然后放在冰水混合物中冷却。再称取0.31g的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于2 mL的DNF中，上述两种溶液在冰浴条件下混匀，置于25℃水浴中磁力搅拌5h。所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。
实施例1０三联吡啶钌标记Her2抗体
向离心管中依次加入50μL 2.0×10-5mol/L Her2抗体，50μL的1.93×10-2mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，10μL的DMF和388μL0.lmol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.2)，室温搅拌孵育6h，可以得到Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2。然后通过超滤离心（12000rpm，60min）除去溶液中过量的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，得到比较纯的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2。
实施例1１标准曲线的绘制
分别取0个、5个、50个、500个、5000个、50000个BT474 Her2阳性乳腺癌细胞分别放入到200uL的总体系中，加入100uL EpCAM抗体磁珠，混匀，在室温的条件下，对微管进行均匀颠倒混合孵育20min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入200uL的清洗缓冲液，洗涤3次。之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2加入到磁性微球体系中，混匀，室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次。再将其置于MPI-E型电致化学发光检测仪中，磁铁吸住磁珠，采用两台相同速度的低速蠕动泵分别将TPA溶液倒入体系和吸出体系，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，绘制标准曲线，如图2所示。
实施例1２乳腺癌病人血液样本的检测
用富集缓冲液将7.5mL 血液样本移至50mL 离心管中，并定容至45mL，室温翻转孵育8 min；400×g 室温离心5 min，弃上清，保留少量液体，并用手指温和地将细胞弹起，加红细胞裂解液至45mL，裂解并重选细胞，重复2次；加富集缓冲液至45mL，重选细胞后计数；400×g室温离心5min，弃上清，加入1 mL PBS 溶液和0.5mg EpCAM抗体磁珠，混匀；室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次。之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2加入到磁性微球体系中，混匀，室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次。再将其置于电致化学发光检测仪中，磁铁吸住磁珠，采用两台相同速度的低速蠕动泵分别将TPA溶液倒入体系和吸出体系，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，测出待测物质的含量。
实施例1３ 检测外周血中循环肿瘤细胞的试剂盒
一种采用所述方法检测外周血中循环肿瘤细胞的试剂盒，包括EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS、肿瘤细胞抗体；或EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。
所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体或者其他肿瘤细胞的抗原抗体。
所述的试剂盒 ，进一步包括所述的富集缓冲液、清洗缓冲液、缓冲溶液。
Claims (10)
1.一种电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法，其特征在于：用富集缓冲液将血液样本移至离心管中，并定容，混匀；离心，弃上清，裂解红细胞并重选细胞；加富集缓冲液，重悬细胞；离心，弃上清，加入富集缓冲溶液和EpCAM抗体磁珠，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座后除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤后得磁性微球体系；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体加到磁性微球体系中，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座上，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；置于电致化学发光检测仪中，测出肿瘤细胞表面抗原的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记EpCAM抗体的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤，然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记二抗的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；再加入EpCAM抗体溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的合成方法如下：首先分别称取0.2g二氯二联吡啶钌Ru(bpy)2Cl2，0.2gNaHCO3和0.15g 2,2'-联吡啶-4,4'二羧酸(dcbpy)置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL80%甲醇，混合溶液在硅油浴80℃下加热回流l0h，所得溶液在冰浴中冷却2h，边冷却边用1mol/L的H2SO4将pH值精确调节到4.4，形成的沉淀用滤纸过滤，再用甲醇洗涤沉淀3次，每次用量2-3mL，过滤后取滤液，向所得滤液中加入6.25mL7.44×10-4 mol/L的NaPF6溶液，并在磁力搅拌器上搅拌30min使其混合均匀，然后将上述溶液置于冰箱中4℃下挥发其滤液，10天后将其过滤，用甲醇洗涤沉淀3次,每次用量2-3m，得到的晶体再用甲醇进行重结晶，收集重结晶得到的紫红色结晶即为Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；分别称取0.46g (2.2mmol)二环乙基碳二亚胺(DCC)和0.24g (2.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于3mL无水DNF中并进行搅拌，然后放在冰水混合物中冷却，再称取0.31g的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于2 mL的DNF中，上述两种溶液在冰浴条件下混匀，置于25℃水浴中磁力搅拌5h，所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体制备方法如下：向离心管中依次加入50μL 2.0×10-5mol/肿瘤细胞抗体，50μL的1.93×10-2mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，10μL的DMF和388μL0.lmol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.2)，室温搅拌孵育6h，可以得到Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体；然后通过超滤离心除去溶液中过量的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，得到纯的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：用富集缓冲液将7.5mL Her2待测血液样本移至50mL 离心管中，并定容至45mL，室温翻转孵育8 min；400×g 室温离心5 min，弃上清，保留余量液体，并用手指温和地将细胞弹起，加红细胞裂解液至45mL，裂解并重选细胞，重复2次；加富集缓冲液至45mL，重选细胞后计数；400×g室温离心5min，弃上清，加入1 mL PBS 溶液和0.5mg EpCAM抗体磁珠，混匀；室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-Her2加入到磁性微球体系中，混匀，室温对微管进行均匀颠倒混合30min；将微管静置于磁性底座上约1min，并除去上清液；加入1mL 的清洗缓冲液，洗涤3次；再将其置于电致化学发光检测仪中，磁铁吸住磁珠，采用两台相同速度的低速蠕动泵分别将TPA溶液倒入体系和吸出体系，电极加电压，启动ECL反应过程；光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，测出待测物质的含量。
8.一种采用如权利要求1所述方法检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒 ，其特征在于，包括EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS、肿瘤细胞抗体；或EpCAM抗体磁珠、Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。
9.如权利要求8所述的试剂盒 ，其特征在于，所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体。
10.如权利要求8所述的试剂盒 ，其特征在于，进一步包括所述的富集缓冲液、清洗缓冲液、缓冲溶液。
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