CN113880922B - 一种检测sirt7酶活性的荧光多肽底物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，所述荧光多肽底物采用7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酸作为荧光多肽修饰探针，其结合到多肽底物的氨基酸序列N端第18位赖氨酸的侧链氨基上形成肽键。当荧光多肽底物被SIRT7酶蛋白识别后，发生去乙酰化反应，赖氨酸的侧链与乙酰基形成的肽键被打断，多肽结构发生变化，荧光基团7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酸释放，产生荧光信号放大，快速检测SIRT7酶活性。反应体系与SIRT7酶蛋白含量呈现良好的剂量‑活性线性反应关系。反应灵敏度高，SIRT7酶蛋白的最低检测限可达10ng/μL。步骤简单，对检测仪器要求不苛刻，检测样品多，4小时可完成最多94个样品的检测。体系稳定，可应用于SIRT7去乙酰化机制的研究和SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。

Description

一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物。
背景技术
Sirtuins是哺乳动物细胞中NAD+依赖的III类去乙酰化酶，通过调节多种组蛋白和非组蛋白底物的去乙酰化水平，参与细胞代谢，在生长发育、衰老和DNA损伤修复中起了关键的调节作用。Sirtuin 7(SIRT7)基因定位于第17号染色体长臂25区3带(17q25.3)，基因组序列长度约为6.2kb，基因编码10个外显子和9个内含子，经过剪接成为长度1.7kb的mRNA，可翻译成含400个氨基酸的蛋白，分子量为44.9kDa。SIRT7作为表观遗传学靶点在多种肿瘤细胞中高度表达。作为致癌因子，SIRT7通过维持低组蛋白乙酰化状态，参与同源重组和非同源末端连接等多种DNA损伤修复机制促进肿瘤的发生发展。
现有技术中，通常采用Western Blot技术来测定SIRT7去乙酰化酶活性。然而，这种技术实验步骤繁多，且对实验技术人员要求较高；获得单次实验结果的实验周期平均需要48个小时；实验所必须的包括抗体、发光液等试剂价格昂贵，不合适作为大规模高通量药物筛选实验。另外，还可以通过高效液相色谱和质谱联用(LC/MS)的方法进行SIRT7蛋白质分析。然而，作为一项复杂系统的操作体系，上述方法要求操作者熟练质谱的检测原理、方法和应用，包括电离、质量分析仪、离子检测器和样品制备等等，而且上述方法所需仪器价值不菲。
因此，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，采用7-甲氧基香豆素-4-乙酸作为荧光多肽修饰探针，通过SIRT7酶蛋白发生去乙酰化反应后，荧光探针随着乙酰基脱落，产生荧光信号的级联放大效应，来快速检测SIRT7酶活性。
本发明的技术方案如下：
一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，其中，所述荧光多肽底物的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且所述荧光多肽底物的氨基酸序列N端第18位的赖氨酸的侧链氨基结合有荧光基团。
所述的检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，其中，所述氨基酸序列N端第18位的赖氨酸的侧链氨基结合的荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酸。
一种如上任一所述荧光多肽底物检测SIRT7酶活性的方法，其中，包括步骤：
设置待测样品组、空白对照组、阳性药物对照组以及背景对照组；
向所述待测样品组、空白对照组以及阳性药物对照组中分别加入SIRT7酶蛋白、所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀，向所述背景对照组中加入所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀；
取待测样品、空白对照品、阳性药物对照品和背景对照品分别加入相应组别中，混合均匀后，在检测板的孔中共孵育进行反应；
待反应完成后，将检测板置于酶标仪上进行检测，收集不同组别对应的荧光信号强度；
根据荧光信号强度的读值计算酶活。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，所述阳性药物对照品为尼克酰胺溶液，所述空白对照品和背景对照品均为缓冲液。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，所述荧光多肽底物浓度为10μM，所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，当所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL时，反应的剂量-活性线性关系为y＝31.88x+2396，R2＝0.9742。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，所述反应在pH为8.0的缓冲液中，温度为37℃的反应体系下进行，反应时间为90min，所述缓冲液包括10mM Tris-HCl、4mM MgCl2、0.2mM DTT和10％甘油。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，所述荧光信号强度为荧光基团在激发波长260nm，发射波长300-600nm的荧光信号强度。
所述的检测SIRT7酶活性的方法，其中，酶活计算公式为：
酶活＝(RLU(样品组)-RLU(背景对照组))/(RLU(空白对照组)-RLU(背景对照组))×100％；其中，RLU表示相对荧光强度的单位，RLU(样品组)为待测样品组或者阳性药物对照组的荧光强度读值，RLU(空白对照组)为空白对照组100％酶活性的荧光强度读值，RLU(背景对照组)为背景对照组的荧光强度读值。
一种如上任一所述荧光多肽底物的应用，其中，将所述荧光多肽底物应用于SIRT7去乙酰化机制的研究以及SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。
有益效果：本发明提供的一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，所述荧光多肽底物采用7-甲氧基香豆素-4-乙酸作为荧光多肽修饰探针，所述7-甲氧基香豆素-4-乙酸结合到多肽底物的氨基酸序列N端第18位赖氨酸的侧链氨基上形成肽键。当18位赖氨酸被修饰的荧光多肽底物被SIRT7酶蛋白识别后，发生去乙酰化反应，赖氨酸的侧链与乙酰基形成的肽键被打断，多肽结构发生变化，荧光基团7-甲氧基香豆素－4-乙酸释放，产生荧光信号放大，之后采用260nm激发光激发，收集300-600nm发射光范围的荧光信号，快速检测SIRT7酶活性。而且，反应体系与SIRT7酶蛋白的含量呈现良好的剂量-活性线性反应关系(y＝31.88x+2396，R2＝0.9742)。反应灵敏度高，SIRT7酶蛋白的最低检测限可达到10ng/μL。不仅如此，该反应实验步骤简单，对检测仪器要求不苛刻，检测样品多，4小时可完成94个以内数量样品的检测，而且不需要操作者有复杂的专业背景。体系稳定，可应用于SIRT7对其特异底物去乙酰化机制的研究和SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。
附图说明
图1为本发明实施例中荧光多肽底物的HPLC分析图。
图2为本发明实施例中荧光多肽底物的质谱分析图
图3为本发明实施例中检测SIRT7酶活性的方法的工作流程图。
图4为本发明实施例中不同剂量的SIRT7在去乙酰化酶体系中的测试结果。
图5为本发明实施例中不同剂量的通用去乙酰化酶SIRT家族抑制剂NAM在去乙酰化酶体系中的测试结果。
图6为本发明实施例中94个化合物在去乙酰化酶体系中的测试结果。
具体实施方式
本发明提供一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
第一方面，本发明实施例提供一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，所述荧光多肽底物采用化学合成的方法制备，包括如SEQ ID NO.1所示的完整的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第18位的赖氨酸的侧链氨基结合有荧光基团。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列N端第18位的赖氨酸的侧链氨基结合的荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酸。
SEQ ID NO.1：
Ala-Arg-Thr-Lys-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-Pro-Arg-Lys(MCA)-Gln-Leu-Ala-Gly-Gly-Lys，其中，MCA是7-甲氧基香豆素-4-乙酸。
香豆素及其衍生物是一种非常经典的荧光染料，其在紫外线波段范围即可被激发，发射波长范围在390-480nm。本发明实施例选择7-甲氧基香豆素-4-乙酸，结合到多肽底物的氨基酸序列N端第18位赖氨酸的侧链氨基上形成肽键，当18位赖氨酸被修饰的多肽底物被SIRT7酶蛋白识别后，发生去乙酰化反应，赖氨酸的侧链与乙酰基形成的肽键被打断，多肽结构发生变化，荧光基团7-甲氧基香豆素-4-乙酸释放，产生荧光信号放大。之后，采用260nm激发光激发，收集300-600nm发射光范围的荧光信号，根据荧光信号强度来计算SIRT7酶活性。
第二方面，本发明实施例还提供一种检测SIRT7酶活性的方法，所述方法基于如上任一所述的荧光多肽底物。
在一些实施方式中，所述的检测SIRT7酶活性的方法包括步骤：
S10、设置待测样品组、空白对照组、阳性药物对照组以及背景对照组；
S20、向所述待测样品组、空白对照组以及阳性药物对照组中分别加入SIRT7酶蛋白、所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀，向所述背景对照组中加入所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀；
S30、取待测样品、空白对照品、阳性药物对照品和背景对照品分别加入相应组别中，混合均匀后，在检测板的孔中共孵育进行反应；
S40、待反应完成后，将检测板置于酶标仪上进行检测，收集不同组别对应的荧光信号强度；
S50、根据荧光信号强度的读值计算酶活。
在一些实施方式中，所述空白对照品和背景对照品为缓冲液，所述阳性药物对照品为通用去乙酰化酶SIRT家族抑制剂尼克酰胺溶于缓冲液中，浓度为1μM-30mM。尼克酰胺(Nicotinamide,NAM)作为一个著名的Sirtuins通路的反馈调节抑制剂，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)经过去乙酰化反应被消耗后的代谢产物，因此可选择尼克酰胺作为药物阳性对照品抑制剂。
在一些实施方式中，所述荧光多肽底物的浓度为10μM。经过验证，在上述浓度时，检测到的荧光信号强度较强，完全可以满足检测的需要。
在一些实施方式中，所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL。经过验证，SIRT7酶蛋白浓度低于10ng/μL时，最终的检测信号过低；而浓度超过70ng/μL，信号值则接近平台期。故而选择SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL。
在一些实施方式中，当所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL时，呈现良好的剂量活性效应，反应的剂量-活性线性关系为y＝31.88x+2396，R2＝0.9742。在一些具体的实施方式中，采用SIRT7酶蛋白浓度为50ng/μL。在该浓度时，可达到最佳的反应效果。
在一些实施方式中，所述反应在pH为8.0的缓冲液中，温度为37℃的反应体系下进行，反应时间为90min，所述缓冲液包括10mM Tris-HCl、4mM MgCl2、0.2mM DTT和10％甘油。其中，待测样品、阳性对照品、SIRT7酶蛋白、荧光多肽底物和NAD+均以上述去乙酰化缓冲液为溶剂。
在一些实施方式中，所述荧光信号强度为荧光基团在激发波长260nm，发射波长300-600nm的荧光信号强度。在此波长范围内，波形会呈现一个先上升再下降的趋势，并在450nm处荧光信号达到峰值。因此在一些具体的实施方式中，通过统计450nm发射波长的荧光信号强度来计算SIRT7酶活性。
在一些实施方式中，酶活计算公式为：
酶活＝(RLU(样品组)-RLU(背景对照组))/(RLU(空白对照组)-RLU(背景对照组))×100％；其中，RLU表示相对荧光强度的单位，RLU(样品组)为待测样品组或者阳性药物对照组的荧光强度读值，RLU(空白对照组)为空白对照组100％酶活性的荧光强度读值，RLU(背景对照组)为背景对照组的荧光强度读值。
计算待测样品组的酶活时，RLU(样品组)为待测样品组的荧光强度读值，计算阳性药物对照组的酶活则RLU(样品组)为阳性药物对照组的荧光强度读值。
在一些具体的实施方式中，所述的检测SIRT7酶活性的方法包括步骤：
S100、取等体积的NAD+加入到96孔板的各个样品孔中；
S200、向步骤S100的各个样品孔中加入等体积的荧光多肽底物；
S300、向步骤S200中待测样品孔、空白对照孔、阳性药物对照孔中加入SIRT7酶蛋白，在背景对照孔中加入相同体积的去乙酰化缓冲液，加完后将微孔板离心；
S400、向步骤S300中的待测样品孔中加入待测药物，在阳性药物对照孔中加入相同体积的NAM，在空白对照孔和背景对照孔中加入相同体积的去乙酰化缓冲液，加完后将微孔板离心；
S500、向步骤S400中的待测样品孔、空白对照孔、阳性药物对照孔和背景对照孔中加入剩余体积的去乙酰化缓冲液补足到50μL，加完后将微孔板离心；
S600、步骤S500离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，37℃条件下共孵育90min；
S700、步骤S600结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，收集荧光信号强度；
S800、根据步骤S700收集的荧光信号强度的读值计算酶活性。
在一些具体的实施方式中，加入的NAD+母液浓度为10mM，体积为5μL；荧光多肽底物的母液浓度为100μM，体积为5μL；SIRT7酶蛋白的母液浓度为500ng/μL，体积为5μL；待测样品的母液浓度为500μM，体积为5μL；NAM的母液浓度为30mM，体积为5μL。最终，NAD+反应终浓度为1mM，荧光多肽底物反应终浓度为10μM，SIRT7酶蛋白反应终浓度为50ng/μL，NAM反应终浓度为3mM，待测样品反应终浓度为50μM。经过验证，上述浓度为所述反应的最佳反应浓度，在此浓度之下，可最大限度的检测SIRT7酶蛋白的活性。
在一些具体的实施方式中，步骤S700中激发光260nm，收集发射波长450nm处的荧光信号强度。这是因为在300-600nm发射光范围的荧光信号范围内，波形会呈现一个先上升再下降的趋势，在450nm处荧光信号达到峰值，因而收集450nm发射光的荧光信号强度。
在一些实施方式中，SIRT7酶蛋白的检测范围为10-70ng/μL，最低检测限可达到10ng/μL。
在现有技术中，尚未有方法可以定量检测SIRT7酶蛋白。而本申请实施例提供的检测方法，可以精确的定量检测SIRT7酶蛋白，且最低检测限可达到10ng/μL，灵敏度极高，是目前唯一可以具体定量SIRT7酶蛋白的检测方法。
第三方面，本发明实施例还提供一种荧光多肽底物的应用，将所述荧光多肽底物用于SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。
本发明实施例选择7-甲氧基香豆素-4-乙酸，结合到多肽底物的氨基酸序列N端第18位赖氨酸的侧链氨基上形成肽键，当18位赖氨酸修饰的多肽底物被SIRT7酶蛋白识别后，发生去乙酰化反应，赖氨酸的侧链与乙酰基形成的肽键被打断，多肽结构发生变化，释放7-甲氧基香豆素-4-乙酸荧光信号，通过荧光信号拟合计算SIRT7酶活性。该方法可以直接应用于靶向SIRT7的小分子药物抑制剂的快速高通量筛选。
在一些具体的实施方式中，SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒包括：缓冲液、空白对照品、阳性药物对照品、SIRT7酶蛋白、荧光多肽底物、NAD+；所述缓冲液包括10mM Tris-HCl，4mM MgCl2，0.2mM DTT和10％甘油，pH＝8.0；所述空白对照品为缓冲液；所述阳性药物对照品为通用去乙酰化酶SIRT家族抑制剂Nicotinamide(NAM)溶于缓冲液中，母液浓度为30mM，反应终浓度为3mM；SIRT7酶蛋白母液浓度为500ng/μL，最适反应终浓度为50ng/μL；待测样品母液浓度为500μM，反应终浓度为50μM；荧光多肽底物母液浓度为100μM，反应终浓度为10μM；NAD+母液浓度为10mM，反应终浓度为1mM。
本发明实施例所述的试剂盒稳定性好，检测SIRT7酶活性方便，可应用于SIRT7抑制剂的大规模筛选。
下面通过具体实施例对本发明一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物做进一步的解释说明：
实施例1：
1、荧光多肽底物的合成及储存
本发明实施例设计的荧光多肽底物完整的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经由商业公司化学合成而来。SIRT7酶蛋白、NAD+、Tris-HCl、MgCl2、DTT、甘油等均来自于市售。合成的荧光多肽底物经高压液相色谱(图1)和质谱分析(图2)以检测荧光多肽底物的纯度及质量。荧光多肽底物以冻干粉形式储存于-20℃冰箱。荧光多肽底物初始采用双蒸水稀释，分装保存于-20℃。
SEQ ID NO.1：
Ala-Arg-Thr-Lys-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-Pro-Arg-Lys(MCA)-Gln-Leu-Ala-Gly-Gly-Lys(MCA是7-甲氧基香豆素-4-乙酸)。
2、基于荧光多肽底物的SIRT7酶活性的快速检测
图3所示为基于荧光多肽底物检测SIRT7酶活性的方法的工作流程图，具体包括步骤：
(1)取5μL母液浓度为10mM的NAD+加入到96孔板的各个样品孔中；
(2)向步骤(1)的样品孔中加入5μL母液浓度为100μM的荧光多肽底物；
(3)向步骤(2)中待测样品孔、空白对照孔、阳性药物对照孔加入5μL母液浓度为500ng/μL的SIRT7酶蛋白，在背景对照孔中加入5μL去乙酰化缓冲液，加完后将微孔板离心；
(4)向步骤(3)中的待测样品孔中加入5μL母液浓度为500μM待测药物，在阳性药物对照孔中加入5μL母液浓度为30mM的NAM，在空白对照孔和背景对照孔中加入5μL去乙酰化缓冲液，加完后将微孔板离心；
(5)向步骤(4)中的待测样品孔、空白对照孔、阳性药物对照孔和背景对照孔中加入剩余体积的去乙酰化缓冲液，将总体积补足到50μL，加完后将微孔板离心；
(6)步骤(5)离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，37℃条件下共孵育90min。
(7)步骤(6)结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，激发光260nm，收集发射光450nm的荧光信号强度。
(8)根据步骤(7)收集的荧光信号强度，按以下公式计算酶活性：
酶活＝(RLU(样品组)-RLU(背景对照组))/(RLU(空白对照组)-RLU(背景对照组))×100％；其中，RLU表示相对荧光强度的单位，RLU(样品组)为待测样品或者阳性药物对照品与SIRT7酶蛋白反应的发射光在450nm处的荧光信号读值，RLU(空白对照组)为反应体系中100％SIRT7酶活性的阳性对照品在450nm处的荧光强度读值，RLU(背景对照组)为未添加SIRT7酶蛋白的背景对照组在450nm处的荧光强度读值。
实施例2：不同SIRT7反应酶量的信号比测量
按照实施例1所述的反应体系以及检测方法，在反应过程中加入不同的SIRT7反应酶量，测试荧光信号。结果如图4所示，当反应时SIRT7酶用量为10-70ng/μL时，呈现良好的剂量活性效应(如图4a)，其剂量-活性线性关系为y＝31.88x+2396，R2＝0.9742(如图4c)，这表明该检测方式显示SIRT7剂量与活性呈现线性正相关。最终，采用SIRT7酶蛋白50ng/μL作为后续实验的反应条件(如图4b)。
实施例3：不同阳性对照品的剂量的信号比测量
按照实施例1所述的反应体系以及检测方法，当SIRT7酶的反应酶量为50ng/μL，反应时间为90min时，加入不同剂量(1μM-30mM)的通用去乙酰化酶抑制剂NAM(即阳性药物对照品)，测试荧光信号。结果如图5a所示，荧光强度随着NAM浓度升高而降低，显示NAM抑制SIRT7活性。图5b显示通过拟合450nm发射波长的荧光信号强度计算SIRT7活性，NAM靶向SIRT7抑制其活性，IC50为2.291mM。根据此实验结果，可以选择3mM作为反应体系的阳性药物抑制浓度。
实施例4：对小分子化合物进行SIRT7靶点抑制剂的初筛
1、提供基于荧光多肽底物的SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒，包括：缓冲液、空白对照品、阳性对照品、SIRT7酶蛋白、荧光多肽底物、NAD+；所述缓冲液包括10mM Tris-HCl(pH＝8.0)，4mM MgCl2，0.2mM DTT和10％甘油，pH＝8.0；所述空白对照品为缓冲液；所述阳性对照品为通用去乙酰化酶SIRT家族抑制剂Nicotinamide(NAM)溶于缓冲液中，母液浓度为30mM，反应终浓度为3mM；SIRT7酶蛋白母液浓度为500ng/μL，反应终浓度为50ng/μL；荧光多肽底物母液浓度为100μM，反应终浓度为10μM；NAD+母液浓度为10mM，反应终浓度为1mM；待测样品母液浓度为500μM，反应终浓度为50μM。
2、应用上述SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒筛选小分子化合物抑制剂的方法，步骤如下：
(1)在冰上解冻SIRT7酶蛋白、荧光多肽底物、去乙酰化缓冲液(10mM Tris-HCl，4mM MgCl2，0.2mM DTT和10％甘油，缓冲液pH＝8.0)，并且以上试剂在整个实验过程中需要一直放置在冰上；
(2)配制待测样品：取待测样品用DMSO溶解，化合物的DMSO浓度不能大于5％，实验最终DMSO浓度不能大于1％，然后用去乙酰化缓冲液进一步稀释待测样品溶液，使其浓度为500μM；
(3)配制阳性对照品：取NAM用双蒸水溶解，然后用去乙酰化缓冲液进一步稀释，使其浓度为30mM；
(4)取5μL母液浓度为10mM的NAD+加入到96孔板的各个样品孔中；
(5)向步骤(4)的孔板中加入5μL母液浓度为100μM的荧光多肽底物；
(6)向步骤(5)中待测样品孔、空白对照品孔、阳性对照品孔加入5μL母液浓度为500ng/μL的SIRT7酶蛋白。在背景对照品孔中加入5μL去乙酰化缓冲液，加完后微孔板离心；
(7)向步骤(6)中的待测样品孔加入母液浓度为500μM待测药物5μL，在阳性药物对照孔中加入5μL母液浓度为30mM的NAM，在空白对照品孔和背景对照孔中加入5μL去乙酰化缓冲液，加完后微孔板离心；
(8)向步骤(7)中的待测样品孔、空白对照品孔、阳性对照品孔和背景对照品孔中加入去乙酰化缓冲液，补足到50μL，加完后微孔板离心；
(9)步骤(8)离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，37℃条件下共孵育90min。
(10)步骤(9)结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(RLU)，按以下公式计算酶活性；
酶活＝(RLU(样品组)-RLU(背景对照组))/(RLU(空白对照组)-RLU(背景对照组))×100％；其中，RLU表示相对荧光强度的单位，RLU(样品组)为待测样品或者阳性药物对照品与SIRT7酶蛋白反应的发射光在450nm处的荧光信号读值，RLU(空白对照组)为反应体系中100％SIRT7酶活性的阳性药物对照品在450nm处的荧光强度读值，RLU(背景对照组)为未添加SIRT7酶蛋白的背景对照组在450nm处的荧光强度读值。
3、对94个小分子化合物进行SIRT7靶点抑制剂的初筛
采用基于荧光多肽底物的SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒，应用上述SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒筛选SIRT7靶点抑制剂的方法，对94个荧光化合物进行筛选，荧光化合物浓度为50μM，选取450nm发射波长的荧光信号，统计药物活性抑制率柱状图。
结果如图6所示，由图可知1号、7号、20号、66号和70号化合物显示出良好的潜在SIR7抑制活性。
根据初筛的结果，验证了实验体系的可行性和成功实现了靶向SIRT7的高通量药物试剂盒筛选。该方法可以在4个小时内完成94个药物的快速筛选。筛选方法快速简易，操作人员培训简单。为后续的药物研发提供了前期高通量初筛判定。
综上所述，本发明提供了一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物，所述荧光多肽底物采用7-甲氧基香豆素-4-乙酸作为荧光多肽修饰探针，所述7-甲氧基香豆素-4-乙酸结合到多肽底物的氨基酸序列N端第18位赖氨酸的侧链氨基上形成肽键。当18位赖氨酸被修饰的荧光多肽底物被SIRT7酶蛋白识别后，发生去乙酰化反应，赖氨酸的侧链与乙酰基形成的肽键被打断，多肽结构发生变化，荧光基团7-甲氧基香豆素-4-乙酸释放，产生荧光信号放大，之后采用260nm激发光激发，收集300-600nm发射光范围的荧光信号，快速检测SIRT7酶活性。而且，反应体系与SIRT7酶蛋白的含量呈现良好的剂量-活性线性反应关系(y＝31.88x+2396，R2＝0.9742)。反应灵敏度高，SIRT7酶蛋白的最低检测限可达到10ng/μL。不仅如此，该反应实验步骤简单，对检测仪器要求不苛刻，检测样品多，4小时可完成94个以内数量样品的检测，而且不需要操作者有复杂的专业背景。体系稳定，可应用于SIRT7对其特异底物去乙酰化机制的研究和SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种检测SIRT7酶活性的荧光多肽底物
<160> 1
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
ARTKQTARKS TGGKAPRKQL AGGK 24

Claims (8)

1.一种荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，包括步骤：
设置待测样品组、空白对照组、阳性药物对照组以及背景对照组；
向所述待测样品组、空白对照组以及阳性药物对照组中分别加入SIRT7酶蛋白、所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀，向所述背景对照组中加入所述荧光多肽底物、NAD+并混合均匀，其中，所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL；
取待测样品、空白对照品、阳性药物对照品和背景对照品分别加入相应组别中，混合均匀后，在检测板的孔中共孵育进行反应；
待反应完成后，将检测板置于酶标仪上进行检测，收集不同组别对应的荧光信号强度；
根据荧光信号强度的读值计算酶活；其中，所述荧光多肽底物的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，且所述荧光多肽底物的氨基酸序列N端第18位的赖氨酸的侧链氨基结合有荧光基团，所述荧光基团为7-甲氧基香豆素-4-乙酸。
2.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，所述阳性药物对照品为尼克酰胺溶液，所述空白对照品和背景对照品均为缓冲液。
3.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，所述荧光多肽底物浓度为10μM。
4.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，当所述SIRT7酶蛋白浓度为10-70ng/μL时，反应的剂量-活性线性关系为y=31.88x+2396，R2=0.9742。
5.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，所述反应在pH为8.0的缓冲液中，温度为37°C的反应体系下进行，反应时间为90min，所述缓冲液包括10mM Tris-HCl、4mM MgCl2、0.2mM DTT和10%甘油。
6.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，所述荧光信号强度为荧光基团在激发波长260nm，发射波长300-600nm的荧光信号强度。
7.根据权利要求1所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法，其特征在于，酶活计算公式为：
酶活=(RLU(样品组)-RLU(背景对照组)) /(RLU(空白对照组)-RLU(背景对照组)) ×100%；其中，RLU表示相对荧光强度的单位，RLU(样品组)为待测样品组或者阳性药物对照组的荧光强度读值，RLU(空白对照组)为空白对照组100%酶活性的荧光强度读值，RLU(背景对照组)为背景对照组的荧光强度读值。
8.一种如权利要求1-7任一所述的荧光多肽底物检测SIRT7酶去乙酰化活性的方法的应用，其特征在于，将所述方法应用于SIRT7去乙酰化机制的研究以及SIRT7靶点小分子药物筛选试剂盒的开发。
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