CN103439511A - 一种检测肺癌的液相芯片试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肺癌的液相芯片试剂盒，包括包被微球，生物素标记的检测抗体，链霉亲和素-藻红蛋白，反应缓冲液和稀释缓冲液，所述包被微球包括包被CRP捕获抗体的微球、包被Prolactin捕获抗体的微球、包被CEA捕获抗体的微球、包被NSE捕获抗体的微球、包被CK19捕获抗体的微球、包被Axl捕获抗体的微球和包被ADAM8捕获抗体的微球中的至少两种，其中包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码；所述检测抗体与捕获抗体相对应。本发明的液相芯片试剂盒的敏感度、准确度高，检测快速，稳定性好，成本低廉。

Description

一种检测肺癌的液相芯片试剂盒

技术领域

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种检测肺癌的液相芯片试剂盒。 

背景技术

近年来，我国癌症的发生率呈明显上升趋势，占死亡原因的20%以上，居各类死因之首。世界卫生组织预测，到2020年，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数达1200万，且绝大多数发生在发展中国家。如果不采取任何有效的预防与控制措施，预计到2020年，我国每年的新发生癌症总数和癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。 

肺癌目前是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近20年来，由于大力推行戒烟，欧洲和美国等西方国家男性肺癌的发病率已开始下降，但女性肺癌的发病率却持续上升。我国是香烟生产和销售大国，不论男性还是女性，肺癌的发病率均呈持续上升趋势，尤以女性发病率上升更快。临床研究表明，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%～90%，而IIIb和Ⅳ期患者的5年生存率仅5%～20%，因此，早期诊断早期发现，早期治疗是降低肺癌死亡率，延长生存期的关键。然而，由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14%左右。因此，如何提高肺癌早期诊断水平已成为肺癌防治工作者面临的严肃而紧迫的任务。 

至今，对肺癌的检测仍依赖于CT、MR、PET等影像检测仪器，但实际上这些影像手段一般只能发现1-2cm以上的肿瘤，而肿瘤从病变到生长至1-2cm，一般要经过2-5年甚至更长的时间，因此，癌症早期漏诊率高达80-90%。 

目前，早期诊断癌症的最新、最有效的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，特别是其中的蛋白标志。所谓肿瘤标志物，指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是宿主对癌类反应性的一类物质，这 类物质可能是循环物质，可在细胞、组织或体液中出现，人们能利用化学、免疫、分子生物学等技术对病人血液或分泌物定性或定量地检测。通过对这类物质的分析，为肿瘤的预测、诊断、治疗和转移等提供信息和决策依据。 

血清肿瘤标志物的测定方法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等。然而，这些方法都是单指标的检测方法，而对肿瘤进行单一标志物的检测始终存在着特异性不强、灵敏度低等不足，导致对早期肿瘤的检出率不高，因此可能会造成部分患者漏诊。若想避免这种情况，则需要对每份标本进行多指标分析，不仅费用昂贵，而且需要的血清量较大。 

肺癌中常用的肿瘤标志物有神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及前胃泌素释放肽(ProGRP)等。 

(1)神经特异性烯醇化酶(NSE)：烯醇化酶是一种糖酵解酶，普遍存在于哺乳动物的组织中，以系列同工酶二聚体的形式存在(αα、αβ、ββ、和γγ)。NSE为含γ亚基的同工酶，存在于神经内分泌细胞和神经源性肿瘤中(如小细胞肺癌、神经母细胞瘤、肠癌等)。小细胞肺癌(SCLC)是一种起源于神经内分泌细胞的肿瘤，因此NSE与SCLC关系密切，是小细胞肺癌的标记物。SCLC患者NSE阳性率约为60%～80%，非小细胞肺癌患者阳性率<20%。因此，NSE有助于SCLC的诊断及其与NSCLC的鉴别诊断。NSE还是肺癌化疗效果观察和随访的有效指标，对化疗产生反应后此酶水平会下降，病情完全缓解后其可达正常水平。 

(2)细胞角蛋白19片段(CK19，Cyfra21-1)：Cyfra21-1是分子量约30kDa的上皮细胞角蛋白的可溶性成分之一，是一种非常好的鉴别肺良恶性疾病的标志物，尤其对肺鳞癌的检测效果更好。Cyfra21-1是相对较新的肿瘤标志物，临床上采用夹心酶联免疫吸附法，联合应用两种特异性单克隆抗体(ks19.1和bm19.21)检测血清中的细胞角蛋白19片段。Cyfra21-1存在于上皮起源的肿瘤细胞的胞浆中，当肿瘤细胞坏死后，可释放到血清中。免疫组织化学研究表明，肺癌中富含细胞角蛋白19片段，Cyfra21-1是NSCLC最灵敏的肿瘤标志物。因为Cyfra21-1只代表细胞角蛋白19一个片段，因此Cyfra21-1比组织多肽抗原(TPA)具有更高的特异性。研究表明，Cyfra21-1在肺鳞癌中的阳性率可高达80%，而且对肺癌的诊断有较高的 特异性，它在肺良性疾病和健康人群血中的浓度很低，与性别、年龄以及吸烟习惯无关。Cyfra21-1的敏感性与肿瘤的组织学类型存在着一定的相关性，如肺鳞癌的敏感性为最高达76.5％、腺癌为47.8％、小细胞肺癌仅为42.1％。血清中Cyfra21-1的含量与肺鳞癌患者的病程呈正相关，根据肺癌的TNM分期，Ⅰ～Ⅳ期患者的敏感性分别为60.0％、88.8％、80％和100％。 

(3)前胃泌素释放肽(ProGRP)：ProGRP是一个相对稳定的激素胃泌素释放肽(GRP)的前体。人类的GRP主要存在于胃肠道、呼吸道以中枢神经系统中。一些研究认为，小细胞肺癌的肿瘤细胞释放GRP，并且GRP可能会刺激SCLC细胞生长。ProGRP作为SCLC的标志物，具有敏感性高(75.5%)、特异性强(97%)的特点。ProGRP水平和治疗反应也有较好的相关性，治疗后肿瘤完全消失的病人，ProGRP降至正常值范围，甚至测不出来长达一个月以上。国内外的研究表明，ProGRP对小细胞肺癌检测的敏感性、特异性和可靠性方面均优于NSE，敏感性和特异性高，阳性预测值和阴性预测值在90％以上，对局限期病变的阳性率也比NSE高，一定程度上提高了早期诊断可能性，而且对化疗后反应、疗效的评价、病程中病情监测和预后判定都提供了有价值的信息。 

(4)癌胚抗原(CEA)：CEA是一种存在于多种肿瘤细胞中的肿瘤抗原，肺癌细胞能直接产生CEA。CEA是最早发现的肺癌肿瘤标志物，也是目前肺癌诊断中最具代表性的肿瘤标志物，在腺癌与鳞癌中升高较明显。原发性肺癌患者血清CEA水平明显升高，对肺癌的诊断阳性率为40%～60%，特别在肺腺癌中，阳性率及特异性较高。另外，CEA在肺癌早期的病人中阳性率较低，在肿瘤中晚期才有较显著的升高，因此CEA水平的动态变化能较好的反映患者对治疗的反应和预后。 

(5)CRP(C反应蛋白)：CRP作为一种急性时相蛋白，受年龄、免疫状况、药物等因素影响较小，其对临床各种急、慢性感染，组织损伤等疾病的诊断、疗效观察及预后判断的意义已被人们所认识。目前，其在肿瘤方面的运用亦越来越受到重视。研究表明，在肿瘤组织存在时CRP明显升高，可达正常时的10～100倍。癌症患者血清CRP水平增高可能是由于癌症患者血清肿瘤坏死因子和IL-6水平增高直接刺激肝脏合成CRP所致。国内外报道肺癌患者血清CRP水平较健康对照者明显升高。 

(6)Dkk-1：Dkk-1是一种分泌型糖蛋白，通过结合细胞表面受体LRP5/6、Kremen1/2在Wnt通路中起负调控作用。Dkk-1的表达受p53、MYCN、b-catenin等基因调控。Dkk-1在细胞内的异位表达能抑制多种肿瘤细胞的增殖，但有时能在促凋亡因子存在时诱发凋亡。Dkk-1在一些肿瘤中低表达，而在另一些肿瘤中高表达。Dkk-1的高表达被证明可以成为多种肿瘤预后差的标志，如肝细胞癌、食道癌、骨肉瘤、肺癌、卵巢上皮癌和多发性骨髓瘤。 

(7)Axl：又被称为UFO，ARK，and Tyro7，最早是在白血病中作为一个转化基因被发现的。该蛋白由894个氨基酸组成，分子量为140KD，大致均匀分布在细胞膜的两侧。Axl的配体是Gas6蛋白，这个蛋白在生长受阻的细胞中表达量很高。Axl和Gas6蛋白的细胞学功能还不完全清楚，比较复杂。例如，在非肿瘤细胞中Axl可以阻止血清缺乏的作用，即可以诱导细胞增殖。在乳腺癌、结肠癌和甲状腺癌细胞系中Axl高表达，并且研究显示Axl在肿瘤中的功能与细胞进入细胞周期、细胞存活和细胞转化(肿瘤生成)有关。 

(8)ADAM8：解整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases，ADAMs)是近年来发现的一类与细胞膜结合糖蛋白家族，参与细胞-细胞的黏连、细胞-基质的黏连、细胞融合、细胞外基质的降解及信号传导等过程，科学家推测其参与了人类肿瘤形成和转移的病理过程。ADAM8是新近发现的肿瘤标志物，文献报道其在脑部肿瘤、胰腺癌、肾癌等肿瘤存在表达。 

(9)Prolactin：泌乳素，为垂体前叶分泌的一种多肽蛋白激素，也叫催乳素(PRL)，在正常男性和女性非妊娠期血清中的含量极低，接近零。但是恶性肿瘤普遍产生异位激素的现象，比如部分肺癌患者内分泌异常，引起泌乳素分泌增多，促使乳头、乳房胀大，分泌乳汁。研究发现肺癌患者血清浓度为21.4±11.48μg/L，远高于对照组13.75±6.44μg/L。 

液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的被誉为后期基因组时代的芯片技术，也称为flexible multi-analyte profiling(XMAP)。XMAP技术是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量检测技术。它有机地整和了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无 与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起，使生物芯片反应体系由固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，检测速度极快，其设计理念亦体现了计算机芯片的并行处理和高密度集成、高通量的精髓，因此也被称为液相芯片技术，又称多功能悬浮点阵。 

与其它传统的临床分析方法相比，液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点。①通量大：可对同一微量样本中的100种不同目的分子同时进行快速的定性、定量分析，在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测；②灵活性好：适用于各种蛋白质以及核酸分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒；③液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应；④灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测(最低检测浓度可达到2pg/mL)，线性范围宽(可达4个数量级)；⑤操作简便，不需洗涤，耗时短。 

因此，如何能够合理的应用液相芯片的技术平台，选择有效的血清标志物，克服交叉反应，提高检测的准确性对肺癌的早期诊断具有重要的意义。 

发明内容

本发明提供了一种检测肺癌的液相芯片试剂盒，可以联合检测多个肺癌血清标志物，敏感度高，重复性好且诊断准确率高，能够高通量的实现肺癌的早期诊断。 

一种用于检测肺癌的液相芯片试剂盒，包括包被微球，生物素标记的检测抗体，链霉亲和素-藻红蛋白，反应缓冲液和稀释缓冲液， 

所述包被微球包括包被CRP捕获抗体的微球、包被Prolactin捕获抗体的微球、包被CEA捕获抗体的微球、包被NSE捕获抗体的微球、包被CK19捕获抗体的微球、包被Axl捕获抗体的微球和包被ADAM8捕获抗体的微球中的至少两种，其中包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码； 

所述检测抗体包括CRP检测抗体、Prolactin检测抗体、CEA检测抗体、NSE检测抗体、CK19检测抗体、Axl检测抗体和ADAM8检测抗体中的至少两种，且与捕获抗体相对应。 

其中，捕获抗体和检测抗体均能特异的与相应的肺癌血清标志物(即CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl或ADAM8)结合，而链霉亲和素-藻红蛋白能够与生物素高度特异性的结合，因此，最终可以形成针对肺癌血清标志物的“微球-捕获抗体+血清标志物+检测抗体+链霉亲和素-藻红蛋白”复合物，通过仪器检测，根据微球色彩不同确定反应类型，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球上结合的肺癌血清标志物的含量。 

所述的反应缓冲液为1%PBSB，所述稀释缓冲液为1%PBSB。 

优选的，所述包被微球包括包被CRP捕获抗体的微球和包被Prolactin捕获抗体的微球。通过对CRP和Prolactin两种标志物进行联合检测，肺癌早期的诊断的准确率可达86%。 

所述微球可采用常规制备液相芯片的微球即可。 

为提高检测的灵敏度和特异性，检测抗体和捕获抗体均为单克隆抗体。 

制备包被微球时，捕获抗体的加入量为20～30μg/6.25×10⁶个微球，优选为25μg/6.25×10⁶个微球。 

每种包被微球的浓度为(1.2～1.8)×10⁴个/μl，优选为1.2×10⁴个/μl。 

每种生物素标记的检测抗体的浓度为0.08～0.12μg/ml，优选为0.1μg/ml。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

(1)本发明的液相芯片试剂盒的敏感度高，通过多个标志物联合检测，大大提高了肺癌早期诊断的准确率，且检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，且成本低廉。 

(2)本发明采用CRP和Prolactin这两个肺癌检测的血清标志物，对CRP和Prolactin两个标志物的联合检测，肺癌早期的诊断的准确率可达86%。 

附图说明

图1为CRP的标准曲线； 

图2为Prolactin的标准曲线； 

图3为肺癌患者和健康血清中的Prolactin检测含量图； 

图4为肺癌患者和健康血清中的CRP检测含量图； 

图5为CRP以及Prolactin两分子检测的ROC曲线。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。 

实施例1液相芯片的制备 

1、试剂和溶液 

(1)pH6.2，0.1M NaH₂PO₄：称量3.5814g NaH₂PO₄于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.2后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤； 

(2)pH5.0，0.05M MES：称量0.976g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至5.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤； 

(3)pH6.0，0.1M MES：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤； 

(4)pH4.5，0.1M MES：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至4.5后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤； 

(5)PBS：NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na₂HPO₄，8.1mM；KH₂PO₄，1.5mM；pH7.2-7.4；0.22um滤膜过滤； 

(6)1%PBSB：0.1%PBS中含0.02%Proclin300，0.22um滤膜过滤； 

(7)0.1%PBST：即0.1%PBS中含0.1%tween-20，0.22um滤膜过滤； 

(8)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)：ddH₂O溶解至50mg/mL； 

(9)S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)：ddH₂O溶解至50mg/mL。 

2、液相芯片试剂盒，包括有： 

1)7-plex包被微球：含有分别包被了CRP捕获抗体、Prolactin捕获抗体、CEA捕获抗体、NSE捕获抗体、CK19捕获抗体、Axl捕获抗体、ADAM8捕获抗体的34#、45#、26#、37#、36#、67#、54#微球，不同种包被微球的浓度相同，均为1.2×10⁴个/μl； 

2)7-plex生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的CRP检测抗体、 Prolactin检测抗体、CEA检测抗体、NSE检测抗体、CK19检测抗体、Axl检测抗体、ADAM8检测抗体的混合液，每种生物素标记的检测抗体的浓度为0.1μg/ml； 

3)链霉亲和素-藻红蛋白； 

4)反应缓冲液：1%PBSB； 

5)稀释缓冲液：1%PBSB； 

6)封口膜； 

7)96孔板。 

3、按上述液相芯片试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同： 

(1)取微球悬液(磁性微球，bio-rad)，分别涡旋和超声约20s后，取200ul(约2.5×10⁶个微球)于干净离心管(美国，Axygen)中，标记上微球型号和蛋白名称； 

（2）14000g，室温(约25℃)，4min； 

(3)小心吸去上清，为减少损失可残留少量上清； 

(4)加入100ul ddH₂O，分别涡旋和超声约20s； 

(5)14000g，室温，4min； 

(6)小心吸去上清，为减少损失可残留少量上清，加入160ul pH6.2，0.1M的NaH₂PO₄，分别涡旋和超声约20s； 

(7)迅速加入20ul S-NHS，涡旋混匀； 

(8)迅速加入20ul EDC，分别涡旋和超声约20s； 

(9)室温，避光旋转孵育20min(若发现微球不呈悬浮状态，可每隔10min涡旋一次)； 

(10)14000g，室温，4min； 

(11)小心吸去上清，加入250μL0.05M MES,pH5.0，分别涡旋和超声约20s； 

(12)14000g，室温，4min； 

(13)小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次； 

(14)小心吸去上清，用50ul pH5.0，0.05M的MES重悬微球，分别涡旋和超声约20s； 

(15)加25ug捕获抗体于上述微球中，加入pH5.0，0.05M的MES至 终体积为500ul，分别涡旋和超声约20s； 

(16)室温，避光旋转孵育2h； 

(17)14000g，室温，4min； 

(18)小心吸去上清，加入1mL0.01%PBST，分别涡旋和超声约20s； 

(19)14000g，室温，4min； 

(20)小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次； 

(21)加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s； 

(22)室温避光旋转孵育30min，封闭微球表面残余的活化羧基位点； 

(23)14000g，室温，4min； 

(24)小心吸去上清，加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s； 

(25)小心吸去上清，加入1%PBSB至终体积为200ul，分别涡旋和超声约20s； 

(26)取2ul于38ul1%PBSB中，涡旋20s，超声20s后，血球计数板计数，最终浓度(个/mL)=(4大格总数/4)×(1×10⁴)×稀释倍数； 

(27)在离心管上标记微球浓度、偶连时间，然后放置4度避光保存。按照上述方法，制备7种捕获抗体包被微球，分别为包被了CRP捕获抗体的34#微球、Prolactin捕获抗体的45#微球、CEA捕获抗体的26#微球、NSE捕获抗体的37#微球、CK19捕获抗体的36#微球、Axl捕获抗体的67#微球、ADAM8捕获抗体的57#微球。 

七种捕获抗体的购买厂家和产品编号分别为：CRP，R&D systems，货号，MAB17071；Prolactin，R&D systems，货号，MAB842242；CEA，Fitzgerald Industries International，货号，10-C10D；NSE，Meridian Life Science，货号，M86520M；CK19，Meridian Life Science，货号，MAM39-221；Axl，R&D systems，货号，MAB154；ADAM8,R&D systems，货号，DY1031。 

实施例2本发明液相芯片试剂盒用于检测肺癌试验 

1、检测方法 

(1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温； 

(2)-80℃取出患者(早期肺癌患者)和健康人的血清，分别放置在冰上融化后，涡旋混匀，取V型96孔血凝板(96孔板)将血清稀释20倍，枪头上下混匀，尽量不产生气泡； 

(3)准备CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl和ADAM8标准蛋白(CRP，产品编号为DY2648，R&D system；Prolactin，产品编号为DY682，R&D system；CEA，产品编号为73/601，NIBSC；NSE，产品编号为DENL20，R&D system；CK19，产品编号为30R-AC04，Fitzgerald Industries International；Axl，产品编号为DY154，R&D system；Adam8，产品编号为DY1031，R&D system)各取8个EP管分别标记上S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，进行2倍系列稀释，每一个标准蛋白稀释后都要涡旋混匀并更换枪头，具体如下表1： 

表1 

(4)取一96孔板，打开洗板机---Prime----rinse(channel2)----Prime---放置plate----Run5：MAGX3； 

(5)取制备好的7-plex捕获抗体包被微球，涡旋混匀20s，超声20s，按每孔2500个微球加入到1%PBSB中，涡旋混匀20s，超声20s，终体积为10ul/孔； 

(6)立即加入稀释20倍的血清和系列稀释的标准物(抗体的不同孔中加入血清或者不同稀释倍数的标准物)，各30ul/孔； 

(7)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min； 

(8)0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3； 

(9)1%PBSB稀释7-plex生物素标记检测抗体(生物素标记的CRP检测抗体，产品编号为DY2648，R&D system；生物素标记的Prolactin检测抗体，产品编号为DY682，R&D system；生物素标记的CEA检测抗体，产 品编号为73/601，NIBSC；生物素标记的NSE检测抗体，产品编号为DENL20，R&D system；生物素标记的CK19的检测抗体，产品编号为30R-AC04，Fitzgerald Industries International；生物素标记的Axl检测抗体，产品编号为DY154，R&D system；生物素标记的Adam8检测抗体，产品编号为DY1031，R&D system)，50ul/孔； 

(10)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min； 

(11)0.1%PBST洗三次，各种抗体的浓度均为0.1ug/ml，Run5：MAGX3； 

(12)1%PBSB稀释链霉亲和素-藻红蛋白(1：500)，50ul/孔； 

(13)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min； 

(14)0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3； 

(15)100ul/孔的1%PBSB重悬微球，室温，震荡3-5min； 

(16)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果，仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样本的测量值。 

2、结果分析 

以CRP和Prolactin两种标志物联合分析为例，制作标准曲线时，CRP和Prolactin标准物的预测浓度、实测浓度和MFI值参见表2，图1和图2分别为CRP和Prolactin的标准曲线。 

表2标准蛋白的标准曲线 

经计算得到， 

CRP的输出标准曲线：FI=99.8135+(4893.65-99.8135)/((1+(Conc/13.9421)^-0.878012))^1.02009； 

Prolactin的输出标准曲线：FI=7.03791+(852.475-7.03791)/((1+(Conc/25.6551)^-1.09938))^0.920591。 

采用本发明的液相芯片，检测88例早期肺癌患者和88例健康对照中CRP和Prolactin的含量(如图3、图4)，利用CCP，DLDA，BCCP3种生物统计学常用的算法分析其准确率均为86%(如图5)。 

Claims (7)

1.一种检测肺癌的液相芯片试剂盒，包括包被微球，生物素标记的检测抗体，链霉亲和素-藻红蛋白，反应缓冲液和稀释缓冲液，其特征在于，

所述包被微球包括包被CRP捕获抗体的微球、包被Prolactin捕获抗体的微球、包被CEA捕获抗体的微球、包被NSE捕获抗体的微球、包被CK19捕获抗体的微球、包被Axl捕获抗体的微球和包被ADAM8捕获抗体的微球中的至少两种，其中包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码；

所述检测抗体包括CRP检测抗体、Prolactin检测抗体、CEA检测抗体、NSE检测抗体、CK19检测抗体、Axl检测抗体和ADAM8检测抗体中的至少两种，且与捕获抗体相对应。

2.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液为1%PBSB。

3.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述稀释缓冲液为1%PBSB。

4.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述包被微球包括包被CRP捕获抗体的微球和包被Prolactin捕获抗体的微球。

5.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，制备包被微球时，捕获抗体的加入量为20～30μg/6.25×10⁶个微球。

6.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，每种包被微球的浓度为（1.2～1.8）×10⁴个/μl。

7.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，每种生物素标记的检测抗体的浓度为0.08～0.12μg/ml。

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