CN102735831B - 截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16用作肝细胞癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血清中甲胎蛋白来确诊HCC，其敏感性、特异性及准确性均不理想。本发明拟在寻找在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质。本发明提供了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16可用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物，本发明还提供了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明寻找到了新的在肝细胞癌中高表达的蛋白质，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的途径。

Description

截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16用作肝细胞癌标志物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16作为肝细胞癌标志物，在制备检测肝细胞癌的试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是严重威胁人类生命健康的疾病。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。我国是肝癌高发国家，每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌严重危害我国人民生命财产安全，并且是影响社会经济发展的一个重要因素。

肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)来确诊HCC，其敏感性、特异性及准确性均不理想，尤其对肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者，其敏感性及阳性率更低，仅分别为33％～65％和9.1％～26％(AFP>20ug／L)。近年来已有20余种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。

因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和／或蛋白质具有重要意义，寻找新的在肝细胞癌中高表达的基因和／或蛋白质也具有迫切需要性。而且，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，分离和鉴定新的肝癌相关基因是肝癌基础研究中的前沿课题。

截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16（truncated retinoic acid induced protein 16）的NCBI登录号为AAQ06676.1，Swissprot登录号为Q86V87，IPI号为IPI00654780.2。截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16是维甲酸诱导产生的蛋白分子，其结构与功能目前尚未清楚。截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16最初是在维甲酸诱导细胞分化时分离出来的，而维甲酸具有抑制细胞增殖、促进细胞调亡和促进细胞分化的作用，已被应用于急性淋巴细胞白血病、肺癌及肝癌等多种癌症的治疗（Okuno M,Kojima S,Matsushima-Nishiwaki R,Tsurumi H,Muto Y，Friedman SL,Moriwaki H.Retinoids in cancer chemoprevention.Curr Cancer DrugTargets.2004;4:285-98）。

因此，截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16很可能也参与一系列生理过程，在细胞增殖、分化、以及细胞凋亡等方面发挥重要作用。

现有研究中，仅由Wang等发现全长型维甲酸诱导蛋白RAI16在肝细胞再生中发挥重要作用（Wang G，Deng J,Yang J,Zheng JJ,Wang HZ,Hu Q,ZhangZM,Chen C,Wang D,Li ZP.Analysis on the protein structure and function ofretinoic acid induced 16.World J Gastroenterol.2007;15:1342-1346）。此外，未发现其他关于截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16参与细胞功能，特别是癌症、肝细胞癌的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的新用途。

本发明通过免疫印迹实验，发现截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中下调表达)。

本发明通过免疫组织化学实验，验证了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中下调表达)。

本发明通过肝细胞癌组织芯片，对62对人肝细胞癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验，进一步证实了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在人类肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中下调表达)。

基于截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16与肝细胞癌的这种相关性，本发明人认为tRAI16可以作为一种检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物，通过对它的表达量进行定性或定量检测，用于检测肝细胞癌。

本发明的第一方面，提供了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物的用途。

本发明第二方面，还提供了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

所述的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其中的肿瘤具体指肝细胞癌。

所述的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，是以常规方法制备抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，建立检测截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。

所述的以常规方法制备抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，常规方法可以是指用外源表达的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16或化学合成的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16多肽作为抗原免疫实验动物制备的抗体（参见《抗体制备与使用实验指南》，科学出版社，2010年）。

所述的抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。

所述的检测截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒，具体是体外检测肝组织中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达是否异常。

体外检测肝组织中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达是否异常，首先是检测待测肝组织中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达量，其次是与正常肝组织中的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达量进行比较，最后判断这种蛋白质分子标记物在待测肝细胞组织中是否均存在下调表达。

所述的试剂或试剂盒，可以是酶联免疫ELISA试剂盒、化学发光法试剂盒、固态或液态芯片试剂盒，或者根据抗体包被检测抗原的方法制备的其他试剂盒。

本发明第三方面，还提供了截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在筛选抗肿瘤药物中的应用。

所述的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在筛选抗肿瘤药物中的应用，具体是指将待选药物用于肝癌细胞，检测截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达量是否回升。

鉴于到目前为止，尚无有关截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16与肝细胞癌的任何相关性报道。

因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和／或治疗提供一条全新的途径。

附图说明

图1为肝细胞癌患者肝组织样本中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的免疫印迹检测结果，其中，P1-P18为肝细胞癌患者编号，T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织。

图2为肝细胞癌患者肝组织样本中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的免疫组织化学实验结果，其中，T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织，物镜放大倍数为20倍。

图3为肝细胞癌组织芯片中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的免疫组织化学实验结果，其中，A为高分化肝细胞癌，B为中分化肝细胞癌，C为低分化肝细胞癌；T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织，物镜放大倍数为10倍。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。

在本发明的下述实施例中，使用的溶液配方如下：

1、裂解液：50mM Tris-盐酸,150mM氯化钠,1%NP-40,1mM正矾酸钠,1mM氟化钠,2.5mM焦磷酸钠，1mM EDTA,pH 7.4。

2、PBS:150mM氯化钠，10mM氯化钾，8mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾，pH 7.4。

3、TBST:50mM Tris-盐酸,150mM氯化钠，10mM氯化钾，0.5%Tween-20,pH 7.4。

实施例1、肝细胞癌的癌组织和癌旁组织蛋白样品的制备

从东方肝胆外科医院获取18例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织。该18例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，未经化学药物和放射性治疗。18例患者的病理资料如表l所示。手术切除的新鲜组织块立即置于冰上，用预冷的PBS冲洗3次，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，而后置于细胞裂解液中，4°C裂解30分钟；在冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪间歇超声破碎2分钟后，4°C 13000g离心15分钟，取上清采用改良Bredford法进行总蛋白定量。

表1、18例肝细胞癌患者的病理资料

实施例2、截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌的肝组织样品中的免疫印迹分析

使用抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16抗体（购自Sigma公司）对上述18对肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫印迹分析，过程如下：每个样品取50ug蛋白质样品用10％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自Bio-Rad公司)上一抗使用兔抗人截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16多克隆抗体(购自Sigma公司，1:2000稀释)，40C孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次10分钟；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(购自KPL公司，1:10000稀释)，室温孵育l小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟；加入ECL plus试剂(购自Pierce公司)反应1分钟后，以Gene Gnome HR成像系统(Syngene公司)检测。检测结果如图l所示，以GAPDH为内参照，对免疫印迹结果图采用定量分析软件Gene tools(Syngene公司)进行数据分析，得出蛋白质表达量的相对比值（见免疫印迹条带下所列数值）。

图l结果显示，肝细胞癌组织中截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的杂交条带的浓度都明显低于相应的癌旁组织。定量分析结果显示，在肝细胞癌组织中的表达量明显低于相应的癌旁组织组织，其平均比值为0.331，P值(配对t检验)为0.00823。根据图l和定量分析的结果，截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌组织存在下调表达。

实施例3、截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌的肝组织样品中的免疫组织化学分析

为确认截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌组织和癌旁组织之间的表达差异，对上述18例肝细胞癌患者的肝癌组织切片，进行免疫组织化学分析。免疫组织化学研究的实验过程如下：将组织切片置于60°C恒温箱烘烤约3个小时，取出后依次使用二甲苯、二甲苯／乙醇(1∶1)、100％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇和水，进行脱蜡水化处理；PBS洗3次，每次5分钟：0.3％H₂O₂(甲醇稀释)浸泡半小时，PBS洗3次，每次5分钟；高压修复抗原，双蒸水洗2次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；含10％山羊血清的PBS室温封闭20分钟；加入兔抗人截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16多克隆抗体(购自Sigma公司，1:200稀释)，4℃过夜，PBS洗3次，每次5分钟；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(购自KPL公司，1:1000稀释)，室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；二氨基联苯胺（DAB）(购自Sigma公司)显色；苏木精-伊红(购自Sigma公司)染色20秒；组织切片依次使用：50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯／乙醇(1∶1)、二甲苯，进行脱水透明处理。然后使用中性树脂封片，于显微镜观察。

实验结果如图2所示，截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在癌旁组织中呈现阳性（主要分布于肝癌细胞胞浆中），在对应的肝癌组织中称弱阳性或阴性。

实施例4、截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌组织芯片中的免疫组织化学分析

为进一步证实截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌组织和癌旁组织之间的表达差异，随机选取62对肝癌的癌组织和对应的癌旁组织样本，使用两张肝癌组织芯片(分别为HLiv-HCC060PG-01肝癌组织芯片和OD-CT-DgLiv03-003肝癌组织芯片，均购自上海芯超生物科技有限公司，进行免疫组织化学研究。其中，选取的样本的具体资料分别如表2和表3所示。免疫组织化学研究的实验过程如实施例3中描述，结果如图3所示。

根据染色强度和阳性率对组织芯片进行打分评估，染色强度打分标准为：阴性为0分、弱阳性为1分、中等阳性为2分、强阳性为3分；阳性率打分标准为：低于5％为0分，5％-30％为1分，31％-60％为2分，60％以上为3分。将染色强度的得分与阳性率的得分相加，获得组织切片的综合得分，得分情况分别如表2、表3所示。

表2、HLiv-HCC060PG-01肝癌组织芯片资料及打分结果

表3、OD—CT—DgLiv03—003肝癌组织芯片资料及打分结果

根据表2、表3的结果：肝细胞癌组织的平均综合得分为3.30，癌旁组织的平均综合得分为5.24，两者具有极显著差异，P值为0.00261。统计发现，在超过78.4％(48对)的样本对中，截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌中显著下调表达。该结果与前述免疫印迹和免疫组织化学结果相一致。

综上所述，截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，包括各种抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的表达量，因而可以用于检测肝细胞癌，或者用于制备检测肝细胞癌的试剂或试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

有关截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将它作为检测肝细胞癌的标记物却是肯定的。截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16可作为肝细胞癌的蛋白质分子标志物，用于制备检测肝细胞癌的试剂或试剂盒，进一步地用于制备诊断肿癌的试剂或试剂盒。而且它在胞内的生物学功能提示截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (3)

1.截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肝细胞癌临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肝细胞癌临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，是以常规方法制备抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，建立检测截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16在制备肝细胞癌临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗截短型维甲酸诱导蛋白tRAI16的抗体，是单克隆抗体或多克隆抗体。