CN102368069A - 对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种临床诊断用的体外检测试剂,具体的说是一种对人体内代谢异常的判定试剂——对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂及其制备方法。该尿液检测试剂是将Hg2 +、Hg2+、Ni2+、Cd2+分别溶解于相应的酸溶液中,然后按比例混合后制得的。所述的硫酸汞作为Hg2+的供体溶解于硫酸溶液中,硝酸亚汞作为Hg2 +的供体溶解于硝酸溶液中,硫酸镍作为Ni2+的供体溶解于蒸馏水中,硫酸镉作为Cd2+的供体溶解于硝酸溶液中。本发明克服了现有技术的缺陷和不足,是一种新配方的代谢异常快速尿检试剂,具有高的稳定性、灵敏度和广泛的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种临床诊断用的体外检测试剂,具体的说是一种对人体内代谢异常的判定试剂——对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 由体内细胞代谢异常而引发的如恶性肿瘤及糖尿病等重大代谢疾病越来越受到人们的普遍关注,治疗由体内代谢异常引起的疾病的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。目前,由此引起的疾病诊断方法主要有物理学、组织细胞学和生物化学三大类。对于肿瘤类疾病,物理学和组织细胞学往往只能发现中晚期,难以达到早期发现的目的,且大多数操作复杂,费用昂贵。
代谢类疾病如:恶性肿瘤等的早期诊断是二级预防中最关键的一步,只有在早期诊断的基础上才能进行早期治疗,降低死亡率,提高生存率。无症状人群的普查筛查又是早期诊断的主要手段之一。尿中肿瘤标志物的检测是目前研究的热点之一。尿中肿瘤标志物主要分两大类:一类是特异性蛋白质,如本一周氏蛋白、硫酸酯酶等;另一类则是肿瘤代谢产物,如核酸代谢产物多胺、氨基酸代谢产物5-羟吲哚乙酸、对羟基苯丙铜酸等。对后者的检测方法很多,其中包括含汞试剂,最近的相关技术专利为欧洲专利EP341803和中国专利《癌症显示剂》CN1096374A(申请号93106885.1),它们分别提出了较为实用的含汞尿检试剂配方,其共同点是均采用了两种汞离子Hg2 +和Hg2+,将二者按一定比例溶解在酸性溶液中,即得专利所述试剂。该试剂中的两种汞离子分别与尿中的不同成分反应,Hg2 +与底物对羟基苯丙铜酸反应生成红色沉淀,Hg2+与其他阴离子反应(如CL-、NO2 -等)生成白色沉淀。中国专利CN1096374提出加入金属镍,用以稳定反应产生的红色沉淀。上述现有技术所提供的试剂在应用中有一定效果,特异性、灵敏度较高,但仍有不足之处,中国专利CN1096374所提供的试剂,其假阳性率偏高,大于10%,不适用于肿瘤的普查筛检,EP341803的标本检测数较少,因而统计学结果可靠性不强。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷和不足,提出一种新配方的代谢异常快速尿检试剂——对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂,同时引入新组分,以提高试剂的稳定性、灵敏度及应用范围。本发明还提供了上述尿液检测试剂的制备方法。
本发明的目的是这样实现的,该尿液检测试剂是将Hg2 +、Hg2+、Ni2+、Cd2+分别溶解于相应的酸溶液中,然后按比例混合后制得的。
所述的硫酸汞作为Hg2+的供体溶解于硫酸溶液中,硝酸亚汞作为Hg2 +的供体溶解于硝酸溶液中,硫酸镍作为Ni2+的供体溶解于蒸馏水中,硫酸镉作为Cd2+的供体溶解于硝酸溶液中。
该尿液检测试剂的制备方法包括以下步骤:
①、A液配制:将18g 硫酸汞加入到6mol浓度的硫酸溶液中搅拌溶解后,再用6个mol浓度的硫酸溶液稀释至100ml得到无色透明的液体待用;
②、B液配制:将65g 硝酸亚汞加入到12mol浓度的硝酸溶液中,溶解后用12mol硝酸溶液稀释至100ml,得到绿色液体,放置待溶液绿色褪去后,方可使用;
③、C液配制:将硫酸镍 3g溶解到蒸馏水中,然后用蒸馏水稀释至100ml,得到蓝绿色液体,待用;
④、D液配制:将硫酸镉2g溶解于的6mol浓度的硝酸溶液中,溶解后用6mol硝酸溶液稀释至100ml,得到D液待用;
⑤、混合:将上述①、②、③、④中制得的A、B、C、D、四种液体按体积比1~1.5: 1.2~1.8: 0.2~0.4: 0.05~01进行混合后,即得到目标产品对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂。
本发明依据的理论基础是:
尿液是人体不断产生、不断排泄的代谢产物,在全身各个组织与部分细胞代谢过程中,代谢产物就汇溶在尿液中形成了一个复杂的含多种有机物及有机化学成分的混合物, 尿液中成分与含量可以准确的反映体内各器官的生理功能和状态,特别是当体内肿瘤因子活动时,体内相对部分的分子量为4000~6000的蛋白代谢异常使尿液中的硫脲、硫乙醇胺、酪氨酸色氨酸等多种有机物量与含毒激素明显增加,这种情况下,尿液与对羟基苯丙氨酸检测试剂汇合发生桃红色反应,这种明显的颜色反应就是本试剂完成代谢异常尿检的理论基础。
本发明具有以下优点和积极效果:
1、本公司研制的“对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂“具有取样容易、操作简单、反应快速、结果明显等特点,其原理是利用重大代谢类疾病,都会引起人体的应激反应,这些应激反应导致人体内的氨基酸代谢异常,使得人体尿液中酪氨酸的含量远远超过正常人,本试剂通过与尿液中的酪氨酸发生特征显色反应,通过沉淀物颜色的变化即可判定被测试者体内是否有相关的细胞异常代谢,可做为细胞内代谢异常类疾病筛查的辅助诊断指标。
2、本发明对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂是硝酸和硫酸的混合性溶液,其中含有硝酸亚汞和硫酸汞,硝酸亚汞作为Hg2 +的供体溶解于硝酸溶液中,硫酸汞作为Hg2+的供体溶解于硫酸溶液中,它还含有硫酸镍,作为Ni2+供体,另外还含有硫酸镉它们分别溶解于硝酸溶液中作为组分,Hg2+、Hg2 +、Ni2+、Cd2+。
3、本发明将Hg2+、Hg2 +、Ni2+、Cd2+分别溶解于相应的酸溶液中,然后按一定比例混合得到一种新的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂,该试剂能与尿中色氨酸、酪氨酸的衍生物及含有此类氨基酸残基的变性蛋白发生具特异性颜色的沉淀反应,尿中这些氨基酸及其衍生物的代谢量随恶性肿瘤的有无及病情变化而不同。因此沉淀反应呈现不同颜色,颜色判断标准为根据大量试验资料制成的比色板。
4、本发明试剂中的Hg2 +可与单羟基酚发生红色络合沉淀反应,Hg2+、Ni2+则优先与尿液中其他阴离子(如卤素离子、亚硝酸根离子)反应生成白色络合物沉淀,从而消除了这些离子对Hg2 +的影响。
5、本发明与现有技术相比较新加入组分硫酸镉的作用主要是:1、与色氨酸的代谢产物5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸发生反应而生成红色;2、与上述金属离子络合,以稳定试剂体系,这是因为Hg2+、Hg2 +易水解,或随温度高低变化而使二者水解或加快氧化还原反应速度而使二者比例发生变化,影响试剂反应灵敏度。加入硫酸镉这一新组份后即可起到稳定上述体系的作用。
6、本发明试剂中硫酸镍作为Ni2+的供体,从而克服了CN1096374专利中将金属镍溶解于硝酸中带来的缺陷,因为金属镍与硝酸反应产生大量二氧化氮气体和氢气,对操作人员极为有害,且不安全,而利用硫酸镍则可消除对操作人员的不良影响。
7、 本发明对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂能够使体内代谢异常者在普检中简便快速准确的反映出来,通过这种检测试剂进行简单的标本试验将体内代谢异常者准确的判断出进行早期发现、早期治疗。
8、 本发明对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂具有取样容易、操作简单、反应快速、结果明显等特点,对人体无创伤、无痛苦,而且价格低,可以用于大规模肿瘤代谢异常等普查,真正做到早检查、早预防、早诊断、早治疗。
针对本发明产品的有关临床研究的具体情况报告如下:
1、资料和方法
1.1实验对象(共分五组)
一组:恶性肿瘤组:7106例,年龄30—80岁,男女各半,经影象学如B超、X线、CT等查到肿物,又经病理诊断所证实,确诊为癌症的病例,有肝癌、胃癌、结直肠癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽喉、膀胱癌、其他恶性肿瘤,采取新鲜尿样检测(最好是早晨首次尿液)
二组:正常健康人群组:6718例,年龄20—60岁,男女各半,健康体检者。
三组:非肿瘤的良性疾病患者组:6813例,年龄20—80岁,男女各半,患者均来自国内7家医院提供的门诊和住院的良性病人。
四组:自2003年开始我们在住院及门诊患者中筛选了158例尿酪氨酸高值者进行了为期三年的跟踪检测研究,采取新鲜尿液检测。检出结果与后期以各种手段检查(诊断肿瘤的金标准包括病理学、手术发现、影象诊断)预示出癌症的病例数的比较。
五组:用该试剂观察了各种恶性肿瘤部分病例的动态变化,即治疗前与治疗(手术治疗、化疗、放疗)后的比较。
1、2实验方法:
前期已通过实验室研究确定了尿中酪氨酸的正常值判断标准(见表1)。使用吉林生物研究院有限公司研制的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂:将新鲜清洁尿样5ml加入装有0.6ml试剂的安瓿中,稍振荡后静置5分钟,将沉淀物颜色与标准色板对照以判定结果。结果判定:包装盒内有标准比色板,即浅黄色为阴性;浅红色为弱阳性;红色为阳性;砖红色为强阳性。
表1:尿中酪氨酸的正常值判断标准
2、结果
2、1恶性肿瘤患者、正常健康人群及非肿瘤的良性疾病患者尿液检测阳性试验情况分析(见表2)。
表2 各组尿液检测含量比较
我们知道寻找一个能可靠鉴别肿瘤良恶性性质的指标,必须具备瘤谱和瘤种的广泛性并有足够高的灵敏度(恶性肿瘤的阳性检出率)和特异性(正常/良疾病的阴性检出率)才能达到正确鉴别良恶性的目的,以上结果可见,国内7家医院提供的7106例癌症患者检测灵敏度为99.09%;13531例非恶性肿瘤(健康组和非肿瘤良性疾病组)的特异性为98.18%;恶性肿瘤组患者尿中酪氨酸水平显著高于正常健康组和非肿瘤良性疾病组,经统计学分析有显著差异(x2值分别为13487.51和12774.71,P<0.01),说明尿中酪氨酸含量测定是良恶性肿瘤鉴别的可靠指标。以上资料的癌谱和癌种的情况见表3,表明该试剂具备瘤谱和瘤种的广泛性。
表3国内7家医院开展对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂试验
2、2为了进一步明确该试剂的检测效果,自2003年开始我们在住院及门诊患者中筛选了158例尿酪氨酸高值者进行了跟踪检测研究。后经各种检测手段现已确珍的癌症病例为142例(肺癌38例,胃癌16例,直肠癌18例,肝癌9例,乳癌45例,非何杰金氏淋巴瘤11例,骨肉瘤5例),早期诊断的符合率已达(90%),进一步说明该指标是癌症早期的敏感指标。
2、3用该试剂观察了各种恶性肿瘤部分病例的动态变化,即治疗前与治疗(手术、化疗、放疗)后的尿液中酪氨酸检测的比较(见表4)
表4 各种恶性肿瘤治疗前后尿中酪氨酸的比较
以上结果表明,该试剂的尿液检测也可在恶性肿瘤治疗(手术、放疗、化疗)过程中,作为疗效观察的客观指标,尿中酪氨酸含量测定与其他肿瘤标志物一样,其值随病情变化而升降,临床研究中癌症病人治疗前后尿中酪氨酸含量变化显著,经过有效治疗后,患者尿中酪氨酸含量明显下降,甚至降至正常水平,在临床实践中也有个别报道,尤其在复发或转移的病人中尿中酪氨酸含量有再次升高的现象。因此尿中酪氨酸含量的动态变化提示我们对癌症患者的疗效观察及预后有重要意义。
此外在临床研究中非肿瘤病人也有个别酪氨酸升高现象,即弱阳性反应平均仅在3.35%,主要存在糖尿病、骨折等急性损伤的患者中,多为一过性的升高,但经治疗或自然康复后会随之下降,通过短期跟踪检测,即可排除假阳性的干扰。据此我们认为该试剂除对恶性肿瘤的早期诊断外也可做为某些代谢异常类疾病辅助诊断如糖尿病、痛风病、骨质疏松等疾病的早期诊断指标。某些药物、肾脏病或黄疸尿、血尿和服用大量水杨酸类药物者,易检出假阳性,本试剂对含有单羟酚类化合物敏感,有干扰现象产生假阳性,干扰物最低浓度5 mg/ml,因此,有患者服用含这类化合物的药物或者尿中含有这类化合物的患者检验时应格外注意。
综上所述,该试剂不论从广谱性,灵敏度,特异性,准确性或简便性来说均有较好的性能。使该检测满足广谱筛查的需求。与目前常用的肿瘤标志物相比,其广谱性、灵敏度更高。癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)属于血清肿瘤标志的胚胎抗原。AFP是诊断肝癌的常用指标,阳性率在60—70%;CEA除消化道癌见升高外,还可见于胰腺癌、乳癌、及某些非癌患者,其阳性率在14—65%,早期检出率很低7—20%,诊断意义不大,多用于预后和随访,不宜做良恶性肿瘤鉴别。AFP 和CEA的共同特点是都具有相对的瘤谱,对定位诊断有一定帮助。而“对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂”是一种安全可靠的体外检测癌症可疑患者的高科技的新型产品。可早期发现、早期诊断、早期治疗及观察各种肿瘤的动态变化及疗效,还可推广到代谢异常类疾病的筛查辅助诊断指标,经过大量的临床检测和专家鉴定该试剂值得临床大面积推广,在恶性肿瘤及其他代谢异常疾病的诊断、预后,治疗过程中发挥重要作用。对于各类医院的临床检测和大范围人群进行健康普查工作具有重要意义。
具体实施方式
实施例1
①、A液配制:将18g 硫酸汞加入到6mol浓度的硫酸溶液中搅拌溶解后,再用6个mol浓度的硫酸溶液稀释至100ml得到无色透明的液体待用;
②、B液配制:将65g 硝酸亚汞加入到12mol浓度的硝酸溶液中,溶解后用12mol硝酸溶液稀释至100ml,得到绿色液体,放置待溶液绿色褪去后,方可使用;
③、C液配制:将硫酸镍 3g溶解到蒸馏水中,然后用蒸馏水稀释至100ml,得到蓝绿色液体,待用;
④、D液配制:将硫酸镉2g溶解于的6mol浓度得硝酸溶液中,溶解后用6mol硝酸溶液稀释至100ml,得到D液待用;
⑤、混合:将上述①、②、③、④中制得的A、B、C、D、四种液体按体积比10ml: 12ml: 2ml: 0.5ml放置于器皿中进行混合后,即得到目标产品对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂。
实施例2
A、B、C、D、四种液体的制备同实施例1,将A、B、C、D、四种液体按体积比12ml: 15ml: 3ml: 0.7ml放置于器皿中进行混合后,即得到目标产品。
实施例3、
A、B、C、D、四种液体的制备同实施例1,将A、B、C、D、四种液体按体积比15ml: 18ml: 4ml: 1ml放置于器皿中进行混合后,即得到目标产品。
实际生产中按上述实施方式的比例进行扩大即可。
Claims (3)
1.一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂,其特征在于:该尿液检测试剂是将Hg2 +、Hg2+、Ni2+、Cd2+分别溶解于相应的酸溶液中,然后按比例混合后制得的。
2.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂,其特征在于:所述的硫酸汞作为Hg2+的供体溶解于硫酸溶液中,硝酸亚汞作为Hg2 +的供体溶解于硝酸溶液中,硫酸镍作为Ni2+的供体溶解于蒸馏水中,硫酸镉作为Cd2+的供体溶解于硝酸溶液中。
3.一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂的制备方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
①、A液配制:将18g 硫酸汞加入到6mol浓度的硫酸溶液中搅拌溶解后,再用6个mol浓度的硫酸溶液稀释至100ml得到无色透明的液体待用;
②、B液配制:将65g 硝酸亚汞加入到12mol浓度的硝酸溶液中,溶解后用12mol硝酸溶液稀释至100ml,得到绿色液体,放置待溶液绿色褪去后,方可使用;
③、C液配制:将硫酸镍 3g溶解到蒸馏水中,然后用蒸馏水稀释至100ml,得到蓝绿色液体,待用;
④、D液配制:将硫酸镉2g溶解于的6mol浓度得硝酸溶液中,溶解后用6mol浓度硝酸溶液稀释至100ml,得到D液待用;
⑤、混合:将上述①、②、③、④中制得的A、B、C、D、四种液体按体积比1~1.5: 1.2~1.8: 0.2~0.4: 0.05~01进行混合后,即得到目标产品对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120307 |