CN112830958B - 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用 - Google Patents

一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112830958B
CN112830958B CN202110162555.6A CN202110162555A CN112830958B CN 112830958 B CN112830958 B CN 112830958B CN 202110162555 A CN202110162555 A CN 202110162555A CN 112830958 B CN112830958 B CN 112830958B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dhdo
dhdr
hydroxyglutaric acid
fragment
biosensor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110162555.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112830958A (zh
Inventor
高超
肖丹
张文
马翠卿
许平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202110162555.6A priority Critical patent/CN112830958B/zh
Priority to PCT/CN2021/080525 priority patent/WO2022165917A1/zh
Priority to US17/795,351 priority patent/US20240077423A1/en
Publication of CN112830958A publication Critical patent/CN112830958A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112830958B publication Critical patent/CN112830958B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种特异性响应于D‑2‑羟基戊二酸的转录调控因子及其在D‑2‑羟基戊二酸生物检测中的应用。其中所述转录调控因子命名为DhdR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用该转录调控因子构建的D‑2‑羟基戊二酸生物传感器BD2HG‑0和D‑2‑羟基戊二酸生物传感器BD2HG‑1能够做到对含有D‑2‑羟基戊二酸的生物样品检测。实验显示该生物传感器能够实现对D‑2‑羟基戊二酸的高灵敏度、专一性、准确性检测，为D‑2‑羟基戊二酸的检测提供了新方法和途径，也为D‑2‑羟基戊二酸相关疾病的诊断与治疗以及靶向药物的开发提供了新的手段。

Description

一种特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
技术领域
本发明涉及一种转录调控因子及其应用，尤其涉及一种特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其在D-2-羟基戊二酸生物检测中的应用，属于生物检测领域。
背景技术
D-2-羟基戊二酸被认为是神经代谢紊乱的D-2-羟基戊二酸血症相关的异常代谢物[1]。在胶质瘤、急性白血病、软骨瘤、胆管癌等多种肿瘤细胞中，由于异柠檬酸脱氢酶突变也会造成D-2-羟基戊二酸的积累[2]。此外，D-2-羟基戊二酸也是L-丝氨酸合成、赖氨酸分解代谢以及4-羟基丁酸分解代谢中重要的中间代谢物[3-5]，可通过D-2-羟基戊二酸脱氢酶分解代谢为2-酮基戊二酸，然而D-2-羟基戊二酸代谢的调控机制尚未阐明。作为2-酮基戊二酸的结构类似物，D-2-羟基戊二酸也会竞争性抑制2-酮基戊二酸依赖的双加氧酶的活性[6]。在正常的生理水平下，D-2-羟基戊二酸浓度较低，但其积累会影响正常的生命活动，因此开发检测D-2-羟基戊二酸的方法对于D-2-羟基戊二酸血症及多种癌症的诊断和检测具有重大意义。
目前检测D-2-羟基戊二酸的常用方法主要包括GC-MS/MS和LC-MS/MS[7-8]，不仅耗时、耗力，并且通常需要使用合适的衍生剂来使D-2-羟基戊二酸与其手性异构体L-2-羟基戊二酸区分开[8]，限制了D-2-羟基戊二酸相关诊疗技术的发展。细菌已经进化出能够感应各种小分子的转录调控因子，这些转录调控因子通常包含一个DNA结合结构域和一个配体结合结构域，小分子与配体结合结构域的特异性结合会诱导转录调控因子的构象发生改变，从而增强或减弱转录调控因子DNA结合结构域与其作用的DNA结合位点之间的相互作用[9]。目前，已有数种细菌转录调控因子被鉴定，并广泛应用于各种类型样品中相关化合物的浓度定量[10-12]。
Alpha技术是基于微珠的高灵敏度均相检测技术，目前已有报道利用转录调控因子作为生物识别元件，与Alpha技术相结合开发高灵敏度检测尿酸与土霉素的生物传感器[13]。鉴于此，基于Alpha技术开发生物传感器的基础是筛选特异性响应D-2-羟基戊二酸的转录调控因子，以此作为生物识别元件来开发高灵敏度的D-2-羟基戊二酸生物传感器。然而，检索发现目前有关特异性响应D-2-羟基戊二酸的转录调控因子以及基于转录调控因子进行D-2-羟基戊二酸生物检测的方法尚未见报道。
参考文献：
[1]Kranendijk,M.,Struys,E.A.,Salomons,G.S.,Van der Knaap,M.S.&Jakobs,C.Progress in understanding 2-hydroxyglutaric acidurias.J.Inherit.Metab.Dis.35,571-587(2012).
[2]Ye,D.,Guan,K.L.&Xiong,Y.Metabolism,Activity,and Targeting of D-andL-2-Hydroxyglutarates.Trends Cancer4,151-165(2018).
[3]Zhang,W.et al.Coupling between D-3-phosphoglycerate dehydrogenaseand D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase drives bacterial L-serine synthesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA114,E7574-E7582(2017).
[4]Araújo,W.L.et al.Identification of the 2-hydroxyglutarate andisovaleryl-CoA dehydrogenases as alternative electron donors linking lysinecatabolism to the electron transport chain of Arabidopsis mitochondria.PlantCell22,1549-1563(2010).
[5]Kaufman,E.E.,Nelson,T.,Fales,H.M.&Levin,D.M.Isolation andcharacterization of a hydroxyacid-oxoacid transhydrogenase from rat kidneymitochondria.J.Biol.Chem.263,16872-16879(1988).
[6]Xu,W.et al.Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitiveinhibitor of α-ketoglutarate-dependent dioxygenases.Cancer Cell19,17-30(2011).
[7]Fernández-Galán,E.et al.Validation of a routine gas chromatographymass spectrometry method for 2-hydroxyglutarate quantification in human serumas a screening tool for detection of idh mutations.J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.1083,28-34(2018).
[8]Struys,E.A.,Jansen,E.E.,Verhoeven,N.M.&Jakobs,C.Measurement ofurinary D-and L-2-hydroxyglutarate enantiomers by stable-isotope-dilutionliquid chromatography-tandem mass spectrometry after derivatization withdiacetyl-L-tartaric anhydride.Clin.Chem.50,1391-1395(2004).
[9]Libis,V.,Delépine,B.&Faulon,J.L.Sensing new chemicals withbacterial transcription factors.Curr.Opin.Microbiol.33,105-112(2016).
[10]Cao,J.et al.Harnessing a previously unidentified capability ofbacterial allosteric transcription factors for sensing diverse smallmolecules in vitro.Sci.Adv.4,eaau4602(2018).
[11]Liang,M.et al.A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for thehighly sensitive detection of diverse small molecules.Nat.Commun.10,3672(2019).
[12]Grazon,C.et al.A progesterone biosensor derived from microbialscreening.Nat.Commun.11,1276(2020).
[13]Li,S.et al.A platform for the development of novel biosensors byconfiguring allosteric transcription factor recognition with amplifiedluminescent proximity homogeneous assays. Chem.Commun.53,99-102(2017)。
发明内容
针对上述现有方法中，D-2-羟基戊二酸检测耗时、耗力以及检测过程繁琐等不足，本发明要解决的问题是提供一种特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其在D-2-羟基戊二酸生物检测中的应用。
本发明所述的特异性响应于D-2-羟基戊二酸转录调控因子，其特征在于：所述转录调控因子命名为DhdR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，属于GntR家族的转录阻遏蛋白，能够与其上游的启动子区域相结合，并特异性响应于D-2-羟基戊二酸；所述转录调控因子DhdR与其所作用的启动子区域的结合位点为5’-AAAGTTATCAGATAACCTGAAAAGTAG-3’；所述转录调控因子DhdR当遇有D-2-羟基戊二酸时，D-2-羟基戊二酸会与转录调控因子DhdR结合而诱导DhdR构象发生改变，导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与其所作用的靶DNA发生解离。
上述转录调控因子DhdR能特异性响应于D-2-羟基戊二酸的证明方法是：
(1)采用pETDuet-1载体外源表达转录调控因子dhdR，其中所述转录调控因子DhdR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；再构建重组质粒pETDuet-dhdR，并将该重组质粒导入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)，然后将重组后的表达菌株培养至OD600nm为0.6～0.8，加入IPTG诱导，采用镍柱亲和层析的方式进行分离纯化，得到带有His标签的DhdR蛋白；
(2)采用PCR扩增并纯化回收包含转录调控因子DhdR所作用的启动子区域的靶DNA，命名为dhdO；其中，所述靶DNA片段dhdO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)通过凝胶阻滞实验进行验证并确定上述转录调控因子DhdR的功能。
将DhdR分别与不同的化合物(D-2-羟基戊二酸、L-2-羟基戊二酸、D-苹果酸、D-乳酸、戊二酸、2-酮基戊二酸或丙酮酸)共同孵育，加入靶DNA片段dhdO，通过电泳分离、染色成像，分析在不同化合物存在的条件下对DhdR与靶DNA片段dhdO结合能力的影响，实验表明仅D-2-羟基戊二酸阻止DhdR与靶DNA片段dhdO的结合，证明DhdR为特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子。
本发明所述特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其在D-2-羟基戊二酸生物检测中的应用。
一种利用特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR构建的检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器由带有His标签的DhdR蛋白、生物素标记的dhdO或dhdO-1、链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠所组成；所述生物传感器在680nm的激发光条件下，能够在520-620nm处产生明显的发光信号；所述生物传感器当检测到样品中有D-2-羟基戊二酸的存在时，因D-2-羟基戊二酸与DhdR蛋白结合诱导DhdR构象发生改变，会导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与生物素标记的dhdO发生解离，进而导致供体微珠与受体微珠之间的距离变远，发光信号减弱。
其中，上述带有His标签的DhdR蛋白是采用pETDuet-1载体外源表达来自反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)NBRC 15125的GntR家族核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的转录调控因子dhdR，再构建得到重组质粒pETDuet-dhdR，并将该重组质粒pETDuet-dhdR以热激转化的方式导入表达菌株E.coli BL21(DE3)，然后将重组后的表达菌株在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm为0.6～0.8，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下诱导12小时，采用镍柱亲和层析的方式进行分离纯化，得到带有His标签的DhdR蛋白。
上述生物素标记的dhdO片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；使用Bio-dhdO上游引物和Bio-dhdO下游引物通过重组PCR获得无标记的dhdO片段；再使用无标记的dhdO片段为模板，使用Bio上游引物和Bio-dhdO下游引物通过PCR扩增、胶回收试剂盒纯化回收，得到生物素标记的dhdO片段；其中PCR引物序列是：
Bio-dhdO上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGATCCGGGCTGTCATTGTCA-3’
Bio-dhdO下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAACTTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
Bio上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGAT-3’，5’端生物素修饰；
上述生物素标记的dhdO-1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该片段是由生物素标记的dhdO片段的第43个碱基“G”突变为碱基“T”制得；使用Bio-dhdO上游引物和Bio-dhdO-1下游引物通过重组PCR获得无标记的dhdO-1片段；再使用无标记的dhdO片段为模板，使用Bio上游引物和Bio-dhdO下游引物通过PCR扩增、胶回收试剂盒纯化回收获得生物素标记的dhdO片段；其中所述扩增生物素标记的dhdO片段的Bio-dhdO上游引物和Bio上游引物与上述扩增生物素标记的dhdO片段的引物相同，所述Bio-dhdO-1下游引物序列是：
Bio-dhdO-1下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAAATTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
上述链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠购自珀金埃尔默企业管理有限公司。
上述检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器，优选的实施方式是：
所述生物传感器由1nM生物素标记的dhdO片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠和20μg/mL镍螯合的受体珠的组成，命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-0；或者，所述生物传感器由1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠和20μg/mL镍螯合的受体珠组成，命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1。
上述检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器的制备方法，步骤是：
(1)制备带有His标签的DhdR蛋白；
(2)制备生物素标记的dhdO片段或者生物素标记的dhdO-1片段；
(3)将制得的带有His标签的DhdR蛋白、生物素标记的dhdO片段或生物素标记的dhdO-1片段与市售的链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠组合，即得到D-2-羟基戊二酸生物传感器。
本发明所述的基于D-2-羟基戊二酸特异性转录调控因子DhdR的生物传感器在检测含有D-2-羟基戊二酸生物样品中的应用。
其中：所述的D-2-羟基戊二酸生物传感器优选D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1。
上述检测含有D-2-羟基戊二酸生物样品的方法是：
分别采用健康成人血清、尿液、细胞培养基配制梯度浓度的D-2-羟基戊二酸溶液作为不同类型生物样品，使用D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1测定所述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线以及不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量值；
其中，所述不同类型生物样品的剂量响应曲线的测定方式是：将1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、与等体积含有不同浓度D-2-羟基戊二酸的生物样品加入白色的384孔板中混匀，孵育30分钟；加入20μg/mL镍螯合的受体珠，孵育30分钟；加入20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠，孵育60分钟；所述的孵育过程均在室温避光条件下进行；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，对逐个样品检测光信号；在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号，获得不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线；
其中，所述测定不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度定量值的方法是：使用上述剂量响应曲线的测定方法测定50μM，150μM，500μM，1500μM，3500μM的不同类型的样品的光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号；使用上述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线将样品扣除背景信号后的光信号值与D-2-羟基戊二酸的浓度进行对应，获得不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量结果。
本发明实施方式中，制得的样品均可使用HBS-P稀释至目的浓度，所述的HBS-P缓冲液配方为：10mM HEPES，150mM NaCl，0.1％BSA，0.005％Tween-20，pH 7.4。
本发明提供的基于D-2-羟基戊二酸特异性转录调控因子DhdR的生物传感器是将转录调控因子DhdR及其所作用的靶DNA dhdO与PerkinElmer公司所开发的商业化的基于微珠的Alpha试剂盒相结合，将D-2-羟基戊二酸生物的浓度转换并放大为化学发光信号；所述的生物传感器在680nm的激发光下，供体珠内的感光剂会将周围的氧气转化为单线态；在其4μs的半衰期内，单线态氧可以在溶液中扩散至少200nm，使能量从受体珠内的单线态氧转移到噻吩衍生物，最终在520-620nm产生大量的发光信号；当所述的生物传感器检测到有D-2-羟基戊二酸的存在时，D-2-羟基戊二酸会与转录调控因子DhdR结合而诱导DhdR构象发生改变，会导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与生物素标记的dhdO发生解离，进而导致供体微珠与受体微珠之间的距离变远，使发光信号减少；发光信号的强度与传感器所检测的D-2-羟基戊二酸的浓度相关，D-2-羟基戊二酸的浓度较大时，发光信号减弱。
本发明具有的突出特点和有益效果是：
(1)本发明提供的特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR，来源于反硝化无色杆菌NBRC 15125，是首次发现调控D-2-羟基戊二酸分解代谢且特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子，常态下会与其所作用的靶DNA dhdO结合；所述转录调控因子DhdR当遇有D-2-羟基戊二酸时，D-2-羟基戊二酸会与转录调控因子DhdR结合而诱导DhdR构象发生改变，导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与靶DNA dhdO发生解离；所述基于D-2-羟基戊二酸特异性转录调控因子生物传感器的发光信号强度与传感器所检测的D-2-羟基戊二酸的浓度相关，利用供体微珠与受体微珠之间的距离变远，使发光信号减少的特点可实现对D-2-羟基戊二酸浓度检测。
(2)本发明将特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR及其所作用的靶DNA dhdO与商业化的Alpha试剂盒相结合，将D-2-羟基戊二酸浓度信号转换为化学发光信号输出，组成简单，易于制备，检测专一性高，操作便捷。
(3)本发明所提供的基于D-2-羟基戊二酸特异性转录调控因子DhdR的生物传感器适用于对血清、尿液、细胞培养基等不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸进行定量，且定量结果与传统检测方法液相色谱-质谱联用技术的结果相比一致性较高，实现了不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸的高灵敏度、专一性的检测，在D-2-羟基戊二酸相关疾病的诊断与治疗以及靶向药物的开发中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1DhdR表达纯化的SDS-PAGE验证。
图2DhdR对D-2-羟基戊二酸的特异性分析。
图3应用DhdR检测D-2-羟基戊二酸的原理示意图。
图4BD2HG-0对D-2-羟基戊二酸的剂量-响应曲线。
图5BD2HG-1对D-2-羟基戊二酸的剂量-响应曲线。
图6比较D-2-羟基戊二酸生物传感器与液相色谱-质谱联用技术对于血清中D-2-羟基戊二酸的定量结果。
图7比较D-2-羟基戊二酸生物传感器与液相色谱-质谱联用技术对于尿液中D-2-羟基戊二酸的定量结果。
图8比较D-2-羟基戊二酸生物传感器与液相色谱-质谱联用技术对于细胞培养基中D-2-羟基戊二酸的定量结果。
图9BD2HG-1检测HT1080细胞培养基上清中D-2-羟基戊二酸水平。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，使用的反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)NBRC15125购自北京北纳创联生物技术研究院，菌株序号为：NCTC 8582；使用的表达载体pETDuet-1购自Novagen公司；本发明方法中所使用的Alpha试剂盒购自珀金埃尔默企业管理有限公司，货号为：6760619，其中包含链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠。其他所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。
实施例1：特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR的获取及鉴定
本实施例中所使用的培养基和试剂如下：
LB培养基：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％NaCl
上样缓冲液：20mM Na2HPO4，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4。
洗脱缓冲液：20mM Na2HPO4，500mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4。
结合缓冲液：10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.5mM EDTA，10％甘油，1mM二硫苏糖醇，pH 7.4。
凝胶阻滞电泳缓冲液：89mM Tris，89mM硼酸，2mM EDTA，pH 8.3。
(1)DhdR的表达与纯化
本发明所用到的DhdR是来源于反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)NBRC15125的阻遏蛋白，以反硝化无色杆菌NBRC 15125的基因组为模板，通过PCR扩增获得dhdR核苷酸片段，使用SacI/HindIII限制性内切酶对dhdR核苷酸片段和pETDuet-1质粒双酶切，通过T4 DNA连接酶连接获得重组质粒pETDuet-dhdR，使用热激法将重组质粒转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，在37℃摇床中孵育50分钟后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB固体平板，在37℃培养箱中培养12小时后，挑取单菌落进行菌液PCR验证；
其中，扩增dhdR核苷酸片段的引物序列如下：
dhdR上游引物5’-ATATGAGCTCGATGAGCGCATCCGACTTTA-3’，携带一个SacI位点；
dhdR下游引物5’-TATTAAGCTTCTACAGCAGCTTCCCGGGAT-3’，携带一个HindIII位点。
PCR反应使用的DNA聚合酶为购自北京全式金生物技术有限公司的TransStartFastPfu DNA聚合酶，PCR反应按照该DNA聚合酶的说明书所述步骤操作。
将验证正确的菌株以体积比2％的接种量接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的1升LB液体培养基中，在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm约0.6，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下过夜诱导12小时。在4℃与6,000rpm的条件下离心10分钟收集菌体，使用含有1‰的PMSF和10％甘油的上样缓冲液将其重悬至OD600nm约25，高压破碎后在4℃与12,000rpm的条件下离心50分钟，收集上清液。
将上清液上样至5mL HisTrap HP镍亲和层析柱中，使用洗脱缓冲液进行梯度洗脱。使用SDS-PAGE检测His6-DhdR的纯化效果，结果见附图1；将纯化的His6-DhdR用超滤管进行浓缩，加入10％甘油后保存于-80℃。
(2)靶DNA片段dhdO的获得
以反硝化无色杆菌NBRC 15125的基因组为模板，通过PCR扩增获得靶DNA片段dhdO核苷酸片段。使用胶回收试剂盒对扩增的dhdO核苷酸片段进行纯化回收，通过NanoDropND-1000测定DNA浓度；其中扩增dhdR核苷酸片段的引物序列如下：
dhdO-上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGAT-3’；
dhdO下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTT-3’。
PCR反应使用的DNA聚合酶为购自北京全式金生物技术有限公司的TransStartFastPfu DNA聚合酶，PCR反应按照该DNA聚合酶的说明书所述步骤操作。
(3)凝胶阻滞实验分析DhdR效应物
使用结合缓冲液将上述步骤(2)中回收的dhdO核苷酸片段稀释至100nM，将纯化的DhdR蛋白稀释至2000nM。首先将70nM纯化的DhdR蛋白与40mM不同的化合物(D-2-羟基戊二酸、L-2-羟基戊二酸、D-苹果酸、D-乳酸、戊二酸、2-酮基戊二酸或丙酮酸)孵育，体系为18μL，反应温度为30℃，反应时间为15分钟，之后加入2μL100 nM dhdO继续孵育，反应温度为30℃，反应时间为30分钟；取10μL样品于冰上进行6％天然丙烯酰胺凝胶电泳，电泳电压为170V，电泳时间约45分钟。随后用SYBR Green I避光染胶30分钟，使用凝胶成像仪拍照，结果见附图2，显示只有D-2-羟基戊二酸能抑制DhdR与dhdO的结合，其它化合物不能干扰DhdR与dhdO的结合；说明DhdR特异性响应于D-2-羟基戊二酸，当无D-2-羟基戊二酸时，DhdR能与dhdO结合；当D-2-羟基戊二酸存在时，DhdR与dhdO会发生解离。
实施例2：利用特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR构建生物检测传感器BD2HG-0
本实施例中所使用的试剂如下：
HBS-P缓冲液：10mM HEPES，150mM NaCl，0.1％BSA，0.005％Tween-20，pH 7.4。
(1)生物素标记的dhdO片段的扩增与纯化
通过两轮PCR获得生物素标记的dhdO片段：
第一轮使用Bio-dhdO上游引物与Bio-dhdO下游引物通过overlap PCR扩增获得无标记的dhdO片段；第二轮使用第一轮PCR的产物无标记的dhdO片段为模板，使用引物Bio上游引物和Bio-dhdO下游引物扩增获得生物素标记的dhdO片段，使用胶回收试剂盒对扩增的生物素标记的dhdO片段进行纯化回收，通过NanoDrop ND-1000测定DNA浓度；
其中扩增生物素标记的dhdO片段的引物序列如下：
Bio-dhdO上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGATCCGGGCTGTCATTGTCA-3’
Bio-dhdO下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAACTTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
Bio上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGAT-3’，5’端生物素修饰。
PCR反应使用的DNA聚合酶为购自北京全式金生物技术有限公司的TransStartFastPfu DNA聚合酶，PCR反应按照该DNA聚合酶的说明书所述步骤操作。
(2)光信号的检测
将5μL生物素标记的dhdO片段、5μL DhdR蛋白与5μL含有D-2-羟基戊二酸的溶液加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟。使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号。
(3)D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-0对D-2-羟基戊二酸的响应
根据(2)中所述光信号检测方法，使用溶解于HBS-P缓冲液的梯度D-2-羟基戊二酸溶液，与5μL 1nM生物素标记的dhdO片段、0.3nM DhdR蛋白、供体珠和受体珠混合，检测光信号绘制剂量响应曲线，结果见附图4，显示光信号与D-2-羟基戊二酸呈现浓度依赖式的响应。
将所述1nM生物素标记的dhdO片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL供体珠和20μg/mL受体珠的组合命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-0，检测限为0.8μM，检测范围约为2-50μM。
实施例3：利用特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR构建生物检测传感器BD2HG-1
本实施例中所使用的试剂如下：
HBS-P缓冲液：10mM HEPES，150mM NaCl，0.1％BSA，0.005％Tween-20，pH 7.4。
(1)生物素标记的dhdO-1片段的扩增与纯化
通过两轮PCR获得生物素标记的dhdO-1片段：
第一轮使用Bio-dhdO上游引物与Bio-dhdO-1下游引物通过overlap PCR扩增获得无标记的dhdO-1片段；第二轮使用第一轮PCR的产物无标记的dhdO-1片段为模板，使用引物Bio上游引物和Bio-dhdO-1下游引物扩增获得生物素标记的dhdO-1片段，使用胶回收试剂盒对扩增的生物素标记的dhdO-1片段进行纯化回收，通过NanoDrop ND-1000测定DNA浓度；其中扩增生物素标记的dhdO-1片段的引物序列如下：
Bio-dhdO上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGATCCGGGCTGTCATTGTCA-3’
Bio-dhdO-1下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAAATTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
Bio上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGAT-3’，5’端生物素修饰。
PCR反应使用的DNA聚合酶为购自北京全式金生物技术有限公司的TransStartFastPfu DNA聚合酶，PCR反应按照该DNA聚合酶的说明书所述步骤操作。
(2)光信号的检测
将5μL生物素标记的dhdO-1片段、5μL DhdR蛋白与5μL含有D-2-羟基戊二酸的溶液加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟。使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号。
(3)D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1对D-2-羟基戊二酸的响应
根据(2)中所述光信号检测方法，使用溶解于HBS-P缓冲液的梯度D-2-羟基戊二酸溶液，与各5μL 1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、供体珠和受体珠混合，检测光信号绘制剂量响应曲线，结果见附图5，显示光信号与D-2-羟基戊二酸呈现浓度依赖式的响应。
将所述1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL供体珠和20μg/mL受体珠的组合命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1，检测限为0.08μM，检测范围约为0.3-20μM，优于D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-0，可优先应用于体外检测D-2-羟基戊二酸的浓度。
实施例4：D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1在检测含有D-2-羟基戊二酸生物样品中的应用
分别采用健康成人血清、尿液、细胞培养基配制梯度浓度的D-2-羟基戊二酸溶液作为不同类型生物样品，使用D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1测定所述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线以及不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量值；
由于所述D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1的检测限为0.08μM，灵敏度极高，检测生物样品时仅需微量的样品并进行稀释即可，因此，所述的梯度浓度D-2-羟基戊二酸溶液以如下方法制备：
(1)将健康成人的血清、尿液分别使用HBS-P缓冲液稀释100倍，将细胞培养基使用HBS-P缓冲液稀释10倍；
(2)使用ddH2O配制100mM的D-2-羟基戊二酸母液；
(3)使用稀释100倍的健康成人的血清、稀释100倍的尿液、稀释10倍的细胞培养基分别对100mM的D-2-羟基戊二酸母液进行梯度稀释，稀释的浓度范围为0.05μM～5000μM，由于样品进行检测时，加入传感器的体系中会被稀释5倍，因此最终绘制的剂量响应曲线的终浓度范围为0.01μM～1000μM。
所述的不同类型生物样品的剂量响应曲线的测定方式是：将5μL生物素标记的dhdO-1片段(1nM)、5μL DhdR蛋白(0.3nM)与5μL含有标准浓度D-2-羟基戊二酸的溶液加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL镍螯合的受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL链霉亲和素包被的供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号，获得不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线。
所述测定不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度定量值的方法是：
使用未稀释的健康成人血清、尿液、细胞培养基分别配制浓度为50μM，150μM，500μM，1500μM，3500μM的不同类型的生物样品；将5μL生物素标记的dhdO-1片段(1nM)、5μL DhdR蛋白(0.3nM)与5μL含有D-2-羟基戊二酸的生物样品加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL镍螯合的受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL链霉亲和素包被的供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号；使用上述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线将样品扣除背景信号后的光信号值与D-2-羟基戊二酸的浓度进行对应，并乘以相应的稀释倍数，获得不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量结果；将该定量结果与液相色谱-质谱联用技术的定量结果相比较，结果见附图6-8，表明D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1的定量结果与液相色谱-质谱联用技术的定量结果一致，完全适用于不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸的准确定量。
实施例5：D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1在检测HT1080细胞培养基上清中D-2-羟基戊二酸浓度的应用
本实施例中涉及的HT1080细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
HT1080细胞携带IDH1/R132C突变；抑制剂GSK864抑制IDH/R132C，AGI-6780抑制IDH2/R140Q；取不同抑制剂(GSK864、AGI-6780)处理后的HT1080细胞的培养基上清各1mL作为待测样品。
所述待测样品中D-2-羟基戊二酸的检测方法是：
使用由HBS-P缓冲液稀释10倍后的HT1080细胞的培养基对100mM D-2-羟基戊二酸母液进行稀释，制得浓度范围为0.05μM～5000μM的梯度浓度的D-2-羟基戊二酸标准溶液，按照实施例4所述方法绘制终浓度范围为0.01μM～1000μM的剂量响应曲线：将5μL生物素标记的dhdO-1片段(1nM)、5μL DhdR蛋白(0.3nM)与5μL含有标准浓度D-2-羟基戊二酸的溶液加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL镍螯合的受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL链霉亲和素包被的供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号，获得测定HT1080细胞的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线。
所述测定待测样品中D-2-羟基戊二酸浓度定量值的方法是：
使用HBS-P缓冲液对待测样品进行适当倍数地稀释；将5μL生物素标记的dhdO-1片段(1nM)、5μL DhdR蛋白(0.3nM)与5μL稀释后的细胞培养基上清液加入白色的384孔板中，使用酶标仪的震荡功能将其混匀，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL镍螯合的受体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为30分钟；加入5μL链霉亲和素包被的供体珠(20μg/mL)，在室温避光条件下孵育，孵育时间为60分钟；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，检测光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号；使用上述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线将样品扣除背景信号后的光信号值与D-2-羟基戊二酸的浓度进行对应，并乘以相应的稀释倍数，获得HT1080细胞培养基上清中D-2-羟基戊二酸浓度的定量结果，结果见附图9。
序列表
<110>山东大学
<120>一种特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
<141>2021-02-03
<160>4
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> Achromobacter denitrificans NBRC 15125
<221> 转录调控因子DhdR的核苷酸序列
<400> 1
atgctgagca agagcctgac cttgaccgaa caggtcgccc gccagatcgc gggcgacatc 60
gccgaaggcg tccattccgt gggcgccaag ctgccgcccg gccgtgtcct ggcggagcag 120
tacggtgtga gcgccgcggt catccgcgag gccaccgagc gcctgcgcgc ccaggggctg 180
atccagagcc gccagggctc gggcagcgtg gtggtgtccc gcaccggtgc tcagggcttc 240
caggtttccg ccggcctcga cgatcgcgag cagctggcca gcgtctacga attgcggatg 300
gaactggaag gcggcgcggc cgccctggcg gcgaggcgcc gcaacgccac cgaccttgcg 360
gccatggccg aggccctggc cgcgctggaa gcgaacctgg accatccgga acagggcgtc 420
gagcacgaca tcgccttcca cgtcgccatc gccgccgcca cgcacaaccg ttattaccag 480
gacctgctgc agtacctgaa cctgcagctg cgcctggccg tcagcaccgc gcgcaccaac 540
agccgccgtc aggagggcct gaccgcggtg gtgcaccagg aacacgtggc cgtctacgac 600
gccatcctcg cgggcgatcc cgaccgcgcc cgactggcgg cgacccgcca cttgcagcag 660
gcggccagcc gcctgcgtct cgatctcctc tctccggccg caaggcagac atcatga 717
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> Achromobacter denitrificans NBRC 15125
<221>靶DNA dhdO的核苷酸序列
<400> 2
gagtcgcggc ggcgcgccgg atccgggctg tcattgtcaa aagttatcag ataacctgaa 60
aagtaggcct ataatcggcg c 81
<210>3
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 生物素标记的dhdO片段的核苷酸序列
<400> 3
gagtcgcggc ggcgcgccgg atccgggctg tcattgtcaa aagttatcag ataacctgaa 60
aagtaggcct ataatcggcg c 81
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<221>生物素标记的dhdO-1片段的核苷酸序列
<400> 4
gagtcgcggc ggcgcgccgg atccgggctg tcattgtcaa aatttatcag ataacctgaa 60
aagtaggcct ataatcggcg c 81

Claims (6)

1.一种利用特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR构建的检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器，其中所述特异性响应于D-2-羟基戊二酸的转录调控因子DhdR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，属于GntR家族的转录阻遏蛋白，能够与其上游的启动子区域相结合，并特异性响应于D-2-羟基戊二酸；所述转录调控因子DhdR与其所作用的启动子区域的结合位点为5’-AAAGTTATCAGATAACCTGAAAAGTAG-3’；所述转录调控因子DhdR当遇有D-2-羟基戊二酸时，D-2-羟基戊二酸会与转录调控因子DhdR结合而诱导DhdR构象发生改变，导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与其所作用的靶DNA发生解离；其中所述靶DNA命名为dhdO，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其包含转录调控因子DhdR所作用的启动子区域；
其特征在于：
所述检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器由带有His标签的DhdR蛋白、生物素标记的dhdO或dhdO-1、链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠所组成；所述生物传感器在680nm的激发光条件下，能够在520-620nm处产生明显的发光信号；所述生物传感器当检测到样品中有D-2-羟基戊二酸的存在时，因D-2-羟基戊二酸与DhdR蛋白结合诱导DhdR构象发生改变，会导致原结合在一起的转录调控因子DhdR与生物素标记的dhdO发生解离，进而导致供体微珠与受体微珠之间的距离变远，发光信号减弱；
其中，上述带有His标签的DhdR蛋白是采用pETDuet-1载体外源表达来自反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)NBRC 15125的GntR家族核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的转录调控因子dhdR，再构建得到重组质粒pETDuet-dhdR，并将该重组质粒pETDuet-dhdR以热激转化的方式导入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)，然后将重组后的表达菌株在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm为0.6～0.8，加入1mM IPTG，在16℃与160rpm的条件下诱导12小时，采用镍柱亲和层析的方式进行分离纯化，得到带有His标签的DhdR蛋白；
上述生物素标记的dhdO片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；使用Bio-dhdO上游引物和Bio-dhdO下游引物通过重组PCR获得无标记的dhdO片段；再使用无标记的dhdO片段为模板，使用Bio上游引物和Bio-dhdO下游引物通过PCR扩增、胶回收试剂盒纯化回收，得到生物素标记的dhdO片段；其中PCR引物序列是：
Bio-dhdO上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGATCCGGGCTGTCATTGTCA-3’
Bio-dhdO下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAACTTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
Bio上游引物5’-GAGTCGCGGCGGCGCGCCGGAT-3’，5’端生物素修饰；
上述生物素标记的dhdO-1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该片段是由生物素标记的dhdO片段的第43个碱基“G”突变为碱基“T”制得；使用Bio-dhdO上游引物和Bio-dhdO-1下游引物通过重组PCR获得无标记的dhdO-1片段；再使用无标记的dhdO片段为模板，使用Bio上游引物和Bio-dhdO下游引物通过PCR扩增、胶回收试剂盒纯化回收获得生物素标记的dhdO片段；其中所述扩增生物素标记的dhdO片段的Bio-dhdO上游引物和Bio上游引物与上述扩增生物素标记的dhdO片段的引物相同，所述Bio-dhdO-1下游引物序列是：
Bio-dhdO-1下游引物5’-GCGCCGATTATAGGCCTACTTTTCAGGTTATCTGATAAATTTTGACAATGACAGCCCGGAT-3’；
上述链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠购自珀金埃尔默企业管理有限公司。
2.根据权利要求1所述检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器，其特征在于：
所述生物传感器由1nM生物素标记的dhdO片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠和20μg/mL镍螯合的受体珠的组成，命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-0；或者，所述生物传感器由1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠和20μg/mL镍螯合的受体珠组成，命名为D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1。
3.权利要求1所述检测D-2-羟基戊二酸的生物传感器的制备方法，步骤是：
(1)制备带有His标签的DhdR蛋白；
(2)制备生物素标记的dhdO片段或者生物素标记的dhdO-1片段；
(3)将制得的带有His标签的DhdR蛋白、生物素标记的dhdO片段或生物素标记的dhdO-1片段与市售的链霉亲和素包被的供体珠和镍螯合的受体珠组合，即得到D-2-羟基戊二酸生物传感器。
4.权利要求1或2所述的D-2-羟基戊二酸生物传感器在以非疾病的诊断和治疗为目的的检测含有D-2-羟基戊二酸生物样品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的D-2-羟基戊二酸生物传感器选择D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测含有D-2-羟基戊二酸生物样品的方法是：
分别采用健康成人血清、尿液、细胞培养基配制梯度浓度的D-2-羟基戊二酸溶液作为不同类型生物样品，使用D-2-羟基戊二酸生物传感器BD2HG-1测定所述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线以及不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量值；
其中，所述不同类型生物样品的剂量响应曲线的测定方式是：将1nM生物素标记的dhdO-1片段、0.3nM DhdR蛋白、与等体积含有不同浓度D-2-羟基戊二酸的生物样品加入白色的384孔板中混匀，孵育30分钟；加入20μg/mL镍螯合的受体珠，孵育30分钟；加入20μg/mL链霉亲和素包被的供体珠，孵育60分钟；所述的孵育过程均在室温避光条件下进行；使用珀金埃尔默Ensight多功能酶标仪设定激发波长为680nm，检测波长为520-620nm，对逐个样品检测光信号；在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号，获得不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线；
其中，所述测定不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度定量值的方法是：使用上述剂量响应曲线的测定方法测定50μM，150μM，500μM，1500μM，3500μM的不同类型的样品的光信号，在每个发射波长下扣除不含D-2-羟基戊二酸生物传感器的背景信号；使用上述不同类型生物样品中的D-2-羟基戊二酸剂量响应曲线将样品扣除背景信号后的光信号值与D-2-羟基戊二酸的浓度进行对应，获得不同类型生物样品中D-2-羟基戊二酸浓度的定量结果。
CN202110162555.6A 2021-02-05 2021-02-05 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用 Active CN112830958B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110162555.6A CN112830958B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
PCT/CN2021/080525 WO2022165917A1 (zh) 2021-02-05 2021-03-12 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
US17/795,351 US20240077423A1 (en) 2021-02-05 2021-03-21 A transcriptional regulator specifically responding to d-2-hydroxyglutarate and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110162555.6A CN112830958B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112830958A CN112830958A (zh) 2021-05-25
CN112830958B true CN112830958B (zh) 2022-06-14

Family

ID=75932482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110162555.6A Active CN112830958B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240077423A1 (zh)
CN (1) CN112830958B (zh)
WO (1) WO2022165917A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647056B (zh) * 2020-06-23 2021-11-23 山东大学 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用
CN113430172B (zh) * 2021-06-23 2022-07-12 浙江大学 一种通过调控代谢促进体外胚胎发育的方法
CN115028743B (zh) * 2022-06-28 2024-05-14 山东大学 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用
CN116497062B (zh) * 2023-02-01 2024-04-05 山东大学第二医院 一种d-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013075065A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 2-hydroxyglutarate as a biomarker for chronic hypoxia
CN104145022A (zh) * 2012-03-01 2014-11-12 德国癌症研究中心 测定(d)-2-羟基戊二酸(d2hg)或(d)-2-羟基己二酸的工具和方法
WO2015148950A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center L-2-hydroxyglutarate and stress induced metabolism
CN107727644A (zh) * 2016-08-12 2018-02-23 上海华盈生物医药科技有限公司 一种(d)‑2‑羟基戊二酸检测试剂盒
CN111647056A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 山东大学 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104515852B (zh) * 2013-09-29 2018-11-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 二羟基戊二酸或其检测试剂的用途
CN107703216A (zh) * 2016-08-07 2018-02-16 复旦大学 一种快速检测肿瘤组织2‑hg累积的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013075065A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 2-hydroxyglutarate as a biomarker for chronic hypoxia
CN104145022A (zh) * 2012-03-01 2014-11-12 德国癌症研究中心 测定(d)-2-羟基戊二酸(d2hg)或(d)-2-羟基己二酸的工具和方法
WO2015148950A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center L-2-hydroxyglutarate and stress induced metabolism
CN107727644A (zh) * 2016-08-12 2018-02-23 上海华盈生物医药科技有限公司 一种(d)‑2‑羟基戊二酸检测试剂盒
CN111647056A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 山东大学 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
3.0 T单体素磁共振波谱成像离体及在体检测2-羟基戊二酸效能初探;俞梅美等;《磁共振成像》;20200420(第04期);45-50 *
Achromobacter denitrificans strain FDAARGOS_786 chromosome, complete genome;GenBank Database;《GenBank Database》;20200604;1-2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022165917A1 (zh) 2022-08-11
CN112830958A (zh) 2021-05-25
US20240077423A1 (en) 2024-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112830958B (zh) 一种特异性响应于d-2-羟基戊二酸的转录调控因子及其应用
Bao et al. Glutarylation of histone H4 lysine 91 regulates chromatin dynamics
US10913972B2 (en) 5,5-disubstituted luciferins and their use in luciferase-based assays
Jing et al. Site-specific installation of succinyl lysine analog into histones reveals the effect of H2BK34 succinylation on nucleosome dynamics
Koch et al. Carbon limitation induces ςS-dependent gene expression in pseudomonas fluorescens in soil
CN111647056B (zh) 一种基于特异性转录调控因子的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用
AU773714B2 (en) Cell assay, method and reagents
Zhou et al. Ultrasensitive detection of small molecule–protein interaction via terminal protection of small molecule linked DNA and Exo III-aided DNA recycling amplification
Taylor et al. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate
He et al. An ultrasensitive chemiluminescent immunosensor for the detection of human leptin using hemin/G-quadruplex DNAzymes-assembled signal amplifier
Zhao et al. A sensitive fluorescence biosensor for alkaline phosphatase activity based on the Cu (II)-dependent DNAzyme
Honda et al. Generation of circularly permuted fluorescent-protein-based indicators for in vitro and in vivo detection of citrate
US20180251765A1 (en) High-throughput split aptamer screening assay
CN115028743B (zh) 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用
Korpela et al. Stable‐light‐emitting Escherichia coli as a biosensor
CN113880922B (zh) 一种检测sirt7酶活性的荧光多肽底物
Lee et al. Translational detection of indole by complementary cell-free protein synthesis assay
Sydnes et al. Protein phosphatase inhibitory activity of tautomycin photoaffinity probes evaluated at femto-molar level
WO2011123021A1 (en) Method for determining the amount of dntp
CN118086465A (zh) 固定化血红素特异性别构转录因子与CRISPR/Cas介导的血红素检测方法
JP2002191396A (ja) ルシフェラーゼ発光反応の増強法
Carvalho et al. Selective inhibition of Zophobas morio (Coleoptera: Tenebrionidae) luciferase‐like enzyme luminescence by diclofenac and potential suitability for light‐off biosensing
Taibi et al. Monitoring HECT Ubiquitination Activity In Vitro
Zhang et al. Fast and sensitive quantification of protein SUMOylation using a dual luciferase biosensor
Ueno et al. Fluorometric Measurement of Adenosine 5'-Triphosphate Using Exonuclease V Activity

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant