CN105218583B - 一种磷酸三酯酶的超高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程领域，公开了一种基于羧基香豆素的磷酸三酯酶荧光底物，以及基于该底物的磷酸三酯酶的高通量筛选方法。该方法为磷酸三酯酶的体外区室化‑荧光激活细胞分选超高通量筛选技术。本发明基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，反应后的荧光产物具有非常好的液滴保留性，在进行酶活性定量与筛选中具有灵敏度高、定量准确的优点。底物和反应产物之间亲水性的差异，使底物可以加入外水相中并通透油相进行酶反应；生成的产物由于亲水性提高而保留在液滴中，从而实现“液滴荧光捕获”的效应，准确地控制反应时间、降低荧光背景干扰、提高筛选准确性。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，涉及一种针对磷酸三酯酶的超高通量筛选方法，具体地说涉及一种磷酸三酯酶荧光底物的设计合成，以及基于该底物的针对磷酸三酯酶的体外区室化-荧光激活细胞分选(in vitro compartmentalization based fluorescence-activated cell sorting，IVC-FACS)超高通量筛选技术。
背景技术
磷酸三酯酶(EC 3.1.8.1)是降解有机磷化合物的有效生物催化剂，在有机磷农药、有机磷化学战剂的检测、降解和解毒方面有着重要的应用(Afriat-Jurnou,L.；Roodveldt,C.；Manco,G.；Tawfik,D.S.Biochemistry 2006,45,13677–13686.Afriat-Jurnou,L.；Jackson,C.J.；Tawfik,D.S.Biochemistry 2012,51,6047–6055)。同时，磷酸三酯酶还是一类研究蛋白质自然进化机理的重要模式酶(Tokuriki,N.；Tawfik,D.S.Nature2009,459,668–673.Gupta,R.D.；Tawfik,D.S.Nat.Methods2008,5,939–942.)，由于自然界中的磷酸三酯酶是近几十年来伴随着有机磷农药的出现才迅速进化出来的，因此被公认为是自然界中对非天然底物催化活性进化最快的酶之一，研究该类酶的进化模式，有助于人类更好地了解自然界定向进化的机制。近年来，研究者对磷酸三酯酶进行了大量的定向进化研究(Zhang,Y.；An,J.；Ye,W.；Yang,G.；Qian,Z.G.；Chen,H.F.；Cui,L.；Feng,Y.Appl.Environ.Microbiol.2012,78,6647–6655.Meier,M.M.；Rajendran,C.；Malisi,C.；Fox,N.G.；Xu,C.；Schlee,S.；Barondeau,D.P.；B.；Sterner,R.；Raushel,F.M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11670–11677.Mandrich,L.；Merone,L.；Manco,G.Environ.Technol.2010,31,1115–1127.Draganov,D.I.Chem.Biol.Interact.2010,187,370–372.)，以期获得催化性质优良的突变酶，并揭示该类酶进化的分子机制。
对磷酸三酯酶进行定向进化研究，需要从大量的突变体中筛选出极少数性质提高的突变体，因此要求对突变库进行快速高效的筛选。而常规的基于底物平板或微孔板的筛选方法由于筛选通量低(<105/天)、费时费力而很难满足对酶进行快速定向进化的要求。区室化-荧光激活细胞分选(in vitro compartmentalization based fluorescence-activated cell sorting，IVC-FACS)是新近出现的酶活性超高通量筛选技术(Aharoni,A.；Amitai,G.；Bernath,K.；Magdassi,S.；Tawfik,D.S.Chem.Biol.2005,12,1281-1289.Mastrobattista,E.；Taly V.；Chanudet,E.；Treacy,P.；Kelly,B.T.；Griffiths,A.D.Chem.Biol.200512,1291-1300.)，该技术利用“水包油包水”二级微液滴作为酶反应体系，在皮升级的体积中包裹酶、基因、底物及荧光产物，利用流式细胞仪可以根据微液滴的荧光强度而对其中的酶活性进行定量，并快速分选出符合预期性质的突变体，其筛选通量高达108个液滴/天，同时大大降低了筛选的试剂和人力消耗，因此被称为超高通量筛选体系。IVC-FACS技术的关键在于获得适于微液滴实验的底物，该底物经酶催化后的荧光产物必须能够在微液滴中有很好的保留才能够准确反映其中的酶活性。目前，只有Tawfik等人开发的一种基于3-氰基-7-羟基香豆素的底物应用磷酸三酯酶的IVC-FACS筛选(Gupta,R.D.；Goldsmith,M.；Ashani,Y.；Simo,Y.；Mullokandov,G.；Bar,H.；Ben-David,M.；Leader,H.；Margalit,R.；Silman,I.；Sussman,J.L.；Tawfik,D.S.Nat.Chem.Biol.2011,7,120-125)，但该底物的产物3-氰基-7-羟基香豆素在微液滴中仍然扩散很快，使得筛选方法的灵敏度和准确度都受到了极大的影响。这里，我们通过对香豆素进行极性修饰，获得了基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，其酶反应产物具有良好的液滴保留性能，基于该底物的IVC-FACS体系能够快速准确地对磷酸三酯酶进行活性定量和筛选，在磷酸三酯酶定向进化领域有着重要应用潜力。
现有的基于氰基香豆素磷酸三酯酶底物DEPCyC的IVC-FACS体系由于反应产物氰基香豆素(图1，3-cyano-7-hydroxycoumarin，CYHC)疏水性较强，容易快速通过“水包油包水”二级微液滴的油相进入外水相，造成荧光信号快速扩散出微液滴，因而无法准确反映酶活性，进而影响筛选的准确度和效率。
发明内容
本发明旨在提供一种新型的磷酸三酯酶底物，可用于筛选和富集磷酸三酯酶，磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌。
本发明还提供了上述磷酸三酯酶底物的制备方法。
本发明还提供了利用上述磷酸三酯酶底物的磷酸三酯酶高通量筛选方法。
这种磷酸三酯酶底物是7-羟基香豆素-3-酸-磷酸二烷酯，结构如式(I)所示：
其中R1选自C1～C6烷基；A为羧基、羧甲基、羧乙基、羧丙基或羧丁基。
优选的，R1为甲基、乙基、丙基或丁基。
所述磷酸三酯酶荧光底物选自：7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二丁酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧甲酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二丁酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸、7-羟基香豆素-3羧乙酸--磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二丁酯。
上述磷酸三酯酶荧光底物可应用于筛选和富集磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌。
磷酸三酯酶荧光底物的制备方法，步骤为:
(1)将式(II)的7-羟基豆香素-3-酸类化合物及1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯溶解于DMF中，加入苄基溴，搅拌反应10～16小时；
(2)向反应体系中加水过滤，取沉淀干燥后溶解于四氯化碳与四氢呋喃的混合液中；0～4℃下加入三乙胺，再加入式(III)的磷酸二烷酯，搅拌反应2～6小时；
(3)用水和二氯甲烷萃取，分离有机相蒸发浓缩，残留液体经硅胶柱层析，溶解于乙酸乙酯；溶液中加入Pd/C催化剂并加氢还原；过滤取沉淀重结晶。
磷酸二甲酯、磷酸二丙酯、磷酸二丁酯代替磷酸二乙酯，或者用7-羟基香豆素-3-羧甲酸、7-羟基香豆素-3-羧乙酸、7-羟基香豆素-3-磺酸、7-羟基香豆素-3-甲磺酸、7-羟基香豆素-3-乙磺酸代替7-羟基香豆素-3-羧酸进行反应，获得具有荧光性的底物。
用上述底物进行磷酸三酯酶高通量筛选方法，该方法为磷酸三酯酶的体外区室化-荧光激活细胞分选(in vitro compartmentalization based fluorescence-activated cell sorting，IVC-FACS)超高通量筛选技术，包括如下步骤：
(1)制备粒径在9～12μm的水-油-水二级微液，其中油相成分为含有乳化剂的轻石蜡油，并将胞内表达磷酸三酯酶突变体的单细胞包裹在内水相中；
(2)在水-油-水二级微液的外水相中加入上述磷酸三酯酶荧光底物，所述磷酸三酯酶荧光底物在外水相中的含量为0.3～0.8mmol/L；
(3)检测产物荧光反应后的荧光强度，并筛选荧光阳性的群体。
水-油-水二级微液的内水相-油相的粒径为3～5μm。所述的内水相和外水相为pH＝7.3～7.5的磷酸缓冲液，优选为pH＝7.4的磷酸缓冲液。更优选的，外水相中还含有1.5％～2.5％体积比的表面活性剂，例如Triton X-120。
所述水-油-水二级微液的制备方法为：
a.用含有乳化剂的轻石蜡油为油相，含有胞内表达磷酸三酯酶突变体的单细胞、pH＝7.3～7.5的磷酸缓冲液为内水相，乳化挤出获得粒径为3～5μm的内水相-油相；优选的，所述的油相中所含乳化剂的体积比为2.5％～3.2％；
b.步骤a获得的内水相-油相乳液挤出注入外水相，混合获得水-油-水二级微液；所述的外水相为pH＝7.4的磷酸缓冲液。
本发明应用具有较高分子极性的羧基修饰香豆素基团，从而提高底物分子的亲水性，降低其在二级微液滴油相的扩散速度，进而达到提高分子在微液滴中保留性的效果，在此基础上设计并合成新的适用于IVC-FACS筛选的磷酸三酯酶底物；此外，由于底物上带有磷酸二乙酯的疏水功能基团，因此其疏水性增强，能够通过加入外水相而快速扩散进内水相与酶进行反应，由此达到“液滴荧光捕获的效果”，从而极大降低反应的荧光背景干扰，同时能够准确控制不同液滴的反应时间一致，有利于提高酶活性检测的准确性。
其次，在新型底物的基础上开发IVC-FACS体系用于磷酸三酯酶的超高通量筛选，获得高效的筛选系统。
本发明磷酸三酯酶荧光底物的酶催化反应式如下。磷酸三酯酶底物与酶催化水解反应产物之间亲水性不同，底物可以加入外水相中并通透油相进行酶反应；生成的产物由于亲水性提高而保留在液滴中，从而实现“液滴荧光捕获”的效应。
本发明的优点在于：
1、本发明中设计的基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，相比于最接近的基于氰基香豆素的底物，其反应后的荧光产物具有非常好的液滴保留性，在进行酶活性定量与筛选中具有灵敏度高、定量准确的优点；
2、由于本发明中的磷酸三酯酶底物和反应产物之间亲水性的差异，底物可以加入外水相中并通透油相进行酶反应；生成的产物由于亲水性提高而保留在液滴中，从而实现“液滴荧光捕获”的效应，由此带来的荧光背景降低、可以准确地控制反应时间是同类方法无法实现的。
以上优点使得基于本发明底物的IVC-FACS体系更有潜力应用于对磷酸三酯酶进行高效准确的超高通量筛选。
附图说明
图1为本发明新型底物DEPHCCA的液滴荧光捕获效果示意图。
图2为羧基香豆素与氰基香豆素的液滴在孵育不同时间的保留性比较。A，氰基香豆素CYHC；B，羧基香豆素HCCA。A图横坐标单位为秒，B图横坐标单位为分钟。
图3为本发明底物DEPHCCA在液滴中的酶反应。A、B分别表示反应前后的荧光强度变化及分布。
图4为表达GkaP不同突变体的大肠杆菌细胞在液滴中(A)和大体积下(B)对DEPHCCA底物的相对活性，对于不同突变体，在液滴实验和大体积实验的活性趋势基本一致。
图5为现有底物DEPCyC在液滴中的酶反应，A、B分别表示反应前后的荧光强度变化及分布。
具体实施方式
实施例1底物HCCA-二乙基磷酸酯(DEPHCCA)合成
7-羟基香豆素-3-羧酸(7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid,HCCA,compound2,)购自Sigma-Aldrich公司。合成方法如下：
将700mg HCCA(3.4mmol)与568mg DBU(1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯,3.74mmol)溶于20mL DMF(二甲基甲酰胺),室温下缓慢加入635mg苄基溴(3.74mmol)。将混合物室温下搅拌14小时。TLC(EtOAc:PE＝1:1)检测证实反应完全。将反应体系加入100mL水，过滤，沉淀经干燥得700mg化合物3(得率70％)。将700mg化合物3(2.36mmol)溶于30mL四氯化碳与四氢呋喃的1：1混合液中，在0℃缓慢加入358mg的三乙胺(3.55mmol)，再加入391mg化合物4(磷酸二乙酯，2.84mmol)。混合物在室温下搅拌3小时。TLC(EtOAc:PE＝1:1)检测证实反应完全。加入100mL水及100mL二氯甲烷萃取，分离二氯甲烷相蒸发浓缩，残留液体经硅胶柱层析(EtOAc:PE＝1:3to 1:1)获得纯化的化合物5(700mg，产率68.6％)，为无色油状液体。将350mg化合物5(0.81mmol)溶于20mL乙酸乙酯，在溶液中加入50mg Pd/C催化剂，在氢气氛围中搅拌1小时。TLC(EtOAc:PE＝1:1)检测证实反应完全。过滤去除溶剂，沉淀在EtOAc:PE＝1:5的溶剂中重结晶，获得白色固体130mg，即为目标底物(化合物1)，产率46.9％。化合物1的1H-NMR(CDCl3,400MHz)谱为δ:1.42(td,J＝7.08,1.00Hz,6H),4.22-4.38(m,4H),7.34-7.48(m,2H),7.77(d,J＝8.54Hz,1H),8.93(s,1H).质谱测定其分子离子的分子量为[ESI,m/z]343.1[M+1]+，符合预期值，证实目标化合物结构正确。
还可以用磷酸二甲酯、磷酸二丙酯、磷酸二丁酯代替磷酸二乙酯，或者用7-羟基香豆素-3-羧甲酸、7-羟基香豆素-3-羧乙酸代替7-羟基香豆素-3-羧酸进行反应，获得相应的荧光底物。
实施例2GkaP及其突变体的表达
采用GkaP及其突变体26A8，26A8Y，26A8C(Zhang,Y.；An,J.；Ye,W.；Yang,G.；Qian, Z.G.；Chen,H.F.；Cui,L.；Feng,Y.Appl.Environ.Microbiol.2012,78,6647–6655.)进行实验，同样，还可以采用其他来源的GkaP及其突变体。
酶基因构建于pET28a并在宿主E.coli BL21(DE3)Codon Plus中表达。表达条件：在含卡那霉素的LB琼脂平板上梯度划线GkaP菌种，培养长出单菌落；挑取单菌落接种于5mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，25℃，220rpm培养过夜。收获菌体：取1mL培养液5000rpm离心2min，去上清，加入1mLPBS(pH7.4)重悬，再5000rpm离心2min，去上清，用1mL PBS重悬后得细胞悬液，备微液滴中单细胞酶反应用。
实施例3膜挤出法制备水-油-水二级微液滴
用膜挤出仪方法制备微液滴(Ma,F.；Xie,Y.；Huang,C.；Feng,Y.；Yang,G.PLoSOne 2014,9,e89785)，具体如下：
1)水-油一级微液滴制备
采用微型膜挤出仪(Avanti Polar Lipids,AL,USA)，配套的两只注射器(Gastight 1001 syringe，1mL,Hamilton,NV,USA)以及孔径为8微米的Track-Etch聚碳酸酯膜(Millipore,USA)来制备微液滴。首先将膜固定在膜挤出仪中，然后用注射器吸取0.5mL的油相(油相成分为，含有2.9％(v/v)ABIL EM90的轻石蜡油)润洗膜两次。乳化时，将100μL内水相(1×PBS buffer,pH7.4，并含有实施例2所获得的细胞悬液)与400μL油相吸取到同一支注射器中，混合体系经膜挤出仪推注到另一个注射器中，然后再推回到第一个注射器中，这一过程称为一次乳化。生成的w/o一级微液滴通过显微镜(50i,Nikon,Japan,40×object)实时观察，通过优化乳化次数，使微液滴的直径分布在3～5μm。制备的微液滴冰上放置。
2)水-油-水二级微液滴制备
将上一步生成的一级微液滴通过8-μm孔径的膜分散到次水相(1×PBS buffer,pH7.4含1％(v/v)TritonX-102)中，从而生成w/o/w二级微液滴。具体步骤为：将一片新的膜置于膜挤出仪中，用0.5mL次水相润洗两遍。将200μL的一级乳液和400μL的次水相分别吸取到两支注射器中，首先，将一级乳液通过膜挤出仪注入第二支注射器的次水相中，再通过膜挤出仪将混合体系推回原注射器中，完成一次乳化。生成的二级微液滴的形态分布通过显微镜进行实时观察，通过优化乳化次数，使得最终二级微液滴的直径在10μm左右且大小相对均一。生成的二级微液滴置于冰上保存。
也可以使用其他方法制备得到直径在10μm左右且大小相对均一的水-油-水(w-o-w)二级微液滴，如可以利用匀浆仪乳化的方法制备二级微液滴(Aharoni A,Amitai G,Bernath K,Magdassi S,Tawfik DS.Chem Biol 2005,12:1281–1289.)，或使用微流控设备制备高度均一的二级微液滴(Zinchenko A,Devenish SR,Kintses B,Colin PY,Fischlechner M,Hollfelder F.Anal Chem 2014 Mar 4；86(5):2526-2533)。
实施例4液滴中荧光分子保留研究
用含荧光分子HCCA或CYHC的PBS溶液(pH7.4)作为内水相分别制备水-油-水二级微液滴。将两种微液滴分别用外水相稀释100倍后室温放置(模拟IVC-FACS分选时的微液滴状态)，间隔一定时间取样进行流式细胞仪荧光强度测定。
将羧基香豆素HCCA与氰基香豆素CYHC(DEPCyC的荧光产物，购自Sigma-Aldrich)的液滴保留性做比较。我们将两种化合物的溶液(100μM，溶于PBS)作为内水相分别制备w/o/w二级微液滴，用外水相稀释100倍后室温孵育不同时间进行流式细胞仪荧光强度分析。如图2，发现CYHC(A)在液滴中扩散十分迅速，60s之内便有一半的荧光泄露；而相比之下，HCCA(B)在液滴中保留性大大提高，放置30min后仍有80％以上的荧光。实验结果表明，相比于CYHC，HCCA大大提高了在微液滴中的保留。因此，基于羧基香豆素的底物更能准确反映微液滴中的酶活性，更适合于IVC-FACS实验。
实施例5
1、水-油-水二级微液滴中单细胞酶反应
将胞内表达GkaP突变体的单细胞包裹于微液滴的内水相中，在外水相中分别加入两种底物，使终浓度为0.5mM。37℃金属浴500rpm震荡反应15min，冰浴终止反应。将反应体系用外水相稀释100倍后进行流式细胞仪(BD FACS AriaII)分析。HCCA及CYHC的荧光强度用DAPI通道(激发375nm，发射450/40nm)检测。
2、GkaP/26A8模式分选
模式分选前，将表达GkaP/26A8的细胞与含有pET28a空质粒的细胞按1:10、1:100、1:1000的比例混合，然后分别将细胞混合液作为内水相制备微液滴，加入DEPHCCA底物反应后在流式细胞仪上进行检测并分选出其中高荧光强度的微液滴。分选出的细胞在涂布琼脂平板，培养后挑取单菌落直接在96孔板中进行活性验证(底物仍为DEPHCCA)，通过荧光强度变化能够方便地分辨出GkaP/26A8细胞与失活突变体细胞。通过对比分选前后的阳性比例计算富集效率。
实施例6基于底物DEPHCCA的IVC-FACS在磷酸三酯酶的超高通量筛选中的应用
液滴荧光捕获效果示意图如图1所示。进一步，我们考察了基于HCCA的底物(化合物1，DEPHCCA)在微液滴中的酶反应性质。按实施例3的方法将胞内表达GkaP/26A8的大肠杆菌单细胞包裹到w/o/w二级微液滴中，在外水相中加入底物DEPHCCA(终浓度0.5mM)，37℃反应后进行流式细胞仪分析。结果如图3，A、B分别为DEPHCCA在液滴中反应前后的荧光强度变化及分布。相比于反应前，反应后的荧光强度明显提高。且反应后根据产物荧光强度，所有微液滴可以明显分为两群，其中荧光强度较高的群体(P2)应该是包裹GkaP/26A8细胞的群体，由于酶反应使得产物在微液滴中积聚从而使荧光信号明显高于不含细胞的群体(P2以外群体)。
在IVC-FACS实验中，除了要求产物分子有较好的微液滴保留性外，更重要的是酶在微液滴中的表观活性能够真实反应其实际活性，这样才能够有效地进行阳性个体的分选。为此我们采用表达GkaP三种不同活性突变体(26A8，26A8Y,26A8C)的大肠杆菌细胞作为模式，通过研究三种细胞分别在大体积和微液滴中的活性差别来考察DEPHCCA的有效性。图4A为三种细胞在微液滴中的反应进程曲线，每一条曲线的斜率都代表了相应细胞在微液滴中的反应速率，三者归一化之后的反应速率为：26A8:26A8C:26A8Y＝100:74:55，与大体积下的活性(图4B，26A8:26A8C:26A8Y＝100:78:47)比基本吻合。结果证实，对于不同突变体，在液滴实验和大体积实验的活性趋势基本一致；由此可以推断，DEPHCCA作为磷酸三酯酶的底物，能够准确地反映微液滴中的单细胞酶活性。
为进一步考察DEPHCCA在磷酸三酯酶突变库筛选中的应用潜力，我们将少量表达GkaP/26A8的细胞与表达失活突变体的细胞按不同比例混合制成模拟突变库，包裹成液滴并反应后用流式细胞仪筛选荧光阳性的群体并进行复苏，鉴定出富集后的阳性比例，与分选前进行比较，如表1。
表1.采用基于DEPHCCA底物的IVC-FACS体系从大量背景细胞中富集少量活性细胞(表达GkaP/26A8酶)的效果。
可以看出，即使在阳性比仅为千分之一的情况下，阳性细胞仍然能够被很好富集，效率高达903倍，该比例高于目前报道的同类筛选体系的富集效率(Aharoni,A.；Amitai, G.；Bernath,K.；Magdassi,S.；awfik,D.S.Chem.Biol.2005,12,1281- 1289.Mastrobattista,E.；Taly V.；Chanudet,E.；Treacy,P.；Kelly,B.T.；Griffiths, A.D.Chem.Biol.2005 12,1291-1300.Prodanovic,R.；Ostafe,R.；Blanusa,M.； Schwaneberg,U.Anal.Bioanal.Chem.2012,404,1439-447.Ma,F.；Xie,Y.；Huang,C.；Feng, Y.；Yang,G.PLoS One 2014,9,e89785.)，进一步证实了基于DEPHCCA底物的IVC-FACS体系在磷酸三酯酶超高通量筛选的应用潜力。
对照例
为说明本发明底物在液滴高通量体系中的优势，我们也在液滴反应器中测试了A基团上用氰基取代的DEPCyC底物的表现。按实施例3的方法将胞内表达GkaP/26A8的大肠杆菌单细胞包裹到w/o/w二级微液滴中，在外水相中加入底物DEPCyC(终浓度0.5mM)，37℃反应后进行流式细胞仪分析。结果如图5，A、B分别为DEPCyC在液滴中反应前后的荧光强度变化及分布。反应后液滴整体的荧光也明显提高，然而相比于图3所示的本发明底物，反应后含细胞液滴与空液滴并无明显荧光分群，这可能由于产物氰基香豆素在微液滴中扩散太快，导致含细胞液滴的荧光强度降低而空液滴荧光增强，从而造成了不同液滴之间的荧光信号干扰，不利于准确定量和分选。该对比进一步说明了本发明底物显著提高了原有底物在微液滴中进行酶反应的性能，即能够提供更加准确可靠的酶活性定量，从而可以大大提高分选的效率。
Claims (10)
1.一种磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，结构如式(I)所示，
其中R1选自C1～C6烷基；A为羧基。
2.权利要求1所述磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，R1为甲基、乙基、丙基或丁基。
3.权利要求1所述磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，所述的磷酸三酯酶荧光底物选自：7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二丁酯。
4.权利要求1～3任一项所述磷酸三酯酶荧光底物在筛选和富集磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌方面的应用。
5.权利要求1～3所述磷酸三酯酶荧光底物的制备方法，其特征在于，步骤为，
(1)将式(II)的7-羟基香豆素-3-酸类化合物及1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯溶解于DMF中，加入苄基溴，搅拌反应10～16小时；
(2)向反应体系中加水过滤，取沉淀干燥后溶解于四氯化碳与四氢呋喃的混合液中；0～4℃下加入三乙胺，再加入式(III)的磷酸二烷酯，搅拌反应2～6小时；R1选自C1～C6烷基；A为羧基；
(3)用水和二氯甲烷萃取，分离有机相蒸发浓缩，残留液体经硅胶柱层析，溶解于乙酸乙酯；溶液中加入Pd/C催化剂并加氢还原；过滤取沉淀重结晶。
6.一种磷酸三酯酶高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备粒径在9～12μm的水-油-水二级微液，结构为内水相、油相和外水相；其中油相成分为含有乳化剂的轻石蜡油，并将胞内表达磷酸三酯酶突变体的单细胞包裹在内水相中；
(2)在水-油-水二级微液的外水相中加入权利要求1～3任一项所述磷酸三酯酶荧光底物，所述磷酸三酯酶荧光底物在外水相中的含量为0.3～0.8mmol/L；
(3)检测产物荧光反应后的荧光强度，并筛选荧光阳性的群体。
7.权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述水-油-水二级微液的制备方法为：
a.用含有乳化剂的轻石蜡油为油相，含有胞内表达磷酸三酯酶突变体的单细胞、pH＝7.3～7.5的磷酸缓冲液为内水相，乳化挤出获得粒径为3～5μm的内水相-油相；
b.步骤a获得的内水相-油相乳液挤出注入外水相，混合获得水-油-水二级微液；所述的外水相为pH＝7.3～7.5的磷酸缓冲液。
8.权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于，所述的油相中所含乳化剂的体积比为2.5％～3.2％。
9.权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于，所述的内水相和外水相为pH＝7.4的磷酸缓冲液。
10.权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于，所述的外水相中还含有1.5％～2.5％体积比的表面活性剂。
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