CN109402222B - 水解酶的高通量筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质工程领域，提供一种水解酶的高通量筛选方法，所述方法包括：利用平板显色法对水解酶突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选得到可能具有水解酶活性的突变体；将初筛得到的突变体经微孔板光谱法进行复筛，得到具有水解酶活性的突变体；将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，确定水解酶突变体的活性。本发明的方法普适性强、灵敏度高、简单有效、通量高。

Description

水解酶的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种酶的高通量筛选方法。
背景技术
随着酶工程和代谢工程的发展，建立一个合适、有效的高通量筛选方法是酶蛋白理性和非理性改造以及天然酶筛选成功的关键之一。一个有效的高通量筛选方法是对筛选过程的强化，其原则是灵敏、可重复、稳定、可行。
目前应用较多的高通量筛选方法如下所述。第一种是pH指示剂加入法，它是最直接、最方便的一种高通量筛选方法，主要针对那些有氢离子释放的水解反应。第二种是指示剂间接添加法，它是利用辅助试剂和辅助酶将目标酶反应的底物或产物再进行另一个反应，从而产生紫外或可见光光谱范围内的光吸收变化，间接指示目标酶的酶活性高低。第三种方法是酶串联法，它是指通过在一个微生物细胞内同时共表达两个酶，利用其中一个酶的酶活来指示目标酶的酶活。第四种方法是平板筛选法，通过将含有目标酶的微生物培养在含有底物的琼脂平扳上，根据平板上颜色的变化、荧光强弱或水解圈的大小来筛选出人们需要的目标酶，这种方法简单、易于操作，常用于对酶蛋白进行初步筛选。
水解酶(Hydrolase)是普遍存在于自然界的酶，在医药、食品、洗涤剂化学合成及油脂等工业领域具有广泛的应用。建立一个合适的、有效的高通量筛选方法是水解酶改造以及天然水解酶筛选成功的关键之一。近年来，研究人员开发了平板筛选法对水解酶进行筛选，其基本原理是平板上微生物细胞中的水解酶水解底物乙酸萘酯生成产物萘酚，萘酚再与重氮染料发生偶联反应，导致菌落显现颜色，以颜色的深浅作为筛选的依据(Roodveldt,C.,Tawfik,D.S.(2005).Directed evolution of phosphotriesterase fromPseudomonas diminuta for heterologous expression in Escherichia coli resultsin stabilization of the metal-free state.Protein Eng.Des.Sel.18,51-58.)。然而该方法的灵敏度较低、假阳性率偏高。
发明内容
针对目前水解酶筛选方法假阳性率高这个问题，本发明提供一种高通量筛选方法，以解决现有技术问题。
具体地，本发明的水解酶的高通量筛选方法包括步骤：
1)初筛：利用平板显色法对水解酶突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选得到可能具有水解酶活性的突变体；
2)复筛：将初筛得到的突变体经微孔板光谱法进行复筛，得到具有水解酶活性的突变体；
3)活性确定：将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，确定突变体的水解酶活性；优选地，突变体的水解酶活性是针对目标底物的活性。
其中，本发明的水解酶指能够催化水解酯键断裂的酶；优选地，所述水解酶为2-甲基丁酸侧链水解酶；进一步优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的野生型氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明所述的水解酶突变体文库可以利用理性改造或非理性改造的手段对水解酶的编码基因进行突变而得到。所述突变体文库是以微生物，如细菌为表达载体。本领域公知，由于突变体活性不一，表达突变体的菌落所表现的颜色也会不同。突变体文库的制备、根据菌落颜色判断酶活性等都属于本领域常识。
本发明所使用的平板显色法、微孔板光谱法以及摇瓶培养突变体这些方法都是本领域的常规方法，本领域技术人员根据说明书的描述可以实现所述方法并实现相应的目的。
在一种优选的实施方式中，利用平板显色法进行初筛包括：
将表达水解酶突变体文库的微生物平铺在平板上，在平板上加入酶反应底物或底物类似物和显色剂，培养微生物发生反应，筛选出颜色发生变化的菌落。
反应底物和显色剂均根据水解酶而定，这是本领域常规技术。底物进入平板上的细菌内，经过细胞内的酶水解生成产物，产物转移到细胞外与显色剂反应生成有颜色的物质，使菌落呈现出不同颜色，即，这些突变体可能具有水解酶活性。
优选地，所述初筛是利用硝酸纤维素膜将微生物形成的菌落转移至含有营养物质和蛋白表达诱导剂的平板上。
优选地，当所述水解酶是2-甲基丁酸侧链水解酶时，初筛时向平板中倒入含有酶反应底物类似物乙酸萘酯和显色剂重氮盐的半固体琼脂糖，琼脂糖的终浓度是0.5％。
进一步优选地，所述乙酸萘酯的浓度范围为0.2-1mM，所述重氮盐的浓度为1-3mM。
在一种优选的实施方式中，利用微孔板光谱法复筛包括：
将平板上颜色发生变化的菌落接入微孔板中培养，诱导表达蛋白，加入酶反应底物或底物类似物，测定特定波长处的光吸收值，根据不同浓度产物在该波长处的光吸收值绘制的标准曲线计算检测的突变体酶水解底物所产生的产物浓度，筛选具有水解酶活性的突变体。
优选地，当所述水解酶是2-甲基丁酸侧链水解酶时，所述酶反应底物或底物类似物是乙酸萘酯；所述特定波长为320nm。
本步骤中，收集初筛出的突变体菌株，在微孔板中加入液体培养基培养，诱导表达蛋白，收集菌体，加入酶反应底物或底物类似物，底物或底物类似物进入细胞内，经过细胞内的酶水解生成产物，产物转移到细胞外，在特定波长处有光吸收的变化，测定该波长处的光吸收值，根据不同浓度产物在该波长处的光吸收值绘制的标准曲线计算检测的突变体酶水解底物所产生的产物浓度，得到具有水解酶活性的突变体。
本步骤中，诱导表达所使用的诱导剂根据表达蛋白的载体而定，这属于常规技术。优选地，所述诱导剂是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选地，所述复筛的步骤为：利用牙签将由初筛得到的突变体菌株接入含有1ml培养基的96深孔板中；培养16-24小时后，按照1％的接种量将突变体加入至另一个96深孔板中，培养至对数生长期，加入诱导剂进行蛋白的诱导表达。培养16-24小时后收集菌体，加入酶反应底物类似物乙酸萘酯，终浓度为0.2-1mM，37℃反应5-20分钟后离心取上清，用酶标仪对上清液进行光谱测定，设定波长为320nm。如果超出以上所限定的范围，会在一定程度上降低检测的灵敏度，增加假阳性率。
在一种优选的实施方式中，所述活性确定步骤包括：将复筛得到的突变体菌落进行摇瓶培养，加入目的底物，反应后，测量产物的浓度，以此确定突变体的水解酶活性。
将得到的具有水解酶活性的突变体的菌株进行摇瓶培养，生产酶蛋白。收集菌株细胞，加入该水解酶的目标底物，底物进入细胞内，与细胞内的酶反应生成产物，产物转移到胞外，定量测定胞外产物的浓度，从而最终确定突变体的水解酶活性。
优选地，所述活性确定步骤为：将微孔板筛选得到的突变体进行摇瓶培养。当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂进行蛋白的诱导表达。培养16-24小时后收集菌体，加入酶反应底物或底物类似物，终浓度是0.2-0.5mM，37℃反应5-10分钟后离心取上清，定量测定生成的产物，从而最终确定突变体的水解酶活性。
在一种优选的实施方式中，本发明提供一种2-甲基丁酸侧链水解酶的高通量筛选方法，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的野生型序列如SEQ ID NO:1所示，所述方法包括：
1)初筛：利用硝酸纤维素膜将表达突变体文库的微生物所形成的菌落转移至含有营养物质和蛋白表达诱导剂的平板上，向平板中倒入含有酶反应底物类似物乙酸萘酯和显色剂重氮盐的半固体琼脂糖，琼脂糖的终浓度是0.5％，所述乙酸萘酯的浓度范围为0.2-1mM，所述重氮盐的浓度为1-3mM；培养微生物，发生反应，筛选出颜色发生变化的菌落；
2)复筛：将平板上颜色发生变化的菌落接入微孔板中培养，加入诱导剂IPTG诱导表达蛋白，加入酶反应底物类似物乙酸萘酯，终浓度为0.2-1mM，测定320nm处的光吸收值，筛选具有水解酶活性的突变体；
3)活性确定：将复筛得到的突变体菌株进行摇瓶培养，至对数生长期，加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，收集菌体，加入酶反应底物洛伐他汀，反应终浓度为0.2-0.5mM，反应后离心取上清，测定生成的产物莫纳可林J的浓度，确定2-甲基丁酸侧链水解酶突变体针对洛伐他汀的酶活性；
得到的2-甲基丁酸侧链水解酶突变体的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示。
因此，在另一方面，本发明提供一种生物材料，它可以是：
1)蛋白质，所述蛋白质是利用本发明方法筛选得到的；优选地，其为通过本发明方法筛选得到的2-甲基丁酸侧链水解酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2～4任一项所示；这些突变体活性显著高于野生型活性，能够有效促使洛伐他汀转化为莫纳可林J，极大地提高了转化效率；
2)编码1)所述蛋白质的核酸分子；本领域技术人员根据蛋白质的氨基酸序列可以推知核苷酸序列；或者
3)包含2)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；本领域技术人员根据需要可以选择合适的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，以实现期望的结果。
本发明首先利用平板显色法对水解酶突变体文库进行初筛，菌落颜色变深的突变体可能具有水解酶活性，但是易出现假阳性的结果，只能是做定性分析；进一步对筛选到的这些突变体进行复筛，利用光谱法定量分析酶反应的产物，从而排除了假阳性的突变体；最后通过摇瓶培养，确定结果。本发明所具有的优点包括：本发明的筛选方法包括平板显色法(初筛)、微孔板光谱法(复筛)和摇瓶培养法(结果确定)，通过将三种方法有机地结合在一起，实现对水解酶突变体文库的高灵敏度、简单易行的高通量筛选。本发明适用于所有水解酶、特别是2-甲基丁酸侧链水解酶天然酶和突变体文库的筛选，本发明的方法普适性强、灵敏度高、简单有效、通量高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的平板筛选时使用不同浓度乙酸萘酯(A)和固红TR-半氯化锌盐(B)的菌落显色图；a.阴性对照，b.含有野生型2-甲基丁酸侧链水解酶的菌株。
图2为本发明实施例2提供的微孔板筛选时使用不同浓度乙酸萘酯进行酶反应后的产物光吸收曲线图。A.阴性对照(OD600＝0.394)，B.编码野生型2-甲基丁酸侧链水解酶的菌株(OD600＝0.368)。37℃反应10分钟。
图3为本发明实施例2提供的微孔板筛选时使用不同时间进行酶反应后的产物光吸收曲线图。A.阴性对照(OD600＝0.394)，B.编码野生型2-甲基丁酸侧链水解酶的菌株(OD600＝0.368)。
图4为本发明实施例2提供的不同浓度α-萘酚的光吸收曲线图，其中内插图为α-萘酚的标准曲线图。
图5是易错PCR产物琼脂糖核酸电泳图。1：Mn2+浓度是0.05mM；2：Mn2+浓度是0.1mM；3：Mn2+浓度是0.2mM；4：Mn2+浓度是0.3mM；5：Mn2+浓度是0.4mM。
图6是2-甲基丁酸侧链水解酶突变体文库的复筛结果图。WT：野生型；其余编号为不同突变株。
图7是2-甲基丁酸侧链水解酶突变体全细胞催化剂的酶活性结果图。WT：野生型；其余编号为不同突变株。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例以2-甲基丁酸侧链水解酶的筛选为例，但本发明方法不限于筛选2-甲基丁酸侧链水解酶，本领域技术人员根据本文所述内容可以毫无疑问地将本方法应用于其它水解酶的筛选中。
McLean等人在利用产青霉菌生产普伐他汀的代谢工程改造研究中，鉴定了一种可以水解美伐他汀2-甲基丁酰侧链的酶(McLean,K.J.,Hans,M.,Meijrink,B.,vanScheppingen,W.B.,Vollebregt,A.,Tee,K.L.,vander Laan,J.M.,Leys,D.,Munro,A.W.,and van der Berg,M.A.(2015).Single-step fermentative production of thecholesterol-lowering drug pravastatin via reprogramming of Penicilliumchrysogenum.P Natl Acad Sci USA 112,2847-2852.)。Huang等于2017年报道了一种新的2-甲基丁酸侧链水解酶(Huang XN,Liang YJ,Yang Y,Lu XF.(2017).Single-stepproduction of the simvastatin precursor monacolin J by engineering of anindustrial strain of Aspergillus terreus.Metab.Eng.,42,109-114)。体外酶活分析显示，该水解酶可以水解洛伐他汀、普伐他汀和美伐他汀的2-甲基丁酰侧链，且当以洛伐他汀为底物时，产物为莫纳可林J和2-甲基丁酸，酶的催化效率显著高于早前另一项专利报道的洛伐他汀侧链水解酯酶(WO2005040107A2)，该2-甲基丁酰侧链水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
以下实施例中，如无特殊说明，所使用的试剂、仪器都是本领域常规试剂、仪器，可以通过商购途径获得。所使用的方法均为本领域常规方法，本领域技术人员根据
实施例1：建立2-甲基丁酸侧链水解酶的平板筛选方法(初筛)
1)将野生型2-甲基丁酸侧链水解酶的编码基因(SEQ ID NO:5)与pET22b大肠杆菌表达载体连接，得到野生型2-甲基丁酸侧链水解酶的表达载体，命名为pET-Est，将这个质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。
2)将含有pET-Est表达载体的菌体和含有pET22b载体的菌体(阴性对照)分别涂布在含有氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)的培养基平板上，37℃培养过夜。
3)利用硝酸纤维素膜将平板上的菌落转移至含有诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度是0.2mM)和氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)的另一个培养基平板上。
4)30℃培养24小时后，向平板中倒入含有乙酸萘酯和重氮盐固红TR-半氯化锌盐的半固体琼脂(琼脂糖的终浓度是0.5％)，观察菌落的颜色变化。
5)设置不同浓度的乙酸萘酯(0-1mM)和固红TR-半氯化锌盐(0-3mM)，选择合适的用量。
6)当固红TR-半氯化锌盐的浓度为1mM时，乙酸萘酯的浓度越高，菌落的颜色越深。为了提高检测的灵敏度，选择0.5mM作为平板筛选时所使用的底物乙酸萘酯的浓度(图1A)。
7)当乙酸萘酯的浓度为0.5mM时，固红TR-半氯化锌盐的浓度越高，菌落的颜色越深。为了提高检测的灵敏度，选择1mM作为平板筛选时所使用的显色剂固红TR-半氯化锌盐的浓度(图1B)。
实施例2：建立2-甲基丁酸侧链水解酶的微孔板筛选方法(复筛)
1)将含有野生型2-甲基丁酸侧链水解酶表达质粒的菌体放入含有培养基和氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)的96深孔板中，37℃过夜培养。
2)按照1％的比例从中取出菌液转接至新的含有培养基和氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)的96深孔板中，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂IPTG(终浓度是0.2mM)进行蛋白的诱导表达。
3)16℃过夜培养后收集菌体，加入乙酸萘酯，37℃反应后离心取上清，用酶标仪对上清液进行紫外可见光光谱扫描(300nm-330nm)。
4)设置不同浓度的乙酸萘酯(0-1mM)和不同的反应时间(5-20分钟)，选择合适的底物用量、时间和检测波长。
5)如图2所示，随着乙酸萘酯浓度的增加，吸光值也相应的增加，与阴性对照(图2A)相比，水解酶表达菌株在320nm处有较高的光吸收值(图2B)，因此选择该波长为检测波长。为了提高检测的灵敏度，选择0.5mM的浓度作为微孔板筛选时所使用的底物乙酸萘酯的浓度。
6)如图3所示，与对照相比，延长反应时间吸光值会增加。为了提高检测的灵敏度，选择10分钟作为微孔板筛选时所使用的反应时间。
7)α-萘酚标准曲线的绘制。在300-400nm范围内对含有不同浓度α-萘酚的溶液(0.0345mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM和0.7mM)进行光谱扫描，如图4所示，α-萘酚在320nm处有较强的光吸收，以α-萘酚的浓度为横坐标，以320nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，在0.0345-0.7mM范围内，α-萘酚的浓度与320nm处的吸光值呈正相关。
实施例3：2-甲基丁酸侧链水解酶的定向进化以及突变体文库的筛选
1)易错PCR
PCR反应体系为：共25μl，具体成分如表1所示。
表1.易错PCR反应体系成分表
Figure BDA0001569757610000081
引物序列如下：
引物1：5’GGAATTCCATATGGATACCACCTTTCAGGCG 3’
引物2：5’CCCAAGCTTTCACTGCTGACCTTTCCAGGC 3’
模板是pEASY-E2-PcEST质粒(Huang XN,Liang YJ,Yang Y,Lu XF.(2017).Single-step production of the simvastatin precursor monacolin J byengineering of an industrial strain of Aspergillus terreus.Metab.Eng.,42,109-114)。
按照上述体系进行易错PCR反应，反应条件是：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。产物电泳图如图5所示，当Mn2+浓度是0.05-0.4mM(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM)时，扩增得到了目标条带。
为进一步确定浓度对易错随机突变频率的影响，分别构建上述五个浓度的基因随机突变文库。每库挑选3个克隆送公司进行测序。表2表明了浓度与基因突变频率的关系，结果表明当Mn2+浓度为0.05mM时，碱基突变率为0.25％，比较符合构建突变文库的要求。
表2.Mn2+浓度与碱基突变率的关系
Figure BDA0001569757610000091
2)突变体文库的初筛：
利用浓度为0.05mM的Mn2+进行易错PCR，构建了随机突变基因表达文库。利用高通量平板显色法初步筛选出阳性克隆。具体做法是：利用硝酸纤维素膜将平板上的菌落转移至含有诱导剂IPTG的另一个平板上，30℃过夜培养后，加入含有乙酸萘酯(0.5mM)和固红TR-半氯化锌盐(1mM)的半固体琼脂，观察平板颜色的变化情况。平板的颜色会慢慢变深，阳性克隆的菌落颜色变成红色，其他菌落变成黄色，根据颜色的差别可以挑选出可能具有高酶活的突变体。共初筛了约2×104个突变体，从中挑选出110个突变体进行复筛。
3)突变体文库的复筛：
用无菌牙签挑取初筛得到的突变体单菌落，置于含有1ml培养液的96深孔板中，加入IPTG(终浓度0.2mM)诱导蛋白表达。过夜后离心，收集菌体，加入乙酸萘酯(终浓度0.5mM)，37℃反应10分钟，取上清液，测定320nm处的吸光值。根据α-萘酚的标准曲线计算得到相同菌量的α-萘酚的浓度，以含有野生型水解酶的细胞反应后α-萘酚的浓度为100％。与野生型相比，酶活提高的突变体有15个，结果如图6所示，说明平板筛选法的假阳性率约为86％。
4)突变体活性的确定：
将复筛得到的15个突变体进行小瓶培养，当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.2mM)进行蛋白的诱导表达，22℃培养16小时后收集菌体，测定酶活性。以20μl菌体为反应物，以洛伐他汀(终浓度0.5mM)作为底物，37℃反应10分钟，取上清液，利用HPLC测定生成的产物莫纳可林J，计算得到相同菌量的莫纳可林J的浓度，以含有野生型水解酶的细胞反应后上清液的莫纳可林J的浓度为100％，结果如图7所示。与野生型相比，酶活提高的突变体有11个，说明微孔板筛选法的假阳性率约为27％。该方法显著地提高了突变体文库筛选的准确度。在以上11个突变体中，1号、2号、5号、12号和14号突变体的2-甲基丁酸侧链水解酶的突变位点是D106G和S393G两个位点，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；3号、8号和13号突变体的2-甲基丁酸侧链水解酶的突变位点是Q140L一个位点，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；7号、9号和15号突变体的2-甲基丁酸侧链水解酶的突变位点是S103R一个位点，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。这些突变体都有重复突变，说明所构建的突变体文库具有足够大的多样性及库容量，且该高通量筛选方法准确可靠，确保能够得到所需性状(如：活性提高)的突变体。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
浙江海正药业股份有限公司
<120> 水解酶的高通量筛选方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400> 1
Met Asp Thr Thr Phe Gln Ala Ala Ile Asp Thr Gly Lys Ile Asn Gly
1 5 10 15
Ala Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Gln Gly His Phe Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Ala Thr Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys Gln Pro Gln Gln
35 40 45
Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu Ile Thr Thr
50 55 60
Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu Ser Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Glu Leu Ala Ala Lys Tyr Val Leu Thr
85 90 95
Gly Phe Thr Asp Asp Glu Ser Pro Leu Asp Asp Pro Pro Ala Arg Pro
100 105 110
Ile Thr Leu Lys Met Leu Leu Thr His Ser Ser Gly Thr Ser Tyr His
115 120 125
Phe Leu Asp Pro Ser Ile Ala Lys Trp Arg Ala Gln Tyr Ala Asn Pro
130 135 140
Glu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Val Glu Glu Met Phe Thr Tyr Pro Leu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Pro Gly Thr Gly Trp Met Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Trp
165 170 175
Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Gly Thr Leu Met Glu Phe
180 185 190
Met Gln Lys Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile Thr Asp Ser Gln Phe
195 200 205
Tyr Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Ala Arg Leu Val Asp Leu Asn
210 215 220
Pro Ser Asp Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Val Ile Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Met Asn Leu Arg Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gly His Gly Leu Phe
245 250 255
Leu Thr Gly Leu Asp Phe Val Lys Ile Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn
260 265 270
Asp Gly Met Leu Leu Lys Pro Ala Ala Val Asp Asn Met Phe Gln Gln
275 280 285
His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Leu Ala Ser
290 295 300
Pro Leu Gly Pro Phe Phe Arg Val Gly Thr Asp Pro Glu Thr Lys Val
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Glu Asp Val Asp Gly Trp
325 330 335
Tyr Gly Glu Arg Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly Leu Thr Leu Thr Trp
340 345 350
Phe Ile Asp Arg Lys Asn Asn Leu Cys Gly Val Gly Ala Ile Gln Ala
355 360 365
Val Leu Pro Val Asp Gly Asp Leu Met Ala Asp Leu Lys Gln Thr Phe
370 375 380
Arg His Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Ser Ala Trp Lys Gly Gln Gln
385 390 395
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Thr Thr Phe Gln Ala Ala Ile Asp Thr Gly Lys Ile Asn Gly
1 5 10 15
Ala Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Gln Gly His Phe Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Ala Thr Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys Gln Pro Gln Gln
35 40 45
Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu Ile Thr Thr
50 55 60
Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu Ser Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Glu Leu Ala Ala Lys Tyr Val Leu Thr
85 90 95
Gly Phe Thr Asp Asp Glu Ser Pro Leu Gly Asp Pro Pro Ala Arg Pro
100 105 110
Ile Thr Leu Lys Met Leu Leu Thr His Ser Ser Gly Thr Ser Tyr His
115 120 125
Phe Leu Asp Pro Ser Ile Ala Lys Trp Arg Ala Gln Tyr Ala Asn Pro
130 135 140
Glu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Val Glu Glu Met Phe Thr Tyr Pro Leu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Pro Gly Thr Gly Trp Met Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Trp
165 170 175
Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Gly Thr Leu Met Glu Phe
180 185 190
Met Gln Lys Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile Thr Asp Ser Gln Phe
195 200 205
Tyr Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Ala Arg Leu Val Asp Leu Asn
210 215 220
Pro Ser Asp Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Val Ile Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Met Asn Leu Arg Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gly His Gly Leu Phe
245 250 255
Leu Thr Gly Leu Asp Phe Val Lys Ile Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn
260 265 270
Asp Gly Met Leu Leu Lys Pro Ala Ala Val Asp Asn Met Phe Gln Gln
275 280 285
His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Leu Ala Ser
290 295 300
Pro Leu Gly Pro Phe Phe Arg Val Gly Thr Asp Pro Glu Thr Lys Val
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Glu Asp Val Asp Gly Trp
325 330 335
Tyr Gly Glu Arg Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly Leu Thr Leu Thr Trp
340 345 350
Phe Ile Asp Arg Lys Asn Asn Leu Cys Gly Val Gly Ala Ile Gln Ala
355 360 365
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370 375 380
Arg His Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Gly Ala Trp Lys Gly Gln Gln
385 390 395
<210> 3
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Thr Thr Phe Gln Ala Ala Ile Asp Thr Gly Lys Ile Asn Gly
1 5 10 15
Ala Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Gln Gly His Phe Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Ala Thr Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys Gln Pro Gln Gln
35 40 45
Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu Ile Thr Thr
50 55 60
Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu Ser Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Glu Leu Ala Ala Lys Tyr Val Leu Thr
85 90 95
Gly Phe Thr Asp Asp Glu Ser Pro Leu Asp Asp Pro Pro Ala Arg Pro
100 105 110
Ile Thr Leu Lys Met Leu Leu Thr His Ser Ser Gly Thr Ser Tyr His
115 120 125
Phe Leu Asp Pro Ser Ile Ala Lys Trp Arg Ala Leu Tyr Ala Asn Pro
130 135 140
Glu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Val Glu Glu Met Phe Thr Tyr Pro Leu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Pro Gly Thr Gly Trp Met Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Trp
165 170 175
Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Gly Thr Leu Met Glu Phe
180 185 190
Met Gln Lys Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile Thr Asp Ser Gln Phe
195 200 205
Tyr Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Ala Arg Leu Val Asp Leu Asn
210 215 220
Pro Ser Asp Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Val Ile Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Met Asn Leu Arg Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gly His Gly Leu Phe
245 250 255
Leu Thr Gly Leu Asp Phe Val Lys Ile Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn
260 265 270
Asp Gly Met Leu Leu Lys Pro Ala Ala Val Asp Asn Met Phe Gln Gln
275 280 285
His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Leu Ala Ser
290 295 300
Pro Leu Gly Pro Phe Phe Arg Val Gly Thr Asp Pro Glu Thr Lys Val
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Glu Asp Val Asp Gly Trp
325 330 335
Tyr Gly Glu Arg Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly Leu Thr Leu Thr Trp
340 345 350
Phe Ile Asp Arg Lys Asn Asn Leu Cys Gly Val Gly Ala Ile Gln Ala
355 360 365
Val Leu Pro Val Asp Gly Asp Leu Met Ala Asp Leu Lys Gln Thr Phe
370 375 380
Arg His Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Ser Ala Trp Lys Gly Gln Gln
385 390 395
<210> 4
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp Thr Thr Phe Gln Ala Ala Ile Asp Thr Gly Lys Ile Asn Gly
1 5 10 15
Ala Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Gln Gly His Phe Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Ala Thr Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys Gln Pro Gln Gln
35 40 45
Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu Ile Thr Thr
50 55 60
Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu Ser Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Glu Leu Ala Ala Lys Tyr Val Leu Thr
85 90 95
Gly Phe Thr Asp Asp Glu Arg Pro Leu Asp Asp Pro Pro Ala Arg Pro
100 105 110
Ile Thr Leu Lys Met Leu Leu Thr His Ser Ser Gly Thr Ser Tyr His
115 120 125
Phe Leu Asp Pro Ser Ile Ala Lys Trp Arg Ala Gln Tyr Ala Asn Pro
130 135 140
Glu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Val Glu Glu Met Phe Thr Tyr Pro Leu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Pro Gly Thr Gly Trp Met Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Trp
165 170 175
Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Gly Thr Leu Met Glu Phe
180 185 190
Met Gln Lys Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile Thr Asp Ser Gln Phe
195 200 205
Tyr Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Ala Arg Leu Val Asp Leu Asn
210 215 220
Pro Ser Asp Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Val Ile Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Met Asn Leu Arg Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gly His Gly Leu Phe
245 250 255
Leu Thr Gly Leu Asp Phe Val Lys Ile Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn
260 265 270
Asp Gly Met Leu Leu Lys Pro Ala Ala Val Asp Asn Met Phe Gln Gln
275 280 285
His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Leu Ala Ser
290 295 300
Pro Leu Gly Pro Phe Phe Arg Val Gly Thr Asp Pro Glu Thr Lys Val
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Glu Asp Val Asp Gly Trp
325 330 335
Tyr Gly Glu Arg Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly Leu Thr Leu Thr Trp
340 345 350
Phe Ile Asp Arg Lys Asn Asn Leu Cys Gly Val Gly Ala Ile Gln Ala
355 360 365
Val Leu Pro Val Asp Gly Asp Leu Met Ala Asp Leu Lys Gln Thr Phe
370 375 380
Arg His Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Ser Ala Trp Lys Gly Gln Gln
385 390 395
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400> 5
atggatacca cctttcaggc ggcgattgat accggcaaaa ttaacggcgc agttgtttgc 60
gcaaccgacg cacagggcca ttttgtttat aacaaagcaa ccggcgaacg taccctgctg 120
tctggcgaaa aacaaccgca acagctggat gatgttctgt atctggcaag cgcgaccaaa 180
ctgattacca ccattgctgc tctgcaatgc gttgaagacg gtctgctgag tctggacggc 240
gatctgagta gtattgcacc ggaactggca gcgaaatacg ttctgaccgg ttttaccgac 300
gacgaaagtc cgctggacga tccgccggca cgtccgatta ccctgaaaat gctgctgacc 360
catagcagcg gtaccagcta tcatttcctg gatccgtcta tcgcaaaatg gcgcgcacaa 420
tacgcgaatc cggaaaacga aaaaccgcgt ctggtcgaag agatgttcac ctatccgctg 480
agttttcaac cgggtaccgg ctggatgtac ggtccgggtc tggattgggc aggtcgcgtt 540
gttgaacgtg ttacgggcgg taccctgatg gaattcatgc agaaacgcat cttcgatccg 600
ctgggtatca ccgatagcca gttttatccg gttacccgcg aagatctgcg cgcacgtctg 660
gttgatctga atccgtctga tccgggcgca ctgggttctg cagttattgg cggcggcggt 720
gaaatgaatc tgcgcggtcg cggcgcattt ggcggtcacg gtctgtttct gaccggtctg 780
gatttcgtca aaatcctgcg tagcctgctg gctaacgacg gtatgctgct gaaaccggct 840
gctgtcgata acatgttcca gcagcatctg ggtccggaag cagcagcaag tcatcgcgca 900
gcactggcaa gtccgctggg tccgtttttc cgcgttggta ccgatccgga aaccaaagtt 960
ggttacggtc tgggcggtct gctgaccctg gaagacgttg acggttggta cggcgaacgt 1020
accctgacct ggggcggtgg tctgaccctg acctggttta tcgaccgcaa aaacaacctg 1080
tgtggtgttg gcgcaattca agcagttctg ccggttgacg gcgatctgat ggcagatctg 1140
aaacagacct tccgccacga tatctaccgc aaatacagcg cctggaaagg tcagcagtga 1200

Claims (1)

1.一种生物材料，为：
1)蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或4所示；
2)编码1)所述蛋白质的核酸分子；或
3)包含2)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
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