CN111647056B - 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用 - Google Patents

一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性响应于L‑2‑羟基戊二酸(L‑2‑HG)的转录调控因子LhgR以及基于该转录调控因子的L‑2‑羟基戊二酸生物传感器；其中所述生物传感器为青色荧光蛋白mTFP、L‑2‑HG特异性转录调控因子LhgR与黄色荧光蛋白Venus线性相连的融合蛋白，包括L‑2‑HG生物传感器LHGFR0N0C、L‑2‑HG生物传感器LHGFR0N3C及L‑2‑HG生物传感器LHGFR0N7C三种。本发明还公开了所述L‑2‑HG生物传感器在检测含有L‑2‑HG生物样品、实时检测细菌胞内L‑2‑HG浓度以及检测人体细胞胞内L‑2‑HG中的应用。实验证实本发明的生物传感器可实现对L‑2‑HG的高特异性、灵敏性、准确性检测，且能够实时测定胞内L‑2‑HG动态，具有很好的应用前景。

Description

一种基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器 及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物传感器及其应用，尤其涉及一种基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG)生物传感器及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG)参与生命中众多的生理过程，在哺乳动物及植物中由乳酸脱氢酶LDH及苹果酸脱氢酶MDH在低氧条件下还原2-酮基戊二酸产生[1]，在微生物中是戊二酸羟化酶CsiD介导的戊二酸羟基化途径的重要中间代谢物[2]，其通过L-2-HG脱氢酶L2HGDH或L-2-HG氧化酶LhgO分解代谢为2-酮基戊二酸[3]，然而尚未阐明L-2-HG代谢的调控机制。L-2-HG被视为多种癌症的标志物[4]，能够抑制多种2-酮基戊二酸依赖性双加氧酶的活性[5]，其积累导致癌症、L-2-羟基戊二酸尿症的发生[6,7]。此外，L-2-HG能够促进CD8+T淋巴细胞的增殖与抗肿瘤能力[8]、减轻细胞还原压力[1]、协调糖酵解通量[9]。鉴于L-2-HG在细胞代谢中生理功能的多样性与复杂性，建立细胞内L-2-HG的实时检测方法意义巨大和至关重要。
已报道的L-2-HG检测方法包括LC-MS/MS、GC-MS/MS等[10,11]，不仅耗时、繁琐并且缺乏时空分辨率，限制了L-2-HG相关诊疗技术的发展。目前已有数种基于荧光共振能量转移(Forster resonance energy transfer，FRET)技术的小分子生物传感器被开发，并广泛应用于测定代谢物胞内动态[12,13]，其由与配体特异性结合的识别元件及一对荧光蛋白组成，配体结合后诱导构象改变，进而影响生物传感器的光学性质(荧光蛋白间发射强度比值的改变可反映配体的浓度变化)，而基于FRET技术的生物传感器构建的基础是筛选获得特异性响应于配体的识别元件，基于响应于L-2-HG的特异性转录调控因子的筛选有助于开发基于FRET技术的L-2-HG生物传感器。经检索，有关L-2-HG特异性转录调控因子及基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器和应用该生物传感器检测含有L-2-HG生物样品或实时检测细菌胞内及人体细胞胞内L-2-HG浓度的方法尚未有报道。
参考文献：
[1]Oldham,W.M.,Clish,C.B.,Yang,Y.&Loscalzo,J.Hypoxia-mediatedincreases in L-2-hydroxyglutarate coordinate the metabolic response toreductive stress.Cell Metab.22,291-303(2015).
[2]Zhang,M.et al.Increased glutarate production by blocking theglutaryl-CoA dehydrogenation pathway and a catabolic pathway involving L-2-hydroxyglutarate.Nat.Commun.9,2114(2018).
[3]Rzem,R.et al.A gene encoding a putative FAD-dependent L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase is mutated in L-2-hydroxyglutaric aciduria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101,16849-16854(2004).
[4]Shelar,S.et al.Biochemical and epigenetic insights into L-2-hydroxyglutarate,a potential therapeutic target in renal cancer.Clin.CancerRes.24,6433-6446(2018).
[5]Xu,W.et al.Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitiveinhibitor ofα-ketoglutarate-dependent dioxygenases.Cancer Cell19,17-30(2011).
[6]Shim,E.H.et al.L-2-Hydroxyglutarate:an epigenetic modifier andputative oncometabolite in renal cancer.Cancer Discov.4,1290-1298(2014).
[7]Kranendijk,M.,Struys,E.A.,Salomons,G.S.,Van der Knaap,M.S.&Jakobs,C.Progress in understanding2-hydroxyglutaric acidurias.J.Inherit.Metab.Dis.35,571-587(2012).
[8]Tyrakis,P.A.et al.S-2-hydroxyglutarate regulates CD8+T-lymphocytefate.Nature540,236-241(2016).
[9]Li,H.et al.Drosophila larvae synthesize the putativeoncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.Proc.Natl.Acad.Sci.USA114,1353-1358(2017).
[10]Struys,E.A.,Jansen,E.E.,Verhoeven,N.M.&Jakobs,C.Measurement ofurinary D-and L-2-hydroxyglutarate enantiomers by stable-isotopedilutionliquid chromatography-tandem mass spectrometry after derivatization withdiacetyl-L-tartaric anhydride.Clin.Chem.50,1391-1395(2004).
[11]Fernandez-Galan,E.et al.Validation of a routine gaschromatography mass spectrometry method for2-hydroxyglutarate quantificationin human serum as a screening tool for detection of idh mutations.J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life.Sci.1083,28-34(2018).
[12]Bischof,H.et al.Novel genetically encoded fluorescent probesenable real-time detection of potassium in vitro and in vivo.Nat.Commun.8,1422(2017).
[13]Zhang,W.H.et al.Monitoring hippocampal glycine with thecomputationally designed optical sensor GlyFS.Nat.Chem.Biol.14,861-869(2018).
发明内容
针对现有技术中L-2-HG检测方法耗时繁琐且难以满足胞内实时监测的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于特异性转录调控因子LhgR的L-2-羟基戊二酸(L-2-HG)生物传感器及其应用。所述生物传感器基于L-2-HG特异性转录调控因子LhgR，耦合荧光共振能量转移技术实现了快速、灵敏、准确的识别L-2-HG浓度并以荧光信号输出，且能实时测定胞内L-2-HG浓度动态变化。
本发明所述的特异性响应于L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG)的转录调控因子，命名为转录调控因子LhgR，其特征在于：所述转录调控因子LhgR来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619，属于GntR家族的转录阻遏蛋白，其基因组位于L-2-羟基戊二酸氧化酶LhgO编码基因上游，能够结合至lhgO的启动子区域，调控L-2-HG分解代谢，且能够特异性响应于L-2-HG；所述转录调控因子LhgR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述特异性响应于L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG)的转录调控因子以如下方法获得：
(1)分析L-2-HG分解代谢关键酶的编码基因lhgO在不同菌株基因组中分布情况，确定在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619基因组中lhgO上游编码GntR家族转录调控因子lhgR，全基因合成lhgR基因，克隆至pETDuet-1载体，并将重组质粒pETDuet-lhgR导入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)，通过诱导表达、分离纯化获得LhgR蛋白。
(2)通过凝胶阻滞实验进行验证并确定上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619中转录调控因子LhgR的功能。将LhgR分别与不同的化合物(L-赖氨酸、5-氨基戊酸、戊二酸、D-2-HG、2-酮基戊二酸、琥珀酸)共同孵育，加入lhgO启动子片段，通过电泳分离、染色及成像，分析在不同化合物存在的条件下对LhgR与lhgO启动子片段结合能力的影响，实验表明仅L-2-HG抑制LhgR与lhgO启动子片段的结合，证明LhgR为特异性响应于L-2-HG的转录调控因子。
本发明所述的基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG)生物传感器，其特征在于：所述生物传感器为青色荧光蛋白mTFP、L-2-HG特异性转录调控因子LhgR与黄色荧光蛋白Venus线性相连的融合蛋白；其包括L-2-HG生物传感器LHGFR0N0C、L-2-HG生物传感器LHGFR0N3C及L-2-HG生物传感器LHGFR0N7C三种，其中所述LHGFR0N0C的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LHGFR0N3C的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述LHGFR0N7C的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；当所述生物传感器结合L-2-HG后会诱导该生物传感器构象改变，导致荧光蛋白间发射强度比值改变，伴随L-2-HG浓度升高，生物传感器发射强度比值也增加，以此指标实现对L-2-HG特异性检测；其中，所述生物传感器对L-2-HG的响应测定方法是：将传感器编码质粒导入表达菌株E.coli BL21(DE3)，经诱导表达、分离纯化，使用50mM pH 7.4Tris-HCl稀释至1μM，与梯度浓度的L-2-HG以3：1体积比混合，使用荧光酶标仪测定在430nm的激发波长下，485nm与528nm处的荧光发射强度。
上述基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器的构建方法，步骤是：
(1)全基因合成青色荧光蛋白mTFP与黄色荧光蛋白Venus，分别作为模板，PCR扩增并通过酶切位点BamHI/SacI与SalI/NotI先后克隆至pETDuet-1载体，获得重组质粒pETDuet-mTFP-Venus；
(2)全基因合成恶臭假单胞菌W619中转录调控因子LhgR，以其为模板，PCR扩增并通过酶切位点SacI/SalI插入pETDuet-mTFP-Venus中，获得重组质粒pETDuet-LHGFR0N0C，该重组质粒命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N0C；
(3)为提高该生物传感器对L-2-HG检测的灵敏度，截短L-2-HG特异性转录调控因子LhgR的N末端及C末端氨基酸以实现对生物传感器的优化：PCR扩增LhgR的截短变体，即LhgR的N末端与C末端截短氨基酸的组合，将获得的截短片段通过酶切位点SacI/SalI插入pETDuet-mTFP-Venus，经过构建与筛选，获得LhgR的C末端截短三个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N3C，该重组质粒命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N3C，或者获得LhgR的C末端截短七个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N7C，该重组质粒命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N7C。
本发明所述基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器在检测含有L-2-HG生物样品中的应用。
上述应用的方法是：采用健康成人血清、尿液或细菌培养基配制L-2-HG的梯度溶液，在避光条件下将该溶液与纯化的L-2-HG生物传感器按体积比混合，使用荧光酶标仪测定mTFP与Venus的荧光发射强度，在每个发射波长下扣除不含L-2-HG生物传感器的背景荧光强度，获得生物样本中对L-2-HG的剂量-响应曲线并得到L-2-HG的定量结果；其中所述L-2-HG生物传感器响应于血清、尿液或细菌培养基中L-2-HG浓度的增加，其荧光发射强度比值表现出剂量依赖式的增加，且该生物传感器对于生物样品中L-2-HG的测定结果与液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)测定结果一致，表明其应用于L-2-HG定量检测中的准确性。
本发明所述基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器在实时检测细菌胞内L-2-HG浓度中的应用。
上述应用的方法是：将L-2-HG生物传感器编码质粒pETDuet-LHGFR0N3C导入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，振荡培养后加入IPTG过夜诱导LHGFR0N3C表达，在无碳源的无机盐培养基中碳饥饿处理8小时以清除胞内L-2-HG，取90μL碳饥饿处理后的菌液与10μL梯度浓度的L-2-HG溶液混合，通过荧光酶标仪以5分钟的时间间隔连续测定mTFP与Venus的荧光发射强度及其比值，其荧光发射比值响应于L-2-HG的添加而增加，且荧光发射比值变化水平与L-2-HG的浓度存在正相关的关系，以此指标实现实时检测细菌胞内L-2-HG浓度动态变化。
本发明所述基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器在检测人体细胞胞内L-2-HG浓度中的应用。
上述应用的方法是：将LHGFR0N3C与LHGFR0N7C的核苷酸序列经哺乳动物密码子优化并全基因合成，在起始密码子前加入kozark序列，5’-GCCACC-3’，并连接于pcDNA3.1(+)质粒，获得的重组质粒pcDNA3.1-LHGFR0N3C与pcDNA3.1-LHGFR0N7C分别转染至HEK293FT细胞中，48h后胰酶消化并重悬于补加20mM HEPES的1×Hank’s平衡盐缓冲液，使用10μM洋地黄皂苷处理细胞，使细胞渗透化；取90μL处理后的细胞悬浮液与10μL梯度浓度的L-2-HG混合，于荧光酶标仪中测定mTFP与Venus的荧光发射强度及比值，其中LHGFR0N3C与LHGFR0N7C能够检测人体细胞胞内L-2-HG浓度，响应于L-2-HG的添加，L-2-HG生物传感器的荧光发射比值增加。
本发明的实质性特点和突出效果是：
(1)本发明基于对L-2-HG分解代谢关键酶编码基因lhgO在不同菌株基因组的邻域分析，结合凝胶阻滞技术，在恶臭假单胞菌W619中鉴定出首个调控L-2-HG分解代谢，且特异性响应于L-2-HG的转录调控因子LhgR。
(2)本发明基于转录调控因子LhgR与L-2-HG结合后发生构象改变的特点，耦合荧光共振能量转移技术，通过将LhgR插入青色荧光蛋白mTFP与黄色荧光蛋白Venus间，构建L-2-HG生物传感器LHGFR，能够将L-2-HG浓度信号转换为荧光强度信号输出，具备极强的特异性，可实现对L-2-HG的快速、灵敏检测。
(3)本发明构建的L-2-HG生物传感器对于包括血清、尿液及细菌培养基在内的生物样本L-2-HG定量中，具备与常规检测方法LC-MS/MS相近的定量结果，表明该方法还具备良好的准确性，在L-2-HG相关疾病的快速诊疗中具备良好的临床应用前景。
(4)本发明构建的L-2-HG生物传感器在胞内表达，结合荧光酶标仪可实时检测细胞内L-2-HG动态，有望阐明L-2-HG在人体细胞中的生理及病理功能。
附图说明
图1：LhgR表达纯化的SDS-PAGE验证。
图2：LhgR对L-2-HG的特异性分析。
图3：L-2-HG生物传感器的原理示意图。
图4：LHGFR0N0C对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图5：LHGFR0N3C对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图6：LHGFR0N7C对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图7：比较L-2-HG生物传感器与LC-MS/MS对于血清中L-2-HG的定量结果。
图8：比较L-2-HG生物传感器与LC-MS/MS对于尿液中L-2-HG的定量结果。
图9：比较L-2-HG生物传感器与LC-MS/MS对于细菌培养基中L-2-HG的定量结果。
图10：LHGFR0N3C实时监测细菌胞内L-2-HG动态。
图11：LHGFR0N3C检测人体细胞胞内L-2-HG水平。
图12：LHGFR0N7C检测人体细胞胞内L-2-HG水平。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。所使用的菌株、细胞、材料、试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径获得。
实施例1：L-2-羟基戊二酸(L-2-HG)的转录调控因子LhgR的获取及鉴定
(1)LhgR的表达纯化
将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619中包含lhgR启动子(F2)、lhgR基因、lhgO启动子(F1)、lhgO基因在内的基因片段
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010501.1)由通用生物系统(安徽)有限公司全基因合成，连接于pETDuet-1质粒，并保存于Escherichia coli Top10菌株。提取该菌株中重组质粒pETDuet-F2-lhgR-F1-lhgO，使用合成的引物PCR扩增lhgR基因，使用BamHI/HindIII双酶切基因片段与pETDuet-1质粒，通过T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pETDuet-lhgR，将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选构建成功的菌株。挑取单菌落，经菌液PCR验证成功后，以1.5％比例接种于1L含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm约0.6，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下过夜诱导LhgR表达，随后进行蛋白质分离纯化，纯化结果见附图1；lhgR基因序列长度为711个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过PCR扩增Pseudomonas putida W619来源的lhgR基因，引物设计如下：
上游引物：5’-AATTGGATCCGATGCTAGAACTCCAGC-3’，携带一个BamHI位点；
下游引物：5’-AATTAAGCTTTCAGTCGAGTGCAGGT-3’，携带一个HindIII位点。
(2)凝胶阻滞实验分析LhgR效应物
以重组质粒pETDuet-F2-lhgR-F1-lhgO为模板，使用合成的引物PCR扩增lhgO的启动子F1片段，使用凝胶阻滞结合缓冲液稀释F1片段至100nM，稀释纯化的LhgR蛋白至2000nM。在18μL的凝胶阻滞结合缓冲液中使之含有60nM纯化的LhgR蛋白，50mM的不同化合物，在30℃下孵育15分钟，之后加入2μL终浓度为10nM的F1片段，在30℃下再孵育30分钟。取10μL反应混合物在4℃、170伏特电压下于6％天然丙烯酰胺凝胶电泳约45分钟。使用SYBRGreen I染料染色约45分钟，通过凝胶成像仪拍照，成像结果见附图2，L-赖氨酸、5-氨基戊酸、戊二酸、D-2-HG、2-酮基戊二酸、琥珀酸均不能干扰LhgR与DNA片段的结合，仅在L-2-HG存在的条件下发生DNA条带的迁移，说明L-2-HG特异性抑制LhgR与lhgO启动子的结合，即LhgR特异性响应于L-2-HG。
通过PCR扩增Pseudomonas putida W619来源的lhgO启动子区域，引物设计如下：
上游引物：5’-TACCCAGAGCTTGCTGCGAC-3’；
下游引物：5’-GCAGGGGTACCTTGTGATTCTT-3’。
其中，上述步骤(1)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl10g/L，pH 7.0；121℃灭菌20分钟。
上述步骤(2)中所述的凝胶阻滞结合缓冲液配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.5mM EDTA，10％甘油，1mM二硫苏糖醇，调整pH为7.4。电泳缓冲液配方为：89mM Tris，89mM硼酸，2mM EDTA，调整pH为8.3。
实施例2：L-2-HG生物传感器的构建
(1)L-2-HG生物传感器LHGFR0N0C的构建
将青色荧光蛋白mTFP编码基因与黄色荧光蛋白Venus编码基因由通用生物系统(安徽)有限公司全基因合成，连接于pETDuet-1质粒，并保存于Escherichia coli Top10菌株。提取E.coli Top10-pETDuet-mTFP菌株与E.coli Top10-pETDuet-Venus菌株中重组质粒pETDuet-mTFP与pETDuet-Venus，分别作为模板，使用合成的引物PCR扩增mTFP基因与Venus基因，使用BamHI/SacI双酶切mTFP片段与pETDuet-1质粒，使用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pETDuet-mTFP’。使用SalI/NotI双酶切Venus片段与pETDuet-mTFP’质粒，并用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pETDuet-mTFP-Venus。
以重组质粒pETDuet-F2-lhgR-F1-lhgO为模板，使用合成的引物PCR扩增完整长度的lhgR基因，使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法插入pETDuet-mTFP-Venus中。即使用SalI/NotI双酶切重组质粒pETDuet-mTFP-Venus，使之线性化，随后在15μL连接体系中加入5μL lhgR片段与线性化的上述重组质粒，其中片段与质粒摩尔比为4：1。在30℃条件下孵育40分钟，随后置于冰上冷却10分钟，得到重组质粒pETDuet-LHGFR0N0C，该重组质粒命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N0C，基因序列长度为2148个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。重组质粒转化至E.coli DH5α中保存。传感器示意图如附图3所示。
通过PCR扩增mTFP基因，引物设计如下：
上游引物：5’-AATTGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGA-3’，携带一个BamHI位点；
下游引物：5’-AATTGAGCTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGT-3’，携带一个SacI位点。
通过PCR扩增Venus基因，引物设计如下：
上游引物：5’-AATTGTCGACATGGTGAGTAAAGGCGAAGAACTGT-3’，携带一个SalI位点；
下游引物：5’-AATTGCGGCCGCTTATTTATACAGTTCATCCATGCCC-3’，携带一个NotI位点。
通过PCR扩增完整长度的Pseudomonas putida W619来源的lhgR基因，引物设计如下：
上游引物：5’-CGAGCTGTACAAGGAGCTCATGCTAGAACTCCAGCGCCC-3’；
下游引物：5’-CTTTACTCACCATGTCGACGTCGAGTGCAGGTAGTTCTA-3’。
(2)L-2-HG生物传感器的优化
本发明通过对L-2-HG生物传感器中信号识别元件LhgR的N末端、C末端氨基酸进行截短处理实现对生物传感器的优化，即以重组质粒pETDuet-F2-lhgR-F1-lhgO为模板，使用合成的引物PCR扩增截短的lhgR基因，使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法插入pETDuet-mTFP-Venus中，从而获得系列L-2-HG生物传感器突变体。以对L-2-HG响应的信噪比为指标，筛选优良的传感器变体。其中以LhgR0N3C(在LhgR的C末端截短三个氨基酸)与LhgR0N7C(在LhgR的C末端截短七个氨基酸)的突变体具备最优的信噪比，对应的重组质粒为pETDuet-LHGFR0N3C与pETDuet-LHGFR0N7C。
将获得LhgR的C末端截短三个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N3C命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N3C，其基因序列长度为2139个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
将获得LhgR的C末端截短七个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N7C命名为L-2-HG生物传感器LHGFR0N7C，其基因序列长度为2127个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.4。重组质粒分别转化至E.coli DH5α中保存。
通过PCR扩增C末端截短三个氨基酸的lhgR基因，引物设计如下：
上游引物：5’-CGAGCTGTACAAGGAGCTCATGCTAGAACTCCAGCGCCC-3’；
下游引物：5’-CTTTACTCACCATGTCGACAGGTAGTTCTATTTTCAGGC-3’。
通过PCR扩增C末端截短七个氨基酸的lhgR基因，引物设计如下：
上游引物：5’-CGAGCTGTACAAGGAGCTCATGCTAGAACTCCAGCGCCC-3’；
下游引物：5’-CTTTACTCACCATGTCGACTTTCAGGCGTTTGGCAGAGG-3’。
其中，上述步骤(1)～(2)中所述的基于T5核酸外切酶的DNA组装方法中15μL连接体系的配方为：4μL 5×等温反应缓冲液(0.5M Tris-HCl，0.05M MgCl2，0.05M二硫苏糖醇)，0.004μL 10U/μL T5核酸外切酶，11μL ddH2O。
实施例3：L-2-HG生物传感器对L-2-HG的响应
(1)L-2-HG生物传感器的表达纯化
将实施例2中所述生物传感器表达质粒pETDuet-LHGFR0N0C、pETDuet-LHGFR0N3C、pETDuet-LHGFR0N7C分别转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中，分别得到E.coli BL21(DE3)-pETDuet-LHGFR0N0C菌株、E.coli BL21(DE3)-pETDuet-LHGFR0N3C菌株及E.coli BL21(DE3)-pETDuet-LHGFR0N7C菌株，然后分别涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选构建成功的菌株。挑取单菌落，经菌液PCR验证成功后，以1.5％比例接种于1L含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm约0.6，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下过夜诱导蛋白表达，分离纯化获得LHGFR0N0C、LHGFR0N3C与LHGFR0N7C蛋白。
(2)L-2-HG生物传感器对L-2-HG的剂量-响应曲线测定
使用50mM Tris-HCl(pH 7.4)稀释纯化后的L-2-HG生物传感器蛋白至1μM，使用50mM Tris-HCl(pH 7.4)配制梯度浓度的L-2-HG，在避光条件下，将纯化的L-2-HG生物传感器与L-2-HG溶液以3：1的体积比混合，取100μL混合物转移至黑色平底96孔板中，于珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪下读取mTFP与Venus的荧光发射强度。仪器参数设置为：激发波长为430nm，发射波长分别为485nm(mTFP)与528nm(Venus)。在每个发射波长下扣除不含L-2-HG生物传感器的背景荧光强度，以校正后的528nm处荧光强度与485nm处荧光强度的比值，与L-2-HG的浓度绘制剂量-响应曲线。
结果如附图4-6所示，表明L-2-HG浓度依赖性的荧光比值变化，LHGFR0N0C及优化变体LHGFR0N3C、LHGFR0N7C的最大荧光比值变化ΔRmax分别为11.47±0.38％、56.13±0.29％与60.37±1.30％，表明响应于L-2-HG的添加，其荧光发射强度比值有显著增加；此外LHGFR0N3C与LHGFR0N7C的表观解离常数Kd分别为29.33±1.24μM与7.22±0.38μM，表明其对于L-2-HG亲和力的不同，可分别适用于检测不同范围的L-2-HG浓度。
实施例4：L-2-HG生物传感器在检测含有L-2-HG生物样品中的应用
将实施例3中所纯化的LHGFR0N3C与LHGFR0N7C蛋白通过50mM Tris-HCl(pH 7.4)稀释至1μM，使用健康成人血清、尿液及细菌培养基配制梯度浓度L-2-HG溶液，在避光条件下，将L-2-HG生物传感器与L-2-HG溶液以3：1的体积比混合，于珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪下读取mTFP与Venus的荧光发射强度，在每个发射波长下扣除不含L-2-HG生物传感器的背景荧光强度，获得不同生物样本中对L-2-HG的剂量-响应曲线并得到L-2-HG的定量结果。该定量结果与LC-MS/MS定量结果相比较，结果如附图7-9所示，结果表明响应于L-2-HG浓度的增加，生物传感器的荧光发射强度比值表现出剂量-响应式的增加，此外生物传感器对于L-2-HG的测定结果与LC-MS/MS测定结果一致，表明其应用于L-2-HG定量检测中的准确性。
实施例5：L-2-HG生物传感器在实时检测细菌胞内L-2-HG浓度中的应用
将实施例3中所构建E.coli BL21(DE3)-pETDuet-LHGFR0N3C菌株以1％接种量接种于50mL含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm约0.6，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下过夜诱导LHGFR0N3C表达。取适量菌液，6000rpm离心2分钟收集菌体，清洗三次后，重悬于不含碳源的无机盐培养基中，在37℃与180rpm的条件下继续培养8小时，在碳饥饿条件下清除内源L-2-HG。在黑色平底96孔板中，取90μL碳饥饿处理后的菌液与10μL梯度浓度的L-2-HG混合，于珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪中连续读取荧光强度。仪器参数设置为：激发波长为430nm，发射波长分别为485nm(mTFP)与528nm(Venus)，温度为37℃，转速为180rpm，检测间隔为5分钟。在每个发射波长下扣除不表达L-2-HG生物传感器的E.coli BL21(DE3)的荧光强度，以校正后的528nm处荧光强度与485nm处荧光强度的比值绘制时间进程曲线。
结果如附图10所示，结果表明LHGFR0N3C能够实时检测细菌胞内L-2-HG浓度动态变化，响应于L-2-HG的添加，L-2-HG生物传感器的荧光发射比值增加，且荧光发射比值变化水平与L-2-HG的浓度存在正相关的关系。
其中，上述不含碳源的无机盐培养基(1L)的配方为：1g NH4Cl，2.26g KH2PO4，4.1gK2HPO4，2.24g NaH2PO4·H2O，3.34g Na2HPO4，10mL金属离子混合液，NaOH调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。金属离子混合液(1L)：14.8g MgSO4·7H2O，550mg FeSO4·7H2O，45mg MnSO4·4H2O，200μL H2SO4。
实施例6：L-2-HG生物传感器在检测人体细胞胞内L-2-HG浓度中的应用
将LHGFR0N3C与LHGFR0N7C的核苷酸序列由通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物密码子优化并全基因合成，在起始密码子前加入kozark序列，5’-GCCACC-3’，并连接于pcDNA3.1(+)质粒，并保存于Escherichia coli Top10菌株。提取该菌株中重组质粒pcDNA3.1-LHGFR0N3C与pcDNA3.1-LHGFR0N7C，并分别转染至HEK293FT细胞中，在转染48h后，使用胰酶消化分别表达LHGFR0N3C与LHGFR0N7C的HEK293FT细胞，并重悬于补加20mM HEPES的1×Hank’s平衡盐缓冲液，使用10μM洋地黄皂苷处理细胞，使细胞渗透化。在黑色平底96孔板中，取90μL处理后的细胞悬浮液与10μL梯度浓度的L-2-HG混合，于美谷分子仪器SpectraMax i3荧光酶标仪中读取荧光强度。仪器参数设置为：激发波长为430nm，发射波长分别为485nm(mTFP)与528nm(Venus)，温度为37℃。在每个发射波长下扣除不表达L-2-HG生物传感器的HEK293FT细胞的荧光强度，以校正后的528nm处荧光强度与485nm处荧光强度的比值绘制表达在人体细胞胞内时的剂量-响应曲线。
结果如附图11-12所示，结果表明LHGFR0N3C与LHGFR0N7C能够检测人体细胞胞内L-2-HG浓度，响应于L-2-HG的添加，L-2-HG生物传感器的荧光发射比值增加。
序列表
<110> 山东大学
<120>一种基于特异性转录调控因子的L-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用
<141> 2020-06-22
<160> 4
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213>恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）W619
<220>
<221>L-2-羟基戊二酸的转录调控因子LhgR的核苷酸序列
<222>（1）…（711）
<400> 1
atgctagaac tccagcgccc cgacactctg gtcgaacggg ttgtcagcgc catccgtgca 60
gaaatcgatt ccggtcgcct ggccgccgaa gcgcgcctgc ccactgaaca gcaactggct 120
gaacaactga acgtcagccg ctcggtagtg cgcgaagcgg tagcgcagct caaggccgat 180
ggcgtgctga tcgcccgccg cgggcttggc tcctatatct cgaaaacccc cgggggcacg 240
gtgttccgct tccccggcag taccggtcgc aaacccgacc tggtgcagat gttcgaaatg 300
cgcctgtgga tcgaaaccca ggcagcggcc atcgccgcgc gccgacgtga cgaacacgat 360
ctggcgaaca tggcccaggc cctgcaggag atgctcgaca aacgcagcga cttcgccact 420
gcctcggcag ctgatgtggc cttccacagg gccatcgccg aagccagcaa gaacgattac 480
ttcgtggcct tccatgactt tctcggcggc cagttggcca atgcacggcg caccgcctgg 540
gaaaactccg cagcccattc ggtgggcggc tcggccgaag ccaatcgcga acaccaagcg 600
ctttatcagg ccatcgccga cggtgaccgc caaagggctg cggcgtgtgc cgaagcgcat 660
ctgcgcgcct ctgccaaacg cctgaaaata gaactacctg cactcgactg a 711
<210> 2
<211> 2148
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221>L-2-HG生物传感器LHGFR0N0C的核苷酸序列
<222>（1）…（2148）
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gaccacaatg ggcgtaatca agcccgacat gaagatcaag 60
ctgaagatgg agggcaacgt gaatggccac gccttcgtga tcgagggcga gggcgagggc 120
aagccctacg acggcaccaa caccatcaac ctggaggtga aggagggagc ccccctgccc 180
ttctcctacg acattctgac caccgcgttc gcctacggca acagggcctt caccaagtac 240
cccgacgaca tccccaacta cttcaagcag tccttccccg agggctactc ttgggagcgc 300
accatgacct tcgaggacaa gggcatcgtg aaggtgaagt ccgacatctc catggaggag 360
gactccttca tctacgagat acacctcaag ggcgagaact tcccccccaa cggccccgtg 420
atgcagaaga agaccaccgg ctgggacgcc tccaccgaga ggatgtacgt gcgcgacggc 480
gtgctgaagg gcgacgtcaa gcacaagctg ctgctggagg gcggcggcca ccaccgcgtt 540
gacttcaaga ccatctacag ggccaagaag gcggtgaagc tgcccgacta tcactttgtg 600
gaccaccgca tcgagatcct gaaccacgac aaggactaca acaaggtgac cgtttacgag 660
agcgccgtgg cccgcaactc caccgacggc atggacgagc tgtacaagga gctcatgcta 720
gaactccagc gccccgacac tctggtcgaa cgggttgtca gcgccatccg tgcagaaatc 780
gattccggtc gcctggccgc cgaagcgcgc ctgcccactg aacagcaact ggctgaacaa 840
ctgaacgtca gccgctcggt agtgcgcgaa gcggtagcgc agctcaaggc cgatggcgtg 900
ctgatcgccc gccgcgggct tggctcctat atctcgaaaa cccccggggg cacggtgttc 960
cgcttccccg gcagtaccgg tcgcaaaccc gacctggtgc agatgttcga aatgcgcctg 1020
tggatcgaaa cccaggcagc ggccatcgcc gcgcgccgac gtgacgaaca cgatctggcg 1080
aacatggccc aggccctgca ggagatgctc gacaaacgca gcgacttcgc cactgcctcg 1140
gcagctgatg tggccttcca cagggccatc gccgaagcca gcaagaacga ttacttcgtg 1200
gccttccatg actttctcgg cggccagttg gccaatgcac ggcgcaccgc ctgggaaaac 1260
tccgcagccc attcggtggg cggctcggcc gaagccaatc gcgaacacca agcgctttat 1320
caggccatcg ccgacggtga ccgccaaagg gctgcggcgt gtgccgaagc gcatctgcgc 1380
gcctctgcca aacgcctgaa aatagaacta cctgcactcg acgtcgacat ggtgagtaaa 1440
ggcgaagaac tgtttaccgg cgttgttccg attctggttg aactggatgg cgatgttaat 1500
ggccataaat tttctgtgag cggcgaaggc gaaggtgacg ctacatatgg caaactgacc 1560
ctgaaactga tttgtaccac cggtaaactg ccggtgccgt ggcctacact ggtgacaaca 1620
ctgggttatg gcctgcagtg ctttgcccgt tatccggatc atatgaaaca gcatgatttc 1680
tttaagagcg caatgccgga aggttatgtt caggaacgca ccattttctt taaagatgat 1740
ggcaattaca agacccgtgc agaagttaaa tttgaaggcg ataccctggt taatcgtatt 1800
gaactgaaag gcattgattt taaagaggat ggcaatattc tgggtcataa actggaatat 1860
aactataata gccacaacgt gtatatcacc gcagataaac agaaaaatgg tattaaggcc 1920
aatttcaaaa tccgccataa tattgaagac ggcggcgtgc agctggcaga tcattatcag 1980
cagaataccc cgattggtga cggtccggtg ctgttaccgg ataatcatta tctgagttat 2040
cagagcgcac tgagtaaaga tccgaatgaa aaacgtgatc atatggtgct gctggaattt 2100
gtgaccgccg caggtattac cctgggcatg gatgaactgt ataaataa 2148
<210> 3
<211> 2139
<212> DNA
<213>人工序列
<221>L-2-HG生物传感器LHGFR0N3C的核苷酸序列
<220>
<222>（1）…（2139）
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gaccacaatg ggcgtaatca agcccgacat gaagatcaag 60
ctgaagatgg agggcaacgt gaatggccac gccttcgtga tcgagggcga gggcgagggc 120
aagccctacg acggcaccaa caccatcaac ctggaggtga aggagggagc ccccctgccc 180
ttctcctacg acattctgac caccgcgttc gcctacggca acagggcctt caccaagtac 240
cccgacgaca tccccaacta cttcaagcag tccttccccg agggctactc ttgggagcgc 300
accatgacct tcgaggacaa gggcatcgtg aaggtgaagt ccgacatctc catggaggag 360
gactccttca tctacgagat acacctcaag ggcgagaact tcccccccaa cggccccgtg 420
atgcagaaga agaccaccgg ctgggacgcc tccaccgaga ggatgtacgt gcgcgacggc 480
gtgctgaagg gcgacgtcaa gcacaagctg ctgctggagg gcggcggcca ccaccgcgtt 540
gacttcaaga ccatctacag ggccaagaag gcggtgaagc tgcccgacta tcactttgtg 600
gaccaccgca tcgagatcct gaaccacgac aaggactaca acaaggtgac cgtttacgag 660
agcgccgtgg cccgcaactc caccgacggc atggacgagc tgtacaagga gctcatgcta 720
gaactccagc gccccgacac tctggtcgaa cgggttgtca gcgccatccg tgcagaaatc 780
gattccggtc gcctggccgc cgaagcgcgc ctgcccactg aacagcaact ggctgaacaa 840
ctgaacgtca gccgctcggt agtgcgcgaa gcggtagcgc agctcaaggc cgatggcgtg 900
ctgatcgccc gccgcgggct tggctcctat atctcgaaaa cccccggggg cacggtgttc 960
cgcttccccg gcagtaccgg tcgcaaaccc gacctggtgc agatgttcga aatgcgcctg 1020
tggatcgaaa cccaggcagc ggccatcgcc gcgcgccgac gtgacgaaca cgatctggcg 1080
aacatggccc aggccctgca ggagatgctc gacaaacgca gcgacttcgc cactgcctcg 1140
gcagctgatg tggccttcca cagggccatc gccgaagcca gcaagaacga ttacttcgtg 1200
gccttccatg actttctcgg cggccagttg gccaatgcac ggcgcaccgc ctgggaaaac 1260
tccgcagccc attcggtggg cggctcggcc gaagccaatc gcgaacacca agcgctttat 1320
caggccatcg ccgacggtga ccgccaaagg gctgcggcgt gtgccgaagc gcatctgcgc 1380
gcctctgcca aacgcctgaa aatagaacta cctgtcgaca tggtgagtaa aggcgaagaa 1440
ctgtttaccg gcgttgttcc gattctggtt gaactggatg gcgatgttaa tggccataaa 1500
ttttctgtga gcggcgaagg cgaaggtgac gctacatatg gcaaactgac cctgaaactg 1560
atttgtacca ccggtaaact gccggtgccg tggcctacac tggtgacaac actgggttat 1620
ggcctgcagt gctttgcccg ttatccggat catatgaaac agcatgattt ctttaagagc 1680
gcaatgccgg aaggttatgt tcaggaacgc accattttct ttaaagatga tggcaattac 1740
aagacccgtg cagaagttaa atttgaaggc gataccctgg ttaatcgtat tgaactgaaa 1800
ggcattgatt ttaaagagga tggcaatatt ctgggtcata aactggaata taactataat 1860
agccacaacg tgtatatcac cgcagataaa cagaaaaatg gtattaaggc caatttcaaa 1920
atccgccata atattgaaga cggcggcgtg cagctggcag atcattatca gcagaatacc 1980
ccgattggtg acggtccggt gctgttaccg gataatcatt atctgagtta tcagagcgca 2040
ctgagtaaag atccgaatga aaaacgtgat catatggtgc tgctggaatt tgtgaccgcc 2100
gcaggtatta ccctgggcat ggatgaactg tataaataa 2139
<210> 4
<211> 2127
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221>L-2-HG生物传感器LHGFR0N7C的核苷酸序列
<222>（1）…（2127）
<400> 4
atggtgagca agggcgagga gaccacaatg ggcgtaatca agcccgacat gaagatcaag 60
ctgaagatgg agggcaacgt gaatggccac gccttcgtga tcgagggcga gggcgagggc 120
aagccctacg acggcaccaa caccatcaac ctggaggtga aggagggagc ccccctgccc 180
ttctcctacg acattctgac caccgcgttc gcctacggca acagggcctt caccaagtac 240
cccgacgaca tccccaacta cttcaagcag tccttccccg agggctactc ttgggagcgc 300
accatgacct tcgaggacaa gggcatcgtg aaggtgaagt ccgacatctc catggaggag 360
gactccttca tctacgagat acacctcaag ggcgagaact tcccccccaa cggccccgtg 420
atgcagaaga agaccaccgg ctgggacgcc tccaccgaga ggatgtacgt gcgcgacggc 480
gtgctgaagg gcgacgtcaa gcacaagctg ctgctggagg gcggcggcca ccaccgcgtt 540
gacttcaaga ccatctacag ggccaagaag gcggtgaagc tgcccgacta tcactttgtg 600
gaccaccgca tcgagatcct gaaccacgac aaggactaca acaaggtgac cgtttacgag 660
agcgccgtgg cccgcaactc caccgacggc atggacgagc tgtacaagga gctcatgcta 720
gaactccagc gccccgacac tctggtcgaa cgggttgtca gcgccatccg tgcagaaatc 780
gattccggtc gcctggccgc cgaagcgcgc ctgcccactg aacagcaact ggctgaacaa 840
ctgaacgtca gccgctcggt agtgcgcgaa gcggtagcgc agctcaaggc cgatggcgtg 900
ctgatcgccc gccgcgggct tggctcctat atctcgaaaa cccccggggg cacggtgttc 960
cgcttccccg gcagtaccgg tcgcaaaccc gacctggtgc agatgttcga aatgcgcctg 1020
tggatcgaaa cccaggcagc ggccatcgcc gcgcgccgac gtgacgaaca cgatctggcg 1080
aacatggccc aggccctgca ggagatgctc gacaaacgca gcgacttcgc cactgcctcg 1140
gcagctgatg tggccttcca cagggccatc gccgaagcca gcaagaacga ttacttcgtg 1200
gccttccatg actttctcgg cggccagttg gccaatgcac ggcgcaccgc ctgggaaaac 1260
tccgcagccc attcggtggg cggctcggcc gaagccaatc gcgaacacca agcgctttat 1320
caggccatcg ccgacggtga ccgccaaagg gctgcggcgt gtgccgaagc gcatctgcgc 1380
gcctctgcca aacgcctgaa agtcgacatg gtgagtaaag gcgaagaact gtttaccggc 1440
gttgttccga ttctggttga actggatggc gatgttaatg gccataaatt ttctgtgagc 1500
ggcgaaggcg aaggtgacgc tacatatggc aaactgaccc tgaaactgat ttgtaccacc 1560
ggtaaactgc cggtgccgtg gcctacactg gtgacaacac tgggttatgg cctgcagtgc 1620
tttgcccgtt atccggatca tatgaaacag catgatttct ttaagagcgc aatgccggaa 1680
ggttatgttc aggaacgcac cattttcttt aaagatgatg gcaattacaa gacccgtgca 1740
gaagttaaat ttgaaggcga taccctggtt aatcgtattg aactgaaagg cattgatttt 1800
aaagaggatg gcaatattct gggtcataaa ctggaatata actataatag ccacaacgtg 1860
tatatcaccg cagataaaca gaaaaatggt attaaggcca atttcaaaat ccgccataat 1920
attgaagacg gcggcgtgca gctggcagat cattatcagc agaatacccc gattggtgac 1980
ggtccggtgc tgttaccgga taatcattat ctgagttatc agagcgcact gagtaaagat 2040
ccgaatgaaa aacgtgatca tatggtgctg ctggaatttg tgaccgccgc aggtattacc 2100
ctgggcatgg atgaactgta taaataa 2127

Claims (4)

1.一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸（l-2-Hydroxyglutarate，l-2-HG）生物传感器，其特征在于：所述生物传感器为青色荧光蛋白mTFP、l-2-HG特异性转录调控因子LhgR与黄色荧光蛋白Venus线性相连的融合蛋白；其为l-2-HG生物传感器LHGFR0N0C、l-2-HG生物传感器LHGFR0N3C及l-2-HG生物传感器LHGFR0N7C三种之一，其中所述LHGFR0N0C的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LHGFR0N3C的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述LHGFR0N7C的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；当所述生物传感器结合l-2-HG后会诱导该生物传感器构象改变，导致荧光蛋白间发射强度比值改变，伴随l-2-HG浓度升高，生物传感器发射强度比值也增加，以此指标实现对l-2-HG特异性检测；其中，所述生物传感器对l-2-HG的响应测定方法是：将传感器编码质粒导入表达菌株E. coli BL21(DE3)，经诱导表达、分离纯化，使用50 mM pH 7.4 Tris-HCl稀释至1 μM，与梯度浓度的l-2-HG以3：1体积比混合，使用荧光酶标仪测定在430 nm的激发波长下，485 nm与528 nm处的荧光发射强度。
2.权利要求1所述基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器的构建方法，步骤是：
（1）全基因合成青色荧光蛋白mTFP与黄色荧光蛋白Venus，分别作为模板，PCR扩增并通过酶切位点BamHI/SacI与SalI/NotI先后克隆至pETDuet-1载体，获得重组质粒pETDuet-mTFP-Venus；
（2）全基因合成恶臭假单胞菌W619中转录调控因子LhgR，以其为模板，PCR扩增并通过酶切位点SacI/SalI插入pETDuet-mTFP-Venus中，获得重组质粒pETDuet-LHGFR0N0C，该重组质粒表达所述l-2-HG生物传感器LHGFR0N0C；
（3）为提高该生物传感器对l-2-HG检测的灵敏度，截短l-2-HG特异性转录调控因子LhgR的N末端及C末端氨基酸以实现对生物传感器的优化：PCR扩增LhgR的截短变体，即LhgR的N末端与C末端截短氨基酸的组合，将获得的截短片段通过酶切位点SacI/SalI插入pETDuet-mTFP-Venus，经过构建与筛选，获得LhgR的C末端截短三个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N3C，该重组质粒表达所述l-2-HG生物传感器LHGFR0N3C，或者获得LhgR的C末端截短七个氨基酸的重组质粒pETDuet-LHGFR0N7C，该重组质粒表达所述l-2-HG生物传感器LHGFR0N7C。
3.权利要求1所述基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器在实时检测细菌胞内l-2-HG浓度中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用方法是将权利要求2所述l-2-HG生物传感器编码质粒pETDuet-LHGFR0N3C导入表达菌株E. coli BL21(DE3)中，振荡培养后加入IPTG过夜诱导权利要求1所述LHGFR0N3C表达，在无碳源的无机盐培养基中碳饥饿处理8小时以清除胞内l-2-HG，取90 μL碳饥饿处理后的菌液与10 μL梯度浓度的l-2-HG溶液混合，通过荧光酶标仪以5分钟的时间间隔连续测定mTFP与Venus的荧光发射强度及其比值，其荧光发射比值响应于l-2-HG的添加而增加，且荧光发射比值变化水平与l-2-HG的浓度存在正相关的关系，以此指标实现实时检测细菌胞内l-2-HG浓度动态变化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647056B (zh) * 2020-06-23 2021-11-23 山东大学 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用
CN112830958B (zh) * 2021-02-05 2022-06-14 山东大学 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
CN113588768B (zh) * 2021-05-18 2022-07-05 国家卫生健康委科学技术研究所 一种以分子图像方式定量组织内内源性代谢物的质谱方法
CN113430172B (zh) * 2021-06-23 2022-07-12 浙江大学 一种通过调控代谢促进体外胚胎发育的方法
CN115028743B (zh) * 2022-06-28 2024-05-14 山东大学 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用
CN116497062B (zh) * 2023-02-01 2024-04-05 山东大学第二医院 一种d-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用
CN116121285B (zh) * 2023-02-06 2023-10-31 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种2-吡咯烷酮生物传感器的构建及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013127997A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-06 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for the determination of (d)-2-hydroxyglutarate (d2hg) or (d)-2-hydroxyadipic acid
CN104515852A (zh) * 2013-09-29 2015-04-15 上海交通大学医学院附属瑞金医院 二羟基戊二酸或其检测试剂的用途
CN108303536A (zh) * 2016-08-07 2018-07-20 复旦大学 快速检测肿瘤组织2-hg累积的试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647056B (zh) * 2020-06-23 2021-11-23 山东大学 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用
CN112592958B (zh) * 2020-12-07 2022-11-01 山东大学第二医院 利用fad依赖型d-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测d-2-羟基戊二酸的方法
CN112830958B (zh) * 2021-02-05 2022-06-14 山东大学 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013127997A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-06 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for the determination of (d)-2-hydroxyglutarate (d2hg) or (d)-2-hydroxyadipic acid
CN104515852A (zh) * 2013-09-29 2015-04-15 上海交通大学医学院附属瑞金医院 二羟基戊二酸或其检测试剂的用途
CN108303536A (zh) * 2016-08-07 2018-07-20 复旦大学 快速检测肿瘤组织2-hg累积的试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A fluorescent L-2-hydroxyglutarate biosensor;Kang 等;《bioRxiv》;20200707;全文 *
An L-2-hydroxyglutarate biosensor based on specific transcriptional regulator LhgR;Kang 等;《nature communications》;20210615;第12卷;3619 *
Pseudomonas putida W619 chromosome, complete genome;Copeland 等;《GenBank Database》;20190910;Accession NO：CP000949.1，PputW619_1596 *
肿瘤代谢物2-HG与胶质瘤发生发展及其检测;陈妍红 等;《中国药理学通报》;20180620;第34卷(第7期);第898-902页 *

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