CN104515852B - 二羟基戊二酸或其检测试剂的用途 - Google Patents

二羟基戊二酸或其检测试剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种二羟基戊二酸(2‑HG)或其检测试剂的用途。具体地，本发明通过筛选大量血液系统肿瘤和健康体检者的AML相关突变基因以及癌症小分子代谢物，确定了2‑HG可作为有效的判断血液系统恶性肿瘤尤其是AML、ALL、NHL患者预后的标志物。此外，通过对2‑HG的异常升高的界定与划分，能够相对精确地判断这一类患者的预后情况，能够为临床诊疗进行有利的指导。

Description

二羟基戊二酸或其检测试剂的用途
技术领域
本发明涉及医学领域。具体地，涉及二羟基戊二酸(2-HG)在判断血液系统恶性肿瘤尤其是急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等患者预后中的应用。
背景技术
血液系统恶性肿瘤是一种异质性疾病，具有特异的临床表现、不同的治疗反应和预后。由于分子生物学、遗传学和测序等技术的发展，对化疗方案改进、各种新药和造血干细胞移植技术的广泛应用，其中，AML的疗效和预后有了明显提高。但是，只有大约40%的年轻患者(<60岁)和10%的老年患者(≥60岁)能够长期存活。到目前为止，临床指标如WBC和年龄，已经被广泛接受。
对于某些血液系统恶性肿瘤而言，细胞遗传学是预后的重要指标，根据患者的染色体核型，可分为预后好、预后差和预后中等三种类型。但是，以AML为例，近50%的患者为染色体核型正常的AML(CN-AML)。这些患者，采用染色体核型检查无法继续进行预后分层。此外，由于体内不同基因的相互作用对预后有着不同影响，导致无法有效地根据基因来作出该类患者预后的判断。
因此，本领域迫切需要开发一种能够对血液系统恶性肿瘤患者尤其是常见的血液系统恶性肿瘤患者进行准确、方便的预后。
发明内容
本发明提供了对血液系统恶性肿瘤患者预后的方法及试剂盒。
本发明第一方面，提供了一种二羟基戊二酸(2-HG)或其检测试剂的用途，用于制备判断血液系统恶性肿瘤预后的试剂盒。
在另一优选例中，所述血液系统恶性肿瘤包括急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、原发性骨髓纤维化(PMF)、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤(HNL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、或慢性粒细胞性白血病(CML)。
在另一优选例中，所述的AML包括核型正常的AML和核型异常的AML，较佳地为核型正常的AML。
在另一优选例中，所述预后是指对测试对象进行总生存时间(OS)或无事件生存时间(EFS)的预估。
在另一优选例中，所述判断血液系统恶性肿瘤预后是指判断AML预后；更佳地，所述判断AML预后包括对AML患者进行分层预后。
在另一优选例中，所述的预后是将来自测试对象的样品2-HG含量A1与正常人群的2-HG含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组预后差；
较佳地，所述“显著高于”指为正常人群血清2-HG的平均值，SD为正常人群血清2-HG的平均值的标准差。
在另一优选例中，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。
在另一优选例中，所述“显著高于”指该升高的差异在统计学上具有显著性。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试对象(如人)血清中2-HG浓度≥4μg/ml。
在另一优选例中，所述的预后是分层预后，包括通过将测试对象的样品2-HG含量A1与正常人群样品的2-HG含量A0相比较，并如下进行分层预后为：
当所述A1≥22.69μg/ml，则表明预后非常差(D级)；
当所述A1为22.01-22.69μg/ml，则表明预后差(C级)；
当所述A1为21.85-22.01μg/ml，则表明预后优于C级(B级)；
当所述A1≤21.85μg/ml，则表明预后优于B级(A级)。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括2-HG特异性抗体、α-酮戊二酸依赖酶、2HGDH酶。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括二羟基戊二酸(2-HG)的标准品。
在另一优选例中，所述的标准品是浓度分别为22.69、22.01、和/或21.85μg/ml的二羟基戊二酸(2-HG)的标准品。
在另一优选例中，所述的检测包括气相色谱-飞行时间质谱法(GC-TOFMS)检测、酶联免疫反应法(ELISA法)检测、核磁共振法(MRI)、或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。
在另一优选例中，所述的2-HG特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述2-HG特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括点样于测试板上的所述检测试剂以及使用说明书。
在另一优选例中，所述的说明书记载了检测方法以及根据A1值进行预后的方法。
在另一优选例中，所述的α-酮戊二酸依赖酶包括Jumonji C区结构域去甲基化酶、TET2-5甲基胞苷脱氢酶等。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括通过测定2-HG对α-酮戊二酸依赖酶的抑制率而进行检测2-HG含量的检测试剂。
在另一优选例中，所述的检测的样品包括血液样品、血清样品。
本发明的第二方面，提供了一种判断急性髓性细胞白血病(AML)预后的方法，包括步骤：
(a)提供受试者的测试样品；
(b)测定所述样品中的2-HG含量为A1；
(c)将步骤(b)与正常人群样品的2-HG含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组预后差；
较佳地，所述“显著高于”指为正常人群血清2-HG的平均值，SD为正常人群血清2-HG的平均值的标准差。
在另一优选例中，所述的分层预后还进一步分层为：
当所述A1≥22.69μg/ml，则表明预后非常差(D级)；
当所述A1为22.01-22.69μg/ml，则表明预后差(C级)；
当所述A1为21.85-22.01μg/ml，则表明预后优于C级(B级)；
当所述A1≤21.85μg/ml，则表明预后优于B级(A级)。
在另一优选例中，所述的方法可通过气相色谱-飞行时间质谱法(GC-TOFMS)检测、酶联免疫反应法(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。
在另一优选例中，所述的检测的样品包括血液样品、血清样品。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在健康对照比和其他血液系统肿瘤中，部分AML患者血清中的2-HG水平显著升高。与405健康对照(HC)比较，急性髓细胞白血病(AML)和其他的血液肿瘤患者(包括淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性粒细胞白血病(CML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、原发性骨髓纤维化(PMF))，2-HG水平均有所上升，但以AML和ALL患者的2-HG水平升高最为显著。
图2显示了Circos图分析提示在AML患者中，2-HG升高与核型正常组密切相关(图1A)，而在核型正常的AML患者中，2-HG升高与IDH1/2突变关系最为密切，其次是NPM1和DNMT3A突变密切相关(图1B)。
图3显示了在CN-AML患者中，不同2-HG水平AML患者的Kaplan-Meier曲线的生存分析比较。以健康体检者的血清2-HG水平的平均值加5倍的标准差为界定值，把CN-AML患者划分为升高组52例，正常水平组182例。高2-HG患者的总生存期和无事件生存期，均低于正常2-HG水平组，两者之间的差异显著，P<0.001(图3A，3B)。分别以高水平组和正常水平组的2-HG的中位数，把两组进一步划分为四组：<1.85(μg/ml,Log2)水平组；1.85-2.01(μg/ml,Log2)水平组；2.01-2.69(μg/ml,Log2)水平组；>2.69(μg/ml,Log2)水平组。Kaplan-Meier(KM)曲线的生存分析的提示，2-HG水平越高，患者的预后越差，呈现出剂量效应(图3C和3D)。
图4显示了标准曲线图。其中，标准曲线的公式y=11.80x+1.66，R2=0.997，y是2-HG的溶度，x是2-HG的相对数值，2-HG的相对数值指2-HG的峰面积除以内标氯苯丙氨酸的峰面积。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，普遍存在于各种恶性肿瘤中的代谢物二羟基戊二酸(2-HG)在血液系统恶性肿瘤患者尤其是AML、ALL等患者中，具有鲜明的、独立于基因突变的预后指导意义。本发明筛选了大量癌症代谢产物，最终通过采用GC-TOFMS检测234例染色体核型分析正常的AML患者血清中的2-HG浓度，发现高血清2-HG水平AML患者预后差，且本发明的预后方法中，2-HG是目前唯一用于对血液系统恶性肿瘤进行预后的小分子化合物，根据不同浓度的2-HG含量对血液系统恶性肿瘤进行更细的分层预后，对于指导临床治疗、调整临床用药有重要意义。在此基础上，完成了本发明。
二羟基戊二酸(2-HG)
2-HG在正常细胞和组织中含量很少。异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是三羧酸循环的限速酶，其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三个成员，均可使异柠檬酸发生氧化脱羧反应，生成α-酮戊二酸(α-KG)，而当IDH突变后，则在失去了正常的酶活性的同时获得新的酶活性，可将α-KG转化为二羟基戊二酸(2-HG)。
α-KG在HOT酶或MDH酶的催化下生成2-HG。D/L2HGDH酶可催化D/L-2-HG为α-KG。在D2HGDH基因突变的遗传性代谢疾病中，血清、尿液、脑脊液的D-2-HG水平升高。而L2HGDH基因突变的患者，L-2-HG水平升高。
2-HG与三羧酸循环的中间代谢物α-KG的结构极为相似，通过竞争性抑制α-KG依赖的酶，如具有Jumonji C区结构域的去甲基化酶和TET2-5甲基胞苷脱氢酶，导致DNA和组蛋白的高甲基化，进而抑制细胞分化、促进肿瘤发生发展。2-HG还可通过干扰机体的抗氧化还原系统，导致肿瘤细胞产生耐药性。此外，2-HG还可稳定HIF-1α蛋白，使得VEGF等生长因子高表达，促进肿瘤的发展。
急性髓性细胞白血病及其核型分析
急性髓性细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病，是造血系统的克隆性恶性疾病。AML是一个具有高度异质性的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化而来，起源于不同阶段祖细胞的AML具有不同的生物学特征。
目前，AML的预后分类主要根据染色体核型分为三大类，染色体核型预后好组，预后中等组和预后差组。预后好的核型有t(15;17)/PML-RARA，t(8;21)/AML1-ETO和inv16/CBFβ-MYH11，预后差的核型有t(9;22)，inv(3)/t(3;3)，-5，-7，del(5q)，del(7p)，11q23和复杂核型。
遗传、接触化学物质、电离辐射已被证明可能是白血病发病的重要危险因素之一。在AML患者中，近一半患者可被检测出染色体异常，且可根据染色体核型判断AML患者的预后。而在另一半染色体核型正常的AML患者中，无法检测到染色体的异常，也无法提供对这一人群的预后指标。
总生存时间(OS)及无事件生存时间(EFS)
本发明采用统计学中常用的肿瘤治疗终点指标，通常包括生存时间(OS)及无事件生存时间(EFS)，完全缓解率。
一种优选的用于客观体现肿瘤治疗终点的指标包括总生存时间(OS)及无事件生存时间(EFS)。本发明中，所述的EFS一般指的是从患者开始治疗到病人出现AML复发进展或死亡或两个诱导疗程后没有完全缓解的时间；而OS一般指的是从患者开始治疗到任何原因死亡的时间。
临界值的判断方法
血清2-HG因非正态分布，首先进行log2转化，使数据更加接近正态性分布，然后采用年龄、性别没有统计学差异的405例健康对照的血清2-HG的平均值加5倍的标准差，做为患者异常升高的界定值。根据该界定值，把367例患者划分为升高组62例，正常组305例。
检测试剂及检测方法
本发明涉及定量和定性检测人体内2-HG水平。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人体内2-HG水平，可以用于判断核型正常的AML的分层预后。
在本发明中，所述2-HG的检测剂包括2-HG特异性抗体、α-酮戊二酸依赖酶。
其中，2-HG特异性抗体通常偶联有或带有可检测标记，如生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。此外，2-HG可作为半抗原与蛋白质载体偶联形成完全抗原，从而制备2-HG的单克隆抗体或多克隆抗体，从而获得2-HG的检测试剂。
在本发明中，术语“α-酮戊二酸依赖酶”指的是各种依赖于α-酮戊二酸结合才能产生活性的酶，且该酶一般可通过2-HG竞争性抑制能够失活。一种优选的α-酮戊二酸依赖酶包括Jumonji C区结构域去甲基化酶、TET2-5甲基胞苷脱氢酶。
通常，可通过测定样品对这类α-酮戊二酸依赖酶的抑制程度从而判断样品中2-HG的含量。因此，α-酮戊二酸依赖酶可作为本发明检测试剂用于判断AML的预后。其中α-酮戊二酸依赖酶的抑制程度可采用本领域常规方法获得。
另一种检测2-HG的方法在间接检测。现有研究已经表明，D/L2HGDH酶可催化D/L-2-HG形成α-KG，而α-KG是易于测定的(可采用常规技术进行测定)，因此将D/L2HGDH酶与经处理待测样品(如血清)或未处理的待测样品进行混合，然后通过测定D/L2HGDH酶转化所生成的α-KG数量，可以间接换算成2-HG的含量。在该间接检测法中，D/L2HGDH酶就是一种2-HG检测试剂。
在本发明中，可采用多种方法对检测试剂-样品之间的反应进行定性或定量检测，优选的方法如气相色谱-飞行时间质谱法(GC-TOFMS)检测、液相质谱(LC-MS)、酶联免疫反应法(ELISA法)检测、核磁共振法(MRI)或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。
一种检测样品中是否存在2-HG的方法是利用CSF2RB蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与2-HG特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在2-HG，当然，还可以采用上述提到的质谱分析等方法进行2-HG的定量分析。
试剂盒
本发明还提供了一种判断核型正常AML患者预后的试剂盒。可用于本发明的试剂盒通常包括点样于测试板上的检测试剂、各种浓度的2-HG标准品和/或预后判断说明书。
其中，所述的说明书中记载了检测方法以及根据不同样品测定值A1判断AML患者预后的方法。
一种优选说明书中记载的判断预后方法如下：
(a)提供受试者的测试样品；
(b)测定所述样品中的2-HG含量为A1；
(c)将步骤(b)与正常人群样品的2-HG含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组预后差；
其中，所述“显著高于”指为正常人群血清2-HG的平均值，SD为正常人群血清2-HG的平均值的标准差。
通常，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。
一般所述“显著高于”指该升高的差异在统计学上具有显著性，典型的“显著高于”的数值是指测试对象(如人)血清中2-HG浓度≥4μg/ml。
此外，本发明所述的预后还可以指进一步的分层预后，包括通过将测试对象的样品2-HG含量A1与正常人群样品的2-HG含量A0相比较，并如下进行分层预后为：
当所述A1≥22.69μg/ml，则表明预后非常差(D级)；
当所述A1为22.01-22.69μg/ml，则表明预后差(C级)；
当所述A1为21.85-22.01μg/ml，则表明预后优于C级(B级)；
当所述A1≤21.85μg/ml，则表明预后优于B级(A级)。
一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人血液样品、血清样品。其中，所述的血液或血清样品可来自于外周血或骨髓。
本发明有益效果
本发明通过筛选大量AML相关基因以及癌症代谢物，确定了2-HG可作为有效的判断AML尤其是核型正常型AML预后的标志物，此外，通过对2-HG的不同含量的界定与划分，还能够相对精确地判断这一类人群的预后情况，能够为临床诊疗进行有利的指导。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
血清样品的前处理
内标溶液和甲氧胺吡啶溶液的制备
1.称取足量的内标2-氯苯丙氨酸粉末，加入准确体积的超纯水，振荡使其充分溶解，然后制成0.3mg/mL的水溶液，放至玻璃管中，避光，4℃冰箱保存备用。
2.称取足量的内标十七烷酸粉末，加入准确体积的甲醇溶液(色谱纯级)，振荡使其充分溶解，制成1mg/mL的醇溶液，放至玻璃管中，避光，4℃保存备用。
3.称取适量的甲氧胺粉末，加入准确体积的吡啶，振荡使其充分溶解，制成15mg/mL的溶液，室温下避光暂时存放备用。
血清衍生化处理
从-80℃冰箱中取出冻存的血清，室温下解冻。对每份标本，取出血清100μL，加入300μL的甲醇:氯仿混合溶液(体积比甲醇:氯仿=3:1)，振荡1分钟，充分混匀。-20℃静置10分钟，沉淀蛋白。室温下，10,000rpm离心10分钟。取上清300μL放入GC高回收进样瓶中，加入10μL内标2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)和10μL内标十七烷酸(1mg/mL)，真空浓缩干燥。干燥完毕后，接通氮气除去进样瓶中的残留水汽，迅速加入80μL甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)并加盖密封，振荡混匀后，置于摇床(30℃，200rpm)上反应90分钟。反应完毕后，开启密封盖，迅速加入80μL硅烷化试剂BSTFA(含1%TMCS)，立即加盖密封，振荡混匀后，置于70℃烘箱中1小时，进行衍生化反应。反应结束后，振荡1分钟，室温下静置1小时，等待上样检测。
检测的程序设置
进样针以splitless的模式吸取1μL衍生化标本入偶联了Pegasus HT飞行时间质谱仪的Agilent6890N色谱仪中((Leco Corporation,St Joseph,USA)。使用的色谱柱为DB-5MS毛细管柱(30m×250μm I.D.,0.25-μm film thickness;(5%-phenyl)-methylpolysiloxane bonded and crosslinked;Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)。载气为氮气，载气流速为1mL/分钟。进样口温度设为270℃，离子源温度设为220℃，接口温度设为270℃。程序升温起始温度为80℃，保持2分钟；以10℃/分钟的速度升至180℃，再以6℃/分钟的速度升至230℃，最后以40℃/分钟的速度升至295℃，保持8分钟。质谱仪的电离方式设为EI，电子能量设为70eV，以全扫描方式扫描，扫描范围设为m/z30-600。
主要仪器设备
气相色谱-质谱联用仪(美国Perkin Elmer公司)
DB-5MS气相毛细管色谱柱(安捷伦科技有限公司)
低温冷冻冰箱(BC/BD-190S型青岛海尔)
离心机(LD5-2A型北京医用离心机厂)
离心机(TGL-16B上海安亭科学仪器制造厂)
微型漩涡混合器(QL-901型江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)
电子分析天平(BS124S德国Startorius公司)
数控超声仪(KQ-250DB型昆山市超声仪器有限公司)
超纯水器(Mill-QⅡ型Milipore,Bedford,MA,USA)
实施例1样本收集
1.研究对象
1.1.实验例：本研究纳入从2007年～2012年间，在全国7个主要的血液病诊疗中心,包括上海交通大学医学院附属瑞金医院、浙江大学医学院附属第一医院、苏州大学附属第一医院、中国医科大学附属第一医院、大连医科大学附属第二医院、南京医科大学附属第一医院、北京大学人民医院，经形态学、免疫学、遗传学(MIC)检查确诊的急性髓细胞白血病患者，共367例，具体如下：
男性210例，女性157例，AML患者的中位年龄46岁，年龄分布15-82岁。
另外收集其他常见的血液系统肿瘤患者：急性淋巴细胞白血病150例，男性92例，女性58例，患者的中位年龄36岁，年龄分布13-73岁；原发性骨髓纤维化7例，男性3例，女性4例，患者的中位年龄54岁，年龄分布46-61岁；多发性骨髓瘤24例，男性15例，女性9例，患者的中位年龄56岁，年龄分布42-79岁；淋巴瘤64例，男性40例，女性24例，患者的中位年龄54岁，年龄分布14-79岁；骨髓增生异常综合症31例，男16例，女15例，患者的中位年龄60岁，年龄分布43-86岁；慢性粒细胞白血病18例，男10例，女8例，患者的中位年龄41岁，年龄分布23-84岁。
入选标准：所有患者无严重的心肝脑肺等其他系统的严重合并症。排除复治AML，排除患有其它脏器恶性肿瘤，排除怀孕或哺乳期妇女，排除糖尿病、甲状腺功能亢进等常见内分泌代谢性疾病患者，排除偏食、烟酒嗜好患者，排除严重胃肠炎患者。
1.3.对照例：瑞金医院体检中心的健康体检者405例，男233例，女性172例，中位年龄46岁，年龄分布16-82岁。体检者无皮肤粘膜出血，无全身浅表淋巴结肿大。血常规、肝肾功能正常。健康对照排除糖尿病、甲状腺疾病等常见内分泌性疾病，排除急性和慢性胃肠炎患者，排除心肝肺肾结构及功能严重受损，排除肿瘤患者。
2.血液样本采集
病人初发状态与健康体检者均在清晨空腹留取5ml静脉血，使用BD公司的真空采血管(BD Vacutainer SSTⅡAdvance REF367955，黄盖普管)采血。血液标本2000转10min离心后获得的血清用Axygen0.5mL离心管分装上清、编号、负80度冻存。此项研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院临床研究伦理委员会批准。充分告知患者和正常对照研究内容和意义，经签署知情同意书后，在无菌条件下采集患者血液标本。
3.材料与试剂
BSTFA购自于美国SIGMA公司。氯仿，无水乙醇，吡啶，氢氧化钠，无水硫酸钠，以上皆为分析纯，购自上海润洁化学试剂有限公司。内标：L-2-氯苯丙氨酸，十七酸，购自美国SIGMA公司。2-HG,购自Toronto Research Chemicals Inc。
实施例2标准品溶液的配置和标准曲线的建立
配置2-HG标准品的母液，然后分别取适量的母液一一稀释成为14个浓度不同溶度，并且各取100μL稀释液入GC高回收进样瓶中，加入内标氯苯丙氨酸和十七烷酸各10μL，按照血清衍生化方法进行衍生化，最后上样检测。
根据标准品的溶度梯度和相应的峰面积，计算出标准品不同溶度对应的峰面积的回归线，由回归线确定每个样本的2-HG的溶度。为了使2-HG的溶度趋向正态分布，所有样本的2-HG溶度经过log2转换。转换的数值再进行最后的分析比较。
图4显示了标准曲线图。标准曲线的公式y=11.80x+1.66，R2=0.997，y是2-HG的溶度，x是2-HG的相对数值，2-HG的相对数值指2-HG的峰面积除以内标氯苯丙氨酸的峰面积。
实施例3数据的提取及定量检测方法
原始GC-TOFMS数据文件，通过Turbomass软件的DataBridge(Perkin-Elmer Inc,USA)数据转换功能转换NetCDF的格式，然后直接导入MATLAB(The MathWorks,Inc.,USA)脚本进行处理。
处理过程大致可以分为基线矫正、峰判别和匹配、内标和一些系统杂峰的排除以及用峰面积总和的方法进行峰的归一化。最终得到三维矩阵图，这三维的坐标分别为：化合物的特性指标(这里用质荷比来表示)，样本名以及归一化后的峰面积。把峰的保留时间和质荷比信息跟标准品进行匹配，鉴定出代谢物2-HG。
结果：通过检测分析405例健康对照和661例血液系统肿瘤包括367例AML患者的血清中小分子代谢物2-羟基戊二酸水平。由于血液系统恶性肿瘤在整体人群中属于发病率较低的疾病，因此为了避免假阳性率过高，选用健康对照的血清2-羟基戊二酸的平均值加5倍的标准差为界定值把血液系统恶性肿瘤患者划分为高2-羟基戊二酸水平组和正常组。
跟健康对照比较，发现部分常见的血液系统恶性肿瘤血清2-羟基戊二酸水平升高，其中，以AML和ALL最为显著(见表1和图1)。
表1
疾病名称 病例数 2-HG升高比例(%)
AML 367 17
ALL 150 3.3
NHL 64 1.6
由于原发性骨髓纤维化(PMF)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合症(MDS)、或慢性粒细胞性白血病(CML)在人群中的发病率较AML、ALL、NHL等更低，因此样本量相对较小。然而，2-HG的含量高低对于这些血液系统恶性肿瘤也具有一定的预后价值。在对更多样本的病例进行测定和统计后，本领域技术人员可以得出更准确的阈值，从而通过对诸如血清中2-HG含量的测定，对原发性骨髓纤维化(PMF)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合症(MDS)、或慢性粒细胞性白血病(CML)等患者进行预后判断。
实施例32-HG水平与患者生存时间的验证
通过随访，对AML患者的总生存时间(OS)和无事件生存时间(EFS)与2-HG水平进行相关性分析。结果可见，跟正常组比较，高2-羟基戊二酸水平组的患者的总生存时间(OS)和无事件生存时间(EFS)显著缩短(见图3)。
实施例4进一步预后分层
分别实施例3中高水平组和正常水平组的2-HG的中位数，把两组进一步划分为四组：<1.85(μg/ml,Log2)水平组；1.85-2.01(μg/ml,Log2)水平组；2.01-2.69(μg/ml,Log2)水平组；>2.69(μg/ml,Log2)水平组。
Kaplan-Meier(KM)曲线的生存分析的提示，2-HG水平越高，患者的预后越差，呈现出剂量效应(图3C和3D)。
讨论
AML是一个多基因调控的复杂疾病，以往的研究曾提示了某些与AML预后差相关的基因如DNMT3A、IDH1/2，以及某些与AML预后较好相关的基因。然而，另外一些研究又表明，在更多的病例分析中发现，某些代表AML预后较好的基因也被发现通常会伴随着预后差的基因同时出现，这导致预后的难度加大。此外，一些现有的研究结果不太一致，对某些基因的结论甚至相反。
2-HG是人体内的小分子化合物，有一些研究认为2-HG属于人体的代谢产物。在本发明之前，本领域中尚未有任何一种小分子化合物被公认为可在临床上用于血液系统恶性肿瘤的预后判断。
本发明发现，2-HG能够明确预后多种血液系统恶性肿瘤，尤其是AML和ALL等。2-HG的含量越高，则预后越差，且高2-HG水平与临床指标(WBC,年龄，治疗方案)和分子指标如基因突变(DNMT3A、、FLT3-ITD、IDH1/2、MLL-PTD、NPM1、CEBPA)等常用预后标志物无关。
这表明，2-HG是一种具有极高预后价值的、可在临床上用于血液系统恶性肿瘤的预后判断的小分子化合物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种二羟基戊二酸(2-HG)或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备判断急性髓细胞白血病(AML)预后的试剂盒；其中，2-HG作为急性髓细胞白血病的预后判断的小分子化合物，
所述的预后是将来自测试对象的样品2-HG含量A1与正常人群的2-HG含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组预后差，且所述的“显著高于”指测试对象血清中2-HG浓度≥4μg/ml；且
所述预后为分层预后，且如下进行分层预后：
当所述A1≥22.69μg/ml，则表明预后非常差，为D级；
当所述A1为22.01-22.69μg/ml，则表明预后差，为C级；
当所述A1为21.85-22.01μg/ml，则表明预后优于C级，为B级；
当所述A1≤21.85μg/ml，则表明预后优于B级，为A级。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AML包括核型正常的AML和核型异常的AML。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的AML为核型正常的AML。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述预后是指对测试对象进行总生存时间(OS)或无事件生存时间(EFS)的预估。
5.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述的正常人群的数量为至少100人。
6.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，正常人群取自200-2000人的人群。
7.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，正常人群至少300人。
8.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，正常人群至少500人。
9.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括2-HG特异性抗体、α-酮戊二酸依赖酶或2HGDH酶。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括二羟基戊二酸(2-HG)的标准品。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的标准品是浓度分别为22.69、22.01、和21.85μg/ml的二羟基戊二酸(2-HG)的标准品。
12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的2-HG特异性抗体带有可检测标记。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
14.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述2-HG特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括点样于测试板上的所述检测试剂以及使用说明书。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的说明书记载了检测方法以及根据A1值进行预后的方法。
17.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的α-酮戊二酸依赖酶包括Jumonji C区结构域去甲基化酶或TET2-5甲基胞苷脱氢酶。
18.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括通过测定2-HG对α-酮戊二酸依赖酶的抑制率而进行检测2-HG含量的检测试剂。
19.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测包括气相色谱-飞行时间质谱法(GC-TOFMS)检测、酶联免疫反应法(ELISA法)检测、核磁共振法(MRI)、或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。
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