CN105556312A

CN105556312A - 用于鉴别受试者的癌症风险的组合物和方法

Info

Publication number: CN105556312A
Application number: CN201480050455.2A
Authority: CN
Inventors: E·弗兰兹曼
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2016-05-04
Also published as: ZA201805056B; CA2919975A1; EP3028047B1; CN111537718A; PE20160657A1; MX2016001439A; IL243643A0; WO2015017692A1; EP3028047A1; EP3028047A4; AU2014296090A1; JP2016527514A; CA2919975C; KR20160052536A; IL243643B; ZA201600801B; US20190079093A1; RU2016104892A; KR102320503B1; US20160187343A1

Abstract

本文公开了使用来自受试者的体液样本及标记物如solCD44和总蛋白的测定来确定受试者的癌症如头颈部鳞状细胞癌的风险的组合物和方法。还公开了基于所述风险治疗受试者的方法。还公开了确定癌症治疗功效的方法。

Description

用于鉴别受试者的癌症风险的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年7月31日提交的美国临时申请号61/860,669、及2014年6月7日提交的美国临时申请号62/009,175、及2014年7月8日提交的美国临时申请号62/021,998的优先权权益，这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文。

政府资助的声明

本发明在国立卫生研究院(theNationalInstitutesofHealth)授予的政府资助号R01CA118584和RO3CA107828的支持下完成。本发明还在佛罗里达卫生部(FloridaDepartmentofHealth)授予的Bankhead-Coley号10BG02的支持下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种差异明显的虚弱的致命性疾病，黑种人的死亡率是白种人的两倍。男性比女性更为常见(CancerFactsandFigures-2013.Atlanta:AmericanCancerSociety,2013)。HNSCC占据了几乎90％的涉及上呼吸消化道(UADT)的癌症(Muir等人Upperaerodigestivetractcancers.Cancer增刊(1995)75:147-53)。每年，该疾病影响美国50,000人口而在全世界影响600,000人口。存活率不佳，因为大部分患者发现于晚期，治愈率低至30％(Vokes等人Headandneckcancer.NEnglJMed(1993)328:184-94)。如果早期检测的话，那么该疾病可以在当时治愈80-90％(Markopoulos等人SalivaryMarkersforOralCancerDetection.OpenDentJ.(2010)4:172–178)。

许多当前的HNSCC生物标记物研究使用“组学(omics)”方法来使用病例-对照研究设计从大的潜在标记物池中鉴别几个候选标记物(Shankar等人Trendsinsalivarydiagnostics-a5-yearreviewoforaloncology2007-2011.OralOncol(2012)48:e22-3；Li等人Salivarytranscriptomediagnosticsfororalcancerdetection.ClinCancerRes(2004)10:8442-8450；Park等人SalivarymicroRNA:discovery,characterization,andclinicalutilityfororalcancerdetection,ClinCancerRes(2009)15:5473-5477；Hu等人ClinCancerRes(2008)14:6246-6252；Carvalho等人Evaluationofpromoterhypermethylationdetectioninbodyfluidsasascreening/diagnosistoolforheadandnecksquamouscellcarcinoma.ClinCancerRes(2008)14:97-107；Elashoff等人Prevalidationofsalivarybiomarkersfororalcancerdetection.CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2012)21(4):664-72)。当进一步测试时，标记物通常未能同样奏效。例如，甲基化标记物组得到35-85％的灵敏度和30-90％的特异性(Carvalho等人Evaluationofpromoterhypermethylationdetectioninbodyfluidsasascreening/diagnosistoolforheadandnecksquamouscellcarcinoma.ClinCancerRes(2008)14:97-107)，而mRNA标记物组得到45-79％的灵敏度和72-77％的特异性(ElashoffD等人Prevalidationofsalivarybiomarkersfororalcancerdetection.CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2012)21(4):664-72)。

HNSCC发展的最重要的发病诱因是烟草、酒精及人类乳头状瘤病毒(HPV)感染，通常是HPV16型(Muscat等人Tobacco,alcohol,asbestos,andoccupationalriskfactorsforlaryngealcancer.Cancer(1992)69:2244-51；Blot等人Smokinganddrinkinginrelationtooralandpharyngealcancer.CancerRes(1988)48:3282-7；Burch等人Tobacco,alcohol,asbestos,andnickelintheetiologyofcancerofthelarynx:acase-controlstudy.JNatlCancerInst(1981)67:1219-24；JohnsonN.Tobaccouseandoralcancer:aglobalperspect.JDentalEdu(2001)65:328-339；BalaramP等人OralcancerinsouthernIndia:theinfluenceofsmoking,drinking,paan-chewingandoralhygiene.IntJCancer(2002)98:440-45；LewinF等人Smokingtobacco,oralsnuffandalcoholintheetiologyofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck.Cancer(1998)82:1367-75；MashbergA等人Tobaccosmoking,alcoholdrinking,andcanceroftheoralcavityandoropharynxamongU.S.veterans.Cancer(1993)72:1369-75；TalaminiR等人Canceroftheoralcavityandpharynxinnonsmokerswhodrinkalcoholandinnondrinkerswhosmoketobacco.JNatlCancerInst(1998)90:1901-3；LinBM等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer.(2013)；D'SouzaG等人Case-controlstudyofhumanpapillomavirusandoropharyngealcancer.NEnglJMed(2007)356:1944-56；GaoJ等人Basicconsiderationofresearchstrategiesforheadandneckcancer.FrontMed2012；6:339-53)。烟草是头颈部癌症的强风险因素且与饮酒协同作用致使提高风险(Muscat等人Tobacco,alcohol,asbestos,andoccupationalriskfactorsforlaryngealcancer.Cancer(1992)；69:2244-51；Blot等人Smokinganddrinkinginrelationtooralandpharyngealcancer.CancerRes(1988)48:3282-7；Burch等人Tobacco,alcohol,asbestos,andnickelintheetiologyofcancerofthelarynx:acase-controlstudy.JNatlCancerInst(1981)67:1219-24；Johnson.Tobaccouseandoralcancer:aglobalperspect.JDentalEdu(2001)65:328-339；Balaram等人OralcancerinsouthernIndia:theinfluenceofsmoking,drinking,paan-chewingandoralhygiene.IntJCancer(2002)98:440-45；Lewin等人Smokingtobacco,oralsnuffandalcoholintheetiologyofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck.Cancer(1998)82:1367-75；Mashberg等人Tobaccosmoking,alcoholdrinking,andcanceroftheoralcavityandoropharynxamongU.S.veterans.Cancer(1993)72:1369-75；Talamini等人Canceroftheoralcavityandpharynxinnonsmokerswhodrinkalcoholandinnondrinkerswhosmoketobacco.JNatlCancerInst(1998)90:1901-3；Lin等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer.2013；Anantharaman等人Populationattributableriskoftobaccoandalcoholforupperaerodigestivetractcancer.OralOncology(2011)47:725-31)。HPV相关的HNSCC是美国发病率正在提高的少数癌症之一。尽管主要由HPV推动的肿瘤具有极佳的预后，但大多数HPV肿瘤在具有吸烟史的个体中出现(Lin等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer.2013；Ang等人Humanpapillomavirusandsurvivalofpatientswithoropharyngealcancer.NEnglJ Med(2010)363(1):24-35)。在吸烟者中的HPV阳性肿瘤具有更坏的预后(Lin等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer.2013；Kumar等人EGFR,p16,HPVTiter,Bcl-xLandp53,sex,andsmokingasindicatorsofresponsetotherapyandsurvivalinoropharyngealcancer.JClinOncol(2008)26:3128-37)。

用于筛选的当前“黄金标准”是身体检查，然后是活组织检查，但灵敏度仅有64％且特异性是74％(Brocklehurst等人Screeningprogrammesfortheearlydetectionandpreventionoforalcancer.CochraneDatabaseSystRev(2010)11:CD004150)。存在帮助检测口腔癌的多项技术，但没有证据表明其在用于筛选时比肉眼好一些。在本领域中需要一种鉴别癌症风险、检测癌症、提供癌症预后、或监测治疗期间的癌症进展的方法。本文所公开的主题解决这些及其他需要。

概述

本文公开了一种确定受试者的癌症风险的方法，其包括提供来自受试者的体液样本；测量样本中solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平进行统计分析来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定针对癌症的不同的统计上显著的风险；以及通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定受试者的癌症风险。癌症可以是HNSCC，但也可以是其他类型的癌症。

还公开了一种确定受试者的癌症预后的方法，其包括提供来自受试者的体液样本；测量样本中solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自对于癌症具有良好预后的个体及具有不良预后的个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定针对癌症的不同的统计上显著的预后；通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定受试者的癌症预后。

还公开了一种确定正接受癌症治疗的受试者的癌症治疗效果的方法，其包括提供受试者的体液样本；测量样本中solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于癌症的不同的统计上显著的结果；通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定癌症治疗的效果。

还公开了一种试剂盒，其包括：盐溶液；用于接收口腔盐水漱洗液的杯子；至少一种特异性地结合CD44的抗体；用于测定总蛋白浓度的试剂；以及solCD44和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平进行多变量分析或逻辑回归计算来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于癌症的不同的统计上显著的风险。

另外的优势将在随后的描述和图中部分地列出，并且部分地将通过描述显而易见，或可通过实践如下所述的方面而获知。如下所述的优势将借助于所附权利要求书特别指出的要素和组合实现及获得。应理解，以上一般描述及随后的详细描述仅为示例性和说明性的，而没有限制性。

附图简述

并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明了本发明的几个方面并且与说明书一同用于解释本发明的原理。

图1示出了通过siRNA靶向CD44抑制肿瘤生长、EGFR表达及CAL27中的磷酸化。图1A示出了CAL27及其CD44-siRNA稳定转染子(3C3)的肿瘤生长曲线。图1B示出了肿瘤切片的免疫染色(20X)。

图2A和2B示出了在137个基于临床的病例群组(cohort)中无进展存活率(PFS)在具有高solCD44水平(>10ng/mL)(图2A)和蛋白水平(>1ng/mL)(图2B)的患者中是降低的。高solCD44水平的副作用见于所研究的每个种族人种群中：黑种人、白种西班牙人(WH)、以及白种非西班牙人(WNH)(图2C)。

图3示出了间隔一年获取的CD44测量值的差异分布。

图4A和4B示出了当测量solCD44(图4A)和蛋白水平(图4B)时在对照中的子宫颈PAP涂片结果。

图5A-F示出了表示基于CD44和蛋白水平切入点在PFS(图5A)和OS(图5B)中的显著差异的Kaplan-Meier曲线。1年内的CD44(图5C)和蛋白(图5E)水平的差异遵循正态分布。线性回归分析显示在1年内向降低水平发展的趋势对于CD44(图5D)和蛋白(图5F)两者是显著的。

详细说明

本文所述的组合物和方法可通过参照以下对所公开主题的具体方面的详细描述及其中所包括的实施例而更容易地理解。

在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应理解的是，以下所述方面并不限于具体合成方法或具体试剂，因为这些当然是可以变化的。还应理解，本文所用的术语仅仅是用于描述具体方面，而不意图作为限制。

并且，在整篇说明书中，参考不同的出版物。这些出版物的公开内容在此以引用的方式整体并入本申请中以便更充分地描述所公开的主题所属领域的现有技术。对所公开的参考文献中包含并在其引用的语句中讨论的材料还可单独并特定地以引用的方式并入本文中。

一般定义

在本说明书及随后的权利要求书中，将会提到许多术语，这些术语应被定义以具有以下含义：

在本说明书的描述和权利要求通篇中，词语“包含(comprise)”及其他形式的词语，如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”意指包括但不限于，且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

除非文中另外清楚指出，如描述和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，“组合物”所指的包括两种或更多种这类组合物的混合物，“试剂”所指的包括两种或更多种这类试剂的混合物，“组分”所指的包括两种或更多种这类组分的混合物等等。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且描述内容包括事件或情况发生的场合以及事件或情况没有发生的场合。

范围在本文中可表达为从“约”一个具体值，和/或至“约”另一个具体值。“约”指的是在5％的值内，例如4、3、2或1％的值内。当表达这样的范围时，另一实例包括从该具体值和/或至另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应了解特定值形成另一个实例。还应理解，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。

如本文所用，“受试者”意指个体。因此，“受试者”可包括驯养的动物(例如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以及鸟类。“受试者”还可包括哺乳动物，如灵长类动物或人类。术语“受试者”和“患者”在本申请通篇中可互换地使用。

“标记物”或“生物标记物”在本文中可互换地使用并且是指多肽(具有特定的表观分子量，或在HA的情况下，是由重复二糖单位构成的分子)，与取自对照受试者(例如，阴性诊断、正常或健康受试者)的相当样本相比，它在取自患有癌症的患者的样本中存在差别。

“存在差异”一词是指取自患有例如癌症的患者的样本与对照受试者比较，二者样本中标记物存在的数量和/或频率是有差异的。例如，标记物可以是与对照受试者的样本相比，在患有头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者的样本中以升高水平或降低水平存在的多肽。或者，标记物可以是与对照受试者的样本相比在患者样本中以较高频率或较低频率检测到的多肽。标记物可以在数量、频率或这两者方面差异地存在。

如果一个样本中标记物、化合物、组合物或物质的量与另一个样本中标记物、化合物、组合物或物质的量在统计上显著不同，那么标记物、化合物、组合物或物质在这两个样本间存在差别。例如，如果化合物在一个样本中的出现较在另一个样本中的出现高至少约120％、至少约130％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约500％、至少约700％、至少约900％或至少约1000％，或是在一个样本中可检测出而在另一个样本中不可检测出，那么它在这两个样本间存在差别。

或者或另外，如果患者样本中多肽的检测频率在统计上显著地高于或低于对照样本，那么标记物、化合物、组合物或物质在这两组样本间存在差别。例如，如果生物标记物在一组样本中观察到的检测频率较在另一组样本中的检测频率高或低至少约120％、至少约130％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约500％、至少约700％、至少约900％或至少约1000％，那么它在这两组样本间存在差别。尽管存在这些示例性值，但预期本领域技术人员可确定截止点等，这些截止点表示统计上显著的差异以确定标记物是否存在差别。

“诊断”意指确认病理状况的存在或性质并且包括鉴别处于发展成癌症的风险下的患者。诊断方法在其灵敏度和特异性上有差异。诊断测定的“灵敏度”是测试呈阳性的患病个体的百分比(“真阳性”比例)。未由测定检测到的患病个体是“假阴性”。没有患病且在测定中测试呈阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为没有患病而测试呈阳性的比例。当特定诊断方法不能提供明确的诊断情况，但如果该方法对诊断提供有帮助性的正向指引，则加上该诊断方法。

术语“检测(detection)”、“检测(detecting)”等可用于检测生物标记物或检测像HNSCC的癌症(例如，当获得阳性测定结果时)的情况中。在后一种情况中，“检测”和“诊断”被视为同义的。

标记物的“测试量”是指存在于被测试的样本中的标记物的量。测试量可以是绝对量(例如ng/mL)或相对量(例如，信号的相对强度)。

标记物的“诊断量”是指在符合癌症诊断的受试者样本中标记物的量或肿瘤负荷的相对量(例如，信号的相对强度)。

标记物的“对照量”可以是有待与标记物的测试量相比较的任何量或量的范围。例如，标记物的对照量可以是在不患癌症的人中标记物的量。对照量可以是绝对量或相对量(例如，信号的相对强度)。

术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基(具体说来，天然存在的氨基酸)的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基形成糖蛋白而被修饰。术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。

“可检测部分”或“标记”是指通过分光镜、光化学、生化、免疫化学或化学方法可检测的组合物。例如，有用的标记包括32p、35S、荧光染料、密电子试剂、酶(例如，如通常在ELISA中使用)、生物素-抗生蛋白链菌素、洋地黄毒苷、抗血清或单克隆抗体可用的半抗原和蛋白质、或具有与靶标互补的序列的核酸分子。可检测部分经常生成可测量的信号，如放射性信号、产色信号或荧光信号，其可用于量化样本中结合的可检测部分的量。信号的定量是通过例如闪烁计数、密度测定法或流式细胞术实现。

“抗体”是指实质上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其可特异性地结合并识别表位(例如，抗原)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ及λ轻链恒定区基因；α、γ、δ、ε及μ重链恒定区基因；以及种种免疫球蛋白可变区基因。抗体例如以完整的免疫球蛋白或以通过用各种肽酶消化产生的许多良好表征的片段存在。其包括例如Fab'和F(ab)'2片段。本文所用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或使用重组DNA方法学从头合成的抗体片段。其还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指包含一个或多个重链恒定区结构域但不包括重链可变区的免疫球蛋白重链的那个部分。

“结合测定”意指其中生物标记物通过结合至如抗体的试剂(检测过程通过该试剂进行)而被检测到的生化测定。检测过程可涉及放射性或荧光标记等等。测定可涉及生物标记物的固定或可在溶液中进行。

“免疫测定”是一种使用特异性地结合抗原(例如标记物)的抗体的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向、和/或量化抗原。

短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)免疫反应”当涉及蛋白或肽时，是指在异源蛋白群和其他生物制品中确定蛋白存在的结合反应。因此，在设定的免疫测定条件下，指定抗体与特定蛋白结合至少两倍于背景，并且基本上不与样本中存在的其他蛋白有显著量的结合。在这类条件下与抗体的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白质的特异性来选择的抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性地免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用来选择特异性地与蛋白质发生免疫反应的抗体(例如参见，Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)，其中有关可用于确定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。

如本文所用的“样本”可包括多核苷酸、多肽、肽、抗体片段及其衍生物。“样本”可以是或可来自体液；细胞制剂或其中生长细胞的培养基的可溶级分；染色体、细胞器、或从细胞分离或提取的膜；在溶液中或结合至底物的基因组DNA、RNA或cDNA、多肽、或肽；细胞；组织；组织印迹；指纹、唾液、血液、皮肤或毛发；其片段和衍生物。

“处于风险下”意指与正常受试者相比或与对照组例如患者群体相比提高的风险。因此，“处于发展成癌症的风险下”的受试者与正常受试者或群体相比是处在提高的风险下，并且“处于癌症复发风险下”的受试者可被视为与所有治疗的患者中的复发风险相比处于提高的复发风险下。

“提高的风险”或“升高的风险”意指例如受试者将发展成癌症或其复发的概率上任何统计上显著的提高。风险与正在进行比较的对照组相比优选地提高了至少10％，更优选至少20％，且甚至更优选至少50％。

术语“预后”意指关于疾病或疾病进展的可能过程的预测，特别是关于疾病缓解、疾病复发、肿瘤复发、转移、及死亡的可能性。“良好的预后”是指患有癌症如头颈部鳞状细胞癌的患者保持无疾病(即无癌症)的可能性。“不良预后”是指患者将具有潜在的癌症或肿瘤的复发或复发、转移或死亡的可能性。癌症患者被分为具有“良好结果”即保持无潜在的癌症或肿瘤。相比之下，“不良结果”癌症患者经受疾病复发、肿瘤复发、转移、或死亡。在具体的实例中，用于评定预后和结果的时间范围是例如小于一年、一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十五年、二十年或更多年。如本文所用，用于评定预后或无疾病存活时间的相关时间从肿瘤的手术切除或肿瘤生长的遏止、缓减或抑制开始。因此，例如，在具体实例中，“良好的预后”是指头颈部鳞状细胞癌患者保持无潜在癌症或肿瘤持续至少五年时间、更具体地至少十年时间的可能性。在进一步的实例中，“不良预后”是指头颈部鳞状细胞癌患者在少于五年、更具体地少于十年内经受疾病复发、肿瘤复发、转移或死亡的可能性。用于评定以上提供的预后和结果的时间范围是说明性的而不意图限制。

术语“治疗”是指具有治愈、缓解、稳定或预防疾病、病理性病状或病症的意向的患者的医疗管理。此术语包括主动治疗，即特别针对改善疾病、病理性病状或病症的治疗；且还包括病因治疗，即针对除去相关疾病、病理性病状或病症的原因的治疗。另外，此术语包括姑息治疗，即为减轻症状而非治愈疾病、病理性病状或病症而设计的治疗；预防治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理性病状或病症的发展的治疗；以及支持治疗，即用于增补针对改善相关疾病、病理性病状或病症的另一特定疗法的治疗。

术语“生活方式咨询”或“风险因素管理咨询”是指给予患者的关于患者生活方式的专业咨询。例如，患者可接受关于嗜好如吸烟、饮酒或药物使用的咨询，或可接受关于性行为的咨询，如关于较低风险性行为、避孕套使用等的咨询。“生活方式咨询”也可是指膳食调节或压力管理。生活方式咨询是由专业人员实施，并且可包括一个或多个治疗会议、文献、专业视频等。

如在具有类似于受试者的年龄的群体中的个体中的短语“类似于”意指群体的平均年龄在受试者的10年、例如5年内。同样，如在具有类似于受试者的种族的群体中的个体中的短语“类似于”意指受试者是或具有至少一位种族与群体中的大部分个体相同的父母。如在具有类似于受试者的饮酒史、吸烟史的群体中的个体中的短语“类似于”意指饮酒或吸烟的平均年份在受试者的10年、例如5年内。

方法

上呼吸消化道(UADT)粘膜在发展成明确的恶性肿瘤之前通过癌前期发育异常进展。鉴别此阶段中的病变是合乎需要的，因为发育异常是可逆的(Pindborg,AfollowupstudyofsixtyoneoraldysplasticprecancerouslesionsinIndianvillagers.OralSurgOralMedOralPathol(1977)43:383-90)并且可以自发地或在戒烟后消退(Larsson等人Reversibilityofsnuffdippers’lesionsinSwedishmoistsnuffusers:aclinicalandhistologicfollow-upstudy.OralPatholMed.(1991)20(6):258-64；Grizzle等人Thebiologyofincipiend,pre-invasiveorintraepithelialneoplasia.CancerBiomark(2010)9:21-39)。令人遗憾地，发育异常仅在有时是明显的并且经常模拟同样在良性炎症时所见到的结果。发育异常经常保持隐匿性的直到导致晚期诊断的进一步的进展为止(Poh等人Directfluorescencevisualizationofclinicallyocculthigh-riskoralpremalignantdiseaseusingasimplehand-helddevice.HeadNeck(2007)29(1):71-6)。

CD44，即一种参与细胞增殖、细胞迁移、及肿瘤发生的细胞表面跨膜糖蛋白(Screaton等人ProcNatlAcadSciUSA(1992)89:12160-4；Ponta等人NatureRevMolCellBiol(2003)4:33-45；Perez等人OralOncol2012；Prince等人ProcNatlAcadSciUSA(2007)104:973)在癌前病变中过度表达(Hirvikoski等人VirchowsArch.(1999)43437-44；Ioachim等人HistolHistopathol(1999)14:1113-8)。由于粘膜变化从正常发展成严重发育异常，所以CD44表达从基底层进展成累及所有上皮层(Hirvikoski等人VirchowsArch.(1999)43437-44；Ioachim等人HistolHistopathol(1999)14:1113-8)。此外，CD44是由蛋白酶释放成可溶性形式(solCD44)，其在体液中可检测出(Kajita等人J.CellBiol(2001)153:893-904)。总蛋白也是有效的肿瘤标记物(Franzmann等人Head&neck(2012)34:687-95；Pereira等人CancerBiomark(2011)10:241-9；Franzmann等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2007)16:1348-55)。

本文公开了一种非侵入式诊断测试，其使用可溶性CD44(solCD44)免疫测定和总蛋白测定来测量体液样本中的标记物。solCD44和总蛋白水平在HNSCC中与对照相比都较高，这与不良预后有关，并且这两者在癌症通过标准口腔检查而可见之前是升高的。此外，已显示还可检测到在如肺和膀胱的其他位置中的癌症(实施例1)。

随着时间监测solCD44和总蛋白水平允许临床医师准确地找出需要分科专家检查、分子成像及活组织检查的那些患者。从无疾病证据进展到证实初癌或癌症(实施例1)的患者中的数据显示solCD44和蛋白水平增至高于正常，在一些情况下，在恶性肿瘤或初癌在临床上明显之前超过2年。此前置时间可促成戒烟干预，由于初癌是可逆性状态(Pindborg等人Afollow-upstudyofsixty-oneoraldysplasticprecancerouslesionsinIndianvillagers.OralSurgOralMedOralPathol.(1977)43:383-90)并且可以在戒烟后消退(Larsson等人Reversibilityofsnuffdippers'lesioninSwedishmoist snuffusers:aclinicalandhistologicfollow-upstudy.OralPatholMed(1991)20(6):258-64)。

本文公开了一种确定受试者的癌症风险的方法，其包括提供来自受试者的体液样本；测量样本中solCD44的水平，即solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的水平，即总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定针对癌症的不同的统计上显著的风险；以及通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定受试者的癌症风险。也就是说，solCD44和总蛋白的参考水平被用作统计上显著的风险间的阈值，以便超过这些参考水平的solCD44和总蛋白的测试量指示与当受试者的solCD44和总蛋白的测试水平低于参考水平时相比受试者(例如，两倍可能性、十倍可能性等)患有癌症的统计上显著的风险。

还公开了一种确定受试者的癌症预后的方法，其包括提供来自受试者的体液样本；测量样本中solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自对于癌症具有良好预后的个体及具有不良预后的个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定针对癌症的不同的统计上显著的预后；通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定受试者的癌症预后。在此，solCD44和总蛋白的参考水平被用作统计上显著的预后(良好对比不良)间的阈值，以便超过这些参考水平的solCD44和总蛋白的测试量指示与当受试者的solCD44和总蛋白的测试水平低于参考水平时相比受试者(例如，两倍可能性、十倍可能性等)具有不良预后的统计上显著的预后。

还公开了一种确定正接受癌症治疗的受试者的癌症治疗效果的方法，其包括提供受试者的体液样本；测量样本中solCD44的测试量；测量样本中总蛋白的测试量；提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于癌症的不同的统计上显著的结果；通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定癌症治疗的效果。在此，solCD44和总蛋白的参考水平被用作针对癌症的统计上显著的结果间的阈值，以便超过这些参考水平的solCD44和总蛋白的测试量指示与当受试者的solCD44和总蛋白的测试水平低于参考水平时相比受试者(例如，两倍可能性、十倍可能性等)具有给定结果(例如缓解)的统计上显著的结果。

本文所述的方法关联了患有癌症的受试者中的solCD44和总蛋白水平。具体说来，本文所公开的方法能够确定受试者的癌症风险。受试者可处于“高风险”类别中，意味着其具有一个或多个已发现与癌症有关联的风险因素。这些“高风险”类别可包括但不限于受试者的年龄、种族、吸烟状况、饮酒、癌症病史、和/或人类乳头状瘤病毒(HPV)测定的阳性结果。这些风险因素可连同solCD44和总蛋白的测试量一起使用以确定受试者发展成恶性肿瘤或初癌的可能性。“初癌”被定义为还不是恶性但随时准备着变成恶性的组织。癌前生长的实例包括结肠中的息肉、皮肤的光化性角化病、子宫颈的发育异常、肺化生、以及粘膜白斑病(口腔中的白色斑块)。在有些情况下，初癌并不一定显示任何临床症状。

受试者未必已被诊断为恶化前或恶性的，或未必在本文所公开的测定之前已接受检查。受试者可能不具有恶性肿瘤或初癌的临床上明显的体征。

在solCD44和总蛋白的水平超过阈值水平的诊断之后，患者可被转送到专家处以便进一步的分析和治疗。然后可基于评分与先前值的比较将受试者暴露于手术、放疗、或化疗、或其组合，其中受试者先前没有暴露于手术、放疗、或化疗、或其组合。还可向受试者提供风险因素管理或生活方式咨询。例如，受试者可就吸烟、饮酒、以及其他风险行为进行咨询。受试者例如可被招募至戒烟计划中。

受试者还可被要求回来接受随访测量和测定。可每周、每月、每6个月、每年或每5年或其间的任何时候就solCD44和总蛋白水平对受试者进行再测试。这可以连同拜访专科医生及如本文所述的风险因素管理咨询一起进行。

“确定受试者的癌症风险”意在是指生物标记物组合的过度表达与肿瘤、转移或死亡的提高的可能性有关。例如，“受试者的癌症风险”可以是指在一年、五年、十年、或更长时间、或其间的任何时间量内癌症或肿瘤、转移、或死亡的可能性提高。solCD44或总蛋白与对照相比可过度表达了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、或更多。

CD44

solCD44在大多数头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)病例中是升高的，并且其以高特异性将癌症与良性疾病区分开。CD44在正常上呼吸消化道上皮的基底面上表达。CD44表达增加并且累及上皮中的所有层，其中在90％的病例中有组织发育异常改变。CD44v促进肿瘤发生，因为其与基质金属蛋白酶相互作用。MMP1型将CD44裂解成可溶性形式(solCD44)。已经显示，HNSCC患者的口腔漱洗液具有比正常对照大7倍的solCD44水平。80％HNSCC具有升高的唾液solCD44，而对照都没有。

已经发现一种基于CD44的筛选测试，其是根据肿瘤生物学中分子的已知作用。CD44由于烟草诱导的遗传损伤而过度表达且是肿瘤发生所需的。大部分HNSCC出现在吸烟者中，即使肿瘤是HPV阳性的(Lin等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer(2013)。烟草烟雾通过分别生成导致突变的DNA加合物和氧化性损害(Pfeifer等人Tobaccosmokecarcinogens,DNAdamageandp53mutationsinsmoking-associatedcancers.Oncogene(2002)21:7435-51)以及DNA双链断裂(Werbrouk等人Single-nucleotidepolymorphismsinDNAdouble-strandbreakrepairgenes:associationwithheadandneckcancerandinteractionwithtobaccouseandalcoholconsumption.MutationRes(2008)656:74-81)来诱导损害。当DNA断裂没有正确地修复时，出现遗传畸变如基因扩增(Mondello等人Geneamplification,radiationsensitivityandDNAdouble–strandbreaks.MutationRes2010；Miller等人GenomicamplificationofMETwithboundarieswithinfragilesiteFRA7GandupregulationofMETpathwaysinesophagealadenocarcinoma.Oncogene(2006)25:409-18；Jarvinen等人High-resolutioncopynumberandgeneexpressionmicroarrayanalysisofheadandnecksquamouscellcarcinomacelllinesoftongueandlarynx.Genes,Chromosomes&Cancer(2008)47:500-9)，从而导致CD44及其他基因产物的过度表达(Miller等人GenomicamplificationofMETwithboundarieswithinfragilesiteFRA7GandupregulationofMETpathwaysinesophagealadenocarcinoma.Oncogene(2006)25:409-18；Liu等人(1978)。CD44代表具有共同的结构域和选择性剪接的外显子(外显子5-14)的可变区的跨膜糖蛋白家族(ScreatonGR等人GenomicstructureofDNAencodingthelymphocytehomingreceptorCD44revealsatleast12alternativelysplicedexons.ProcNatlAcadSciUSA(1992)89:12160-4)。CD44同工型与许多其他分子相互作用，包括细胞外基质组分(透明质酸)(HA)、膜蛋白(EGFR，HER2)、细胞骨架组分(埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白及merlin)及核内蛋白(STAT3)，从而造成致癌信号传导(Ponta等人CD44:fromadhesionmoleculestosignalingregulators.NatureRevMolCellBiol(2003)4:33-45；Morrison等人(1998)；Lokeshwar等人Ankyrin-bindingdomainofCD44isrequiredfortheexpressionofhyaluronicacid-mediatedadhesionfunction.JCellBiol(1994)126:1099-1109；Lee等人AcetylationandactivationofSTAT3mediatedbynucleartranslocationofCD44.JCellBiol.(2009)185:949-57)。此信号传导抑制细胞凋亡(Perez等人CD44interactswithEGFRandpromotesheadandnecksquamouscellcarcinomainitiationandprogression.OralOncol.(2013)4:306-13；Lakshman等人CD44promotesresistancetoapoptosisinhumancoloncancercells.ExpMolPathol(2004)77:18-25)，从而促进进一步的遗传损伤和恶性转化。

CD44不仅仅是肿瘤发生的副产物，而且是肿瘤起始的驱动物，其可通过口腔漱洗液测试容易地且非侵入性地检测到。CD44阳性(CD44+)的肿瘤细胞具有肿瘤起始能力(PrinceME等人Identificationofasubpopulationofcellswithcancerstemcellpropertiesinheadandnecksquamouscellcarcinoma.ProcNatlAcadSciUSA(2007)104:973-8)。CD44阴性(CD44-)的肿瘤细胞在40例植入的仅一例中产生肿瘤，而CD44+细胞在注射了只有几千细胞的30例植入的20例中产生肿瘤(Prince等人Identificationofasubpopulationofcellswithcancerstemcellpropertiesinheadandnecksquamouscellcarcinoma.ProcNatlAcadSciUSA(2007)104:973-8)。

CD44是透明质酸的受体并且还可与其他配体如骨桥蛋白、胶原及MMP相互作用。CD44是一种多结构和多功能细胞表面分子，其参与细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、血管生成、细胞因子、趋化因子和生长因子向相应受体的呈递、以及蛋白酶在细胞膜处的对接以及细胞存活的信号传导。所有这些生物性质对正常细胞的生理活性是必不可少的，但其还与癌细胞的病理活性有关。CD44表达可在体液中容易地测量到，因为蛋白酶如膜-1型MMP(MT1-MMP)将CD44裂解成其可溶性形式(solCD44)(Kajita等人Membrane-type1matrixmetalloproteinasecleavesCD44andpromotescellmigration.JCellBiol(2001)153:893-904)。

所公开的测定涉及检测来自受试者的样本中的一种或多种生物标记物，如CD44(例如可溶性CD44(solCD44))。Franzmann等人的美国专利号8,088,591因其关于生物标记物的描述而以引用的方式整体并入，生物标记物可用于诊断和监测受试者中的HNSCC。

CD44在大量哺乳动物细胞类型中表达。称为CD44的标准同工型包含外显子1-5和16-20，其在大部分细胞类型中表达。含有可变外显子的CD44剪接变体被称为CD44v。一些上皮细胞还表达更大的同工型(CD44E)，其包括外显子v8-10。CD44蛋白还经由蛋白酶以可溶性形式(solCD44)释放(Kajita等人JCellBiol(2001)153:893–904)并且在正常循环中可检测到(Naor等人AdvCancerRes(1997)71:241–319；Guo等人CancerRes(1994)54:422–6；Martin等人IntJCancer(1997)74:443–5；Ristamaki等人Blood(1997)90:4039–45；Yamane等人Oncology(1999)56:232–8；Scott等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2000)9:1211–4；VanHal等人ClinCancerRes(1999)5:3534–4)。solCD44的循环水平与一些肿瘤的转移有关(Ristamaki等人Blood(1997)90:4039–45；Yamane等人Oncology(1999)56:232–8)。

solCD44可通过免疫测定来测量。免疫测定包括但不限于ELISA、MELISA、CEDIA、免疫筛选、侧流测试(侧流测定)、磁性免疫测定、放射免疫测定、或环绕光纤免疫测定(SOFIA)。其他实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)或侧流测定。

总蛋白

总蛋白(TP)如本文中所提及的是存在于样本(例如口腔漱洗液)中的所有蛋白质的量。用于溶液中的蛋白质的最简单且最直接的测定方法是测量280nm下(UV范围)的吸光度。含有芳族侧链的氨基酸(即，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)展现强紫外光吸收。因此，蛋白质和肽与其芳族氨基酸含量和总浓度成比例地吸收紫外光。传统上在通过HPLC的氨基酸分析中使用的另一种方法将是用有色或荧光染料如水合茚三酮或邻苯二甲醛(OPA)标记所有伯胺(即，N端和赖氨酸残基的侧链)。还已知几个比色的、基于试剂的蛋白测定技术。添加蛋白质至试剂中，产生与所添加的量成比例的颜色变化。蛋白质浓度通过参考由已知浓度的纯化参照蛋白组成的标准曲线来测定。

总蛋白测定的实例包括Bradford测定、劳瑞(Lowry)测定、修改的劳瑞、以及PierceBCA蛋白质测定。劳瑞测定是用于测定溶液中的总蛋白水平的生化测定。总蛋白浓度通过样本溶液与蛋白浓度成比例的颜色变化来展现，蛋白浓度随后可使用比色技术测量。对劳瑞测定还存在修改，其可用于本文所公开的方法。一个实例见于Peterson等人(AnalBiochem(1977)83(2):346–356)中。

统计分析

如本文所公开的solCD44和总蛋白的参考水平可通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于癌症的不同的统计上显著的风险。可对这些参考水平进行统计分析，如逻辑回归计算。多变量分析同样可用于统计分析中。使用逻辑回归计算和多变量分析的方法在本领域中是已知的，如美国专利6,110,109中列出的那些，该专利以引用的方式整体并入本文。

可对来自健康个体以及患有癌症的那些个体的solCD44和总蛋白的参考水平进行回归分析。注意到，此分析可对患有某一类型癌症(例如像HNSCC)的个体进行。可分析这些评分以确定癌症风险的统计上显著的界定。一旦获得这些评分，便可将其应用于本文所公开的方法以通过判定患者中solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于抑或低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定受试者的癌症风险。个体患者的风险水平可因此基于此比较来评定。

计算逻辑回归的方法以及多变量分析方法公开于以下文献中：GarethJames等人,(2013).AnIntroductiontoStatisticalLearning.Springer.第6页；Harrell,FrankE.(2001).RegressionModelingStrategies.Springer-Verlag.ISBN0-387-95232-2；Hosmer,David等人(2000).AppliedLogisticRegression(第2版).Wiley.ISBN0-471-35632-8；Menard,ScottW.(2002).AppliedLogisticRegression(第2版).SAGE.ISBN978-0-7619-2208-7；Cohen,Jacob等人(2002).AppliedMultipleRegression/CorrelationAnalysisfortheBehavioralSciences(第3版).Routledge.ISBN978-0-8058-2223-6；Mark等人(2001).MultipleRegressionAnalysisandMassAssessment:AReviewoftheIssues.TheAppraisalJournal,Jan.第89-109页)，所有文献因其关于逻辑回归计算和多变量分析的教导而以引用的方式整体并入本文。

样本收集

有待用于本文所公开的方法中的样本可从任何体液中获得。例如，体液可选自由以下组成的组：口腔漱洗液、唾液、痰液、呼吸气冷凝液、血液、血浆、血清、以及尿。优选地，样本是唾液或口腔漱洗液。唾液可使用许多方法收集。一种常见的方法是完整的唾液收集。唾液经常在规定的一段时间内从前部口腔中收集，其中大多数是在静息状态下释放。口腔漱洗涉及使用设定量的流体(经常是盐水)，其在口腔中处置并有助于释放粘附于口腔、喉和咽的内层的物质。

受试者被要求在获得口腔漱洗液样本之前禁止饮食、饮水或吸烟。受试者被要求禁止持续例如10、20、30、40、50或60分钟或更久。

癌症

本文所公开的方法可用于检测任何类型的癌症或一种以上类型癌症的组合。实例包括但不限于白血病、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、原始粒细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脾大性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、实体肿瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡树突神经胶细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、以及成视网膜细胞瘤。(关于此类病症的综述，参见Fishman等人,(1985,Medicine,第2版,J.B.LippincottCo.,Philadelphia.)

具体说来，癌症可选自由以下组成的组：头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、白血病/淋巴瘤、乳腺癌、以及骨肉瘤。

本文还公开了“初癌”，其出现在进展至瘤形成或癌症之前，具体说来，其中由增生、化生或最特别地发育异常组成的非赘生性细胞生长已经出现(关于这种异常生长状况的综述，参见Robbins和Angell,1976,BasicPathology,第2版,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,第68-79页)。增生是一种受控形式的细胞繁殖，其包括组织或器官中细胞数目的增加，而在结构或功能方面没有显著变化。但是作为一个实例，子宫内膜增生经常出现在子宫内膜癌之前。化生是一种受控形式的细胞生长，其中一种类型的成年细胞或完全分化的细胞被另一种类型的成年细胞所替代。化生可出现于上皮或结缔组织细胞中。典型的化生包括一定程度紊乱化生的上皮。发育异常多为癌症的预兆，并且主要见于上皮中；它是非赘生性细胞生长的最紊乱形式，包括个别细胞均一性的丧失和细胞结构定位的丧失。发育异常的细胞通常具有异常巨大而深染的细胞核，呈现多形性。发育异常特征性地出现，其中存在慢性刺激或炎症，并且常常见于子宫颈、呼吸道、口腔及胆囊中。

患者风险

分析本文所公开的受试者除了总蛋白和solCD44的测量外的风险因素。例如，患者风险因素可包括饮酒、吸烟、或人类乳头状瘤病毒(HPV)感染。患者风险因素还可包括关于另一种癌症标记物的实验室结果。

传统上，80％-90％的HNSCC已归因于烟草和饮酒(Sturgis等人Cancer(2007)110:1429-35)。对于吸烟者来说发展成HNSCC的风险比不吸烟者大5至25倍，其中风险随着吸烟的频率、持续时间及程度以剂量-反应方式增大(Marur等人MayoClinProc.(2008)83:489-501；Sturgis等人Cancer(2007)110:1429-35；Ragin等人JDentRes(2007)86:104-14；Curado等人CurrOpinOncol.(2009)21:194-200)。风险实质上随时间因戒烟而降低，不过此风险从未达到从不吸烟者的水平(Schlect等人Epidemiology(1999)10:412-18；Bosetti等人AmJEpidemiol(2008)167:468-73)。一项意大利研究发现，对于所有上呼吸消化道癌症在75岁时的累积风险在一直吸任何类型的烟草的男性中是6.3％，在大约50岁时戒烟的男性中是3.1％，在大约30岁时戒烟的男性中是1.2％，并且在终身不吸烟的男性中是0.8％(Bosetti等人AmJEpidemiol.(2008)167:468-73)。虽然主动吸烟是HNSCC的主要风险因素，但非故意的或二手的吸烟也与提高的癌症风险有关。在国际综合分析中，在家和工作中长期暴露于非情愿吸烟(描述为发生超过15年时间)与HNSCC(特别是咽部和喉部癌症)的风险提高有关(Lee等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2008)17:1974-81)。

还显示，酒精协同地提高可归因于吸烟的HNSCC风险(Ragin等人JDentRes(2007)86:104-14)。严重酗酒单独是HNSCC的独立风险因素。被定义为每天饮酒三次或更多次的高频率饮酒独立地与口咽、下咽及喉的提高的癌症风险有关(Hashibe等人JNatlCancerInst(2007)99:777-89)。

与HNSCC有关的其他风险因素包括饮食模式、病毒及职业性暴露。大量的研究显示HNSCC与维生素A缺乏症相关，而其他研究描述与高水果和蔬菜摄入量的负相关(Marur等人MayoClinProc.(2008)83:489-501；Curado等人CurrOpinOncol.(2009)21:194-200)。已牵涉的病毒包括埃-巴二氏病毒(EBV)和人类乳头状瘤病毒(HPV)，并且职业性暴露(如铬、镍和镭)还特别与鼻窦癌有关(Marur等人MayoClinProc.(2008)83:489-501)。

HPV

吸烟相关HNSCC的发病率在美国自从1975年起开始下降，而可能归因于人类乳头状瘤病毒(HPV)的HNSCC的比例则有所提高。仅美国每年在女性中就有超过2,370个HPV相关的口咽鳞状细胞癌(OPSCC)新病例被诊断出，而在男性中有近9,356个病例被诊断出。在性活跃的女性中子宫颈HPV感染的估计的终生风险高达80％。本文公开了在HPV与诱导的口咽癌及子宫颈癌之间的免疫学关联。PD-1(程序性细胞死亡)受体是肿瘤免疫逃避中的一种共同的关联。(2008,WorldHealthOrganizationSectionofCancerInformation,2008；Goodman,MT等人；2012,Lyford-Pike,S等人)

组合的solCD44和总蛋白水平在将HNSCC与对照区分方面比单独的任一标记物更有效。然而，solCD44水平在患有人类乳头状瘤病毒(HPV)感染的受试者中可以是较低的。实际上，使用solCD44和总蛋白水平的双变量分析在黑人男性中最好用，其中HPV感染不太常见。因此，在多变量分析中纳入HPV状况可提高测定的灵敏度和精度并且允许检测HPV+HNSCC(实施例2)。

与HNSCC检测或预后有关的其他生物标记物可与总蛋白、solCD44及HPV检测组合用于提高所公开的方法的灵敏度和/或精度。例如，solCD44水平可基于年龄和吸烟状况而变化。可在多变量分析中使用的HNSCC风险因素和人口统计因素的实例包括烟草暴露、酒精暴露、种族、人种、口腔卫生、性别、教育水平、年龄、一般健康状况、癌症家族史、性交史和社会经济状况并且在多变量分析中使用一个或多个风险因素或人口因素来确定组合分数。

HPV感染可通过直接地或间接地测量HPV来确定。三种类别的分子测定目前可用于检测组织和脱落细胞样本中的HPV感染。所有都是基于HPVDNA的检测并且包括：(1)非扩增的杂交测定(DNA印迹转移杂交(STH)、斑点印迹杂交(DB)和原位杂交(ISH))；(2)信号放大杂交测定，如杂交捕获测定；以及(3)靶标扩增测定，如PCR和原位PCR。DNA印迹杂交需要大量DNA、并且是繁重且不可再现的，而原位杂交对HPV仅具有中等灵敏度。HPV的基于PCR的检测具有极高的灵敏度和特异性。使用此方法，病毒DNA通过DNA聚合酶在体外扩增以生成足量的靶标，然后靶标在凝胶上被直接地目测到或(更特异性的方法)使用传统的杂交方法由特异性探针检测到。实际上，基于PCR的方法的灵敏度在100ng细胞DNA的背景中为约10-100HPV病毒基因组。由于PCR可在极少量的DNA(10-100ng)上进行，所以理想的是在具有低DNA含量的样本上使用。

遗传因素

在其他实例中，可为本文所公开的方法选择展现恶性肿瘤的一种或多种以下发病诱因的患者：与恶性肿瘤、家族性息肉病或加德纳氏综合征(结肠癌的可能预兆)有关的染色体易位、良性单株丙种球蛋白病(多发性骨髓瘤的可能预兆)、以及与患有显示孟德尔(遗传)遗传模式的癌症或癌前疾病的人有一级亲属关系(例如，结肠家族性息肉病、加德纳氏综合征、遗传性外生骨疣、多发性内分泌腺瘤病、伴有淀粉状蛋白产生和嗜铬细胞瘤的甲状腺髓样癌、黑斑息肉综合征、冯雷克林豪森神经纤维瘤病、成视网膜细胞瘤、颈动脉体瘤、皮肤黑素癌、眼内黑素癌、着色性干皮病、共济失调毛细血管扩张、齐-希二氏综合征、白化病、范科尼再生障碍性贫血、以及布卢姆氏综合征；参见Robbins和Angell,1976,BasicPathology,第2版,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,第112-113页)等)。

HA和HAase

还可在样本中测量透明质酸(HA)和透明质酸酶(HAase)的水平。HA是在某些癌症中过度表达的非硫酸化糖胺聚糖(GAG)。HA是由透明质酸合酶在细胞表面上合成并且由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的重复二糖单元构成。其存在于体液、组织、以及细胞外基质中。其与细胞表面受体(例如CD44、RHAMM等)相互作用并且通过这些相互作用来调节细胞粘附、迁移、及增殖。取决于肿瘤类型，HA可由间质细胞、肿瘤细胞或这两者合成。在肿瘤组织中，HA通过促进肿瘤细胞迁移、提供抵御免疫监视的保护以及造成细胞生长和迁移的接触介导的抑制的部分丧失来支持转移。HA的小片段是血管生成的并且已从膀胱癌患者的尿、前列腺癌组织以及来自HNSCC患者的唾液中分离。HA的浓度在包括结肠、乳腺、前列腺、膀胱及肺的若干癌症中是升高的。HA在如结肠和乳腺的肿瘤中的组织表达指示不良的预后。

表1：在有和没有癌症病史的患者中CD44和总蛋白水平的比较

表2：在具有不同癌症病史的患者中的CD44和蛋白水平

HAase是将HA降解成小血管生成HA片段的内切糖苷酶。HA和HA片段通过激活局部粘附激酶和MAP激酶途径刺激内皮细胞增殖、粘附和迁移。HAase改变CD44同工型的表达并且与增加的肿瘤细胞周期有关。在由不同基因编码的6种人类HAase中，三种在蛋白水平上表征。

试剂盒

本文还公开了一种试剂盒，其包括：盐溶液；用于接收口腔盐水漱洗液的杯子；至少一种特异性地结合CD44的抗体；用于测定总蛋白浓度的试剂；以及solCD44和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于癌症的不同的统计上显著的风险。

实施例

下文列出以下实施例以说明根据所公开的主题的方法、组合物、和结果。这些实施例并不意图包括本文公开的主题的所有方面，而是为了说明代表性方法、组合物和结果。这些实施例并不意图排除本领域技术人员所显而易见的本发明的等价物和变化。

实施例1：CD44和总蛋白口腔漱洗液测试

solCD44/总蛋白口腔漱洗液测试是一种用于鉴别早期和侵袭性HNSCC的有力工具。在150个癌症病例和150个基于临床的频率匹配对照的试验中，注意到口腔漱洗液CD44/总蛋白测试在黑人男性子集中以将近90％的准确度将HNSCC病例与对照区分开。在病例中的高solCD44水平与不良的无进展存活率(PFS)和总存活率(OS)有关，PFS和OS不依赖于蛋白水平、疾病类型(口咽对口腔)、肿瘤阶段、及其他协变量。

solCD44/蛋白口腔漱洗液测试的特异性在基于社区的群组中比预期要好。在佛罗里达南部存在吸烟和若干烟草相关癌症群的高发病率，这些地区包括位于Miami-Dade县的社会经济不发达城市(“社区群组)(DietzNA等人Towardtheidentificationofcommunitieswithincreasedtobacco-associatedcancerburden:Applicationofspatialmodelingtechniques.JCarcinog2011；10:22)，在Miami-Dade县中北部的少数富裕和经济不发达的邻域。在社区群组中相对于佛罗里达州南部其余地区的患癌率全部是高度显著的：肺相对风险(RR)＝1.4；p<0.0001；口腔RR＝1.5；p<0.01；以及子宫颈RR＝2.6；p<0.0001(DietzNA等人Towardtheidentificationofcommunitieswithincreasedtobacco-associatedcancerburden:Applicationofspatialmodelingtechniques.JCarcinog2011；10:22)。开发一种社区群组HNSCC早期检测和预防程序。评定CD44和蛋白水平，以及其在此高风险群体中随时间的可变性，并且如果戒烟导致降低的水平，那么对其进行测定。如果口腔漱洗液测试是可接受的，那么也对其进行评估。在来自社区群组的受试者中证实口腔漱洗液测试的特异性并且发现该测试以100％灵敏度和92％特异性将黑人男性HNSCC病例(招募到基于临床的研究中)与社区群组对照区分开。在7例“假阳性”中，一例被证实是肺癌且另一例据推测是口腔初癌。口腔漱洗液测试是被充分接受的。此外，平均solCD44水平在回来接受年度随访的受试者中下降了9％，这显示癌症风险在筛选的群组中可能是降低的。因此，此程序可显著并积极地影响处于HNSCC风险下的患者。

数据

CD44参与了肿瘤起始和进展：CD44是在细胞表面上表达的跨膜蛋白并且参与了肿瘤起始。在正常粘膜中，CD44染色限于基底层和基底旁层，但蔓延至累及所有层，伴有增加的发育异常和侵袭性癌症。分化不良的肿瘤显示围绕血管并且在癌症扩散区域的外周处的局部CD44染色(Germani,R等人Molecularmarkersofmicrometastasisinoralcavitycarcinomas.OtolaryngolHeadNeckSurg2009；141:52-8)。表明CD44的敲减极大地削弱了裸小鼠中的肿瘤生长(图1A)(P<0.05)(PerezA等人CD44interactswithEGFRandpromotesheadandnecksquamouscellcarcinomainitiationandprogression.OralOncol.2013；4:306-13)。图1B显示表皮生长因子受体(EGFR，即一种主要HNSCC分子驱动物)及其磷酸化形式(Y1068)在CD44-siRNA异种移植物上是减少的，表明两种分子在功能上是相关的。

因为CD44在肿瘤起始中的已知作用(PrinceME等人IdentificationofasubpopulationofcellswithcancerstemcellpropertiesinheadandnecksquamouscellcarcinomaProcNatlAcadSciUSA2007；104:973-8)，所以评估来自癌症患者和对照的口腔漱洗液中的solCD44。已显示该测试将HNSCC与正常对照和患有头颈部良性疾病的那些准确地区分开(FranzmannEJ等人SalivarysolubleCD44:apotentialmolecularmarkerforheadandneckcancer.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2005；14:735-739；FranzmannEJ等人SolubleCD44isapotentialmarkerfortheearlydetectionofheadandneckcancer.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007；16:1348-1355；FranzmannEJ等人SalivaryproteinandsolCD44levelsasapotentialscreeningtoolforearlydetectionofheadandnecksquamouscellcarcinoma.HeadNeck.2012；34:687-95)。还发现通过简单的劳瑞样测定测量的总蛋白在HNSCC中与对照相比是升高的(FranzmannEJ等人SalivaryproteinandsolCD44levelsasapotentialscreeningtoolforearlydetectionofheadandnecksquamouscellcarcinoma.HeadNeck.2012；34:687-95)并且组合的solCD44和总蛋白水平将HNSCC与对照比单独任一标记物更有效地区分开(FranzmannEJ等人SalivaryproteinandsolCD44levelsasapotentialscreeningtoolforearlydetectionofheadandnecksquamouscellcarcinoma.HeadNeck.2012；34:687-95；PereiraLH等人Salivarymarkersandriskfactordata:amultivariatemodelingapproachforheadandnecksquamouscellcarcinomadetectionCancerBiomark.2011；10:241-9)。

多机构、盲的、频率匹配的、病例对照研究(n＝300)：

招募150个口腔癌病例和150个频率匹配的基于临床的对照。在2007年和2012年间从迈阿密大学医学院校园(UniversityofMiamimedicalcampus)的私人初级保健诊所和JeffersonReaves,Sr.健康中心(由JacksonMemorialHospitalSystem经营的市区县诊所)招募对照。当执行solCD44和蛋白测定时，研究人员对病例对照状况是不知情的。在破盲之前，由PI做出资格决定。

病例和对照的整个群组(n＝300)处于烟草相关恶性肿瘤的高风险下，这是由于78％具有吸烟史且大约50％中度或重度饮酒。大约40％来自两个组的人由于不良的口腔卫生而缺失6颗或更多颗牙齿。病例组包括53％JMH(县医院)受试者，44％超过60岁，81％是男性，17％是黑人，且51％是西班牙人。在包括年龄、性别、种族人种、口腔卫生(掉落的牙齿数目)、吸烟史、饮酒习惯或从县医院对比私人医院系统招募的数量的关键协变量方面，在病例与对照之间不存在显著差异(p<0.05)。

solCD44和总蛋白水平两者在病例中与对照相比是升高的(solCD44：5.50ng/mL对比2.87ng/mL，p<0.0001；蛋白质：0.94mg/mL对比0.76mg/mL，p＝0.007)。基于在病例和对照组之间和之内的风险因素或人口统计变量方面的差异来检测标记物水平。当考虑了年龄、性别、种族/人种、吸烟习惯或饮酒习惯时，SolCD44和蛋白水平在p<0.05水平下在病例中与对照相比一般较高。在solCD44水平中基于年龄的显著差异(在年长患者中水平较高)见于病例组中。

肿瘤特征如阶段和p16状态(当可获得组织时测量的HPV的替代物)(Lin等人Long-termprognosisandriskfactorsamongpatientswithHPV-associatedoropharyngealsquamouscellcarcinoma.Cancer.2013)不显著地影响solCD44或蛋白水平，例外的是对于CD44而非logCD44看到肿瘤大小的差异(T1-T2对比T3-T4；CD44：4.23ng/mL对比6.4ng/mL，p＝0.026)。基于这些研究结果，开发一种逻辑回归模型以便基于log2solCD44、蛋白和年龄将HNSCC与对照区分开。尽管有极高的风险和各种群组，该模型仍具有0.69的精度，如通过曲线下面积(AUC)所测量(表3)。

美裔非洲人(特别是男性)以较低的总存活率不成比例地患有口腔癌。使用包括solCD44、蛋白和年龄的多变量逻辑回归模型通过种族、人种和性别进行子集分析以评估群体之间的差异。黑人男性子集的结果显示该模型以AUC＝0.89将HNSCC患者与对照准确地区分开(表4)。为每个黑人男性受试者计算基于回归模型的概率得分。如果预测概率超过或等于0.3418，那么像预期的那样来预测观察结果。在此切入点下，灵敏度是100％且特异性是71.4％，期中精度在87.1％下。

对于其他种族/人种和性别组，包括solCD44、蛋白和年龄的预测模型产生以下AUC：非西班牙白人男性＝0.76；西班牙白人男性＝0.76；所有女性＝0.64。单独模型分量的优势率并没有达到显著性，可能是由于小样本规模，例外的是黑人男性的年龄，以及西班牙白人男性的年龄、logsolCD44和蛋白(下表5)。因此，不同于黑人男性，在西班牙男性中的蛋白水平与显著的保护作用有关。

社区群组早期检测和预防研究：将Bankhead-Coley(BHC)研究项目补助金用于研究社区群组中的solCD44/蛋白测试。招募并测试150个黑人受试者，并且获得基线标记物水平。BHC受试者在风险因素和人口统计方面类似于来自基于门诊的试验的黑人病例，例外的是他们平均年龄要小十岁(51岁对比61岁，p<0.05)并且在BHC研究中存在较小比例的西班牙裔黑人(<1％对比27％，p<0.05)。将在基于门诊的研究中为黑人男性衍生的模型和切入点(表5)应用于BHC研究中的黑人男性并且发现81(92.05％)被预测为对照且7(7.95％)被预测为病例。这七个“假阳性”中的一个发展成肺癌，通过在基线阳性solCD44/蛋白测试之后14个月进行的活组织检查诊断出。另一个受试者具有前列腺癌病史和正常的基线检查，但还具有高概率标记物结果。他在以后年度随访时进行的口腔漱洗液收集之后9个月发展成恼人的粘膜白斑病。此受试者中的标记物水平是升高的且活组织检查待定。因此，甚至一些“假阳性”也可能是发展成或具有远端疾病的真阳性。

标记物测试在基于社区的BHC群组中比基于门诊的群组更具特异性(92％对比71.4％)。SolCD44水平在BHC群组中比基于门诊的对照黑人群组中要低，对于log2CD44达到了界线显著性(CD44：1.85ng/mL对比2.67ng/mL，log2CD44：0.69ng/mL对比1.14ng/mL；p＝0.057)。这表明基于门诊的群组是比基于社区的群组风险更高的组。支持该观点的是，发现150个基于门诊的受试者中有超过10％对比小于1％的BHC群组具有早先的癌症病史。具有早先癌症病史的基于门诊的对照与没有早先癌症的对照相比具有显著增加的solCD44(中值3对比2.2ng/mL，p<0.05)和蛋白(中值1.03对比0.64mg/mL，p<＝0.05)水平。

在基于门诊的研究中由于频率匹配准则存在9个黑人女性病例。具有两种性别的模型还显示有利的AUC(表6)。

SolCD44/蛋白测试在癌症可见之前对其进行检测：来自早先研究(18)的具有升高的口腔漱洗液solCD44水平且无疾病(假阳性)的两个对照受试者发展成严重的发育异常且在2-3年后变成侵袭性癌。基于回归树模型处于风险中的两个以上基于门诊的对照参与者在随访期间发展成原位癌或侵袭性癌。来自BHC研究的患者现已发展成肺癌并且在诊断之前14个月具有升高的标记物水平。具有恼人的口腔损伤、前列腺癌病史及升高的solCD44和蛋白水平的另一个受试者有待接受口腔活组织检查。

升高的solCD44和蛋白水平与不良预后有关：图2A至图2C显示存在随访的150个基于门诊的病例中的137个的PFS。在149个可评价的受试者中有59例死亡(中值随访22.9个月，范围：0.7至65.1个月)且137个可评价的受试者中有68个进展事件。平均3年PFS和总存活率(OS)分别是48.8％和54.7％。solCD44(>10ng/mL)和总蛋白(>1mg/mL)的高水平与降低的PFS有关。在单变量分析中，PFS以及OS的预测因素是CD44(作为连续/分类形式)、蛋白(连续/分类)、阶段、T4阶段、种族(黑人种族结果更差)以及年龄。性别、吸烟和饮酒状况、以及部位(口咽对比口腔)都不是显著的预测因素。P16仅可用于病例子集；p16-对比p16+的作用对于PFS是显著的(HR2.201，p＝0.0458，n＝73)而对于OS(HR1.531p＝0.2941，n＝79)则不是。在模型中针对CD44和蛋白使用逐步选择的多变量分析(排除p16)产生对于PFS和OS的共同模型，包括：CD44、蛋白、阶段、种族和年龄。在此模型下，solCD44水平≥10对PFS(HR2.628，95％CI：1.325，5.210，p＝0.0057)和OS(HR2.103，95％CI：1.031，4.291，p＝0.0411)存在独立的风险效应。蛋白≥1mg/mL的风险效应对于PFS接近显著性(HR1.571，95％CI：0.906，2.725，p＝0.1079)，而对于OS则不接近显著性(HR1.459，p＝0.215)。这些研究结果显示升高的solCD44和蛋白水平与更具侵袭性的疾病有关。因此，口腔漱洗液测试可鉴别最需要早期检测的疾病。

使用口腔漱洗液测试针对HNSCC的筛选检测远处部位处的癌症：SolCD44和蛋白水平在包括以下的其他部位处具有早先癌症病史的基于门诊的对照中是升高的：前列腺(7)、结肠(2)、膀胱(2)、黑色素瘤(2)、白血病/淋巴瘤(1)、乳腺(1)、以及骨肉瘤(1)，这支持标记物可反映UADT之外的癌症风险。BHC对照中的一个在升高的口腔漱洗液标记物测试之后14个月发展成肺癌。在基于门诊的研究中，如果在收集之时发现在UADT外的部位处具有癌症，则将病例和对照参与者排除在主分析之外。由于这个缘故，排除了两个病例和3个对照。兼有结肠和HNSCC的一个病例具有64.2ng/mL的solCD44水平，这是正常水平的22倍。具有远端癌症的3个对照中的一个患有膀胱癌，其中solCD44水平是14ng/mL且蛋白水平是1.5mg/mL。因低级口腔初癌的可能性而被排除的另一个对照具有4.8ng/mL的solCD44水平和1.3mg/mL的蛋白水平并且继续发展成肺癌。此数据显示solCD44和蛋白水平可在疾病在临床上被识别之前指示在更远端部位处的该疾病。

实验步骤1

社区群组招募和筛选场所：在社区群组的食物储蓄站招募受试者，该食物储蓄站每周供应1000名个体以及一项住房计划。西尔维斯特癌症中心差异和社区推广的核心(SylvesterCancerCenter’sDisparitiesandCommunityOutreachCore，DCO)推动此基于社区的合伙的成功。

受试者：在2年内完成150名受试者的招募。如果患者在其一生中具有100根或更多根烟的吸烟史且如果其在40岁以上，那么便招募该患者。平均年龄是51.2岁，58.7％是男性，100％是黑人且99.3％是非西班牙人。招募117名参与者。其中，74名回去接受第一和或第二次年度随访且5名仍在随访窗中。

调查问卷：知情同意之后，临床研究人员实施调查问卷以收集关于可能影响结果分析的潜在协变量的详细信息。该调查问卷是基于BRFSS调查并且包括询问年龄、种族、人种、性别、吸烟和饮酒、社会经济状况(SES)、教育、营养及口腔卫生(参见SurveyInstruments)。所有这些都是牵涉作为头颈部癌症的可能的风险因素。询问患者关于UADT的良性疾病史的症状并且进行包括癌症的器官系统疾病的评估。参与者列出其处方药、草药疗法、非处方药及维生素并且询问关于他们最近何时使用烟草产品或嗽口水、刷牙或是吃了或喝了什么东西。

头颈部检查：在实施知情同意和调查问卷之后，PI(即，有经验的头颈部外科医生)便进行标准的头颈部检查，包括前灯辅助检查、口腔、舌根和颈部的触诊、脑神经检查、鼻检查及喉镜检查。记录可代表恶性肿瘤的白色或红色、隆起的或溃疡性病灶并且进行活组织检查。指出如回流改变和感染的其他异常并如指示转诊。在社区群组场所对具有不足以恼人到保证活组织检查的反应性病灶和溃疡的患者进行随访，而需要治疗或活组织检查的那些则去UM或JMH头颈部门诊就医。考虑龋齿和牙周病的相对数量并且以0至2的量度评分。所有异常连同诊断日期一起被编制输入数据库。

口腔漱洗液的收集和处理：可使用口腔漱洗液而不是血清测量，因为血清中的solCD44水平很大程度上受到源自于正常上皮区室的变体同工型的污染(VanHalNL等人EvaluationofsolubleCD44v6asapotentialserummarkerforheadandnecksquamouscellcarcinomalClinCancerRes1999；5:3534-41)。口腔漱洗液主要是由盐水和少量唾液组成并且接触UADT粘膜。研究人员在筛选场所处从受试者收集口腔漱洗液。在收集之前至少1小时，受试者被要求禁止口腔卫生清洁操作、吸烟、吃饭和饮水(NavazeshM.Methodsforcollectingsaliva.AnnNYAcadSci1993；694:72-7)。以0至2的量度对HNSCC患者的漱口液进行评分。收集之后，将样本冷藏、在冰上转移到实验室、离心，分离沉淀物，将漱洗样本分级并且将这些级分和沉淀物储存在-80℃下。

随访：在研究持续期间进行年度口腔漱洗液收集、调查问卷以及身体检查。

数据收集：使用预印刷的日志记录检查研究结果并且输入到数据库中。调查问卷、日志及口腔漱洗液样本不含识别信息，但用那个受试者所独有的代码来标记。主日志将识别信息与此数目相关联。保持此主日志与用于分析的数据库分开以保持对患者保密且在进行测定时是不知情的。

SolCD44和蛋白测试：根据如多个出版物中具有修改(17-20)的由制造商提供的说明书(BenderMedSystems)进行solCD44ELISA测试。分批测试样本并且在全浓度下测量。根据如先前出版的制造商方案进行蛋白测定(Bio-RadLaboratories)(Franzmann等人SalivarysolubleCD44:apotentialmolecularmarkerforheadandneckcancer.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2005；14:735-739；Franzmann等人SolubleCD44isapotentialmarkerfortheearlydetectionofheadandneckcancer.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007；16:1348-1355；Franzmann等人SalivaryproteinandsolCD44levelsasapotentialscreeningtoolforearlydetectionofheadandnecksquamouscellcarcinoma.HeadNeck.2012；34:687-95；Pereira等人Salivarymarkersandriskfactordata:amultivariatemodelingapproachforheadandnecksquamouscellcarcinomadetection.CancerBiomark.2011；10:241-9)。通过样本代码将结果输入数据库中，将该数据库与含有患者信息的数据库保持分开直到分析。

质量控制：基于已定义的质量控制准则重复在接受范围外测试的样本。例如，最高标准的吸光度可在1.5-2.5的范围内。单个样本和板间变异性被接受为至多10％CV。允许高达20％CV的板间变异性。在1/2浓度下重复超过最高标准的水平。在同一天且于ELISA板上进行所有重复测量(例如，针对个人受试者每年收集)以降低技术变异性。

示范数据：在基线处且在首次年度随访时获得51名BHC受试者的标记物水平结果。在一年期间在个人参与者的标记物水平中量化变化，然后将这些变化绘制成直方图。总体上，对于solCD44、log2CD44和蛋白，参与者的最高百分比倾向于具有接近零中值的波动。年平均solCD44水平从1.63降低到1.48ng/mL(p＝0.0185)(图3和表7)，显示风险是降低的。在CD44方面的变化伴随有log2CD44的显著变化，而蛋白则一点也不改变。

统计分析：这是在总共5年期间每年都进行的一项150名受试者的纵向研究。solCD44和蛋白的水平可在招募时收集且随后高达4倍。预期将随着时间以不等的时间间隔对每名受试者进行不等次数的观察，并且为此设计分析方法。视需要将标记物数据进行对数转化以稳定方差并提高正态分布拟合。时间序列图是用于描述个体和总体轨迹，例如，CD44表达方面的变化是通过将研究受试者的平均水平连同个体受试者值作为整体时间的函数进行绘制并且通过说明变量来描述。重复测量的一般混合效应模型是用于描述标记物水平随时间的变化，其中调整如性别、年龄等说明变量。时间与所预期的说明变量之间相互作用的显著性是在于标记物表达随时间的不同模式可针对由这些变量中的一些所限定的亚组找出。对于随机效应模型使用PROCMIXED程序在9.3中进行分析。根据标准统计准则选择代表测量值之间的依赖性的方差-协方差矩阵的结构。进行时间之间以及在选定时间下亚组之间的后hoc配对比较，其中进行调整以保持总I类误差率。

研究能力说明：为简明起见，基于150名受试者展示能力说明，每人两次重复观测，且有两个组(例如吸烟类别)。比较配对数据(例如，基线比对1年随访)的150名受试者的总体研究规模具有80％能力，该能力是基于配对t检验在5％的双侧显著性水平下用于检测0.23的效应大小。对于在100或50名受试者(例如当前吸烟者)的较小组尺寸内的两个时间之间的比较，80％能力是用于分别检测0.28或0.40的效应大小。对于两样本比较，例如，在给定时间下(例如在招募时)50名当前吸烟者比对100名早先吸烟者，基于两样本t检验，在5％的双侧显著性水平下，存在80％能力来检测0.56的效应大小。

实验步骤2

理想的早期检测测试鉴别在可逆阶段下的HNSCC。这提出了一个挑战，因为早期疾病经常是不可见的(PohCF等人Directfluorescencevisualizationofclinically occulthigh-riskoralpremalignantdiseaseusingasimplehand-helddevice HeadNeck.2007Jan；29(1):71-6)。分子成像可能有用，但没有离散的病变，对于患者不存在切除选择。因此，最佳的是进行干预以减小其中病变仍不能被鉴别的受试者的风险。有证据支持血清中的CD44同工型在戒烟之后降低。在实验步骤2中，可以表明口腔漱洗液中的solCD44和蛋白水平随着戒烟而降低。

招募总共125名受试者。其中，23名表示他们在3个月时停止吸烟且15名表示他们在1年时停止吸烟。在至少3个月的戒烟者中，已在15人上获得可替宁确认。solCD44和蛋白水平的可用的结果在表8中给出。大部分这些受试者具有等于或低于对照平均值的标记物水平(solCD44＝1.85ng/mL，蛋白＝0.63mg/mL)。

受试者：受试者是成功地戒烟至少3个月但没有癌症或初癌的那些人。参与者主要通过社区群组区域中的社区组织并通过县级招募工作来招募。招募不管其是否参与干预方案(例如，组或个体咨询、尼古丁替代等)仍试图戒烟的吸烟者。优先招募处于较高HNSCC风险下的40岁以上的那些人。

戒烟计划：使吸烟者找到满足其需要的资源(例如，佛罗里达州戒烟热线，初级护理、自助材料、或咨询计划)。使对行为治疗与尼古丁替代组合感兴趣的当前吸烟者找到UM门诊以便干预。该计划包括使用认知行为策略进行基于组的强化咨询。当参与者完成其优选的戒烟计划时对其进行随访并且通过电话和邮件与参与者保持联络。

口腔漱洗液、唾液样本和调查问卷：受试者在戒烟之前于戒烟门诊提供口腔漱洗液、唾液样本并且完成调查问卷。血清solCD44水平在停止吸烟之后的首个4周内下降了20-30％，因此，排除在收集之前超过一周已停止吸烟的受试者(ScottDA等人Plasmaconcentrationsofreputedtumor-associatedsolubleCD44isoforms(v5andv6)insmokersaredose-relatedanddeclinewithsmokingcessation.2000CancerEpidemiolBiomarkPrev2000；9:1211-4)。将全部非刺激性唾液收集到样本杯中并持续5分钟。冷藏唾液样本直到分析。在基线(戒烟之前)、并且在戒烟之后3个月和1年时实施收集和问卷调查。

SolCD44、蛋白和可替宁测定：可替宁是一种主要的烟碱代谢物并且已经广泛用作烟草暴露的生物标记物。唾液可替宁水平是使用试剂盒(Salimetrics)根据制造商说明书来测量唾液的可替宁水平。因此进行SolCD44和蛋白。

随访：在戒烟门诊中对患者进行随访。口腔漱洗液和调查问卷在三个时间点。

数据收集：关于停止吸烟的资料(包括取样日期和调查问卷施用、戒烟开始日期和戒烟结束日期)被记录在日志上并且使用隐私保护输入数据库中。

统计分析：solCD44、蛋白及可替宁的水平是从在戒烟后3个月和1年时招募到戒烟计划中的所有研究受试者处收集。使用双样本t检验或多重回归模型在完成戒烟计划之后就标记物水平对戒烟者与非戒烟者进行比较以允许对说明变量进行调整。在成功的戒烟者中对所关注标记物的纵向数据分析类似于如上所述从受试者及标记物水平随时间变化的组绘图(groupplots)开始的那个。

研究能力说明：作为能力的说明，用于配对数据比较(例如，戒烟计划前对比完成之后3个月和1年)的由30名戒烟者组成的研究规模具有80％能力以便基于配对t检验及在5％的双侧显著性水平下0.5的配对观测值之间的相关性来检测0.53的效应大小在当前吸烟者中log2solCD44的测量平均值(及标准偏差)是1.6(0.7)；因此，效应大小0.53对应于0.4(0.86)的平均差，也就是说在log2solCD44方面有25％降低(从1.6至1.2)。在戒烟计划完成之后3个月就标记物水平对戒烟者与非戒烟者进行比较，在5％的双侧显著性水平下基于双样本t检验，80％能力用于检测0.62的效应大小，假设30名戒烟者和90名非戒烟者的研究规模。

实验步骤3

纳入标准：如果其新近被诊断出且活组织检查证明口腔或口咽的鳞状细胞癌，那么纳入受试者(n＝30)。在统计分析中指出并解决治疗(例如手术、化疗、放疗)。受试者是从在UM和JMH处的头颈部门诊招募来。诊断是由手术病理报告证实。

排除标准：排除具有任何涉及UADT的组织学的早先癌症的患者。排除具有下咽、鼻咽、鼻旁窦、食道、唾液腺或喉中或喉以下的原发性鳞状细胞癌病史的患者。排除孕妇或女性护士。排除除皮肤鳞状或基底细胞癌外在另一部位处具有任何早先癌症病史的患者。

口腔漱洗液收集、solCD44和蛋白测定、数据收集：所有的收集(包括调查问卷)和测定程序如本文所述。完整的AJCC阶段分期信息、包括p16状态的病理特征(每个机构标准)、以及给定治疗(例如化疗、放疗、手术)的类型和持续时间有待被记载。

在治疗之前和之后的肿瘤测量：使用标准RECIST(实体肿瘤反应评价标准(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors))来确定测量(EisenhauerEA等人Newresponseevaluationcriteriainsolidtumours:revisedRECISTguideline(1.1 版).EurJCancer.2009；45:228-47)。肿瘤必须通过标准成像来测量。成像时间点是每个机构的方案。

口腔漱洗液收集的时间点：在诊断时(基线)以及如果给予放射线(由于放射线在给予最后一次剂量之后继续发挥作用持续约3个月)那么在完成疗法之后三个月时且如果不给予放射线那么在完成疗法之后1个月时收集口腔漱洗液。

统计分析：经确定solCD44标记物水平随着对治疗的反应而降低。分析数据包括1)来自口腔漱洗液的solCD44和蛋白结果以及2)治疗之前和之后的肿瘤测量值，3)肿瘤特征、治疗及风险因素(例如吸烟)的描述。就平均值和标准偏差对定量变量(如solCD44和总蛋白)进行概括。视需要转化数据以提高正态拟合。分类变量被概括成计数和百分比。检查所有标记物在治疗之前至治疗之后的变化情况。这对应于纵向设计，其中solCD44和蛋白的水平是在治疗前和治疗后收集。一般混合效应模型被用于重复测量以描述标记物水平在治疗前对比治疗后的变化，其中在小样本规模下对协变量有调整。对于随机效应模型使用PROCMIXED程序在9.3中进行分析。根据标准统计准则选择代表测量值之间的依赖性的方差-协方差矩阵的结构。进行时间之间以及在选定时间下亚组(例如，种族类别)之间的配对比较，其中进行调整以保持总I类误差率。

研究能力和精度：病例可对治疗具有完全反应(CR)，这取决于其吸烟状况(BrowmanGP等人Influenceofcigarettesmokingontheefficacyofradiationtherapyinheadandneckcancer.NEnglJMed.1993；328:159-63)。对于在15名CR患者的亚组(50％CR率)中在治疗之前至治疗之后标记物水平的评价，可具有80％能力以在5％的双侧显著性水平下基于配对t检验检测0.67的小至中等效应大小。假定有21名CR患者(CR率为70％)，存在80％能力来检测0.55的效应大小。

实施例2：HPV阳性鳞状细胞癌、CD44、和HPV阳性子宫颈感染

方法

在2007年1月和2013年9月之间根据方案招募患有HNSCC的150名患者和150名对照。他们在年龄、人种、吸烟及饮酒上是频率匹配的。他们是从耳鼻喉科门诊和癌症中心招募来的。对照受试者如果在门诊摄入调查问卷时对于吸烟或饮酒回答“是”，那么便联系这些对照受试者。如果他们具有潜在恶性病状，便排除这些对照。病例受试者全部是活组织检查证明有所有阶段和部位的头颈部鳞状细胞癌的患者。排除患有鼻咽癌的那些。还排除怀孕的或感染了HIV的受试者。

鉴别患有口咽癌的31名女性的亚组，并且使用IHC测试21名的HPV替代标记物p16。对其病历进行审查以验证口咽HPV状态。完成另外的病历审查，以便经由PAP涂片记录和初级护理注释评定子宫颈HPV状态。鉴别34名女性对照的亚组。为这些受试者完成另外的病历审查，以便经由PAP涂片记录和初级护理注释评定子宫颈HPV状态。如果他们至少显示意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)迹象，那么便考虑PAP涂片化验为阳性。

口腔漱洗液收集

用5mL生理盐水漱口5秒并且在口中摇晃5秒，然后存放到样本杯中。将唾液置于冰上以便运输并且储存在80℃下。

蛋白测定

使用BioRad蛋白测试(BioRad,Hercules,CA)来测定总蛋白浓度。蛋白估算一式两份进行。

可溶性CD44测定

口腔漱洗液样本中的solCD44浓度通过使用酶联免疫吸附测定(BenderMedSystems,Vienna,Austria)来测定。所有都是正常CD44的变体同工型。将样本涡流，离心并且上清液被用于研究。所有实验都是一式两份进行。统计分析通过Mann-Whitney-Wilcoxon(MWW)进行。进行零假设的非参数检验。

结果

人口统计特征

对照组由34名个体组成。存在3％非西班牙裔白人、6％西班牙裔黑人、44％非西班牙裔黑人、以及47％西班牙裔白人。在31名个体的病例组中，29％是非西班牙裔白人，26％是非西班牙裔黑人，并且45％是西班牙裔白人。

口咽鳞状细胞癌和p16状态

在21名个体的组中，36％是p16阳性。在这些p16阳性个体中，4名是非西班牙裔黑人且4名是西班牙裔白人。剩余64％是p16阴性的。

子宫颈PAP涂片

在19名个体的对照组中，26％具有阳性PAP涂片，而74％具有阴性PAP涂片。在8名个体的病例组中，38％具有阳性PAP涂片，而62％具有阴性PAP涂片。基于对照中PAP涂片结果的solCD44和蛋白水平的差异可见于图4A和图4B中。

讨论

实现p16测试的度量是对具有口咽鳞状细胞癌的所有患者进行。阳性PAP涂片被显示为口咽鳞状细胞癌的潜在风险因素。阳性PAP涂片的发生率在病例中比对照更高。solCD44的水平在具有阳性PAP涂片的患者中比没有阳性PAP涂片的那些人更高。

Biron等人表示在口咽鳞状细胞癌患者中与一般人群相比发展成子宫颈癌的风险增加。已显示，该风险是至少25倍大并且更常见存在有扁桃体肿瘤(55％)，其次是舌根肿瘤(25％)。两项先前研究检查负相关：在患有子宫颈癌的大的女性群组中第二原发性肿瘤的比率；并且发展成口咽鳞状细胞癌的风险与一般人群中的女性相比是增加的。流行病学相关性反映了子宫颈与口咽之间的HPV的可能的共感染。

一个病例显示患者具有子宫颈HPV的高风险且其次是子宫颈癌和p16口腔癌。患有p16口咽鳞状细胞癌的另一个患者通过原位杂交得出是p16阳性和HPV阳性的，其之前具有25年的子宫切除术史。

实施例3：口腔癌筛选的风险分层系统

一种多机构、病例对照、基于医院的设计被用于测定来自150名口腔癌患者和150名对照的口腔漱洗液中的可溶性CD44(CD44)和总蛋白水平，150名对照是关于年龄、性别、种族、人种、吸烟和饮酒、以及社会经济状况(SES)在频率上匹配的。执行多变量分析以确定标记物与病例/对照状态之间的相关性。测定病例中的无进展存活率(PFS)和总存活率(OS)。来自正在进行的基于社区的口腔癌筛选计划(n＝150)的受试者被充当参考对照并且在1年内对水平进行追踪以评定标记物水平变化。

多变量递归分割基于各自对于CD44和蛋白的2个切入点将基于医院的受试者分成5个组。CD44≥5.33ng/mL与病例状态高度相关(调整的OR14.714，95％CI：6.094，35.527；p<.0001，对比最低风险组CD44<2.22ng/mL和蛋白<1.23mg/mL作为参考)。当CD44水平<5.33ng/mL时，总蛋白帮助预测病例状态。CD44≥5.33ng/mL与不良的PFS(调整的HR＝3.588，95％CI：1.558，8.265，p＝0.0027)和OS(调整的HR＝2.882，95％CI：1.165，7.130，p＝0.022)有关。对于保留在基于社区的筛选试验中1年的受试者(n＝95)，标记物水平显著地下降(CD44：24％，p<.0001，蛋白：16％，p＝0.036)。

研究方案

受试者是在2007年与2012年间从迈阿密大学西尔维斯特综合癌症中心(UM)和杰克逊纪念医院(JMH)门诊处招募。根据世界医学协会的道德规范(赫尔辛基宣言)，所有实验都要在每个受试者知情同意的情况下实施。此项研究评估150名口腔癌患者和150名对照中的可溶性肿瘤标记物，150名对照是关于年龄、性别、种族、人种、吸烟和饮酒、以及社会经济状况(SES)在频率上匹配的。口腔癌病例包括新近诊断的、患有累及口咽(OP)和口腔(OC)的HNSCC的先前未治疗的受试者。受试者同样招募自UM(为医保患者服务的一个私立大学医院系统)和JMH(主要为低收入患者服务的一个县医院系统)。受试者完成基线调查问卷，包括人口分布、行为风险因素和SES。对于病例来说，有关肿瘤特征和结果的数据是提取自医疗记录和肿瘤登记。排除具有为癌症担忧的病变的对照。排除HIV阳性或怀孕个体。排除决定是在不知晓标记物水平结果的情况下做出。

为了验证，纳入一个对照群组，其是由具有吸烟史或饮酒史的150名个体组成，他们来自Miami-Dade县北部的低收入社区。随着时间的推移对此社区群组进行随访；获得并测量基线和年度随访口腔漱洗液以评定标记物在筛选人群中的变化。还纳入主要是不吸烟者的21名正常志愿者的另一个对照群组。且最后，纳入27名口腔和口咽病例以及39名具有UADT的风险因素和良性疾病史的对照，其水平已被测试作为先前基于医院研究的一部分(Pereira等人CancerBiomark2011；10:241-9)。

实验室分析

使用先前公布的工序(Franzmann等人HeadNeck2012；34:687-95；Pereira等人CancerBiomark2011；10:241-9；Franzmann等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007；16:1348-55)收集口腔漱洗液样本。solCD44(正常的和变体同工型)的水平是使用具有先前公布的修改的夹层ELISA测定(eBioscience)来测量。DC蛋白测定(Bio-Rad实验室)是使用如先前公布制备的唾液样本根据制造商方案进行(Franzmann等人Head&neck2012；34:687-95；PereiraLH等人CancerBiomark2011；10:241-9；Franzmann等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007；16:1348-55)。每个样本一式两份测试并且技术人员对疾病状况不知情。吸光度是在微板读数器(Bio-Rad实验室)中读取并且浓度是使用标准曲线来测定。

当可用时，将福尔马林固定的和石蜡包埋的样本从病例中取出(n＝79)。使用p16INK4A免疫组织化学(IHC)评定HPV状态，其是HPV状态的可接受的替代标记物(Hafkamp等人InternationalJournalofCancer2008；122:2656-64；El-Naggar等人HeadNeck.2012,34:459-61)。根据制造商IHC方案对68个样本执行p16INK4A。HPV状态也通过病历审查，借助于IHC(n＝10)或原位杂交(ISH)(n＝1)来评定。由对患者的临床资料不知情的研究病理学家(CG)对所有样本进行审查。如果在≥50％的肿瘤样本中存在强烈且弥漫性的核与细胞质染色，便将p16INK4A表达评为阳性(El-Naggar等人HeadNeck.2012；34:459-61)。

统计分析

使用卡方检验或费舍尔氏精确检验，关于潜在重要的绝对协变量的分布对患者组进行比较。将关于CD44的数据log₂转化以稳定方差估计并提供对正态分布的拟合。使用Studentt检验或方差分析(ANOVA)分析连续变量，然后是费舍尔氏最小显著性差异检验用于配对平均比较，以及预定对比的检验。使用逻辑回归分析来评定标记物与口腔癌风险之间的相关性。用相应的95％置信区间(95％CI)和用于拟合模型的操作特性曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)来报告优势率(OR)估算值。同样，灵敏度、特异性和精度的估算值是从拟合的多变量逻辑模型推导出，其包括标记物与协变量之间的显著相互作用以及包括风险组的模型，该模型是基于使用在R包MVPART(v.1.6.1.)和RecursivePartitioningandRegressionTrees(RPART),1.6-0版中执行的多变量递归分割分析(Breiman等人1984ClassificationandRegressionTrees.Wadsworth,Belmont,CA)得出的CD44和蛋白的切入点。Kaplan-Meier和Cox回归模型是用于评估PFS与总OS。报告危险比率(HR)估算值和相应的95％CI。使用SAS9.2版(SASInstitute,Inc.)和R包执行统计分析。

结果

基于医院的病例对照研究的特征

包含150名患有口腔癌的患者和150名对照的基于医院的病例对照研究的描述概述于表9中。

表9.病例和对照的特征

¹饮酒习惯：不饮酒/轻度：过去饮酒≤2杯/天或现在饮酒≤2杯

/天，持续1-15天/月；中度：过去饮酒3至<5杯/天或现在饮酒≤2杯/天持续16-30天/月或≥3杯/天持续1-15天/月；重度：过去饮酒5或更多杯/天或现在饮酒≥3杯/天，持续16-30天/月。

关于年龄、性别、种族、口腔卫生(掉落的牙齿数目)、吸烟史、饮酒习惯或他们是从县医院(JMH)抑或私人医院(UM)系统招募，在病例与对照之间不存在显著差异。表10显示病例中的癌症特异性特征。OP患者很可能处于晚期(III/IV对比I/II；p<.0001)，与OC患者相比显示更高级的N-状态(N1-N3对比N0，Nx；p<.0001)且具有HPV+比对HPV-肿瘤(p<.001)。

表10.在150个病例中由疾病部位确定的阶段和HPV状态

Log₂CD44(下文称为CD44)和总蛋白是在病例和对照组内关于风险因素或人口统计变量来评估(表11)。当考虑了年龄、性别、种族/人种、吸烟习惯或饮酒习惯、牙齿脱落或漱口能力时，CD44和蛋白水平在p<0.05下在病例中与对照相比更高。CD44水平在病例组中而不是在对照组中随年龄(在年长的患者中水平更高)、嗽口(在漱口能力较差时，水平更高)、及牙齿脱落(在牙齿脱落较多时，水平更高)而显著不同。CD44和蛋白的水平并不因TNM状态或HPV状态而显著不同。

表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的log₂solCD44和蛋白水平

表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔

漱洗液中的log₂solCD44和蛋白水平

风险建模

在单变量分析中，CD44和总蛋白将癌症病例与对照区分开，其中优势率是：在2.036的CD44中有一个单位的增加(95％CI：1.552，2.671，p<0.0001，AUC＝0.68)且在2.159的蛋白中有一个单位的增加(95％CI：1.288，3.617，p<0.0035，AUC＝0.59)。在对重要变量及其相互作用调整之后，AUC提高至0.757；CD44的OR增至2.668(95％CI：1.794，3.968p<.0001)，而蛋白的优势率变得小于1且无显著性(OR＝0.661，95％CI：0.312，1.399，p＝0.279)(表12组A)。

在患有口咽HNSCC的不吸烟者中常见的HPV+肿瘤与烟草和酒精诱发的肿瘤相比具有较佳预后。由p16INK4A(代替HPV状态)分层的分析的研究结果类似于组合分析(Hafkamp等人InternationalJournalofCancer2008；122:2656-64；El-Naggar等人HeadNeck.2012,34:459-61)。在HPV组中，蛋白水平与多变量分析之后的显著保护作用有关(表12组B)。

将多变量递归分割和逻辑回归分析用于更好地理解CD44、蛋白与疾病存在预测之间的关系(表12组C)。分类树基于CD44和蛋白的2个切割点产生5个显著风险组，分类为组1(CD44<2.22ng/mL和蛋白<1.23mg/mL，n＝102)和组4(CD44≥2.22&<5.33ng/mL和蛋白≥0.558mg/mL，n＝116)中的“对照”受试者；以及组2(CD44<2.22ng/mL和蛋白≥1.23mg/mL，n＝5)、组3(CD44≥2.22&<5.33ng/mL和蛋白<0.558mg/mL，n＝20)和组5(CD44≥5.33ng/mL，不管蛋白水平，n＝57)中的“病例”受试者(表12组C)。CD44≥5.33ng/mL(不管蛋白水平)与病例状况高度相关(OR＝11.830，95％CI：5.279，26.508；p<0.0001，比较组5对比组1作为参考)。当CD44低于5.33ng/mL时，蛋白有助于确定风险的量级。例如，具有CD44<2.22ng/mL和蛋白>≥1.23mg/mL的患者(组2)与组1中的患者相比具有作为病例的显著更高风险(OR＝10.069，95％CI：1.079，93.93，p<0.05)。具有CD44≥2.22&<5.33ng/mL和蛋白小于0.558mg/mL的患者(组3)与组1相比也具有作为病例的显著更高风险(OR＝10.069，95％CI：3.103，32.672，p＝0.0001)。对于具有CD44≥2.22ng/mL&<5.33ng/mL和蛋白≥0.558mg/mL的患者(组4)，观察到作为病例的较低但显著的风险(OR＝2.192，95％CI：1.247，3.854，p＝0.006)。从包括人口统计和风险因素的多变量模型推导出的OR显示CD44水平≥5.33ng/mL仍然与病例状况高度相关(调整的OR＝14.714，95％CI：6.094，35.527；p<.0001)且总蛋白水平帮助预测病例状况(表12组C)。

表12.预测模型

标准逻辑回归，通过HPV状态来分层

表12.预测模型(续)

逻辑回归模型包括CD44-蛋白风险组(5类，p<0.0001)、年龄(≥60对比<60，p＝0.060)、性别(男性对比女性，p＝0.016)、种族/人种(WNH和WH对比黑人，p＝0.0027)、饮酒(曾有对比从不，p＝0.0103)、以及相互作用种族/人种×年龄(p＝0.0138)和性别×饮酒(p＝0.0063)。吸烟(曾有比对从不，p＝0.844)和牙齿脱落(6颗或更多颗或全部比对5颗或5颗以下，p＝0.274)不被纳入模型中，由于其纳入不会提高模型拟合。

表11组A显示更高百分比的HPV+受试者在风险组3中，而更高百分比的HPV-受试者在风险组4中。患有阶段IV疾病的患者在风险组1或5中与患有不算晚期的肿瘤的患者相比更常见(表13，组A)。

表13.在检测和确定HNSCC预后中的SolCD44/总蛋白测试

A.由HPV状态和阶段确定的每个风险组中的病例百分比

B.无进展存活率和总存活率

¹PFS的Cox成比例危险模型包括风险组(5类，p＝0.0181)、阶段(III/IV对比I/II，p＝0.0117)、种族(黑人对比其他，p＝0.0066)、人种(非西班牙人对比西班牙人，p＝0.5964)、性别(女性比对男性，p＝0.5779)、以及年龄(p＝0.2112)。

²OS的Cox成比例危险模型包括风险组(5类，p＝0.0750)、阶段(III/IV对比I/II，p＝0.0315)、种族(黑人对比其他，p＝0.0041)、人种(非西班牙人对比西班牙人，p＝0.1091)、性别(女性比对男性，p＝0.2663)、以及年龄(p＝0.0725)。

表13(续)

C.使用回归树模型的灵敏度和特异性

灵敏度

特异性

标记物的预后意义

由风险组确定的无进展存活率(PFS)和总存活率(OS)的Kaplan-Meier曲线展示于图5A和图5B中。由风险组确定的PFS和OS的未调整的和调整的危险比率(HR)估算值展示于表13组B中。基于肿瘤阶段、年龄、性别、种族和人种有调整的多变量分析，分到风险组5(高CD44)中的基于医院的病例与风险组1中的病例相比具有减小的PFS(调整的HR＝3.588，95％CI：1.558，8.265，p＝0.0027)和OS(调整的HR＝2.882，95％CI：1.165，7.130，p＝0.0220)。风险组2与减小的PFS具有临界相关性(HR＝3.863，95％CI：0.966，15.445，p＝0.056)且在OS中与风险组1中的病例相比无显著差异(HR＝2.406，95％CI：0.579，9.990，p＝0.2268)；然而，此组仅包括4个病例。

灵敏度和特异性

用于预测病例状况的灵敏度是80.7％(表13C)。这在2006基于医院的研究中是证实的(灵敏度77.8％)。33对于2012基于医院的病例，灵敏度在阶段I-III癌症中达到了88％(表13C)。特异性在基于医院的对照、处于HNSCC的高风险下的社区(n＝150，98％吸烟者，卫生条件恶劣)及主要是非吸烟者的正常志愿者中得到证实(表13C)。特异性在正常志愿者群组中是最大的(95.2％)。在进一步的评价中，发现超过10％基于医院的对照对比小于1％社区群组具有UADT之外的早先癌症病史。具有早先癌症病史的基于医院的对照与没有早先癌症的对照相比具有显著更高的solCD44(p<0.05)。

风险的逆转

在基于社区的群组中总共有95名患者提供基线和年度随访收集物。在1年内CD44和蛋白水平的变化分布分别展示于图5C和5E中。平均CD44水平在基线处是1.829ng/mL且在1年随访时是1.390ng/mL。-0.439ng/mL(24％)的CD44水平的年平均下降是显著的(p<.0001)。线性回归分析证实了对于较低CD44值的显著线性趋势(R2＝0.227，截距＝0.785(p<.0001)，斜率＝0.331(p<.0001))(图5D)。平均蛋白水平也从0.644显著地下降到0.543mg/mL(p＝0.036)，通过线性回归分析来证实(R2＝0.108，截距＝0.284(p＝0.002)，斜率＝0.402(p<.0001))(图5F)。为了确定这些改变是否归因于在测定条件下一年过程中的变化，将基线第二等分试样(基线2)在与年度随访收集相同的板上进行，其中81个这种配对用于每个测定(蛋白和CD44)。在基线2与每年随访之间的水平下降仅对于CD44是显著的(CD44：-0.296ng/mL，p＝0.023；蛋白：-0.013mg/mL,p＝0.796)，而线性回归显示朝向两种标记物的较低数量的显著趋势(CD44:R2＝0.227，截距＝0.882(p<.0001)，斜率＝0.288(p<.0001)；蛋白，R2＝0.155，截距＝0.256(p＝0.008)，斜率＝0.534(p<.0001)。通过基线2在基线1上的线性回归比较两条基线。对于CD44，相关性是高的(R＝0.899)，截距不是显著不同于零(p＝0.150)且斜率不是显著不同于1(p＝0.881)，指示这两个是等效物。对于蛋白，相关性也是高的(R＝0.925)，截距不是显著不同于零(p＝0.712)，但斜率显著不同于1(0.85，p<.001)，指示蛋白的基线之间的差异不在预期的随机变化内。

在中度(风险组4，n＝14)或高风险(风险组2，n＝1，风险组3n＝5以及风险组5n＝2)的22名社区受试者中，1年随访之后仅有5名保留在风险类别(风险组4，n＝3，风险组2n＝1，风险组5n＝1)中。

CD44在检测口腔癌或其他部位处的癌症中的作用

2名受试者落入升高的风险类别(都是风险组4)中且在随访中发展早期HNSCC(唇和喉的原位癌)。一个对照因为膀胱癌而被排除，其具有14ng/mL的solCD44水平和1.5mg/mL的蛋白水平。另一对照由于口腔初癌的关系而被排除，其具有4.8ng/mL的solCD44水平和1.3mg/mL的蛋白水平并且继续发展成肺癌。来自基于社区的研究的一个患者发展成肺癌并且在诊断之前14个月具有升高的水平(CD44＝3.975ng/mL，蛋白＝0.656mg/mL)。

讨论

本文所公开的方法显示一种基于CD44和蛋白的便宜的非侵入式筛选工具，其能够将口腔癌病例与对照准确地区分开。本文所独有的频率匹配防止因协变量如吸烟或社会经济状况所致的混淆。在美国有超过8500万个体处于口腔癌的风险中，但这些脆弱的个体中几乎没有人实际上接受口腔检查。本文所述的口腔漱洗液分子测试可通过提供口腔癌风险的简单和可靠的量度来改革口腔癌筛选，其提醒初级护理提供者和牙科医生关于最需要熟练的口腔检查的个体。CD44ELISA测定和蛋白测试早已被转化为侧向流测试条原型。因此，普查是可行的。

研究还显示高CD44与不良的PFS和OS有关。这些标记物可适用于指导疗法(Ang等人NEnglJMed.20101；363:24-35)该测试可检测早期(I-III)口腔癌超过晚期(IV)疾病。CD44的作用对于肿瘤起始来说可能很重要。

在此研究中被认为是假阳性的两个患者在随访期间发展成HNSCC(Franzmann等人CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007；16:1348-55)。此外，患有包括肺和膀胱的其他吸烟相关肿瘤的受试者也具有升高的CD44水平。因此，“假阳性”可实际上是对于具有相关风险因素的隐匿性口腔疾病或其他癌症的真阳性。由于CD44是肿瘤起始因子，所以如果风险因素减少且隐匿性病变消失，那么水平便可下降。数据显示留在社区筛选计划中一年的个体经历了CD44水平的显著下降。所有受试者都接受了关于戒烟的教育并且可利用资源来帮助他们改善口腔卫生和营养。因此，行为变化可造成水平降低。

Claims

1.一种确定受试者的癌症风险的方法，其包括：

a)测量来自所述受试者的体液样本中solCD44的测试量；

b)测量所述样本中总蛋白的测试量；

c)提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于所述癌症的不同的统计上显著的风险；以及

d)通过确定solCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于或是低于solCD44和总蛋白的参考水平来确定所述受试者的癌症风险。

2.如权利要求1所述的方法，其中在所述群体中的个体具有与受试者的社会人口统计和风险因素类似的年龄、种族、饮酒史、吸烟史、和/或癌症病史。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述群体中的个体具有与受试者的社会人口统计和风险因素类似的人类乳头状瘤病毒(HPV)感染状况。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液选自由以下组成的组：口腔漱洗液、唾液、痰液、呼吸气冷凝液、血液、血浆、血清、以及尿。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述口腔漱洗液是口腔盐水漱洗液。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述口腔漱洗液是在所述受试者吃饭、吸烟、及饮水之后至少一小时获得。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、白血病/淋巴瘤、乳腺癌、或骨肉瘤。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于受试者年龄、种族、饮酒史、吸烟史、癌症病史和/或人类乳头状瘤病毒(HPV)测定的阳性结果选出所述受试者以提供口腔漱洗液。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者没有临床上明显的恶性肿瘤或初癌。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是基于所鉴别的风险通过手术、放射线、或化学疗法、或其组合来治疗。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在确定癌症风险之前，将solCD44的测试量针对总蛋白的测试量进行标准化。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫测定是用于测量所述样本中solCD44的测试量。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫测定是用于测量来自所述群体的solCD44水平。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于测量所述样本中solCD44的测试量和/或来自所述群体的solCD44水平的所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)或侧流测定。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中劳瑞或改性劳瑞蛋白测定是用于测量所述样本中总蛋白的测试量。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中劳瑞或改性劳瑞蛋白测定是用于测量来自所述群体的总蛋白水平。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者提供风险因素管理咨询。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述风险因素管理咨询包括戒烟计划

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以固定的时间间隔重复步骤a)至d)。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每三至六个月重复步骤a)至d)。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括步骤e)把所述受试者送交癌症专家。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括测量所述样本中透明质酸(HA)和透明质酸酶(HAase)中的至少一个的水平。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约10ng/mL、约5.5ng/mL、约5.3ng/mL、和/或约2.2ng/mL。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中总蛋白的参考水平为约1.5mg/mL、约1.2mg/mL、和/或约0.6mg/mL。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约1.2mg/mL。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约0.5mg/mL。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44和总蛋白的参考水平分别为约2.22ng/mL和约1.2mg/mL。

29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中统计分析是用于测定参考水平。

30.如权利要求29所述的方法，其中统计分析包括多变量分析或逻辑回归计算。

31.一种试剂盒，其包括：盐水溶液；用于接收口腔盐水漱洗液的杯子；至少一种特异性地结合CD44的抗体；用于测定总蛋白浓度的试剂；以及solCD44和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体和患有癌症个体的群体的solCD44和总蛋白水平来测定，并且其中solCD44和总蛋白的参考水平划定关于所述癌症的不同的统计上显著的风险。

32.如权利要求31所述的试剂盒，其还包括至少一种结合p16INK4a的抗体。

33.如权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述至少一种特异性地结合p16INK4a的抗体包括E6H4抗体克隆的个体遗传型。

34.如权利要求31-32中任一项所述的试剂盒，其还包括CD44参考样本、p16参考样本、或其组合。

35.如权利要求31-34中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测特异性地结合p16INK4a的抗体、特异性地结合CD44的抗体、或其组合的一种或多种比色剂。

36.如权利要求31-35中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是侧流免疫测定。

37.如权利要求31-36中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括任选地涂覆有以下的多孔板：特异性地结合p16INK4a的抗体、特异性地结合CD44的抗体、或其组合。

38.如权利要求31-37中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约10ng/mL、约5.5ng/mL、约5.3ng/mL、和/或约2.2ng/mL。

39.如权利要求31-38中任一项所述的试剂盒，其中总蛋白的参考水平为约1.5mg/mL、约1.2mg/mL、和/或约0.6mg/mL。

40.如权利要求31-39中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约1.2mg/mL。

41.如权利要求31-40中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约0.5mg/mL。

42.如权利要求31-41中任一项所述的方法，其中solCD44和总蛋白的参考水平分别为约2.22ng/mL和约1.2mg/mL。